DE3785591T2

DE3785591T2 - Kompetitiver homogener test.

Info

Publication number: DE3785591T2
Application number: DE8787300195T
Authority: DE
Inventors: Larry Edward Morrison
Original assignee: BP Corp North America Inc
Current assignee: BP Corp North America Inc
Priority date: 1986-01-10
Filing date: 1987-01-09
Publication date: 1993-09-02
Anticipated expiration: 2007-01-10
Also published as: JPS62244399A; DE3785591D1; JP2619866B2; US5928862A; EP0232967B1; EP0232967A3; EP0232967A2; ATE88761T1; CA1296242C

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, Reagenzien, Zusammensetzungen sowie Kits zur Verwendung bei der Bestimmung und der quantitativen Analyse von Targetmolekülen. Ins besondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren, Reagenzien, Zusammensetzungen sowie Kits zum Durchführen von Desoxyribonukleinsäure- (DNA) oder Ribonukleinsäure- (RNA) Hybridisierungsassays.
Der Begriff "Marker" bezieht sich auf einen Molekülteil, der bestimmbar ist, beispielsweise ohne Einschränkung einschließend: radioaktive Isotope; Enzyme; Lumineszente oder präzipitierende Mittel sowie Farbstoffe. Der Begriff "Mittel" wird in weitem Sinne verstanden, jeglichen Molekülteil einschließend, welcher teilnimmt an Reaktionen, die zu einer bestimmbaren Antwort führen. Der Begriff "Kofaktor" wird weit verwendet, um jeglichen Molekülteil einzuschließen, welcher an Reaktionen mit dem Mittel teilnimmt.
Die genetische Information wird in lebenden Zellen in fadenähnlichen DNA Molekülen gespeichert. In vivo liegt das DNA Molekül als eine Doppelhelix vor, wobei jeder Strang derselben eine Nukleotidkette ist. Jedes Nukleotid ist durch eine der vier Basen gekennzeichnet: Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) und Cytosin (C). Die Basen sind komplementär in dem Sinne, daß aufgrund der Orientierung der funktionellen Gruppen gewisse Basenpaare sich gegenseitig anziehen und durch Wasserstoffbrückenbindungen binden. Adenin in einem DNA-Strang paart sich mit Thymin in einem entgegengesetzten komplementären Strang. Guanin in einem DNA-Strang paart sich mit Cytosin in einem entgegengesetzten komplementären Strang. In der RNA wird die Thyminbase durch Uracil (U) ersetzt, welches sich mit Adenin in einem entgegengesetzten komplementären Strang paart.
Der genetische Code eines lebenden Organismus wird auf dem DNA-Strang in der Sequenz der Basenpaare getragen. DNA besteht aus kovalent gebundenen Ketten von Desoxyribonukleotiden und RNA besteht aus kovalent gebundenen Ketten von Ribonukleotiden.
Jede Nukleinsäure wird durch eine Phosphodiesterbrücke zwischen der 5'-Hydroxygruppe des Zuckers des einen Nukleotids und der 3'-Hydroxygruppe des Zuckers eines benachbarten Nukleotids gebunden. Jeder lineare Strang von natürlich vorkommender DNA oder RNA weist ein terminales Ende mit einer freien 5'-Hydroxygruppe und ein anderes terminales Ende mit einer 3'-Hydroxygruppe auf. Die terminalen Enden von Polynukleotiden werden oft mit 5'-Termini oder 3'-Termini in Bezug auf die einzelne freie Hydroxylgruppe bezeichnet.
Natürlich vorkommende Polynukleotide können eine Phosphatgruppe an dem 5'-Terminus haben. Komplementärstränge von DNA und RNA bilden antiparallele Komplexe, in welchen das 3'- terminale Ende des einen Stranges an dem 5'-terminalen Ende des entgegengesetzten Stranges orientiert und gebunden ist.
Nukleinsäurehybridisierungsassays basieren auf der Tendenz zweier Nukleinsäurestränge sich an ihren komplementären Bereichen zu paaren. Gegenwärtig werden Nukleinsäurehybridisierungsassays in erster Linie verwendet, um einzigartige DNA- oder RNA-Basensquenzen oder spezifische Gene in einem vollständigen DNA Molekül, in Mischungen von Nukleinsäuren oder in Mischungen von Nukleinsäurefragmenten zu bestimmen und zu identifizieren.
Die Identifizierung von einzigartigen DNA- oder RNA-Sequenzen oder spezifischen Genen mit der gesamten DNA oder RNA, welche von Gewebe- oder Kulturproben extrahiert wird, kann das Vorliegen von physiologischen oder pathologischen Bedingungen anzeigen. Insbesondere kann die Identifizierung von einzigartigen DNA- oder RNA- Sequenzen oder spezifischen Genen innerhalb der gesamten DNA oder RNA, welche von menschlichem oder tierischem Gewebe isoliert wurde, das Vorliegen von genetischen Erkrankungen oder Bedingungen, wie beispielsweise Sichelzellanämie, Gewebsverträglichkeit, kanzeröse, präkanzeröse Zustände oder bakterielle oder virale Infektionen anzeigen. Die Identifizierung von einzigartigen DNA- oder RNA-Sequenzen oder spezifischen Genen innerhalb der gesamten DNA oder RNA, welche aus Bakterienkulturen isoliert wurden, können das Vorliegen von antibiotischen Resistenzen, Giften, viralen oder Plasmid- abhängigen Zuständen anzeigen oder können eine Identifizierung von Bakterientypen zur Verfügung stellen.
Demzufolge haben Nukleinsäurehybridisierungsassays einen großen Stellenwert bei der Diagnose und Bestimmung von Erkrankungen. Ein weiterer Stellenwert existiert in der Landwirtschaft und bei der Nahrungsmittelverarbeitung, wo Nukleinsäurehybridisierungsassays verwendet werden können, um Pflanzenerkrankungen oder Gift produzierende Bakterien zu bestimmen.
Eine der am meisten verwendete Polynukleotidhybridisierungsassayprozedur ist bekannt als das Southernblot-Filterhybridisierungsverfahren oder einfach als das Southern-Verfahren (Southern, E., J. Mol. Biol., 98, 503, 1975).
Das Southernverfahren wird verwendet, um Target DNA- oder RNA-Sequenzen zu identifizieren. Das Verfahren wird im allgemeinen durchgeführt, indem man Proben- RNA oder -DNA, welche von einem Organismus isoliert worden ist, welche möglicherweise die interessierende Targetsequenz trägt, einem Restriktionsendonukleaseverdau aussetzt, um DNA- Fragmente zu bilden. Die Proben- DNA- Fragmente werden dann auf dem Gel, z. B. Agarose oder Polyacrylamid, elektrophogetisiert, um die Probenfragmente nach Länge zu sortieren. Jede Fragmentegruppe kann auf das Vorliegen der Targetsequenz getestet werden. Die DNA wird innerhalb des Geles denaturiert, um einen Transfer auf Nitrocelluloseblätter zu ermöglichen. Das Gel, welches die Proben-DNA-Fragmente enthält, wird in Kontakt mit den Nitrocellulosefilterblättern oder diazotiertem Papier angeordnet (geblottet), auf welchem die DNA-Fragmente übertragen und gebunden oder immobilisiert werden. Die Nitrocelluloseblätter, welche die Proben-DNA-Fragmente enthalten, werden dann auf ungefähr 85ºC erwärmt, um die DNA zu immobilisieren. Das Nitrocelluloseblatt wird dann behandelt mit einer Lösung, welche eine denaturierte (einzelstrangige) radiomarkierte DNA-Sonde enthält. Die radiomarkierte Sonde schließt einen DNA-Strang ein mit einer Basensequenz, welche komplementär ist zu der Targetsequenz und welche eine radioaktiven Teil aufweist, welcher bestimmt werden kann.
Zwischen der Sonde und den Proben-DNA-Fragmenten wird eine Hybridisierung durchführen gelassen während des Hybridisierungsprozesses wird es der immobilisierten Proben-DNA erlaubt, mit der radiomarkierten DNA-Sonde zu rekombinieren und wieder doppelsträngige Strukturen zu bilden.
Der Hybridisierungsprozeß ist sehr spezifisch. Die markierte Sonde wird nicht mit Proben- DNA kombiniert, wenn die beiden DNA- Gesamtheiten nicht eine im wesentlichen komplementäre Basenpaarorganisation gemeinsam haben. Die Hybridisierung kann von 3 bis 48 Stunden dauern, abhängend von den gegebenen Bedingungen.
Nichthybridisierte DNA-Sonde wird anschließend weggewaschen. Das Nitrocelluloseblatt wird dann auf einer Röntgenfilmplatte angeordnet und exponiert. Der Röntgenfilm wird entwickelt mit den exponierten Bereichen des Filmes, welche die DNA-Fragmente identifizieren, welche mit der DNA-Sonde hybridisiert haben, und deshalb die interessierende Basenpaarsequenz aufweisen.
Die Verwendung von Nukleinsäurehybridisierungsassays wurde teilweise behindert durch lange Expositionszeiten, um auf dem Röntgenfilm Banden sichtbar zu machen. Ein typisches Southern Verfahren kann einen bis sieben Tage zur Exposition erfordern.
Darüber hinaus erfordern viele der gegenwärtigen Techniken radioaktive Isotopen als Markermittel. Die Verwendung von radioaktiven Markierungsmitteln erfordert spezielle Laboratoriumsverfahren und Genehmigungen.
Die obigen Probleme, welche verbunden sind mit Assays, welche Radio-Isotopen-Marker einschließen, haben zu der Entwicklung von Immunassaytechniken geführt, welche nichtisotopische Marker, wie beispielsweise Lumineszenzmoleküle anwenden. Siehe im allgemeinen, Smith et al., Ann. Clin. Biochem 18: 253-74 (1981). Lumineszenzmarker emitieren Licht aufgrund einer Anregung durch eine externe Lichtquelle und können in Kategorien, abhängig von der Quelle der Anregungsenergie gruppiert werden, einschließend: Radiolumineszenzmarker, welche Energie aus Hochenergieteilchen ableiten, Chemilumineszenzmarker, welche Energie erhalten aus chemischen Reaktionen; Biolumineszenzmarker, worin die anregende Energie durch ein biologisches System geliefert wird; und Photolumineszenz- oder Fluoreszenzmarker, welche anregbar sind, durch Einheiten von elektromagnetischer Strahlung (Photonen) von Infrarot, sichtbarem oder ultra-violettem Licht. Id. auf 255.
Lumineszenzassaytechniken, welche anregbare Marker verwenden, durch nicht-radioaktive Energiequellen, vermeiden die Gesundheitsrisiken und Genehmigungsprobleme, welche mit Radioisotopen- Markerassaytechniken verbunden sind. Darüber hinaus erlaubt die Verwendung von Lumineszenzmarkern die Entwicklung von "homogenen" Assaytechniken, worin die markierte angewendete Sonde unterschiedliche Lumineszenzcharakteristiken aufweist, wenn sie mit einem Assayreagenz verbunden wird, als wenn sie unassoziiert vorliegt, wobei der Bedarf einer Trennung der assoziierten und nicht-assoziierten markierten Sonde sich erübrigt. Nicht radioaktive Nukleinsäureassaytypen, welche präzipitierende enzymatische, Lumineszenzmarkerteile verwenden, haben nicht die Empfindlichkeit oder die Spezifizität der Assayverfahren erbracht, welche als zuverlässig erachtet wird.
In Lumineszenzassays kann das Vorliegen von Proteinen und anderen Molekülen in biologischen Proben die Streuung von anregendem Licht ("Raleigh-Streuung") bewirken, was zu einer Interferenz mit jenen Lumineszenzmarkern führt, welche Licht bei Wellenlängen emitieren, welche innerhalb etwa 50 nm der Wellenlänge des anregenden Lichtes liegen. Die endogenen Verbindungen können ebenfalls das anregende Licht streuen bei einer längeren Wellenlänge, charakteristisch für die streuenden Moleküle ("Raman-Streuung") oder können Licht absorbieren in dem Emissionsspektrum des Lumineszenzmarkers, was zu einem Quenchen der Lumineszenzsonde führt.
Versuche, die Empfindlichkeit heterogener Lumineszenzassays zu verbessern, haben die Entwicklung von sogenannten "zeitaufgelösten" Assays eingeschlossen. Siehe, Soni et al., Clin. Chem. 29/1, 65-68 (1983); US-Patent Nr. 4,176,007.
Zeitaufgelöste Assays beinhalten im allgemeinen die Anwendung von Lumineszenzmarkern mit Emissionslebenszeiten, welche signifikant unterschiedlich sind von (gewöhnlich viel länger als) den 1-20 nSek Emissionslebenszeit der natürlichen Fluoreszenz von Materialien, welche in der Probe vorliegen. Der Assayverbindungsschritt wird durchgeführt und das getrennte assoziierte oder unassoziierte markierte Material wird angeregt durch eine Reihe von Energiepulsen, welche durch eine Xenon-Blitzröhre oder andere gepulste Energiequellen zur Verfügung gestellt werden. Die Lumineszenzemission des Markers, welche sich ergibt aus jedem Puls, wird gemessen bei einer Zeit größer als die Zeit der natürlichen Fluoreszenz des Hintergrundmaterials in der Probe. Die Interferenz aus der Hintergrundstreuung und der kurzlebigen Probenfluoreszenz wird dann aus der gemessenen Lumineszenz eliminiert.
Gegenwärtige Techniken, welche die Trennung oder Immobilisierung der Sonden- oder Proben-DNA erfordern, heterogene Assays, können wechselwirken mit der Durchführung von nichtradioaktiven Assays. Emissionen von Lumineszenzmarkerteilen können gequencht werden durch feste Träger. Trägermaterialien können eine Quelle von Hintergrundfluoreszenz sein oder können Lichtemissionen reflektieren oder streuen, wobei sie mit dem Assay wechselwirken. Die Zeit, die erforderlich ist für den Hybridisierungsschritt wird erhöht, wenn die komplementären DNA-Stränge nicht vollständig frei sind, sich aufgrund der Immobilisierung auf eine der Strangpaare in einer komplementären Paarungsweisung zu orientieren. Unspezifische Bindung der markierten Sonde auf dem festen Träger kann die Genauigkeit des Assays vermindern.
Beispiele von Assay-Prozeduren, welche Chemilumineszenz und Photolumineszenzmarker anwenden, können gefunden werden in EP-A 0 070 685 und EP-A 0 185 547.
EP-A 0 070 685 offenbart eine homogene Assaytechnik, worin Polynukleotidsonden jeweils mit einem Chemilumineszenzkatalysator markiert werden und einem Absorber/Emitterteil zusammengebracht werden durch Binden eines Targetpolynukleotidstranges dicht genug, um einen nicht-strahlenden Energietransfer zu erlauben. Licht, welches von dem Chemilumineszenzkatalysator emittiert wird, wird gemessen, um das Hybridisierungsausmaß zu bestimmen.
EP-A 0 185 547 beschreibt eine ähnliche Prozedur, worin Polynukleotidsonden markiert werden, jeweils mit einem Apolumineszenzmittel und einem Katalysator. In diesem System erlaubt die proximale Hybridisierung der Sonden mit einem Targetpolynukleotidstrang dem Katalysator das Apolumineszenzmittel über ein Transformationsradikal in ein Lumineszenzmittel umzuwandeln.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Verfahren, Reagenzien, Zusammensetzungen und Kits zum Durchführen von Assays für interessierende Targetpolynukleotidstränge bereitzustellen. Andere Aufgaben werden anschließend vorgestellt.
Zusammengefaßt schließt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Untersuchen einer Probe auf Targetpolynukleotide, die folgenden Schritte umfassend, ein:
(a) Inkontaktbringen der Probe mit Reagenz unter Bindungsbedingungen, wobei das Reagenz einschließt eine erste Polynukleotidsonde und eine zweite komplementäre Polynukleotidsonde, wobei die ersten und zweiten Sonden in der Lage sind, eine erste Position einzunehmen, worin die ersten und zweiten Sonden fähig sind, einen Doppelstrang zu bilden und wenigstens eine der Sonden in der Lage ist, eine zweite Position einzunehmen, worin wenigstens eine Sonde an das Target gebunden wird und mit dem Target einen Doppelstrang bildet, wobei die ersten und zweiten Sonden einen ersten Markerteil einschließen, verbunden mit einer der Sonden und einen zweiten Markerteil einschließend, verbunden mit der Komplementärsonde, wobei die ersten und zweiten Markerteile in der Lage sind, zu wechselwirken, wenn die ersten und zweiten Sonden einen Doppelstrang bilden, um ein spezifisch bestimmbares Signal zu erzeugen, welches charakteristisch für die Sonde in einer der beiden Positionen ist, und
(b) Überwachen der Probe für das spezifisch bestimmbare Signal, welches charakteristisch ist für die Sonde in einer der beiden Positionen.
Die Probe, welche mit dem Reagenz in Kontakt gebracht wird, wird auf das Signal hin überwacht, dessen Vorliegen im Zusammenhang steht mit dem Vorliegen von Targetpolynukleotidsträngen in der Probe. Das vorliegende Verfahren erlaubt es eine Polynukleotidprobe zu untersuchen, ohne Immobilisierungsschritte und ohne radioaktive Markierungstechniken zu benötigen.
Vorzugsweise ist wenigstens ein Markierungsteil am 3'-Ende einer der Sonden angeordnet und der zweite Markierungsteil ist angeordnet am 5'-Ende der Komplementärsonde. Eine Mehrzahl von Markierungsteilen kann verwendet werden für jede Probe, vorzugsweise zwei - eine an jedem Ende. Z.B. kann ein erster Markerteil mit der ersten Sonde an einer 3'- Position verbunden und ein zweiter Markerteil kann mit der 5'-Position verbunden werden. Eine zweite Sonde mit einer ähnlichen Markerteilorganisation, einem ersten Markerteil in der 3'-Position und einen zweiten Markerteil in der 5'-Position wird mit der ersten Probe hybridisieren, so daß die ersten und zweiten Markerteile der Komplementärsonden in enger Nachbarschaft sind und wechselwirken können.
Eine Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung schließt die zusätzlichen Schritte ein des Sondenherstellens durch Spleißen von Polynukleotidsegmenten mit Basensequenzen, welche im wesentlichen identisch denen der Targetsequenzen sind in Verstärkermittel, um Vielfachkopien der Reagenzpolynukleotidsegmente zu bilden. Vorzugsweise schliefen die Verstärkungsmittel eine hohe Kopienzahl Plasmid oder Phagen ein, welche, wenn sie in Bakterien inkorporiert sind, reproduziert werden. Die Polynukleotidsegmente, welche Sequenzen aufweisen, welche im wesentlichen identisch mit den Targetsequenzen sind, werden isoliert aus zellulären Bestandteilen, und unwünschenswert Bakterien, Plasmid oder Phagen-DNA und werden einem Restriktionsverdau ausgesetzt, um Segmente zu bilden. Die Segmente sind dann verfügbar für die Addition von Markerteilen, um Sonden zu bilden.
Zusätzlich kann jeder plasmid- oder phagenabgeleitete Abschnitt weiteren Restriktionsenzymen ausgesetzt werden, um eine Vielzahl von Unterabschnitten herzustellen, an welche Markerteile massenhaft angehängt werden können. Jeder Unterabschnitt würde in der Lage sein, mit einem repräsentativen Teil des Targetstranges zu hybridisieren. Eine Vielzahl von Reagenzsonden aus Plasmid- oder Phagenquellen würde größere Signalerzeugungskapazitäten schaffen und würde wirksame und relativ kostengünstige Sonden zur Verfügung stellen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt Verfahren ein, zum nicht-radioaktiven Markieren des 3'-Endes eines DNA-Stranges und der sich ergebenden Zusammensetzungen. Eine sich ergebende Zusammensetzung schließt einen DNA-Strang ein, mit einem Aminoalkylderivat einer Nukleinsäure. Die Aminogruppe der Nukleinsäure kann umgesetzt werden mit aminreaktiven Markerteilen. Vorzugsweise beinhalten die Aminoalkylderivate eine aliphatische primäre Aminogruppe. Insbesondere beinhaltet ein bevorzugtes Aminoalkylderivat ein Ribonukleinsäurederivat, wie beispielsweise Aminohexylaminoadenosintriphosphat, welches an den Reagenzstrang mittels des Enzymes terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) angehängt werden kann.
Die terminale Transferase wird ein oder zwei Ribonukleinsäurederivate an das terminale Ende einer einsträngigen DNA addieren, wobei Probleme verhindert werden, welche in den Schwänzen aus Desoxyderivaten liegen, welche bemessen sein müssen, um die Signalstärke zu standardisieren, und welche zu sterischen Effekten beitragen können.
Marker an Schwänzen können nicht länger eine geeignete räumliche Nähe zum Energietransfer oder Kollisionswechselwirkung besitzen. Jedoch sind Schwänze gut, wenn die Markerteile der Schwänze "still" sind, z. B. Mehrfach- Quencher führen zu einer größeren Quenchwirkung aufgrund der größeren lokalen Quencher-Konzentration, führen jedoch noch nicht zu einem erhöhten Hintergrund, wenn der Quencher nicht fluoreszierend ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt einen Kit zum Untersuchen einer Probe auf Targetpolynukleotide ein, ein Reagenz umfassend, worin das Reagenz eine erste Polynukleotidsonde und eine zweite Komplementärpolynukleotidsonde einschließt, wobei die ersten und zweiten Sonden in der Lage sind, eine erste Position einzunehmen, worin die ersten und zweiten Sonden in der Lage sind, einen Doppelstrang zu bilden und wenigstens eine der Sonden in der Lage ist, eine zweite Position einzunehmen, worin wenigstens ein Sondenstrang gebunden wird und einen Doppelstrang mit einem Target bildet, wobei die ersten und zweiten Sonden einen ersten Markerteil einschließen, welcher mit einer der Sonden verbunden ist und einen zweiten Markerteil einschließen, welcher mit der Komplementärsonde verbunden ist, wobei die ersten und zweiten Markerteile in der Lage sind, mit den ersten und zweiten Sonden zu wechselwirken, wenn die ersten und zweiten Sonden einen Doppelstrang bilden, um ein spezifisch bestimmbares Signal zu erzeugen, welches charakteristisch ist für eine Sonde in einer der beiden Positionen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden mit jeglichem geeigneten Gerät. Wenn es sich bei dem Target um ein Polynukleotidsegment handelt, schließt das Gerät eine Reaktionskammer, aufgelegt zum Aufnehmen von Reagenz und Target in einem im wesentlichen gemischten homogenen Zustand ein. Das Reagenz schließt eine erste Polynukleotidsonde und eine zweite komplementäre Polynukleotidsonde ein.
Ausführungsformen des Gerätes, welches ausgelegt ist zur Verwendung mit einem Fluoreszenzassay schliefen geeignete Markeranregungsmittel ein, Laser oder Licht emittierende Anordnungen mit Filtern, um definierte geeignete Wellenlängen oder Injektionsgeräte zum Injizieren von Kofaktoren im Falle von Chemilumineszenz oder enzymatischen Mitteln einschliefen.
Ein bevorzugtes Gerät würde einschließen zeitauflösende Steuerung für gepulstes Licht in die Reaktionskammer und selektives Lesen der Fluoreszenzemissionen, die sich aus dem Energietransfer ergeben, um die Hintergrundfluoreszenz zu vermindern.
Zu den Zeichnungen:
Diese stellen im Wege der Verdeutlichung bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar; und insbesondere ist in Fig. 1 ein Verfahren der Prozedur verdeutlicht, mit notwendigen Reagenzzusammensetzungen, in schematischer Form für eine Untersuchung auf einen Targetpolynukleotidstrang. Bei herkömmlichen Assaytechniken, hätte man mehr als einen Targetstrang und mehr als einen Sondenstrang verwendet, um einen Assay durchzuführen; jedoch zur Vereinfachung und um die Erfindung besser zu verstehen, verwendet die Verdeutlichung lediglich ein einzelnes Reagenzsegment und ein einzelnes Targetsegment.
Fig. 1 zeigt erste und zweite Polynukleotidstrangsonden (P1 bzw. P2) in einer hybridisierten oder wechselseitig gebundenen ersten Position. Ebenfalls verdeutlicht ist ein Doppelstrang-DNA-Segment, welches zwei komplementäre interessierende Targetstränge (T1 bzw. T2) fast. Die erste Sonde (P1) schließt zwei Markerteile ein (A1 und D1) an den Strangenden. Ein erster Markerteil (A1) wird kovalent gebunden an das 5'-Ende der ersten Sonde (P1) und ein zweiter Markerteil (D1) wird kovalent gebunden an das 3'-Ende der ersten Sonde. In ähnlicher Weise wird ein anderer erster Markerteil (A2) kovalent gebunden an das 5'-Ende der zweiten Sonde (P2) und ein anderer zweiter Markerteil (D2) wird kovalent gebunden an das 3'-Ende der zweiten Sonde. Die ersten und zweiten Markerteile der entgegengesetzten Sonden (A1 und D2) und (A2 und D1) sind in der Lage miteinander zu wechselwirken, wenn die ersten und zweiten Sonden in der ersten gegenseitig gebundenen Position sind.
Der Fachmann wird erkennen, daß die Markerteile kombiniert oder verbunden werden können mit DNA-Sonden, aufanderen Wegen als über kovalentes Binden, z. B. ohne Beschränkung, Interkalation, Chelatisierung und ionische, hydrophile oder hydrophobe Affinität. Das Wort "gebunden" umfalt sämtliche Mittel zum Binden eines Markerteiles an eine Sondengesamtheit.
Die Markerteile der vorliegenden Erfindung sind gepaart oder gruppiert in einer Art und Weise, welche den Markerteilen erlaubt, zu wechselwirken. Beispielsweise, ohne Einschränkung, können die Markergruppen Kombinationen von Markergruppen umfassen, einschließend einen ersten und zweiten Fluorophor, einen Fluorophor und einen Chemilumineszenzteil, einen Chemilumineszenzteil und einen Kofaktor, ein Enzym und ein Substrat, und kolorimetrische Teile und Kofaktoren.
In der vorliegenden Verdeutlichung sind die ersten Markerteile Fluorophore (A1 und A2), welche in der Lage sind Energie oder Licht einer bestimmten Wellenlänge (hv&sub1;) und emittierende Energie oder Licht bei einer zweiten Wellenlänge (hv&sub2;) zu empfangen.
In ähnlicher Weise sind die zweiten Markerteile Fluorophore (D1 und D2), welche in der Lage sind, Energie oder Licht einer bestimmten Wellenlänge (hv&sub3;) zu empfangen und Energie einer zweiten Wellenlänge (hv&sub1;) zu emittieren und zu übertragen. Die ersten und zweiten Fluorophore der entgegengesetzten Sonden (A1 und D2) und (A2 und D1) sind in der Lage wechselzuwirken, wenn die ersten und zweiten Sonden (P1 und P2) in der ersten gegenseitig gebundenen Position sind, derart, daß die Lichtemissionen, welche von den zweiten Fluorophoren ausgehen, gequencht werden. Desweiteren führt das Licht der Wellenlänge hv&sub3;, welches normalerweise nicht in der Lage ist von den ersten Fluorophoren (A1 und A2) empfangen zu werden, aufgrund der Wechselwirkung zu Emissionen bei Wellenlänge hv&sub2;.
Wie in Fig, 1 gezeigt, werden die Sonden (P1 und P2) zugegeben oder kombiniert mit Targetsträngen (T1 und T2). Die Sonden um Targets werden denaturiert, wobei es den Strängen erlaubt wird sich zu trennen. Als nächstes wird es den Sonden und Targets erlaubt, zu Rehybridisieren, wobei es den Strängen ferner erlaubt wird in eine zweite Position zu rekombinieren, worin die Sonden an die Targets gebunden werden, um Sonden-Target-Hybride (PT1 und PT2) zu bilden. Die Markerteile jedes Sondenstranges werden von den Markerteilen des entgegengesetzten Sondenstranges getrennt und sind nicht fähig wechselzuwirken.
In der ersten Position, worin die Sondenstränge (P1 und P2) gegenseitig gebunden sind, führt die Beleuchtung mit Lichtenergie einer Wellenlänge (hv&sub3;), welche geeignet ist die zweiten Fluorophore (D1 und D2) anzuregen zu der Emission von Lichtenergie durch die ersten Fluorophore (A1 und A2) bei einer unterschiedlichen Wellenlänge (hv&sub2;) als die anfängliche Anregungswellenlänge (hv&sub3;) oder der normalen Emissionswellenlänge (hv&sub1;) der zweiten Fluorophore (D1 und D2). Die Hybridisierung der Sonden (P1 und P2) in eine zweite Position mit Targets (T1 und T2) führt zum Zerreiben der Wechselwirkung zwischen den Markerteilen der entgegengesetzten Sondenstränge (A1 und D2 und A2 und D1) und zu einem Abfall in der Lichtemission bei der Emissionswellenlänge (hv&sub2;) der ersten Fluorophore (A1 und A2). Der Abfall der Lichtemission der Emissionswellenlänge (hv&sub2;) der ersten Markerteile, Fluorophore (A1 und A2) steht in umgekehrter Beziehung mit der Konzentration des vorliegenden Targets.
Die Emissionen der zweiten Fluorophore (D1 und D2) werden normalerweise in der Gegenwart der ersten Fluorophore (A1 und A2) gequencht, was zu einer geringen oder nicht bestimmbaren Emission an Lichtenergie bei der Emissionswellenlänge (hv&sub1;) führt. Die Hybridisierung der Sondenstränge (P1 und P2) an die Targetstränge (T1 und T2) um Sondentargethybride (PT1 und PT2) zu bilden, zerstört jedoch die Wechselwirkung zwischen den Markerteilen der entgegengesetzten Sondenstränge (A1 und D2; und A2 und D1), was eine bestimmbare Emission an Lichtenergie bei Wellenlänge (hv&sub1;) aus den zweiten Fluorophoren (D1 und D2) erlaubt, welche charakteristisch ist und auf die Sonde (P1 und P2) hinweist, eine zweite Position, gebunden an die Targets (T1 und T2) voraussetzend. Das Ansteigen der Lichtemmission bei der Emissionswellenlänge (hv&sub1;) der zweiten Markerteile, Fluorophore (D1 und D2) steht in Beziehung zu der Konzentration des Targetstranges.
Die Emissionswelle der ersten und zweiten Markerteile, Fluorophore (A1 und A2; und D1 und D2) bei den beiden Wellenlängen (hv&sub1;) können analytisch kombiniert werden, um einen Gesamtwert für die Targetstrangkonzentration zur Verfügung zu stellen mit größerer Empfindlichkeit und Genauigkeit als der Einzelwert für sich. Jedes Signal kann untersucht werden auf das Vorliegen von Targetsträngen (T1 und T2).
Gemäß der Wahl der ersten und zweiten Fluorophore, Lichtstreuung, Sekundärfluoreszenz und Beschränkungen bei der Anregungs- oder Beleuchtungsausrüstung, welche Licht auf die Fluorophore bringt, kann es schwierig sein, Mehrfachsignale zu bestimmen und insbesondere das Signal das ersten Fluorophors (A1 und A2) wenn die Sonden (P1 und P2) in einer gegenseitig gebundenen Position sind. Desweiteren kann die Lichtemissionswellenlänge (hv&sub2;) nicht notwendigerweise bei der normalen Emissionswellenlänge des ersten Fluorophors (A1 und A2) aufgrund der Wechselwirkung der zweiten Fluorophore (D1 und D2) liegen. Die Lichtemission (hv&sub2;) kann charakteristisch sein für die Markerteile als eine Kombination der Gruppe, unterschieden von den ersten Fluorophoren (A1 und A2) oder den zweiten Fluorophoren (D1 und D2) allein oder können gequencht sein.
Nach Denaturierung und Reassoziierung können die Markerteile, die ersten und zweiten Fluorophore (A und D) der entgegengesetzten Sonden getrennt werden und getrennt gehalten werden durch Bildung von Target und Sondendoppelsträngen (PT1 und PT2). Die Bildung von Target und Sondendoppelsträngen (PT1 und PT2) zerstört die Fähigkeit des ersten Markerteils, Fluorophore (A1 und A2) Energie zu akzeptieren oder zu quenchen aus den zweiten Fluorophoren (D1 und D2). Die signalerzeugende Fähigkeit der zweiten Fluorophore (D1 und D2), welche Energie geben oder senden an die ersten energieaufnehmenden Fluorophore ist im allgemeinen leichter zu bestimmen. Das Ansteigen der Größe des Signales der zweiten Fluorophore (D1 und D2) ist ein Maß der Konzentration und des Vorliegens von Target in einer Probe. Je größer die Targetmenge in einer bestimmten Probe ist, desto größer ist die Intensität des Signales bei einer bestimmten Wellenlänge (hv&sub1;), welches von dem zweiten Fluorophor erzeugt wird.
Das vorliegende Verfahren kann durchgeführt werden mit der Hilfe einer Vorrichtung, welche in Blockform in Fig. 2 dargestellt ist. Die Vorrichtung schließt die folgenden hauptsächlichen Elemente ein: Ein Anregungselement oder Lichtquelle, ein Aufnahmegefäß und Signaldetektoren in Form von Photonenzählern (PC).
Das Aufnahmegefäß ist ausgelegt zum Aufnehmen von Proben, welche möglicherweise Targetpolynukleotide enthalten und Reagenz. Falls nötig, wird die Probe aufbereitet, um celluläre Bestandteile mit Ausnahme der Targetpolynukleotide, durch geeignete Targetfang- und Loslaßtechniken, welche im Stand der Technik bekannt sind, zu entfernen. Chaotrope Salze können angewendet werden, um Proteinmaterial in der Probe aufzulösen.
Die Probe wird mit Reagenz gemischt, einschließend eine erste Sonde und eine zweite Sonde. Die ersten und zweiten Sonden sind in der Lage, eine erste Position einzunehmen, worin die Sonden wechselseitig aneinander gebunden sind und eine zweite Position, worin wenigstens eine der Sonden in der Lage ist, an das Target zu binden. Jede Sonde schließt erste und zweite Markerteile ein, beispielsweise Fluorophore, welche verbunden sind mit der Sonde, um wechselzuwirken, wenn die Sonden in der ersten wechselseitig gebundenen Position vorliegen. Das Reagenz kann ebenfalls Beschleuniger einschließen, welche im Stand der Technik bekannt sind, die den Hybridisierungsprozeß beschleunigen.
In einem Gerät, welches ausgelegt ist zur automatischen Analyse, schließt die Vorrichtung, wie in Fig. 2 ausgeführt, vorzugsweise Mittel ein zum Aufnehmen einer Mehrzahl von Aufnahmebehältern. Aufnahmebehälter, welche die Probe enthalten, würden nacheinander analysiert werden. Probenreinigung, Erwärmen, Mischen und Reassoziieren findet vorzugsweise vor und an einer Station statt, welche entfernt ist von der Station, an welcher die Markersignale gemessen werden. Demzufolge werden die Aufnahmebehälter von einer ersten Station oder einer Reihe von Stationen, an welchen Probenreinigung, Erwärmungen und Mischung auftritt, zu einer zweiten Station transportiert, an welcher Sonden und Target, falls gegenwärtig, erlaubt wird zu reassoziieren. Die Aufnahmebehälter werden dann zu einer dritten Station transportiert, an welcher die Markersignale überwacht werden.
Die Transportmittel können einen drehbaren Drehtisch, ein Förderband oder andere Mittel einschließen. Wie in einer klinischen Krankenhausanlage angewandt, können die Transportmittel auch manuelle Bewegungen einschließen. Demnach können Krankenhausangestellte eine Gewebsprobe aus einem Patienten erhalten und die Probe in dem Aufnahmegefäß anordnen. Probenreinigung, Erwärmen und Mischen der Reagenzien würde am Krankenbett begonnen werden und fortgesetzt werden, bis der Aufnahmebehälter zu der dritten Station zum Überwachen gewandert ist.
Jetzt soll die erste Station beschrieben werden. Ein Heizelement wird angeordnet in dichter Nachbarschaft zu dem Aufnahmegefäß, um die Probe und die Sonden auf die Schmelztemperatur zu erwärmen. Target und Sonden sind in der Lage, jeweils eine erste Position einzunehmen, in welcher die Sonden wechselseitig gebunden sind, oder eine zweite Position, wenn Target vorliegt, in welcher wenigstens eine Sonde an das Target gebunden wird, nach anschließendem Kühlen. Das Heizelement kann viele Formen aufweisen, einschließlich einer chemischen Heizquelle, elektrische Heizquelle oder andere im Stand der Technik bekannte Mittel. Das Aufnahmegefäß schließt ein Rühr- oder Bewegungselement ein, um die Mischung von Probe und Sonden zu erleichtern.
Von der ersten Station wird das Aufnahmegefäß zu einer zweiten Station transportiert, wo man Sonden und Target, falls es vorliegt, reassoziieren läßt. Um das Kühlen des Aufnahmegefäßes von Schmelztemperaturen oder denaturierenden Temperaturen zu erleichtern, schließt die zweite Station ein Kühlelement ein. Das Kühlelement wird nicht benötigt, wenn hinreichend Zeit gegeben ist und die Umgebungstemperaturen kühl sind, um zu erlauben, daß Sonden und Target reassoziieren.
Nach dem Verlassen der zweiten Station wird das Aufnahmegefäß zu einer dritten Station transportiert, an welcher das Signal, welches charakteristisch ist für die Sonden, welche eine der beiden Positionen einnehmen, gemessen wird.
Die dritte Station schließt Mittel ein, um einen der Markerteile anzuregen. In dem vorliegenden Beispiel, in welchem die ersten und zweiten Markerteile Fluorophore sind, schließt das Anregungsmittel eine Lichtquelle ein, vorzugsweise ausgestattet mit geeigneten Filtern, so daß keine nennenswerte Anregung des zweiten Fluorophores bewirkt wird. Alternativ kann ein Laser verwendet werden, mit einem geeignet schmalen Emissionsspektrum.
Wenn eine der Markerteile ein Chemilumineszenzmittel einschließt, würden die Anregungsmittel Mittel injizieren von geeigneten Kofaktoren in das Aufnahmegefäß, um eine lichtemittierende Reaktion zu erzeugen.
Die dritte Arbeitsstation schließt ein: Signaldetektoren, Photonencounter (PC), angeordnet um Fluoreszenzemissionen aus den Aufnahmegefäßen zu empfangen. Vorzugsweise werden zwei Photonencounter (PC) verwendet. Ein Photonencounter empfängt Signale, welche von dem ersten Markerteil ausgehen und der zweite Photonencounter empfängt Signale aus dem zweiten Markerteil durch die Verwendung von Filtern und Zeitauflösungstechniken.
Die Photonencounter erzeugen ein Photonensignal, welches empfangen wird, verstärkt wird und mittels eines Analysators verarbeitet wird. Der Analysator verarbeitet Photonensignale in Werte, welche graphisch dargestellt werden können oder illustriert werden können oder in andere Formen gebracht werden können, welche die Ergebnisse an einen Betreiber weiterleiten.
Die vorliegende Vorrichtung kann ausgelegt werden auf Lebensdauer-aufgelöste Techniken unter Verwendung von Analogdetektoren in Verbindung mit einer gepulsten Lichtquelle, oder eine sinusförmig modulierte Lichtquelle.
Die vorliegende Erfindung ist ausgezeichnet geeignet zur Verwendung mit synthetischen Oligonukleotiden. Jedoch kann die vorliegende Erfindung schnell an biologische Klonierungstechniken angepaßt werden, um Sonden, (P1 und P2) in ökonomischer Weise herzustellen.
Im Folgenden wird Fig. 3 beschrieben. Ein doppelsträngiges Segment (hierin anschließend als das Sondensegment bezeichnet) von DNA, welches eine Basensequenz enthält, von der bekannt ist, daß sie komplementär zu der Targetsequenz ist, wird eingeführt in ein Plasmid mittels herkömmlicher rekombinanter DNA-Techniken. Z.B. kann das Plasmid einer Restriktionsendonuklease ausgesetzt werden, welches den Plasmidring spaltet und einzelsträngige Vorsprünge oder klebrige Enden liefert. Die klebrigen Enden sind komplementär und binden an klebrige Enden an den Termini des Sondensegmentes. Das Sondensegment kann inkorporiert werden mit Selektionsmarkern, um ferner die Identifikation von erfolgreichen Klonen zu bewerkstelligen.
Das Plasmid wird dann in ein Bakterium wie beispielsweise Escherichia coli inkorporiert, worin das Plasmid reproduziert oder verstärkt wird. Man erlaubt dem Bakterium in Kolonien zu wachsen, auf einem Medium, welches für das Bakterium toxisch ist, mit Ausnahme für solche, die das Sondensegment und den Selektionsmarker erfolgreich inkorporiert haben.
Nachdem es den bakteriellen Kolonien erlaubt wurde sich zu reproduzieren und man das Plasmid sich auf eine hohe Kopienzahl replizieren ließ, werden Bakterien und Plasmid DNA aus den anderen zellulären Bestandteilen isoliert und die DNA wird Restriktionsenzymen ausgesetzt, um das Sondensegment aus der Plasmid DNA zu schneiden. Die Sondensegmente können isoliert werden durch geeignete Mittel, Elektrophorese einschließend. Die interessierenden Sondensegmente können geeignet sein zur Endmarkierung, um Sonden zu bilden, oder können aus Teilen oder Unterteilen bestehen, welche selbst als Sonden wertvoll sind. Demzufolge wird das größere Sondensegment einen mehrfachen Restriktionsenzymverdau ausgesetzt, um das größere Sondensegment in kleinere Sondensegmente aufzubrechen, welche geeignet sind zur Markierung an den 3'- und 5'-Enden.
Eine Markierung an den 3'-Enden der Sondensegmente oder Subsegmente wird durchgeführt unter Verwendung eines Nukleotids mit einer funktionellen Gruppe, welche zur Umsetzung mit einem aktivierten, Fluorophor in der Lage ist. Das Nukleotid mit der funktionellen Gruppe kann zu den Sondensegmenten hinzugefügt werden, unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyltransferase (TdT). Das Enzym TdT wird lediglich ein oder zwei Basen eines Ribonukleotides zu den Sondensegmenten hinzufügen, wodurch die Addition eines Schwanzes oder einer ausgedehnten Kette von Nukleotiden an die Sondensegmente vermieden werden. Lange Schwänze oder Nukleotidketten können sterische Effekte aufweisen, die den Energietransfer zwischen den Markerteilen ändern können oder ändern oder verschlechtern die Hybridisierung des Sondenstranges mit dem Targetstrang. Markierung an dem 5'-Ende der Sondensegmente wird durchgeführt durch Verknüpfen eines Markerteils an die Sondensegmente unter Verwendung einer bifunktionellen aliphatischen Gruppe. Vorzugsweise kann der Markerteil mit einem aliphatischen Diamin an das Sondensegment geknüpft werden.
Zuerst zu der Markierung eines DNA-Einzelstranges an dem 3'- Terminus, wobei die Reaktion des Hinzufügens eines Nukleotides zu einem DNA-Strang durch die Verwendung des Enzymes TdT geschrieben werden kann:
In der obigen Gleichung, ist p(dx)m ein Oligodesoxynukleotid der Länge in Basen und N ist eine der Basen Adenin, Guanin, Cytidin, Uridin, Thymin oder eine Modifikation davon. Der Buchstabe n bezeichnet die Anzahl von Monomeren, welche zu dem DNA-Strang hinzugefügt werden.
Vorzugsweise wird das Monoiner ein Aininoalkylderivat einer Nukleinsäure einschließen. Die Aminogruppe kann umgesetzt werden mit einer Zahl von fluoreszierenden Mitteln. Besonders bevorzugt schließt das Aininoalkylderivat eine primäre aliphatische Aininogruppe ein. Die Verwendung eines Ribonukleotidmonomers in dem Enzym TdT beschränkt die Addition von Monoinerbasen an den DNA-Strang, n, auf eine oder zwei Basen. M²&spplus; stellt einen Metallionenkofaktor dar. Ein Beispiel eines bevorzugten Ribonukleotidderivates schließt 8-(6-Aminohexyl)-amidoadenosin-5'-triphosphat (AHA-ATP) ein, dessen Struktur unten wiedergegeben ist:
Die Verbindung AHA-ATP schließt eine primäre aliphatische Aininogruppe ein, welche in der Lage ist, eine grobe Reihe von chemischen Reaktionen einzugehen, welche die Addition einer groben Reihe von Fluoreszenzmarkern erlaubt.
Demzufolge wird das 3'-Ende eines DNA-Stranges mit AHA-ATP und terminaler Transferase bei pH 7 wie unten dargestellt, reagieren:
Der sich ergebende Produktstrang schließt eine funktionelle Aininogruppe ein, welche umgesetzt werden kann mit einem Markerteil, wie beispielsweise einem präzipitierenden oder lösenden Mittel, kolorimetrischen Mittel, Lumineszenzmittel, Enzym oder Kofaktor, um eine Sonde mit einem Markerteil herzustellen. Beispielsweise reagiert der Fluorophor Isothiocyanat mit der funktionellen Aminogruppe von AHA-A bei pH 9,3, um einen Sondenstrang zu bilden. Andere aminreaktive Fluorophore schliefen beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung ein: Fluorescein, Isothiocyanat, Sulforhodamin 101, Sulfonsäurechlorid (Texas Red), N-Hydroxysuccinimidylpyrenbutanoat, Eosinisothiocyanat und Erythrosinisothiocyanat. Geeignete Chemilumineszenzmittel und Kofaktoren schliefen ein: Aminreaktive Luminolderivate, Mikroperoxidasen, Acridiniumester, Peroxidasen sowie deren Derivate. Es wird von dem Durchschnittsfachmann erkannt werden, daß fluoreszierende und chemilumineszierende Mittel, welche normalerweise nicht aminreaktiv sind, modifiziert werden können, um aminreaktiv zu sein und als Markerteile gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet zu sein.
Die DNA-Stränge können ebenfalls markiert sein an ihren 3'- Termini durch Trennen des DNA-Stranges mit einem fluoreszierenden Nukleotidderivat, beispielsweise 1-N&sup6;-Ethenadenosin- 5'-triphosphat (EATP) vermittelt durch terminale Transferase (TdT). Jedoch kann die Anwendung von Desoxynukleotiden auf DNA einen Schwanz oder eine Kette erzeugen, welche viele Additionen enthält, die schwierig zu standardisieren sind und welche sterische Effekte bewirken können. Andere- Fluoreszenznukleotidderivate schliefen beispielsweise jedoch ohne Beschränkung ein: 3'-(Dimethylaminonaphthoyl)-ATP oder -CTP und/oder jegliches Nukleotidtriphosphat, welches eine Fluoreszenzheterozyklische Einheit inkorporiert hat.
Die 5'-Enden von Einzelstrang-DNA können in einer Zweischritt Reaktionssequenz markiert werden, unter Verwendung von Ethylendiamin, um die Stränge an dem 5'-Phosphat an ein aktiviertes Fluorophor zu knüpfen, wie in der Reaktion unten dargestellt ist:
Synthetische Polynukleotide werden einen zusätzlichen Schritt erfordern, um die 5'-Hydroxygruppe zu phosphorylieren. Die Phosphorylierung kann durchgeführt werden mit dein Enzym T&sub4;-Kinase vor Schritt (I).
Vorzugsweise ist das Carbodiimid wasserlöslich, beispielsweise einschließend 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propylcarbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimidinetho- p-toluol-sulfat und deren Derivate.
Das Ethylendiaminpolynukleotidderivat weist eine reaktive funktionelle Aminogruppe auf, welche umgesetzt werden kann mit einem Markerteil (II). Die reaktive funktionelle Aminogruppe wird mit Isothiocyanat bei pH 9,3 reagieren, um einen Sondenstrang zu bilden. Geeignete Markerteile für einen Endmarker, beispielsweise einen 5'-Endemarker, werden ausgewählt, um den Markerteil, den 3'-Endemarker, von dem Markerteil des entgegengesetzten Endes zu ergänzen. Geeignete Fluorophore schliefen beispielsweise, ohne Beschränkung ein: Fluoresceinisothiocyanat, Sulforhodamin 101, Sulfonsäurechlorid, (Texas Red), N-Hydroxysuccinimidylpyrenbutanoat, Eosinisothiocyanat, Erythrosinisothiocyanat sowie deren Derivate. Geeignete Chemilumineszenzmittel und Kofaktoren schliefen ein: Luminol, Mikroperoxidase, Glucoseoxidase, Acridiniumester, Lucigenin sowie deren Derivate.
Als nächstes wird das doppelsträngige DNA-Segment umgesetzt mit AHA-ATP, vermittelt durch TdT und umgesetzt mit einem zweiten Fluorophor (D) kovalent an die 3'-Position jedes einzelnen Stränges. Demzufolge wird der erste Fluorophor (A) des einen Sondenstranges so angeordnet, daß er mit dem zweiten Fluorophor des entgegengesetzten Sondenstranges an beiden Termini des DNA-Segmentes wechselwirkt. Die Markerteile, die ersten Fluorophor (A) und die zweiten Fluorophor (D) sind in der Lage zu wechselwirken, um ein Signal zu erzeugen, welches charakteristisch ist für eine der beiden Positionen, welche die Sonde nach Hybridisierung mit dem Target einnehmen kann.
Die vorliegende Erfindung wird weiter verdeutlicht und beschrieben in den folgenden experimentellen Beispielen, welche Merkmale bevorzugter Ausführungsformen exemplifizieren.

Beispiel

A. Materialien

In den vorstehenden Beispielen wurden 1-N&sup6;-Ethenoadenosin- 5'-triphosphat (Natrium), 2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat (Natrium), DNA-Oligogmere und Oligomere, welche an Zellulose immobilisiert wurden, von Pharmacia Biochemicals Inc. in Piscataway, New Jersey gekauft. Die Restriktionsenzyme wuren vom Bethesda Research Laboratories in Gaithersburg, Maryland gekauft. Terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) mit der niedrigen Molekulargewichtsform wurde gekauft bei Life Sciences, Inc. in St. Petersburg, Florida. 8-(6- Aminohexyl)-aminoadenosin-5'-triphosphat (AHA-ATP) wurde gekauft von Sigma Chemicals, Inc. in St. Louis, Missouri. Das Plasmid pSP65 wurde gekauft von Promega Biotech in Madison, Wisconsin. Aminreaktive Fluorophore wurden gekauft von Molecular Probes, Inc., Junction City, Oregon. Alle anderen Reagenzien waren von analytischem Grad oder besser. Synthetische DNA-Oligoinere wurden hergestellt auf einem Biosearch Sam One automatisierten DNA-Synthesizer (San Radael, California) unter Verwendung von Standard Phosphoramaditverfahren und Reagenzien von verschiedenen kommerziellen Quellen, American BioNuclear in Emeryville, California einschließend.
In dem vorliegenden Beispiel schließt der TdT-Reaktionspuffer (2X) 0,4M Kakodylsäure, 0,002M Dithiothreitol, 0,016M Magnesiumchlorid bei pH 7,1 ein. Der Bindungspuffer schließt ein: 1M Natriumchlorid, 0,02 M Kaliumphosphat, monobasisch (KH&sub2;PO&sub4;) bei pH 7,5. Borsäurepuffer schließt ein eine 0,05M Borsäure oder 0,05M Natriumboratlösung, eingestellt auf pH 9,3 unter Hinzugabe von Salzsäure oder Natriumhydroxid. Die Absorpstionsmessungen wurden durchgeführt, um die DNA-Sonden-Zusammensetzung, DNA und DNA-Sondenkonzentrationen sowie der Grad der Basenpaarung in DNA-Schmelzexperimenten (Schmelzkurven) zu bestimmen. Die Absorptionsspektren wurden aufgenommen unter Verwendung eines Cary 17D Absorptionsspektrophotometers (Varian Associates, Palo Alta, California). Zum Messen von Absorptionsänderungen der DNA als eine Funktion der Temperatur, wurde die Temperatur des thermostatisierten Küvettenhalters mit einem Haakemodel A81 gekühlten Wasserbad (Saddle Brook, New Jersey) gesteuert.
Die Extinktionskoeffizienten, welche verwendet werden zum Bestimmen der Homopolymerkonzentration wurden genommen aus der Extinktionskoeffizientensammlung in dem Anhang des Pharmacia Molecular Biologicals-Katalogs. Der Durchschnitt der Extinktionskoeffizienten des Homopolymers und alternierend homopolymerer DNA, in demselben Anhang aufgelistet, wurden verwendet, um die Extinktionskoeffizienten für gemischte Basensequenzen anzunähern, 8,7·10³ 1/mol/Base für einzelstränige DNA und 6,8·10 1/mol/Base für doppelsträngige DNA. Die Extinktionskoeffizienten nicht konjugierter Fluorophore wurden verwendet, um die Fluorophormenge zu bestimmen, welche vorlag in konjugierten DNA-Sonden.
Die Fluoreszenzspektren wurden gemessen und aufgenommen unter Verwendung eines SLM-Models 4800 analogen Spektrofluorometers (SLM-AMINCO Instruments, Urbana, Illinios). Für größere Empfindlichkeit wurde das analoge Spektrofluorometer modifiziert, um eine Photonenzählbestimmung von der Fluoreszenz durchzuführen. Die Modifikationen schlossen ein: Ersetzen des üblichen Detektors, einer Hamamatsu Model R928-Photomultiplierröhre in einem Raumtemperaturgehäuse mit derselben Modelphotomultiplierröhre in einem thermoelektrischen gekühlten Gehäuse (Produkte für research model TE-177RF) gehalten auf ungefähr -30ºC. Strompulse an der Anode der Röhre wurden verstärkt, konditioniert und gezählt unter Verwendung von EG&G ORTEC nuclear instrumentation Modulen. Die Module schlossen ein: ein Model 9301 schnellen Vorverstärker, ein Model 9302 Verstärker-Diskriminator und ein Model 874 quad counter/timer. Hochspannung für die Photomultiplierdynodenkette wurde geliefert durch ein EG&G ORTEC model 478 Netzteil.
Das Countermodul wurde an einen Hewlett Packard 9825 Computer über ein IEEE-488 Interface angeschlossen. Der Computer und das Interface erlaubten, Photonenzählspektren aufzunehmen in Koordination mit Monochromatorscanning und Bezugsdetektormessungen der unmodifizierten Teile des Fluorometers.
Die Temperaturkontrolle wurde aufrechterhalten mit einem SLM-thermostatisierten Küvettenhalter in Verbindung mit einem Haake Model A81 Wasserbad.
Wenn nicht gescannt wurde, wurde die Probenemission im allgemeinen durch einen zweiten Port an dem Fluorometer gemessen, welche anstelle des Emissionsmonochromators Filter verwendet. Für diese Messungen wurde der Photonenzähldetektor eingesetzt. Die Emission aus Proben, welche Fluorescein markierte DNA enthalten, wurde gefiltert durch ein Ditric Optics 3 cavity Interferenzfilter mit Gipfeldurchlässigkeit zentriert bei 520 nm (FWHM=8.2 nm). Fluoresceinproben wurden angeregt bei 490 nm mit der Monochromatorbandbreite eingestellt auf 2 um. Die Fluoreszenzemission als eine Funktion der Zeit wurde aufgenommen unter Verwendung des Countermoduls, welches an einen Hewlett Packard Model 0836 Computer angeschlossen war, welcher es erlaubte Daten der kinetischen Information zu speichern und zu verarbeiten.
Eine Reihe von wohlbekannten Hybridisierungsbedingungen wurden angewendet bei den vorliegenden Prozeduren. Eine allgemeine Referenz für Hybridisierungsbedingungen kann gefunden werden in Meinkoth and Wahl, Analytical Biochemistry, vol. 138, pp 267-284 (1984).
Die folgenden Bedingungen würden bei Durchschnittsfachleuten bei Bedarf angewendet werden. Optimale Hybridisierungsraten werden im allgemeinen erhalten zwischen ungefähr 200 bis 25ºC unterhalb der Schmelzübergangstemperatur. Für eine höhere Bindungskraft werden Hybridisierungen durchgeführt innerhalb von 5º oder 10ºC der Schmelztemperatur. Es wurde herausgefunden, daß das Hinzufügen von Träger-DNA in Form von Lambda-DNA die Stabilität der Sonde bei niedriger Konzentration verbessert. EDTA wurde in manchen Fällen ebenfalls hinzugefügt, um die DNA-Stabilität zu verbessern. Andere Additive wie beispielsweise Konzentratoren oder Beschleuniger können in Hybridisierungslösungen verwendet werden, solange diese für die Größe der Oligomere, welche beim Herstellen der Sonden verwendet werden, wirksam waren und wenn die Fluoreszenzhintergründe durch die Hinzufügung nicht stark anstiegen.
Das allgemeine Verfahren, welches in den Experimenten hierin angewendet wurde, schließt ein einen ersten Schritt - um zuerst das Target und die Sonden-DNA einsträngig zu machen. Dies wurde erreicht durch Erwärmen der Proben, welche Target und Proben-DNA in einem Wasserbad enthalten. Für lange DNA- Targets wird die Probe im allgemeinen im kochenden Wasserbad für etwa 10 Minuten in einem Niedrigsalzpuffer (oder destilliertem Wasser) angeordnet. Die Sonde wird der Probe zugegeben, welche die Target-DNA enthält, oftmals in der Nähe des Endes der Dehybridisierungsprozedur, um eine verlängerte Exposition bei der hohen Temperatur zu vermeiden. Am Ende der Dehybridisierung wird konzentrierter Hochsalzpuffer zugegeben, um die gewünschte Salz- und Pufferkonzentration zur Hybridisierung herzustellen. Kleinere Oligomertargets und Sonden können in dem Kochsalzhybridisierungspuffer bei niedriger Temperatur geschmolzen werden. Gewöhnlich verwendet man 1 M NaCl für die Hybridisierungen; jedoch wird 100 mM ebenfalls in manchen Fällen verwendet, wenn es erwünscht ist, die DNA-Schmelztemperatur zu senken. Die einsträngige Probe, welche das Target und die Sonde enthält, läßt man dann auf die Hybridisierungstemperatur abkühlen und die Fluoreszenzmessungen werden durchgeführt, um das Ausmaß der Fluorophormarkerwechselwirkung zu ermitteln. Die Länge der Hybridisierungsdauer variiert von Minuten, für Proben bei hoher Probenkonzentration, bis zu Stunden für Proben, welche niedrige Konzentrationen an Sonden-DNA enthalten.
Das folgende Beispiel zeigt ein typisches experimentelles Protokoll, zuerst beginnend mit Beispielen, welche die 3'- Endmarkierung von Sondensegmenten beschreiben, sich dann zur 5'-Endmarkierung von Sondensegmenten zuwendend und schließlich sich der Anwendung der endmarkierten Produkte in( einem homogenen kompetitiven Assay zuwendend.

B. 3'-terminale Endmarkierung

Die 3'-Termini der einzelsträngigen DNA wurden in einer Zweischrittreaktion markiert. In dem ersten Schritt wird das Enzym TdT verwendet, um ein einzelnes Nucleotid mit einer reaktiven funktionellen Gruppe an die 3'-Hydroxygruppe jedes DNA-Stranges anzuheften. Der zweite Schritt schließt die Kupplung eines Markerteils an jeden DNA-Strang durch eine Reaktion mit der reaktiven funktionellen Gruppe ein.
Das folgende Protokoll wurde durchgeführt unter Verwendung von einzelsträngigen Homopolymeren von Desoxythymidin mit einer Basenlänge von (dT&sub1;&sub2;) und Homopolymerdoppelsträngen von Polydesoxyadenosin und Polydesoxythymidin, wobei jeder Strang eine Länge von 20 Basen (dA&sub2;&sub0;-dT&sub2;&sub0;), synthetische gemischte Basen-Oligomere und Plasmidfragmente des pSP65 aufweist, welches das Neomycinphospho transferasegenfragment enthält, welches mit den Enzymen Alu I und Hae III geschnitten wurde.
Wenden wir uns nun dem ersten Schritt in größerem Detail zu. In einem konischen Standardgefäß wurden etwa 10 nmole DNA kombiniert mit 25 ul einer 3,3 mM Lösung von AHA-ATP in Wasser und die Probe wurde in einer Zentrifugenvakuumvorrichtung (Speed Vac, Savant) getrocknet. Das Verhältnis der AHA- ATP-Moleküle zu den 3'-terminalen Hydroxygruppen der DNA in der DNA/AHA-ATP-Lösung ist ungefähr 10:1. Zu der DNA-AHA-Lösung werden 30 ul TdT-Reaktionspuffer, 20 3ml Rinderserumalbumin (5 ug Rinderserumalbumin pro Milliliter Wasser), 500 Einheiten TdT und Wasser gegeben, um 70 ul einer Reaktionsmizu bilden. Die Reaktionsmischung wird 18 bis 24 Stunden in einem 37ºC Wasserbad inkubiert. Einzelne Homopolymerstränge werden von dem unumgesetzten AHA-ATP getrennt durch Binden der Homopolymerstränge bei 10º C an komplementäre Homopolymere, welche an Cellulosepartikel immobilisiert wurden, gefolgt vom Waschen der Cellulose bei 20ºC mit Bindungspuffer. Als nächstes wird das Produkt eluiert, von den Cellulosepartikeln befreit, in einem 0,05 M Borsäurepuffer bei pH 9,3.
Homopolymerdoppelstränge, gemischte Basenoligomere und pSP65 doppelsträngige Plasmidrestriktionsfragmente werden getrennt von dem unumgesetzten AHA-ATP durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Sephadex G-25®-Chromatographiemedium und in Wasser oder Borsäurepuffer eluiert oder durch Ionenaustauschsäulen wie beispielsweise eine NACS-Ionenaustauschsäule, hergestellt von Bio-Rad-Laboratorien.
In einem zweiten Schritt, welcher sich insgesamt auf einzelsträngige Homopolymere, gemischte Basenoligomere, Homopolyinerstränge oder doppelsträngige Plasmidfragmente bezieht, wurde ein aminreaktiver Fluorophor kovalent gebunden an die primäre aliphatische Amingruppe des terminalen Aminohexylamino-adenosins, gebildet durch die Reaktion von AHA- ATP mit dem 3'-Terminus jedes DNA-Stranges. Die aminreaktiven Fluorophore schliefen ein: Sulforhodamin 101 (Texas Red), Pyrenbutanoat, Fluorescein, Eosin und Erythrosin, Isothiocyanatderivate, Sulfonsäurechloride und N-Hydroxysucchinimidester. Die aminreaktiven Fluorophore wurden aufgelöst in einem geeigneten nicht-reaktiven lösenden Lösungsmittel, wie beispielsweise Aceton für N-Hydroxysucchiniinidylpyrenbutanoat, Dimethylformamid für Sulforhodamin 101 Sulfonsäurechlorid und Dimethylsulfoxid für Fluoresceinisothiocyanat. Eine 0,01 molare Lösung des Fluorophors wurde tropfenweise zu einer 0,05 molaren Borsäure/Natriumhydroxidpufferlösung bei pH 9,3, welche die AHA-AMP gekoppelten DNA-Stränge enthielt, unter ständigem Rühren zugegeben. Ein 20- bis 200-facher molarer Überschuß an reaktivem Fluorophor über AHA-AMP gekoppelte DNA wurde verwendet, um die Reaktion zu den gewünschten Produkten zu zwingen. Man lieb die Reaktion dann für 16 bis 24 Stunden fortlaufen. Am Ende der Reaktionsdauer wurden die fluorophormarkierten einzelsträngigen Homopolymeren durch Affinitätschroinatographie isoliert. Die fluorophormarkierten doppelsträngigen Homopolymere, gemischten Basenoligomere und Restriktionsfragmente des Plasmids pSP65 wurden isoliert auf NACS-Säulen oder durch Gelpermeationschromatographie wie oben angegeben. Die fluorophormarkierten Homopolymereinzelstränge, gemischten Basenoligomere, Homopolymerdoppelstränge und doppelsträngigen Plasmidfragmente wurden isoliert in Wasser oder Bindungspuffer. Zur Langzeitaufbewahrung wurden die fluorophormarkierten DNA-Lösungen zur Trockene vermindert in einem Zentrifugenvakuumkonzentrator und bei -20º C gelagert.
Als eine Alternative zu der Zweischritt 3'-Markierungstechnik, welche oben angegeben wurde, können Polynukleotide direkt mit fluoreszierenden Nukleotiden markiert werden unter Verwendung des Enzyms TdT. Als ein weiteres Beispiel wurden einzelsträngige Homopolymerstränge an den 3'-Termini markiert mit dem Fluorophor, 1,N&sup6;-Ethenadenosintriphosphat (EATP), einem modifizierten Nukleotid, in einem Verfahren, welches identisch ist mit dem Verfahren zur Addition von AHA-ATP an die 3'-Termini von einzelsträngiger DNA.
Die obigen Verfahren ergaben Fluoreszenzinarkierungsteile, welche an den 3'-Termini der einzel- und doppelsträngigen Oligomere, wie in Tab. 1 unten identifiziert, angeordnet sind. TABELLE 1 3'-terminalmarkierte DNA-Oligomere Oligomer Markierungsverbindung Marker pro Oligomer Fluoresceinisothiocyanat 1,N&sup6;-Ethenoadenosin Sulforhodamin-101-Sulfonsäurechlorid (Texas Red) N-Hydroxysuccinimidylpyrenbutanoat Eosinisothiocyanat Erythrosinisothiocyanat

C. 5'-terminale Endmarkierung

Die 5'-Termini von einsträngigen DNA-Homopolymeren, doppelsträngigen DNA-Homopolymeren und Restriktionsfragmenten von Plasmid-DNA wurden in einer Zweischrittreaktionssequenz markiert. In dem ersten Schritt wurde die 5'-Phosphatgruppe an den DNA-Strang kondensiert mit einem reaktiven difunktionellen organischen Molekül, welches in der Lage ist, die 5'- Phosphatgruppe an einen Markerteil zu knüpfen, gemäß B.C.F. Chu, G.M. Wahl und L. Orgel, Nucleic Acids Research, 11 (18), 6513-6529 (1983). Der zweite Schritt beinhaltet Umsetzen des DNA-Stranges und des reaktiven organischen Moleküls zu dem Markerteil, um einen Sondenstrang zu bilden.
Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß viele Formen von natürlich vorkommender DNA an dem 5'-Terminus phosphoryliert sind. Nicht phosphorylierte DNA erfordert einen anfänglichen Phosphorylierungsschritt unter Verwendung des Enzyms T&sub4;-Kinase, dessen Verfahren und Prozeduren im Stand der Technik wohlbekannt sind. Siehe: Bethesda Research Laboratories product profile für 5'-DNA-Terminusmarkierungssysteme.
Beispielsweise, mit dem ersten Schritt im Detail beginnend, wurde Ethylendiamin mit der terminalen 5'-Phosphatgruppe der einzelsträngigen DNA, den Homopolymerdoppelsträngen und den doppelsträngigen Restriktionsfragmenten des pSP65-Plasinids unter Verwendung des wasserlöslichen Carbodiimids, 1-Ethyl- 3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, kondensiert. Eine Reaktionsmischung wird gebildet mit 50 nmol DNA, aufgelöst in 500 ul Wasser und zusammengemischt mit 500 ul einer Reaktandenlösung 0,5 M Ethylendiamin, 0,2 M Carbodiimid und 0,2 M 2-(N-morpholino)-ethansulfonsäure, eingestellt auf pH 6,0, enthaltend. Die Reaktionsmischung wird über Nacht gerührt für 16 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur.
Ethylendiamin-umgesetzte einzelsträngige DNA-Polymere wurden gereinigt durch Zufügen von Natriumchlorid zu der Reaktionsmischung auf eine einmolare Konzentration und dann Passieren der Mischung durch eine Säule bei 10º C, welche komplementäre, an Cellulose immobilisierte Homopolymere enthält. Die Säule wurde dann mit Bindungspuffer bei 10º C und anschließend bei 20º C gewaschen. Ethylendiamin-umgesetzte DNA-Homopolymere wurden wiedererhalten durch Passieren eines 0,05 M Borsäurepuffers durch die Säule bei Temperaturen im Bereich zwischen 50-65º C.
Homopolymerdoppelstränge, gemischte Basenoligomere und Restriktionsfragmente der Plasmid-DNA wurden gereinigt durch Passieren der ethylendiamin-umgesetzten DNA durch eine Sephadex G-25® Säule und Eluieren mit Borsäure/Natriumhydroxidpuffer. Ein alternatives Reinigungsverfahren beinhaltet Binden der Ethylendiamin-umgesetzten DNA an Bio-Rad-NACS-Säulen in einem Niedrigsalzpuffer und Eluieren in Hochsalzpuffer oder 2,0 M Ammoniumacetat. Proben, welche mit 2,0 M Ammoniumacetat eluiert wurden, wurden getrocknet, um den Salzpuffer zu entfernen unter Verwendung entweder einer Zentrifugenvakuumvorrichtung oder eines Lyophylisators.
In dem zweiten Schritt wird der DNA-Strang, welcher an den reaktiven organischen Teil, Ethylendiamin, gebunden ist, weiter umgesetzt mit einem reaktiven Fluorophor, um einen Sondenstrang zu bilden. Detaillierter wurden aminreaktive Fluorophore, entweder Isocyanatderivate oder N-Hydroxysuccinimidester, aufgelöst in einem geeigneten nicht-reaktiven lösenden Lösungsmittel. Eine 0,01 M Fluorophorlösung wurde tropfenweise unter konstantem Rühren zu einer 0,05 M Borsäurepufferlösung gegeben, welche die Ethylendiamin-umgesetzte DNA bei pH 9,3 enthält. Das reaktive Fluorophor wurde zugegeben in einem 20- bis 200-fachen molaren Überschuß, um die Reaktion zu den gewünschten Produkten zu treiben. Man lieb die Reaktion unter Rühren 16 bis 24 Stunden fortlaufen.
Am Ende der Reaktionsdauer wurde die 5'-Fluorophor-markierte DNA filtriert. Die 5'-Fluorophor-markierte Homopolymereinzelstrang-DNA wurde durch Affinitätschromatographie isoliert. Die 5'-Fluorophor-markierte Doppelstrang-DNA, gemischte Basenoligomere oder markierte Plasmidrestriktionsfragmente wurden auf NACS-Säulen oder durch Gelpermeationschromatographie isoliert. Die 5'-Fluorophormarkierten doppelsträngigen Homopolymere oder Plasinidrestriktionsfragmente wurden dann in Wasser oder Bindungspuffer isoliert. Die 5'-Fluorophor-markierte einsträngige DNA wird wie in Tab. 2 unten ausgeführt, identifiziert: TABELLE 2 5'-terminalmarkierte DNA-Oligomere Oligomer Markierungsverbindung Marker pro Oligomer Fluoresceinisothiocyanat N-Hydroxysuccinimidylpyrenbutanoat Fluoresceinisothiocyanat
Die 5'-terminalmarkierten Homopolymersondenstränge sind in der Lage, an komplementären 3'-terminale Homopolymerstränge zu binden, um einen Doppelstrang zu bilden, in welchem der 3'-Markerteil des einen Stranges in einer Stellung ist, um mit dem 5'-Markerteil des entgegengesetzten Stranges zu wechselwirken. Die 5'- und 3'-Homopolymerdoppelstränge und Plasmidrestriktionsfragmente beinhalten zwei endmarkierte komplementäre Polynukleotidstrangsonden.
Multiple Doppelstrangsonden wurden ebenfalls hergestellt aus synthetischer DNA für E.Coli-Enterotoxingen. Komplementäre Oligomerenpaare wurden synthetisiert und dann markiert. Fünf Oligomerenpaare wurden hergestellt mit Sequenzen, welche fünf unterschiedlichen Bereichen auf dem Genom eines E.Coli- Entertoxingenes entsprechen. Vier Paare enthielten Oligomere, welche 21 Basen lang waren und ein Paar enthielt Oligomere, welche 22 Basen lang waren. Die 10 einzelsträngigen Oligomere wurden zur Markierung in zwei Gruppen eingeteilt. Eine Gruppe enthielt ein Mitglied eines jeden komplementären Paares und die andere Gruppe enthielt die anderen Paarmitglieder. Nichtkomplementäre Stränge wurden gruppiert, um hybridisierte DNA in der terminalen Transferasereaktionsmischung zu vermeiden. Die Enzymaddition eines terminalen Nukleotids ist weniger wirksam, wenn ein Doppelstrang DNA-primer mit glattem Ende verwendet wird.
Die Markierungseffizienz bei dieser Herstellung war nicht so hoch wie diejenige, welche in den vorherigen Doppelstrangsondenpräparationen erhalten wurde, obwohl die Fluoreszenzwelche mit der Hybridisierung verbunden ist, grob genug war, daß sie bei angemessen niedrigen Sondenkonzentrationen bestimmt werden könnte.
Die Homopolymerdoppelstränge, Plasmidrestriktionsfragmente und Toxingensonden werden in Tab. 3, wie auf der folgenden Seite gezeigt, identifiziert. Tabelle 3 An zwei Enden markierte Doppelstränge 5'-Markierung Doppelstrang Markierungsverbindung Marker/Doppelstrang 3'-Markierung Fluorescein-Intensität der nicht-hybridisierten über die hybridisierte Form Fluoresceinisothiocyanat N-Hydroxysuccimidylpyrenbutanoat Eosinisothiocyanat *Plasmid * pSP65 (Promega Biotec. Madison, WI) enthaltend Neomyocinphosphaotransferosegen, geschnitten mit Alu I und HaeIII Enzymen. ** Zu Escherichia Coli-Enterotoxingen komplementäre synthetische Oligomere.
Bezugnehmend auf Tab. 3 inkorporieren die Homopolymerdoppelstränge, gemischten Basenoligomere und Plasmidrestriktionsfragmente sowohl Marker an den 3'-Termini als auch an den 5'-Termini jedes einzelnen Stranges. Die Tabellen 1, 2 und 3 beinhalten eine Anzeige von Markern pro Doppelstrang oder Markern pro Strang als einen Hinweis auf die Effizienz der Markierungsreaktionen. Die Zahl der Marker pro Sonde wurde mittels Absorptionsspektroskopie bestimmt.
Die Markerteile komplementärer Sondenstränge sind in der Lage, wechselzuwirken, wenn die Sondenstränge in einer wechselseitig gebundenen Position, wie grafisch in Fig. 5 illustriert, sind. Fig. 5 zeigt eine Beziehung zwischen Fluorescein-Emission gegen die Temperatur, wenn die Temperatur über den Schmelzpunkt der hybridisierten Sonden verändert wird. Die Sonden beinhalten einen Homopolymerdoppelstrang von Desoxyadenosin und Desoxythymidin mit 12 Basen Länge, welche Markierungsgruppen eines 5'-Fluoresceins bzw. eines 3'-Sulforhodamins tragen. Wie verdeutlicht, stellen gefüllte Kreise und Dreiecke Werte dar, welche erhalten werden, wenn die Temperatur einer Probe, welche Sonden enthält, fallend war. Offene Dreiecks- und Kreisfiguren stellen Werte dar, welche erhalten werden, wenn die Temperatur einer Probe, eine Sonde enthaltend, steigend war. Punkte, welche durch Dreiecke wiedergegeben sind, spiegeln Werte wider, welche korrigiert werden für Temperaturquenching der Fluoreszenzteile. Die Punkte, welche durch Kreise wiedergegeben sind, geben die tatsächlichen Werte wieder. Genauer gesagt, wurden die Schmelzkurvendaten aus Fig. 5 aufgenommen an den A-Proben im Puffer, bestehend aus 1N NaCl und 0,02N Kaliumphophat bei pH 7,5. Die in Fig. 5 auf getragenen Daten wurden erhalten durch Mischen äquimolarer Mengen (0,1 uM) von 5'-Fluorescein-dA&sub1;&sub2; und dT&sub1;&sub2;-Sulforhodamin-3' und Messen der Fluoreszenzemission nach Probenäquilibrierung bei einer Reihe von Probentemperaturen. Die Fluoreszenz des 5'-FluoresceindA12 allein wurde ebenfalls bei denselben Temperaturen gemessen, um die Wirkung der Temperatur auf die Fluorescein- Emission zu bestimmen. Die Daten aus den alleinigen 5'-Fluorescein-dA&sub1;&sub2; - Messungen wurden verwendet, um die Schmelzkurve zu korrigieren, welche an der Zwei-Sondenprobe auf genommen wurde. Sowohl korrigierte als auch unkorrigierte Daten sind aufgetragen.
Wenn die Sonden gekühlt und reassoziiert werden, werden die Fluorescein-Emissionen gequencht, welches zu einem Abfall in der Fluorescein-Signalintensität führt. Wenn die Sonden auf Schmelz- oder Denaturierungstemperatur erwärmt werden, trennen sich die Sonden unter Zerstörung der Wechselwirkung zwischen den Markerteilen. Die Fluorescein-Emissionen werden nicht länger gequencht und die Fluorescein-Emissionen steigen an.
Die Wechselwirkung der Markerteile, wie in Fig. 5 dargestellt, entsprechen den Schmelztemperaturdaten von "unmarkierten" Sonden, wie durch herkömmliche Verfahren zum Messen von DNA-Hybridisierung gemessen wird.
Fig. 6 stellt grafisch die Beziehung zwischen Lichtenergieabsorption bei 260 nM und Temperatur dar, wenn die Temperatur durch die Schmelztemperatur der unmarkierten Sonden verändert wird. Die Sonde, welche in Fig. 6 dargestellt ist, beinhaltet Homopolymere von Desoxyadenosin und Desoxythymidin mit einer Länge von 12 Basen. Punkte auf dem Graphen, welche wiedergegeben sind durch gefüllte Kreise, stellen Ablesungen dar, wenn die Temperatur der Probe abfällt. Offene Kreise stellen Ablesungen dar, wenn die Temperatur der Probe ansteigt. Wenn die Sondentemperatur verändert wird durch die Schmelztemperatur der Sonden, steigt die Absorption bei 62 nM von ungefähr 0,135 auf 0,182 an, aufgrund der Basenpaarbildungsverminderung. Die Schmelztemperatur von unmarkierter DNA, wie durch Absorptionsmessungen bestimmt, ist identisch mit der Schmelztemperatur, welche durch Fluorophor-Wechselwirkungen bestimmt wurde, was anzeigt, daß ein Markieren der DNA nicht mit dem Hybridisierungsprozeß wechselwirkt.
Die Wechselwirkung der Markerteile wird ebenfalls dargestellt in den Tabellen 3 und 4. Tabelle 3 beinhaltet einen Vergleich der Fluorescein-Intensität von markierten hybridisierten Homopolymerkomplexen und Plasmidrestriktionsfragmenten mit unhybridisierten Formen. Das Verhältnis des Signales von unhybridisierten Sonden zu dem Signal einer hybridisierten Sonde kann bis zu 4,1 betragen.
Tabelle 4, ein Vergleich der Fluoreszenzintensität von nicht hybridisierten markierten Sonden über hybridisierte markierte Sonden wird auf der folgenden Seite fortgesetzt: TABELLE 4 Fluorophor-Wechselwirkung in komplementären, einzeln markierten Sonden 5'-markiertes Oligo-dA 3'-markiertes Oligo-dT Oligomer (Länge in Basen) bestimmter Marker Fluoreszenzintensität einer nicht-hybridisierten über eine hybridisierte Form Fluorescein Sulforhodamin Pyrenbutanoat beide Acridin Ethenoadenosin Eosin Erythrosin
In den Tabellen 3 und 4 werden die Fluoreszenzänderungen, wenn das Verhältnis der Fluoreszenz eines oder beider Marker im nicht hybridisierten Zustand zu der Fluoreszenz, welche unter Hybridisierungsbedingungen beobachtet wird, berichtet. Die Daten wurden entweder aus Experimenten erhalten, in welchen die Temperatur verwendet wurde, um den Hybridisierungszustand auszuwählen, aus Experimenten, in welchen die Komplementärsonden zusammen geprüft wurden und dann allein oder aus Experimenten, in welchen die Hybridisierung der Sonden durchgeführt wurde in der Gegenwart oder in Abwesenheit eines groben Überschusses (gewöhnlich 10fach oder mehr) an unmodifizierter komplementärer DNA. In den letzteren Experimenten stellt der grobe Überschuß an Target DNA eine kompetitive Hybridisierungsreaktion zur Verfügung, welche komplementäre DNA-Sonden davor bewahrt, miteinander zu hybridisieren. Vielfachwerte der Fluoreszenzänderungen werden eingegeben für Sondenpaare, für welche unterschiedliche Herstellungen desselben markierten Oligomers geprüft wurden. Tab. 4 enthält Daten, welche erhalten wurden unter Verwendung von Sonden, welche hergestellt wurden durch Einzelmarkieren der Oligomere. Die Zusammensetzungen dieser Sonden sind in den Tabellen 1 und 2 aufgelistet. Die Daten aus Tab. 3 sind abgeleitet von Sonden, welche markiert wurden während sie derart gepaart wurden, daß ein erster Fluorophor an den 5'-Termini jedes Oligomers getragen wird und ein zweiter Fluorophor an den 3'-Termini getragen wird. Im Hybridisierungszustand ist der erste 5'-Fluorophor des einen Stranges in enger Nachbarschaft mit dem zweiten 3'-Fluorophor des Komplementärstranges.
Die Tabellen 3 und 4 zeigen verschiedene Markerkombinationen, welche Anlaß geben, um signifikante Änderungen in der Fluoreszenz von wenigstens einem der beiden Marker zu geben. In einem Energieübertragungsmechanismus vom Typ Forster wird erwartet, daß der Marker, welcher Licht einer längeren Wellenlänge absorbiert und emittiert, Energie empfängt aus dem anderen Marker (Energiedonor) nach Anregung jenes Markers. Dies führt zu einem Quenchen von Emissionen aus dem Energiedonormarker, begleitet von einem Anstieg der Emission aus dem Energieempfangsmarker, wenn jener Marker ein fluoreszierendes Mittel ist. Markerkombinationen, welche ein kompatibles Verhalten mit diesem Mechanismus zeigen, sind Fluorescein/Sulforhodamin 101, Acridin/Sulforhodamin 101, Fluorescein/Ethenoadenosin, Fluorescein/Eosin und Fluorescein/Erythrosin.
Jedoch zeigen die Tabellen 3 und 4 verschiedene Wechselwirkungen, welche sich nicht im Einklang mit einem Mechanismus vom Forster-Typ verhalten. Die Markerzusammensetzungen, welche ein Verhalten zeigen, welches inkonsistent ist mit einem Energietransfermechanismus vom Forster-Typ sind Fluorescein/Pyrenbutanoat und Fluorescein/Acridin.
Auch wenn verschiedene Markerkombinationen ein typisches Energietransferverhalten vom Forster-Typ zeigen, kann der Mechanismus der Wechselwirkung nicht durch Daten bestätigt werden, welche gesammelt werden aus lediglich einem der beiden Marker. In den untersuchten Markerkombinationen war das andere Glied des Markerpaares entweder im wesentlichen nicht fluoreszierend, wenn es an die DNA angehängt wurde (z. B. Acridin) oder zeigte Fluoreszenz, welche im Zustand der Hybridisierung intensitätsdeutlich war. Die Unschärfe in dem Markerwechselwirkungsmodus ist ein Ergebnis der Fähigkeit, zwei Markermoleküle innerhalb eines Kollisionsabstandes voneinander zu bringen. Wenn Kollisionswechselwirkungen erlaubt werden, können die unterschiedlichen Mechanismen des dynamischen Quenchens die beobachteten Wechselwirkungen ausgleichen und dominieren. Nahbereichsdynamische Wechselwirkungen sind auch möglicherweise durchschlagender in der Wirkung als die statischen Gegenstücke.
Manche Fluoreszenzänderungen, welche in den Tabellen 3 und 4 aufgeführt sind, sind größer als jene, welche bei quenchenden und auf Energietransfer basierenden Immunassays beobachtet werden, welche sich auf eine zufällige Markierung von Proteinmolekülen verlassen müssen (d. h. Antikörper und/oder Proteinantigene), um eine oder beide der markierten Spezies herzustellen. Nur eine kleine Markerfraktion kann deshalb in der geeigneten Position für statische oder Kollisionswechselwirkung miteinander in einem Antikörper-Antigenkomplex liegen. Selektive Markierung von DNA-Termini andererseits erlauben die genaue Positionierung von entgegengesetzten Markern derart, daß Kollisionswechselwirkungen erlaubt werden oder statische Wechselwirkungen intensiviert werden durch sämtliche Marker in hybridisierten Sondensträngen.
Die Daten in den Tabellen 3 und 4 zeigen ebenfalls die Notwendigkeit auf, die Art, nach welcher die Marker an die DNA geheftet werden, geeignet auszuwählen. In dem Beispiel, in welchem Fluorescein am 3'-Terminus angeordnet wird und Pyrenbutanoat am 5'-Terminus angeordnet wird, wird wenig, falls überhaupt, Markerwechselwirkung beobachtet, wogegen nennenswerte Wechselwirkung bestimmt wird, wenn Fluorescein am 5'-Terminus angeordnet wird und Pyren am 3'-Terminus angeordnet wird. Dies wurde sowohl mit Homopolymeroligomeren als auch mit restriktionsenzymverdauter Plasmid-DNA beobachtet. Der Unterschied in der Markeranordnung betrifft die unterschiedliche Chemie, welche verwendet wird bei dem Anhängen der DNA an die beiden unterschiedlichen Termini, wobei der 3'-Marker über einen Aminohexylamidoadenosin-Linkerarm angehängt wird, wogegen der 5'-Marker über einen Ethylendiamin-Linker angehängt wird.

D. Kompetitive Assays

Die Reagenzsonden der vorliegenden Erfindung wurden in kompetitiven DNA-Assays angewendet. Die vorliegende Hybridisierungsprozedur ist typisch für Sonden, welche 5'-FluoresceindA&sub1;&sub2; und dT&sub1;&sub2;-Sulforhodamin-3'-Homopolymere beinhalten.
Es wird auf Fig. 7 Bezug genommen, in welcher Lösungen der Sonden und Target-DNA gemischt werden. Die Sondenkonzentration wird festgesetzt auf 0,1 uM und die Targetkonzentration variierte zwischen 0 und 0,5 uM. Die Sonden wurden gemischt mit Target-DNA, genügend Wasser und einem Puffer, um Endkonzentrationen von 1,0 M Natriumchlorid und 0,01 - 0,02 M Kaliumphosphat (monobasisch) bei pH 7,5 zur Verfügung zu stellen, um eine Hybridisierungslösung zu bilden. Die Lösungen wurden erwärmt auf 65º C für 15 Minuten in einem Wasserbad, um eine vollständige Dehybridisierung von Target- und Sonden-DNA zu gewährleisten. Die Proben wurden als nächstes gekühlt auf 10º C für zwei Stunden, um eine kompetitive Hybridisierung auftreten zu lassen.
Fig. 7 verdeutlicht die Beziehung in grafischer Form von Fluoreszenzintensität in relativen Einheiten gegen die Wellenlängen für unterschiedliche Konzentrationen der Targetstränge mit einer fixierten Konzentration von 10&supmin;&sup7; molar Sondendoppelstrang, bestehend aus Fluoresceinisothiocyanat (Fluorescein) -markiertem Desoxyadenosinhomopolymer und Sulforhodaminsulfonsäurechlorid (Sulforhodamin) -markiertem Desoxythymidin-Homopolymer einer Basenlänge von 12. Alle Proben wurden mit Lichtenergie von 300 nm beleuchtet.
Die Peak-Fluoreszenzaktivität bei der geeigneten Wellenlänge von 520 nm variiert mit der Konzentrationsänderung des Targethomopolymers aus Desoxyadenosin und Desoxythymidin mit einer Basenlänge von 12.
Fig. 8 beschreibt die Beziehung von Fluorescein-Emissionen zu den Targetkonzentrationen. Die Punkte des Graphen von Fig. 8 sind die Peak-Werte des Graphen von Fig. 7 unter Verwendung von einer fixierten Sondenkonzentration. Wenn die Targetkonzentration wächst, nimmt das Ausmaß der Fluoresceinquenchung durch Sulforhodamin ab und die Fluorescein- Emissionen steigen an.
Die zuvor vorgestellten Hybridisierungsdaten für das 5'- Fluorescein dA&sub1;&sub2;/dT&sub1;&sub2;-Pyrenbutanoat-3'-System dient dazu, das Konzept eines kompetitiven DNA-Hybridisierungsassays zu demonstrieren, welcher basiert auf wechselwirkenden Markern. Damit es sich um ein nützliches Assay-System handelt, muß sich die Technik jedoch als spezifisch und empfindlich herausgestellt haben.
Die Daten in den Fig. 9 bis 12 dienen dazu, diese Aspekte des Markerwechselwirkungsassays zu demonstrieren. Die Markerspezifität wird gezeigt in Fig. 9 unter Verwendung einer Doppelstrangsonde, der ersten dA&sub2;&sub0;:dT&sub2;&sub0; abgeleiteten Sonde, welche in Tabelle 3 aufgeführt ist.
In diesen Experimenten wurden 50 nM-Lösungen der Sonde gemischt mit unterschiedlichen Konzentrationen von drei unterschiedlichen Target-DNAs in Wasser. Ein Target bestand aus äquimolaren Mengen von dA&sub2;&sub0; und dT&sub2;&sub0;, dem geeigneten Target für die Hybridisierung mit der Sonde. Die beiden nicht komplementären Targets waren Kalbsthymus-DNA und Lambdaphagen- DNA. Die Proben wurden erwärmt für 6 Minuten in einem kochenden Wasserbad und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Proben wurden-dann zur Hälfte verdünnt mit 2X konzentriertem Bindungspuffer, um NaCl- und Kaliumphosphat- Endkonzentrationen von 100 mM bzw. 10mM bei einem pH von 7,5 zu ergeben. Kurz danach wurden die Raumtemperaturfluoreszenzspektren für jede Probe aufgenommen.
Die Fluoreszenzintensitätsdaten, welche in Fig. 9 auf getragen sind, zeigen das erwartete konzentrationsabhängige Verhalten für eine kompetitive Hybridisierung, wenn die korrekte Target-DNA (dA&sub2;&sub0;:dT&sub2;&sub0;) verwendet wurde. Die Target- DNA-Konzentrationen sind in Basenpaaren ausgedrückt aufgetragen, da Targets unterschiedlichen Molekulargewichts verwendet wurden. Die korrespondierende Basenpaarkonzentration von markiertem Sondendoppelstrang, welche in jeder Probe vorlag, war 1 uM (50nM Doppelstrangsonde). Der Mittelpunkt für die Fluoreszenzänderung trat bei ungefähr 1,2 uM dA&sub2;&sub0;:dT&sub2;&sub0; auf, was dem erwarteten 1 u-Wert für eine kompetitive Hybridisierung, in welcher Komplementärtargetstränge mit derselben Affinität zueinander wie für Komplementärsondenstränge erwartet wurde, nahekam. Die gesammelten Daten, welche die nicht komplementäre Target-DNA verwenden (Kalbsthymus und Lambda-DNA) zeigen, daß die Sonde spezifisch ist für das dA&sub2;&sub0;:dT&sub2;&sub0; Target-DNA, da ein Überschuß nichtkomplementärer DNA die komplementären Sondenstränge nicht von einer Hybridisierung untereinander abhält.
Die Empfindlichkeit des Hybridisierungsassays wurde demonstriert durch Durchführen kompetitiver Hybridisierungen bei niedrigen Sondenkonzentrationen. Daten erhalten aus kompetitiven Hybridisierungen unter Verwendung der dA&sub2;&sub0;: dT&sub2;&sub0;-markierten Sonde bei 500 pM, 50 pM und 5 pM-Konzentrationen ist in Fig. 10 vorgestellt. Mit diesen Experimenten wurde die Sonde mit Target-DNA gemischt in Puffer enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM Kaliumphosphat bei pH 7,5. Die Proben wurden dann erwärmt auf 80º C für 10 Minuten, in welcher Zeit man es erlaubte, daß die Temperatur auf 20º C mit einer Geschwindigkeit von 5º C/Std. abfiel. Dies wurde erreicht unter Verwendung eines computergesteuerten Wasserbades. Die Fluorescein-Emission wurde dann für jede Probe bei 20º C gemessen. Die charakteristische sigmoidale Abhängigkeit der Fluorescein-Emissionsintensität als eine Funktion der Targetkonzentration wurde bei jeder Sondenkonzentration beobachtet und der Mittelpunkt der Fluoreszenzintensitätsänderung, welche bei niedrigen Targetkonzentrationen auftrat für Assays, welche niedrige Sondenkonzentrationen verwenden. Für diejenigen Assayserien, welche die niedrigste Sondenkonzentration, 5 pM-Sonde, verwenden, lag der Mittelpunkt für Fluoreszenzänderung etwa bei 20 pM Target. Die in diesen Experimenten verwendeten Proben waren 1 ml an Volumen, da Standard-Halbmikrofluoreszenzküvetten verwendet wurden. Dies entspricht 20 fmol Target-DNA. DNA-Hybridisierungen mittels anderer Techniken werden häufig durchgeführt unter Verwendung von Volumen in der Gegend von 10 ul. Die Probenzellen können ausgelegt sein für Fluorometer, welche ähnliche Volumina zu verwenden erlauben und würden daher zu einem hundertfachen Anstieg der Empfindlichkeit auf 200 amol für den Mittelpunkt der Fluoreszenzänderung führen. Ein großer Empfindlichkeitsanstieg wird nicht erwartet durch weiteres Vermindern der Sondenkonzentration, da in dem vorliegenden Experiment die maximale Fluoreszenzänderung unter Verwendung von 5 pM-Sonden ungefähr dieselbe Größenordnung aufwies wie die Pufferfluoreszenz; mit anderen Worten, war das Signal- Rausch-Verhältnis gleich 1. Der Pufferhintergrund wird abgezogen von den Daten, welche in Fig. 10 dargestellt sind.
Ein Verfahren, welches einen Anstieg der Assay-Empfindlichkeit erlaubt, ist die Verwendung von Mehrfachsonden, welche an unterschiedlichen Bereichen des interessierenden Genoms oder der Genome hybridisieren. Zwei derartige Ansätze wurden untersucht. In dem ersten Ansatz wurden Mehrfachdoppelstrangsonden hergestellt aus natürlicher DNA durch die Verwendung von Restriktionsenzymen. Das Neomycinphophortransferasegen wurde in ein pSP65-Plasmid (Promega Biotech, Madison, Wisconsin) inseriert und das Plasmid in Escherichia coli vermehrt. Einige Milligramm des Plasmids wurden dann aus E.coli-Kulturen isoliert und die Plasmid-DNA wird mit zwei Restriktionsenzymen, Alu I and Hae III behandelt. Dies erzeugte ungefähr 37 Doppelstränge mit glattem Ende pro Plasmid, deren Größe im Bereich von etwa 6 Basenpaaren bis zu 600 Basenpaaren liegt (aus DNA-Sequenzanalysen). Die Sammlung der Doppelstränge wurde dann markiert unter Verwendung der üblichen 5'- und 3'-Markierungstechniken, wie durchgeführt, wenn man die dA&sub2;&sub0;:dT&sub2;&sub0;-Sonden markiert. Das Neomycinphosphortransferasegen wurde nicht zuerst frei von dem pSP65-Plasmid isoliert, wie allgemein erwünscht wäre, um diese anfängliche Studie zu vereinfachen. Verschiedene markierte Präparationen dieses restriktionsgeschnittenen Plasmids sind in Tab. 3 aufgelistet.
Die Fig. 11 stellt Daten dar aus einer kompetitiven Hybridisierung, durchgeführt unter Verwendung der ersten Plasmidpräparation, aufgelistet in Tab. 3 an Sonden unterschiedlicher Konzentrationen aus ungeschnittenem pSP65-Plasmid, enthaltend das Neomycinphosphortransferasegen. Die Plasmidsonde lag bei einer Konzentration vor, welche 2,7 pM des gesamten Plasinides entspricht (100 pM der gesamten markierten Doppelstränge). Sonden und Target-DNA in Wasser wurden angeordnet in einem kochenden Wasserbad für 12 Minuten und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen mit der Zugabe von zweifach konzentriertem Bindungspuffer, um Endkonzentrationen von NaCl und Kaliumphosphat von 1 M bzw. 10 mM zu ergeben.
Die Fluorescein-Emission wurde aufgenommen bei unterschiedlichen Zeiten für jede Probe. Die Daten, welche in Fig. 11 aufgetragen sind, entsprechen der Fluoreszenz, gemessen bei 1,5 und 5 Stunden, wie angezeigt. Von beiden Fluoreszenzwertreihen ist gezeigt, daß sie abfallen mit ansteigender Targetkonzentration, wie erwartet.
Der Targetkonzentrationsbereich, der untersucht wurde, war nicht grob genug, um den vollen Bereich der Fluoreszenz-Variation mit der Temperatur zu zeigen, jedoch zeigt das Assay eine Empfindlichkeit von wenigstens einigen Pikomolen, welches der entsprechenden Sondenkonzentration entspricht, welche in diesem Assay verwendet wurde. In einer hypothetischen 10 ul-Probe entsprechen mehrere pikomolare Targets ungefähr 30 amol. Die Fluorescein-Emissionsintensität war mehr als eine Größenordnung größer als die Hintergrundfluoreszenz in diesem Experiment.
Hybridisierungen werden als schwierig erwartet für eine heterogene Sondenpopulation in bezug auf Sondenlänge und den logischerweise weiten Bereich der Schmelztemperaturen, die sich ergeben aus zufälliger Restriktionsdarstellung der Plasmide. Es wäre daher günstig, eine vorsichtige Auswahl an Restriktionsenzymen zu verwenden, um Sondenpopulationen mit soweit wie möglicher homogener Größe zu erzeugen. Neue Restriktionsstellen können in das Genom eingebracht werden, um solch eine homogene Population aus klonierter DNA zu erzeugen.
Wendet man sich Fig. 12 zu, welche einen Assay für E.Coli- Enterotoxingen zeigt, wurde Target-DNA zusammengesetzt aus dem Enterotoxingenfragment von ungefähr 1000 Basenpaaren Länge mit 14 ug von Lambda-DNA (Träger-DNA) in 700 ul eines Puffers gemischt, welcher ein mM EDTA und 10 mM TRIS bei pH 7,5 enthält. Diese Lösung wurde angeordnet in einem kochenden Wasserbad für 12 Minuten, nach welcher Zeit die Doppelstrangsonden DNA, welche in Tab. 3 als "TOXIN" identifiziert ist, zugegeben, und die Lösung wieder in dem kochenden Wasserbad für zusätzliche 2 Minuten angeordnet wurde. Die Lösung wurde dann zu 700 ul von 2X NaCl/Phosphatpuffer in einer Fluoreszenzküvette gegeben, welche innerhalb des thermostatisierten Küvettenhalters des Fluorometers enthalten ist und bei 42ºC (25ºC unterhalb der Sondenschmelztemperatur) gehalten wird. Die Endkonzentrationen von Lambda-DNA, Natriumchlorid und Kaliumphosphat waren 10 ug/ml, 1 M bzw. 0,01 M.
Die Fluoreszenzintensität wurde gemessen in einer anderen Art als bei den vorherigen Experimenten. Die Fluoreszenzwerte wurden kontinuierlich mit der Zeit aufgenommen unter Verwendung eines Computers, welcher an die Detektorelektronik angeschlossen war (siehe Material- und Methodenabschnitt). Die Daten, welche in dieser Art gesammelt wurden, sind in Fig. 12 für Beispiele gezeigt, welche unterschiedliche Konzentrationen des Enterotoxintargets enthalten. Durch Aufnehmen von anfänglichen und Fluoreszenzendewerten wird eine Fluoreszenzänderung erhalten, welche unabhängig ist von den Hintergrundlichtniveaus, welche zwischen den Proben variierbar sein können. Die Datenspuren in Fig. 12 wurden versetzt, so daß jede Datenreihe dieselben anfänglichen Fluoreszenzwerte enthält. Die Wirkung davon ist es, die Hintergrundvariation von Probe zu Probe auszulöschen. Die Fluoreszenzänderung jeder Probe wird auf die vorliegende Target- DNA-Menge bezogen. Die niedrigste bestimmbare Targetkonzentration wurde als 4 pM gezeigt. Eine hypothetische 10 ul-Probe würde deshalb 40 amol Target bei dieser Konzentration enthalten. Ein zweiter Vorteil des kontinuierlichen Aufnehmens der Fluoreszenzintensität mit der Zeit ist, daß kürzere Hybridisierungszeiten verwendet werden können, da die Zeitabhängigkeit der Fluoreszenzänderungen angepaßt werden kann durch kinetische Gleichungen, welche eine Extrapolation der Gleichgewichtsdatenwerte erlauben. Der relative Grad der Fluoreszenzänderungen kann bei Zeiten unter 2 Stunden differenziert werden für die Experimente, welche in Fig. 12 gezeigt werden.
Obwohl die vorhergehenden Beispiele individuelle Fluorophore nennen, würde die vorliegende Erfindung auf andere aminreaktive Fluorophore und Chemilumineszenzmittel anwendbar sein. Aminreaktive Fluorophore beinhalten beispielsweise das zuvor erwähnte Fluorescein, Pyren, Acridin, Sulforhodamin, Eosin, Erythrosin und deren Derivate. Aminreaktive chemilumineszente Mittel beinhalten beispielsweise Mikroperoxidase, Luminol, Isoluminol, Glucoseoxidase, Acridiniumester und deren Derivate.
Chemilumineszenzmittel können angewendet werden auch für den vorliegenden Assay in Verbindung mit einem Fluorophor, in welchem der chemilumineszente Markerteil einer Sonde wechselwirken würde mit einem Fluorophor einer zweiten komplementären Sonde. Die Fluorophore würden die Emissionen des chemilumineszenten Mittels quenchen, bis die Markerteile sich trennen. Geeignete Chemilumineszenzkofaktoren würden angewendet werden auf das Probenmedium, um die lichtemittierenden Reaktionen zu initiieren. Wenn das Target im Wettbewerb steht mit den Sonden um die Bindungsstellen, würden die Markerteile getrennt werden, wobei dem Chemilumineszenzmittel oder -teil erlaubt werden würde, ungequencht zu sein und in der Lage zu sein, ein Signal zu erzeugen, welches bestimmt werden könnte.
Ein Chemilumineszenzmittel könnte ebenfalls angewendet werden in der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit Chemilumineszenzkofaktoren. Demnach würde ein Chemilumineszenzmarkerteil einer ersten Sonde mit einem Chemilumineszenzkofaktormarkerteil einer zweiten Komplementärsonde wechselwirken. Das System würde Licht einer bestimmten Intensität emittieren. An der Stelle, an welcher Target vorliegt, würde das Target mit den Sonden konkurrieren, wodurch sich die ersten und zweiten Sonden und die Markerteile trennen, und wobei die Lichtemission des Systems vermindert würde.
Fluorophormarkierte Sonden können verwendet werden bei zeitaufgelösten Assay-Prozeduren, um Hintergrundfluoreszenz zu begrenzen. Demnach könnte ein Lichtpuls eingeführt werden bei einer Wellenlänge, hinreichend, um einen ersten Fluorophor anzuregen. Die ersten Fluorophore übertragen die Energie auf einen zweiten Fluorophor. Der Energietransfer von einem ersten Fluorophor auf einen zweiten Fluorophor und die Energieemission durch den zweiten Fluorophor ist ein langsamer Prozeß relativ zur direkten Fluoreszenz. Der erste Fluorophor kann ausgewählt werden, um eine lange Emissionshalbwertszeit zu haben, um den Energietransferprozeß zu verlängern. Die Probe kann untersucht werden auf die Lichtenergie aus dem zweiten Fluorophor nach dem Puls, nachdem die direkte Fluoreszenzaktivität, welche durch den Puls initiiert wurde, beendet ist und während des Intervalls, in welchem übertragene Energie durch den zweiten Fluorophor emittiert werden würde. Nur solche Fluoreszenzgruppen würden eine Emission erzeugen, welche untersucht werden könnten, welche in einer Position sind, um Energie zu übertragen. Lediglich Markerteile komplementärer Sonden in einer Stelle, um zu wechselwirken, würden detektierbare Signale aufweisen, wodurch die Hintergrundemission vermindert würde.
Demzufolge weist die vorliegende Erfindung die Merkmale eines homogenen nichtradioaktiven Assays auf. Aufgrund der homogenen Natur des vorliegenden Assays können Assays innerhalb kürzerer Zeiten durchgeführt werden. Die Verwendung nichtradioaktiver Marker erlaubt, daß die Assays durchgeführt werden können ohne spezielle Genehmigungen und vereinfacht die Assaytechniken und Herstellungstechniken.

Claims

1. Ein Verfahren zum Untersuchen einer Probe auf Targetpolynukleotide, die folgenden Schritte umfassend:

(a) Inkontaktbringen der Probe mit Reagenz unter Bindungsbedingungen, wobei das Reagenz einschließt eine erste Polynukleotidsonde und eine zweite komplementäre Polynukleotidsonde, wobei die ersten und zweiten Sonden in der Lage sind, eine erste Position einzunehmen, worin die ersten und zweiten Sonden fähig sind, einen Doppelstrang zu bilden und wenigstens eine der Sonden in der Lage ist, eine zweite Position einzunehmen, worin wenigstens eine Sonde an das Target gebunden wird und mit dem Target einen Doppelstrang bildet, wobei die ersten und zweiten Sonden einen ersten Markerteil einschließen, verbunden mit einer der Sonden und einen zweiten Markerteil einschließend, verbunden mit der Komplementärsonde, wobei die ersten und zweiten Markerteile in der Lage sind, zu wechselwirken, wenn die ersten und zweiten Sonden einen Doppelstrang bilden, um ein spezifisch bestimmbares Signal zu erzeugen, welches charakteristisch für die Sonde in einer der beiden Positionen ist, und

(b) Überwachen der Probe für das spezifisch bestimmbare Signal, welches charakteristisch ist für die Sonde in einer der beiden Positionen.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin der erste Markerteil an einem 3'-Ende einer der Sonden angeordnet ist und der zweite Markerteil an dem 5'-Ende der Komplementärsonde angeordnet ist.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin jede Sonde eine Mehrzahl von Markerteilen aufweist.

4. Das Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin jeder Markerteil an den Enden der Sonden angeordnet ist.

5. Das Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin der erste Markierungsteil an die Sonde gebunden ist durch ein Aminoalkylderivat einer Nukleinsäure.

6. Das Verfahren nach Anspruch 5, worin das Derivat ein Aminoalkylderivat des Adenins einschließt.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, worin das Derivat ein Aminohexylderivat des Adenins einschließt.

8. Das Verfahren nach Anspruch 6, worin das Derivat ein 8-(6-Aminohexyl)-aminoadenosin-5'-monophosphat einschließt.

9. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, worin der Markerteil an dem 3'-Ende ein fluoreszierendes Derivat einer Nukleinsäure ist.

10. Das Verfahren nach Anspruch 9, worin der Markerteil ein Derivat des 1-N&sup6;-ethenoadenosin-5'-monophosphats einschließt.

11. Ein Verfahren zum Verbinden eines aminreaktiven Teils mit dem 3'-Ende eines Polynukleotids, die folgenden Schritte umfassend:

(a) Umsetzen des Polynukleotids mit einem Aminoalkylderivat einer Nukleinsäure in Gegenwart des Enzyms terminale Transferase unter Reaktionsbedingungen;

(b) Umsetzen der Aminogruppe des Aminoalkylderivates mit dem aminreaktiven Teil.

12. Das Verfahren nach Anspruch 11, worin das Aminoalkylderivat ein Aminoalkylderivat des Adenins einschließt.

13. Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, worin das Aminoalkylderivat ein Ribonukleotid ist.

14. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 13, worin das Aminoalkylderivat 8-(6-Aminohexyl)-aminoadenosin-5'-triphosphat einschließt.

15. Ein Verfahren zum Herstellen von Polynukleotiden, eine erste Polynukleotidsonde und eine zweite komplementäre Polynukleotidsonde einschließend, wobei die erste und zweite Sonde in der Lage sind, eine erste Position einzunehmen, worin die ersten und zweiten Sonden fähig sind, einen Doppelstrang zu bilden, und wenigstens eine der Sonden in der Lage ist, eine zweite Position einzunehmen, worin wenigstens eine Sonde gebunden wird und einen Doppelstrang mit einem Target bildet, wobei die ersten und zweiten Sonden einen ersten Markerteil einschließen, verbunden mit einer der Sonden und einen zweiten Markerteil einschließen, verbunden mit der Koinplementärsonde, wobei die ersten und zweiten Markerteile in der Lage sind, zu wechselwirken, wenn die ersten und zweiten Sonden einen Doppelstrang bilden, um ein spezifisch bestimmbares Signal zu erzeugen, welches charakteristisch ist für die Sonde in einer der beiden Positionen, wobei umfalt werden: Spleißen von Polynukleotidsegmenten mit Basensequenzen, welche im wesentlichen identisch sind mit den Targetsequenzen, in Verstärkermittel, um vielfache Kopien des Polynukleotidsegments zu bilden, Isolieren der Segmente und Verbinden der Markerteile mit den Enden der Segmente, um Sonden zu bilden.

16. Das Verfahren nach Anspruch 15, worin die Verstärkungsmittel Plasinide und Phagenpartikel einschließen.

17. Das Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin die Segmente nach Isolierung einem Restriktionsverdau ausgesetzt werden, um weitere Subsegmente zu bilden, und die Subsegmente werden mit den Markerteilen verbunden, um Sonden zu bilden.

18. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17, worin der erste Markerteil verbunden ist mit den 3'-Enden durch Umsetzen der Segmente mit einem Aminoalkylderivat eines Nukleotids in Gegenwart von terminaler Transferase unter Reaktionsbedingungen und Umsetzen der Aminoalkylgruppe mit einem Markerteil.

19. Das Verfahren nach Anspruch 18, worin ein zweiter Markerteil verbunden wird mit den 5'-Enden durch Umsetzen der Segmente mit einem bifunktionellen Alkylamin, um ein Segment mit einer Aminoalkylgruppe zu bilden und anschließendem Umsetzen eines zweiten Markerteiles mit der Aminoalkylgruppe.

20. Ein Kit zum Untersuchen einer Probe auf Targetpolynukleotide, ein Reagenz umfassend, worin das Reagenz eine erste Polynukleotidsonde und eine zweite Komplementärpolynukleotidsonde einschließt, wobei die ersten und zweiten Sonden in der Lage sind, eine erste Position einzunehmen, worin die ersten und zweiten Sonden in der Lage sind, einen Doppelstrang zu bilden und wenigstens eine der Sonden in der Lage ist, eine zweite Position einzunehmen, worin wenigstens ein Sondenstrang gebunden wird und einen Doppelstrang mit einem Target bildet, wobei die ersten und zweiten Sonden einen ersten Markerteil einschließen, welcher mit einer der Sonden verbunden ist und einen zweiten Markerteil einschließen, welcher mit der Komplementärsonde verbunden ist, wobei die ersten und zweiten Markerteile in der Lage sind, mit den ersten und zweiten Sonden zu wechselwirken, wenn die ersten und zweiten Sonden einen Doppelstrang bilden, um ein spezifisch bestimmbares Signal zu erzeugen, welches charakteristisch ist für eine Sonde in einer der beiden Positionen.

21. Der Kitt nach Anspruch 21, worin wenigstens eine der Sonden und/oder Markerteile definiert ist wie in irgendeinem der Ansprüche 2 bis 9.

22. Ein Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, durchgeführt in einer Vorrichtung mit:

(a) Kammermitteln, ausgelegt zum Aufnehmen von Reagenz und Probe;

(b) Mitteln zum Anregen einer der Markerteile;

(c) Mitteln zum Bestimmen des spezifisch bestimmbaren Signales.

23. Das Verfahren nach Anspruch 22, worin die Markerteile Fluorophosphore sind und die Mittel zum Anregen eines der Markerteile eine Lichtquelle einschließen.

24. Das Verfahren nach Anspruch 22, worin wenigstens einer der Markerteile ein Chemilumineszenzmittel ist und daß Mittel zum Anregen der Markerteile Mittel einschließt zum Einführen von Chemilumineszenzkofaktoren in die Kammer.

25. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 22 bis 24, worin die Bestimmungsmittel einen Lichtdetektor einschliefen.