DE3783643T2

DE3783643T2 - Anheftende biomaterialien fuer die adhaesion von zellen und geweben.

Info

Publication number: DE3783643T2
Application number: DE8787105672T
Authority: DE
Inventors: Christine V Benedict; Paul T Picciano
Original assignee: Discovery Labware Inc
Current assignee: Discovery Labware Inc
Priority date: 1986-04-25
Filing date: 1987-04-16
Publication date: 1993-05-13
Anticipated expiration: 2007-04-17
Also published as: FI871728A7; EP0243818B1; NO174675C; DK171996B1; EP0243818A3; FI91037C; NO871665L; NO871665D0; DK205287A; NO174675B; US5108923A; EP0243818A2; FI871728A0; JPH0779695B2; JPS6339583A; FI91037B; AU7188587A; CA1328237C; AU597647B2; DK205287D0

Description

Hintergrund der Erfindung:

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von bioadhäsiven polyphenolischen Proteinen zur Förderung der Adhäsion (Anhaftung) von Zellen, Geweben und anderen biologisch aktiven Komponenten auf verschiedensten Substraten. In diesem Zusammenhang hat "Bioadhäsiv" die Bedeutung eines Adhäsives, das kompatible ist mit Stoffwechsel, Wachstum, oder Funktion von lebendem Gewebe, lebenden Zellen und anderen biologisch aktiven Komponenten in vitro oder in vivo. Bioadhäsive polyphenolische Proteine leiten sich ab von der Aminosäure-Sequenz von sich wiederholenden Dekapeptiden mit der Formel
wie sie in dem US - Patent Nr. 4 585 585 mit dem Titel "Decapeptides Produced From Bioadhesive Polyphenolic Proteins" beschrieben ist. Bioadhäsive, die aus den sich wiederholenden Dekapeptiden hergestellt sind, sind von Vorteil, da sie, wie jetzt gefunden wurde, Zellen und andere biologisch aktive Komponenten wie Proteine, Desoxyribonukleinsäuren (DNS), Hormone und Antibiotika befähigen, sich an nahezu jedes Substrat anzuheften.
Anwendungen in vitro umfassen Forschungsdiagnostika, Gewinnung von Zellprodukten und Untersuchungen des Zellstoffwechsels. Anwendungen in vivo umfassen die Produktion von geschlossenen Zellmonolayern auf der Oberfläche von Prothesen, insbesondere kardiovaskulären Prothesen.

Stand der Technik:

Die Gewinnung von Zellen aus Geweben zur Erhaltung und Vermehrung in vitro mittels Gewebekultivierung ist ein Hauptinstrument in der medizinischen und biochemischen Forschung. Gewebekultivierung ist die Technik oder der Prozeß, den Stoffwechsel von Geweben oder Zellen die aus Organismen (Pflanze oder Tier) stammen, in einer zubereiteten nährstoffhaltigen Umgebung zu steigern und/oder zu unterstützen. Im Anschluß an eine schonende Gewebedissoziierung werden die isolierten Zellen in einem Nährmedium inkubiert, das geeignet ist, die Lebensfunktionen der Zellen zu unterstützen. Von einigen Ausnahmen abgesehen, benötigen Zellen zur Durchführung ihrer normalen Stoffwechselfunktionen, für Wachstum und Zellteilung ein Substrat, an dem sie anhaften können. Im Gewebe stellt dieses Substrat die Grundsubstanz (Matrix) für das Zellwachstum dar und besteht aus Kollagen, Laminin und Fibronectin. In vitro ist dieses Substrat meistens Plastik, wenngleich auch gelegentlich Glas und mikroporöse Zellulosefllter als Ersatzstoffe verwendet werden. Beispiele für die Verwendung von Zellen, die in Gewebekultur produziert wurden, umfassen: (1) die Untersuchung des Zellstoffwechsels, des Stoffwechsels von Parasiten (d.h. Viren, Bakterien usw.) innerhalb der Zellen, des interaktiven Stoffwechsels von verschiedenen Zelltypen (d.h.: Epithelzellen, Fibroblasten, immunkompetente Zellen, Thymuszellen, Blutplättchen, u.s.w.), des Einflusses exogener Faktoren auf den Zellstoffwechsel, der genetischen Zusammensetzung von Zellen ( in vitro Diagnosen ); (2) die Produktion spezifischer Komponenten, d.h. Gene, Proteine oder anderer zellulärer Komponenten, und (3) die Reimplantation von Zellen als Haut, Cornea-Transplantate, Gehirn, Gefäß-Transplantate und in vitro Fertilisation.
In den letzten Jahren wurden Kollagen, Laminin und Fibronektin aus tierischem Gewebe extrahiert und gereinigt und den Zell- und Gewebekulturforschern als zelluläre Adhäsionsförderstoffe auf dem Markt angeboten. Synthetisches Poly-D-Lysin und Poly-L-Lysin wurde ebenfalls für solche Zwecke vorgeschlagen. Der primäre Grund dafür ist, daß in vitro Substrate wie Plastik oder Glas biologisch inert sind und häufig keine ausreichenden Substratbindungseigenschaften für eine befriedigende Zell- oder Gewebeanhaftung aufweisen. Charakteristische Anschauungsbeispiele für schlechte Anhaftungsfähigkeit sind unter anderem frisch isolierte Zellen (Primärzellisolate), Zellen, die mit geringer Dichte ausgesät sind und Zellen, die in kontinuierlichen Fließsystemen wie Bioreaktoren oder Kapillarkultursystemen ausgesät sind. Darüberhinaus erlauben bestimmte Substrate, wie einige mikroporöse Filter oder Teflon materialien für Gefäßtransplantate aufgrund ihrer niedrigen Oberflächenenergie keinerlei Zellanhaftung.
Obwohl adhäsionsfördernde Stoffe merklich bei der Bekämpfung von Anhaftungsproblemen geholfen haben, bleiben einige nennenswerte Unzulänglichkeiten. Erstens: Ihre Wirkungsweise basiert auf dem Umstand, daß diese Faktoren, obwohl physiologischen Ursprungs, nicht wirklich adhäsiv sind; sie liefern lediglich eine physikalische Unterlage und Aufnahme für die Zellen. Zweitens: Sie können nicht ohne weiteres auf einer Vielzahl anderer als den herkömmlich in Zellkulturen verwendeten Substraten angewendet werden (z.B.: Polystyrol, Nitrocellulose) und nicht jeder kann mit gleicher Wirksamkeit für alle Zelltypen angewendet werden. Drittens: Einmal in Gebrauch genommen (rekonstituiert), haben die meisten dieser Faktoren eine Haltbarkeitsdauer von etwa 4 Wochen bei -20ºC. Viertens: Mit Ausnahme von Poly-D-Lysin und der Poly-L-Lysin müssen diese Faktoren aus biologischem Ausgangsmaterial gewonnen werden, sie können nicht zu wirtschaftlich akzeptablen Kosten synthetisiert werden. Fünftens: Bei bestimmten zellulären Adhäsionsförderstoffen taucht ein erkennbares Gesundheitsrisiko auf, wie zum Beispiel bei der Extraktion von Fibronektin aus menschlichem Blut.
Für in vivo Anwendungen werden geschlossene Zellmonolayer auf Prothesen, insbesondere kardiovaskulären Prothesen benötigt. Normalerweise kleiden endotheliale Zellen das Lumen solcher Gefäße aus und verhindern die Entstehung von Thrombosen, einem Hauptproblem bei der Behandlung von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen. Diese Zellen produzieren außerdem Grundmembranmaterial, die Matrix für weitere Wundheilung. Gegenwärtig sind solche Prothesen aus Teflon hergestellt, einem Substrat, das die Zellanhaftung nicht unterstützt. Kein anderer bekannter Anhaftungsfaktor vermittelt die Anhaftung von Zellen an Teflon .
Die Verwendung von bioadhäsiven polyphenolischen Proteinen beseitigt diese Probleme. Sie haften gut auf zahlreichen Substraten in Gegenwart von Wasser und verlieren nicht an Wirksamkeit in einer konstant feuchten Umgebung. Als echtes Adhäsiv haftet sich bioadhäsives polyphenolisches Protein schnell sowohl an das Substrat als auch an die verschiedensten Zellen, Gewebe und anderen biologisch aktiven Komponenten oder Substanzen. Es kann bei 4ºC für mindestens 10 Monate und bei Raumtemperatur mindestens 1Monat ohne einen Abbau (Degradation) oder Funktionalitätsverlust aufbewahrt werden. Darüberhinaus kann es mittels "solid phase peptid synthesis" hergestellt werden, oder mit Hilfe einer gentechnologischen Methode, was eine höhere Standardisierung größerer Mengen erlaubt.
Die sich wiederholende Dekapeptidstruktur von bioadhäsiven polyphenolischen Proteinen, die aus der marinen Miesmuschel stammen, ist in dem US-Patent Nr. 4 585 585 "Decapeptides Produced from Bioadhesive Polyphenolic Proteins" beschrieben. Zubereitungen der bioadhäsiven polyphenolischen Proteine und Methoden zur Gewinnung bioadhäsiver polyphenolischer Proteine sind Gegenstand von parallel anhängigen Patentanmeldungen. Methoden zur chemischen Darstellung bioadhäsiver polyphenolischer Proteine sind Stand der Technik (Waite & Tanzer, 1981, Science 212, 1038).
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Präparationen zu schaffen, die als Adhäsionsfaktoren geeignet sind zur Unterstützung oder Steigerung von Anhaftungsfähigkeit, Geschwindigkeit und/oder Stärke der Adhäsion, Wachstum und spezifischer Funktionen von Zellen an Zellkultur- oder Nicht-Zellkultur-Materialien und Substraten wie Plastik, Glas, Metallen, mikroporösen Filtern (aus Zellulose, Nylon, Glasfaser, Polyester, Polykarbonat, Polyethylenterephthalat und anderen synthetischen oder nicht-synthetischen Materialien, inklusive anderer Materialien aus synthetischen Polymeren und durch Modifikation aus den vorgenannten synthetischen Polymermaterialien hervorgegangenen Produkten) und synthetisches oder alloplastisches Material, das in Geweben oder Verfahren zur Implantation von Prothesen (z.B.: künstliches Herz und Polytetrafluorethylen und verwandte Materialien für Gefäßimplantate).
Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Präparationen, die als Adhäsionsfaktoren geeignet sind, um Anhaftungsfähigkeit, Geschwindigkeit und/oder Stärke der Adhäsion von anderen biologisch aktiven Substanzen wie Proteinen, DNS, Hormonen und Antibiotika an eine Vielzahl von Substraten, von denen einige oben genannt sind, zu unterstützen oder zu steigern.
Eine dritte Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung oder Beschichtung von Substraten mit bioadhäsiven polyphenolischen Proteinen und die Bereitstellung von Testsystemen zur Untersuchung der Wirksamkeit dieser Beschichtungen anhand der vorgenannten Parameter.

Zusammenfassung

Die vorgenannten und andere Aufgaben, Vorteile und Merkmale dieser Erfindung sind in der vorliegenden Erfindung vereinigt, die ein Verfahren zur Befestigung lebender Zellen, Gewebe und anderer biologisch aktiver Substanzen wie Proteinen, DNS, Hormonen und Antibiotika an einem Substrat schafft, bei dem:
(1) ein Substrat mit einer sterilen Zubereitung beschichtet wird, die polyphenolisches Protein enthält, das etwa 35 bis 100 Gewichtsprozent reines bioadhäsives polyphenolisches Protein enthält mit der sich wiederholenden Dekapeptideinheit
wobei N eine ganze Zahl von etwa 10 bis etwa 100 ist, wobei jedes X unabhängig aus der aus Hydroxyl und Wasserstoff bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und wobei jedes R unabhängig aus der aus Wasserstoff und Methyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
(2) die Beschichtung auf dem Substrat getrocknet wird;
(3) die Beschichtung auf dem Substrat fixiert wird;
(4) das beschichtete Substrat gespült wird, um nicht fest an dem Substrat anhaftendes fremdes Material zu entfernen; und
(5) lebende Zellen, Gewebe oder andere biologisch aktive Komponenten oder Substanzen auf das beschichtete Substrat aufgetragen werden, wodurch diese Komponenten oder Substanzen an dem beschichteten Substrat befestigent werden. Konzentrationen und Zubereitungen des bioadhäsiven polyphenolischen Proteins können verändert werden in Anpassung an den Substrattyp oder die Anheftungsbedingungen der verwendeten speziellen Zellen, des Gewebes oder der biologisch aktiven Komponente oder Substanz. Wenn lebende Zellen befestigt werden, ist die Anwesenheit einer nährstoffhaltigen Umgebung notwendig, damit die Zellen ihre normalen Zellstoffwechselfunktionen durchführen können.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der Zeichnungen, die ein repräsentatives Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung im Einzelnen beschreiben, leichter verstanden, wobei:
Fig. 1 eine graphische Darstellung der in Beispiel 1 gewonnenen Daten ist und die geschätzte Prozentzahl anhaftender Zellen pro Zeiteinheit in Minuten zeigt;
Fig. 2 eine graphische Darstellung der in Beispiel 2 gewonnenen Daten ist und die Prozentzahl anhaftender Zellen pro Zeiteinheit in Minuten zeigt;
Fig. 3 eine graphische Darstellung der in Beispiel 3 gewonnenen Daten ist und die geschätzte Prozentzahl Zellen pro Zeiteinheit in Minuten zeigt;
Fig. 4 eine graphische Darstellung der in Beispiel 4 gewonnenen Daten ist und anhand eines Balkendiagramms für jeden einzelnen bestimmten Faktor sowohl die Anzahl Kolonien pro Platte als auch die durchschnittliche Anzahl Zellen pro Kolonie zeigt; und
Fig.5 eine Photographie von drei Proben Polytetrafluorethylen (PTFE) nach Anfärbung mit Kristallviolett ist: Probe 1 (linke Probe) zeigt PTFE, beschichtet mit Zubereitung 2; Probe 2 (mittlere Probe) zeigt PTFE, besät mit Zellen aber nicht mit Zubereitung 2 beschichtet; und Probe 3 (rechte Probe) zeigt PTFE, beschichtet mit Zubereitung 2 und mit Zellen besät.

Beschreibung der Erfindung im Einzelnen

Das Wachstum und der normale Stoffwechsel eukaryontischer Zellen benötigt die Anheftung an ein Substrat, dem sich die Zellschicht im wesentlichen vollflächig anlegen kann. In herkömmlichen Zellkulturverfahren wurden Substrate aus Plastik und, in geringerem Umfang, aus Glas und mikroporösen Filtern verwendet, um eine Anhaftung und Vermehrung der Zellen zu erreichen. In jüngerer Zeit wurden an Stelle von Plastik physiologische Substrate (Kollagen, Laminin, Fibronektin, Poly-D- und Poly-L-Lysin) verwendet, um Probleme zu vermeiden, die Zellkulturen mit geringer Aussaatdichte, mit frisch isolierten Zellen oder mit einem Substrat, das weniger gut für die Anhaftung der Zellen geeignet ist (z.B. Teflon ), inhärent sind. Bioadhäsive polyphenolische Proteine stellen aufgrund ihrer hohen Bindungsaffinität sowohl für Zellen als auch für verschiedene biologische und inerte Substrate eine nützliche Alternative dar.
Bioadhäsive polyphenolische Proteinzubereitungen wurden auf ihre Wirksamkeit, in Zellkultur Zellen in vitro zu binden, getestet. Die getesteten Zubereitungen enthielten (1) 95% reines bioadhäsives polyphenolisches Protein natürlichen Ursprungs ("Zubereitung 1") und (2) 45% reines bioadhäsives polyphenolisches Protein natürlichen Ursprungs ("Zubereitung 2").
Im Anschluß an die Gewinnung von bioadhäsiven polyphenolischen Proteinen gemäß dem in der US-PS 4 585 585 beschriebenen Verfahren, wurden diese Zubereitungen unter Anwendung von High Performance Liquid Chromatographie (HPLC), Testsystemen zur quantitative Bestimmung von L-Dopa, Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz und Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gründlich biochemisch charakterisiert. In Tabelle 1 ist die Zusammensetzung der kennzeichnenden Aminosäuren in der bioadhäsiven polyphenolischen Proteinzubereitung dargestellt. Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung der bioadhäsiven phenolischen Proteine (in Promille, bezogen auf die Aminosäuregesamtzahl) 95% bioadhäsives polyphenolisches Protein 45% bioadhäsives polyphenolisches Protein 3-Hydroxyprolin 4-Hydroxyprolin Prolin Glycin 1/2 Cystin L-3,4-Dihydroxyphenylalanin Tyrosin Lysin
Die verbleibenden 55% der Zubereitung 2 bestehen überwiegend aus Kollagen. Die Grundeinheit des bioadhäsiven polyphenolischen Proteins ist ein Dekapeptid (eine Aminosäurekette aus 10 Aminosäuren), das über kovalente Bindungen mit ähnlichen Dekapeptiden verbunden ist und sich 75-85 mal wiederholt. Diese Zubereitungen auf der Grundlage von bioadhäsivem polyphenolischem Protein sind hinsichtlich ihrer adhäsiven Wirksamkeit bei 4ºC in 5% (V/V) Essigsäure, pH 2,8 für mehr als 10 Monate stabil. Extrahierte Zubereitungen mit einem Gehalt von 40 bis 50% Kollagen sind bei Raumtemperatur in 5% (V/V) Essigsäure, pH 2,8 oder nach dem Antrocknen auf Plastiksubstrat für mindestens 2 Monate stabil.
Die Fähigkeit von bioadhäsivem polyphenolischem Protein, sich fest an die verschiedensten Substrate anzubinden, ermöglicht die Anhaftung, Erhaltung und das Wachstum von Zellen auf Oberflächen, die bisher entweder aufgrund ihrer Zusammensetzung, ihrer Anwendung oder des verwendeten Zelltyps mit Problemen behaftet waren. Zu den verwendbaren Substraten gehören Plastik, Glas und mikroporöse Filter (z.B.: Zellulose, Nylon, Glasfaser, Polyester, Polykarbonat) für konventionelle Zellkulturuntersuchungen und/oder für die Gewinnung von Zellprodukten aus Bioreaktoren, die in "batch cell culture" oder in gentechnologischen Verfahren verwendet werden; Kapillarsysteme zur Gewinnung von Zellprodukten und Materialien für prothetische Gefäßimplantate wie Polytetrafluorethylen (Teflon ) und verwandte Stoffe. Die meisten dieser Oberflächen tragen eine negative Nettoladung und haben daher die Tendenz, sich an Materialien mit einer positiven Nettoladung wie die bioadhäsiven polyphenolischen Proteine anzulagern. Zellen tragen eine negative Nettoladung und werden infolgedessen von unbehandelten Oberflächen leicht abgestoßen, während sie von dem dazwischenliegenden bioadhäsiven polyphenolischen Protein mit seiner positiven Nettoladung angezogen werden.
Bioadhäsives polyphenolisches Protein könnte die Anhaftungsfähigkeit, Geschwindigkeit und Stärke der Anhaftung erhöhen. Dieser letzte Parameter ist kritisch bei Anwendungen, die Verfahren zur Gewinnung von Zellprodukten oder zur Reimplantation von Zellen auf Gefäßimplantaten umfassen, die den Durchgang von Flüssigkeiten über Zellmonolayer beinhalten. Desweiteren können durch diesen Vermittler auch solche Zellen an Substrate angeheftet werden, die nach der Isolierung aus dem Gewebe oder aufgrund des Zelltyps schlecht anhaften, und solche Zellen, die normalerweise nicht anhaften, wie Blutzellen und Suspensionsgewebekulturzellen (histiozytische Lymphomazellen, Blutplättchen, weiße und rote Blutzellen usw.).
Darüber hinaus erlaubt die Fähigkeit des bioadhäsiven polyphenolischen Proteins, sich fest an die verschiedensten Substrate anzuhaften, die Anheftung von vielen anderen biologisch aktiven Komponenten oder Substanzen wie DNS, Proteine, Hormone und Antibiotika.
Die Beschichtung von Substraten mit bioadhäsiven polyphenolischen Proteinzubereitungen und die Anheftung an Substrate wird gewöhnlich wie folgt durchgeführt: In Abhängigkeit von der gewünschten Endkonzentration pro Quadratzentimeter werden etwa 1 bis 2 ul steriles bioadhäsives polyphenolisches Protein in einer Konzentration von 10 bis 60 ug/ul pro cm² Substrat gleichmäß aufgetragen. Der resultierende Film wird schnell getrocknet, indem das Substrat in eine Laminar-Flow-Werkbank gestellt wird. Sobald er getrocknet ist, wird der Film mit 35-100% Ethanol oder Isopropanol zum Spülen und Fixieren und anschließend mit sterilem Gewebekulturmedium behandelt, um Alkoholreste und nicht anhaftende fremde Substanzen zu entfernen. Das Substrat kann sofort verwendet werden oder für eine Lagerung getrocknet werden. Zur Anheftung an den Film werden Zellen oder andere biologisch aktive Komponenten oder Substanzen auf die gewünschte Konzentration eingestellt und in serumfreiem oder serumhaltigem Medium dem Substrat zugegeben. In dem Fall der Anheftung von Zellen werden die Zellen in verschiedenen Zeitabständen hinsichtlich Anheftung, Wachstum oder Funktion geprüft, oder gemäß vorgeschriebener Versuchsvorgaben, die die angehefteten Zellen in Gewebekultur benötigen, behandelt.
Andererseits kann das bioadhäsive polyphenolische Protein, wenn gewünscht, an den biologisch aktiven Komponenten oder Substanzen befestigt werden und die entstehenden biologisch aktiven Komponenten oder Substanzen können anschließend an dem Substrat befestigt werden. Das erwähnte Verfahren umfaßt im einzelnen die Schritte, daß:
(1) die biologisch aktiven Komponenten oder Substanzen in einer serumfreien Lösung dispergiert werden;
(2) eine sterile Zubereitung, die polyphenolisches Protein enthält, das etwa 35 bis 100 Gewichtsprozent bioadhäsives polyphenolisches Protein enthält mit der sich wiederholenden Dekapeptideinheit:
wobei N eine ganze Zahl von etwa 10 bis etwa 100 ist, wobei jedes X unabhängig aus der aus Hydroxyl und Wasserstoff bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und wobei jedes R unabhängig aus der aus Wasserstoff und Methyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist; mit der Dispersion biologisch aktiver Komponenten oder Substanzen gemischt wird, wodurch das bioadhäsive polyphenolische Protein an die biologisch aktiven Komponenten oder Substanzen angeheftet wird;
(3) die entstehenden biologisch aktiven Komponenten oder Substanzen zurückgewonnen werden; und
(4) die zurückgewonnenen biologisch aktiven Komponenten oder Substanzen an dem Substrat befestigt werden.

Beispiel 1

Bestimmung der Zellbindungseffizienz

Zubereitungen, die entweder 95% bioadhäsives polyphenolisches Protein (Zubereitung 1) oder 45% bioadhäsives polyphenolisches Protein (Zubereitung 2) enthalten, wurden mit 50 ug pro Schale in 5% (V/V) Essigsäure gleichmäßig auf 35 mm ( 9 cm²) Plastik-Petrischalen für Gewebekultur ausplattiert, schnell getrocknet, "fixiert" und durch Spülen mit 100% Ethanol sterilisiert. Anschließend wurden die Schalen mit sterilem dreifach destilliertem Wasser gespült. Für die Anheftung wurden die Zellen wie folgt aufbereitet:
Endothelzellen der Rindercornea wurden mit Trypsin behandelt, einer Protease, die Zellanhaftungsproteine verdaut, und anschließend in einem Feuchtkulturschrank (Feuchtinkubator) bei 37ºC in 5% CO&sub2; in Luft in Subkultur gezüchtet. Zellmonolayer wurden mit serumfreiem Medium gespült, um überschüssiges Serum und Medium, das die Trypsinierung beeinträchtigen könnte, zu entfernen, und mit 0,05% Trypsin - 0,02% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 10 Minuten lang inkubiert. Die durch die Einwirkung von Trypsin abgelösten Zellen wurden mit einer Pipette abgenommen und vorsichtig bei 250 x g zentrifugiert. Das entstehende Pellet wurde in serumfreiem Minimal Essential Medium (Earle's Salze) resuspendiert , um Reste von Serumproteinen und Trypsin von den Zelloberflächen zu entfernen, und nochmals zentrifugiert.
Die Anzahl der lebenden Zellen wurde mit Hilfe eines Farbausschlußtest bestimmt, bei dem repräsentative Aliquots der Zellen in Minimal Essential Medium mit einem Gehalt von 15% fetalem Rinderserum bis zu einer Endkonzentration von 2 x 10&sup5; Zellen pro ml resuspendiert wurden. Die Zellen wurden in unbehandelten Gewebekultur -Plastik-Petrischalen (Kontrolle) und in Gewebekulturschalen, die mit bioadhäsivem polyphenolischem Protein beschichtet waren, ausgesät. Nach 1, 2,5 , 5, 12,5 und etwa 20 Minuten wurden jeweil drei Versuchs- und Kontrollplatten zufällig ausgewählt und die Anzahl nicht anhaftender Zellen bestimmt.
Nicht anhaftende Zellen wurden durch Spülen von der Platte entfernt und in einem Hämocytometer ausgezählt.; entsprechende Aliquots der Zellen, die verwendet, aber nicht auf Schalen aufgetragen worden waren , wurden ebenso im dreifachen Ansatz ausgezählt. Die Versuchsergebnisse wurden als Prozent anhaftender Zellen berechnet, indem die Anzahl der von jeder Schale gewonnenen nicht anhaftenden Zellen von der Gesamtzahl ausplattierter Zellen subtrahiert wurde. Ein Vergleich der Daten, die die prozentuale Anhaftung von Zellen an bioadhäsive Zubereitungen zeigen, findet sich in Tabelle 2 und ist in Fig. 1 graphisch dargestellt. Tabelle 2 Vergleich der Anhaftung auf Plastik und auf Zubereitung 1 und 2 Zeit (Minuten) Variable Prozent geschätzte Anhaftung Plastik Zubereitung
Man kann sehen, daß die Anhaftung der Zellen in Zubereitung 2 (d.h. höherer Kollagengehalt) innerhalb von nur 5 Minuten zweimal so groß ist wie die Anhaftung der Zellen an Plastik.
Darüberhinaus übertrifft die Bindungsfähigkeit der Zellen an bioadhäsives polyphenolisches Protein die der Zellen an Plastik zu allen Zeitpunkten. Obwohl die Ergebnisse für Zubereitung 1 ähnlich sind, lassen andere Daten vermuten, daß Zubereitung 2 als Anhaftungsfaktor und Hilfssubstanz für die Gewebekultur vorzuziehen ist.
Zubereitung 2 ist über eine Langzeitlagerung hinweg sehr stabil. Bei der Überprüfung anhand der Aminosäurebestimmung blieben die Verhältnisse L-Dopa zu Protein bei Zubereitung 2 nach 4 Monaten bei 4ºC und -20ºC stabil; dagegen ist bei Zubereitung 1 unter ähnlichen Bedingungen eine Abnahme um bis zu 25% gefunden worden (Tabelle 3). Tabelle 3 Prozent beständiges bioadhäsives polyphenolisches Protein nach Lagerzeiten bei 4ºC und -20ºC (Bestimmt mittels Aminosäureanalyse) Zubereitung 3 Monate 4 Monate
Da in Zellkultursystemen die Stabilität von Substanzen auf der biochemischen Ebene in hohem Maß wünschenswert ist, wurde gefolgert, daß Zubereitung 2 zu Zwecken der Steigerung der Zellanhaftungsfähigkeit vorzuziehen ist.

Beispiel 2

Effekt von Serum auf Zellbindung Stärke und Effizienz

Abhängig von den Zielen eines Experiments oder eines Tests kann mehr oder weniger Serum während und nach der Zellanhaftung benötigt werden. Der Einfluß von Serum auf Zellbindung und Stärke der Anheftung wurde an Zellen in Medium mit einem Gehalt von 15% Rinderserum (FBS) oder 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) untersucht. Rinderserum ist der in FBS am häufigsten gefundene Proteinbestandteil. Die Stärke der Anhaftung wurde indirekt ausgewertet anhand der Fähigkeit oder Unfähigkeit, anhaftende Zellen mit Trypsin von dem Substrat, an dem sie angeheftet sind, abzulösen. Die Konzentration des angewendeten Rinderserumalbumins war equivalent zu der in 0,5% bis 1% FBS gefundenen. Die Beschichtung der Gewebekultur - Petrischalen mit Zubereitung 2 des bioadhäsiven polyphenolischen Proteins wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Auf Plastik und Adhäsiv-beschichteten Petrischalen wurden in dreifachem Ansatz Zellen ausgesät, und die nicht angehefteten Zellen wurden durch Spülen nach 2,5, 5 und 15 Minuten entfernt. Nicht anhaftende Zellen wurden mit 0,8 ml einer 0.05% Trypsin - 0.02% EDTA -Lösung für 10 Minuten trypsiniert und in Röhrchen überführt, die 0,2% FBS enthielten, um die weitere Einwirkung des Trypsins auf die Zellen zu blockieren. Die rückgewonnenen angegefteten und nicht angehefteten Zellen wurden in einem Hämocytometer ausgezählt, und die Werte für die anhaftenden Zellen wurden als Prozentsatz der von jeder Schale zurückgewonnenen Gesamtzellzahl berechnet. Diese Daten sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4 Einfluß von Serum auf die Rückgewinnung von Zellen von Plastik und von bioadhäsivem polyphenolischem Protein Zeit (min.) Variable %Anhaftung %Zellen rückgewonnen %geschätzte Anhaftung FBS-Plastik FBS-Bioadhäsiv BSA-Plastik BSA-Bioadhäsiv
Aus den Daten in Tabelle 4 ist ersichtlich, daß Zellen in frühen Zeitabschnitten stärker an bioadhäsives polyphenolisches Protein als an Plastik anhaften. Ebenso kann man sehen, daß der Ersatz von FBS im Medium durch Rinderserumalbumin zu einer verminderten Rückgewinnung von Zellen durch Trypsinierung führt. Dies ist besonders zu Zeiten zu sehen, wenn die Zellen dauerhafte Verankerungen ausbilden (5 Minuten) und anfangen, sich abzuflachen (15 Minuten). Nach 15 Minuten wurden mit BSA auf Plastik und bei den Adhäsivbeschichteten Petrischalen so niedrige Werte wie 33% und 39% Rückgewinnung erhalten, verglichen mit 83% und 74% Rückgewinnung mit FBS auf Plastik, beziehungsweise bei Adhäsivkulturen. Visuelle, mikroskopische Beobachtungen der Platten bestätigten diese Befunde. Andere Ergebnisse dieser Studie zeigen, daß die direkte Auswertung der in diesem Beispiel beschriebenen Zellanhaftung streng mit den indirekten Messungen durch Auszählung allein der nicht anhaftenden Zellen übereinstimmt (für Einzelheiten der Zählung siehe Beispiel 1). Fig. 2 zeigt diese Ergebnisse graphisch.

Beispiel 3

Anheftung von nicht anhaftenden Zellen an bioadhäsives polyphenolisches Protein

Die meisten Zelltypen, die man nach Dissoziierung aus Geweben gewinnt, können, sobald sie in Zellkultur gebracht sind, mit unterschiedlich ausgeprägter Wirksamkeit an Plastiksubstraten anhaften. Gewisse Zelltypen haften dagegen nicht an Plastiksubstraten. Die Fähigkeit, solche Zellen anzuheften, könnte dadurch von Vorteil sein, daß ein Mittel für Diagnostik- und Forschungstests, die die Immobilisierung dieser Zellen benötigen, geliefert würde und die Möglichkeit geschaffen würde, Zellen an Bioreaktorfiltern zu sichern zur Gewinnung von Zellprodukten. Desweiteren würde eine eindeutige Demonstration der Fähigkeit von bioadhäsivem polyphenolischem Protein geliefert, als Anhaftungsfaktor in Gewebekultur zu wirken.
Die Zellinie U937 ist eine menschliche histiocytische Lymphoma ("histiocytic lymphoma"), die aus malignen Zellen, isoliert aus einem Pleuraerguß, etabliert wurde. Diese Zellen wachsen kontinuierlich in Suspension in RPMI 1640 Gewebekulturmedium, das mit 10% fetalem Rinderserum angereichert ist. U937 Zellen haften in Gegenwart von Serum schlecht an Plastik. Gewebekultur - Petrischalen (35 mm Schalen) wurden mit bioadhäsivem polyphenolischem Protein gemäß der in Beispiel 1 ausgeführten Prozedur beschichtet. U937 Zellen wurden in Zentrifugenröhrchen überführt und wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Die Zellen wurden auf Plastik-Gewebekulturschalen und auf Schalen, die mit 100 ug bioadhäsivem polyphenolischem Protein (Zubereitung 2) beschichtet waren, ausgesät und in dreifachen Ansätzen nach 5, 12.5 und 20 Minuten hinsichtlich ihrer Anheftungsfähigkeit ausgewertet (siehe Beispiel 1). Die Ergebnisse in Tabelle 5 (die in Fig. 3 graphisch dargestellt sind) zeigen deutlich den Einfluß von bioadhäsivem polyphenolischem Protein auf die Anhaftung der U937 Zellen. Wie erwartet hafteten die Zellen schlecht an den als Kontrollen dienenden Plastikschalen, während an den beschichteten Schalen innerhalb von 5 Minuten 75% der ausgesäten Zellen und innerhalb von 20 Minuten 87 % der Zellen angeheftet waren. Tabelle5 Prozent Anhaftung der U937 Zellen Zeit (Minuten) unbeschichtetes Plastik mit Zubereitung 2 beschichtetes Plastik

Beispiel 4

Vergleich von Zellwachstum auf bioadhäsivem polyphenolischem Protein und kommerziell erhältlichen Zellanhaftungsfaktoren

Die Anhaftung von Zellen an ein Substrat ist nur die erste Bedingung für die Erhaltung von Zellen in in vitro Kulturen. Die zweite und vielleicht wichtigere Bedingung ist, daß die Zellen wachsen. Die bei der Dissoziierung von Gewebe gewonnene Anzahl Zellen ist jedoch häufig sehr gering. Geringe Zellaussaatzahlen können die Erhaltung von Kulturen ungünstig beeinflussen, da weniger Zellen die Chancen verringern, bis zum Anhaften zu überleben. Dies basiert auf einfachen mathematischen Wahrscheinlichkeiten und auf dem Bedarf an Stoffwechselprodukten, die von den Zellen selbst produziert werden (Dichte-abhängigen Metaboliten) und für Zellanhaftung und -wachstum benötigt werden. Wenn die Zellzahlen niedrig sind, sind die Wahrscheinlichkeiten geringer, daß eine ausreichende Anzahl Zellen anhaftet, die notwendig ist, damit sich die kugelförmigen Zellen auf dem Substrat abflachen. Nach dem Abflachen kann der Metabolismus fortgesetzt werden, um das Medium weiter für Zellwachstum und Teilung zu konditionieren.
Um die Anhaftung und die Vermehrung der Zellen zu steigern, die entweder nicht gleich anhaften und/oder in geringer Dichte ausgesät sind, wurden verschiedene Peptide und Protein- Anhaftungsfaktoren kommerziell verfügbar gemacht. Zu diesen gehören Kollagen, Laminin, Poly-D-Lysin und Fibronektin. Alle diese Faktoren wirken unterschiedlich stark auf biologisch inerten Substraten in Abhängigkeit von dem ausgesäten Zelltyp. Um die Effektivität von bioadhäsivem polyphenolischem Protein hinsichtlich der Ermöglichung von Wachstum bei geringen Aussaatdichten mit diesen Faktoren zu vergleichen, wurden Endothelzellen der Rindercornea mit einer Dichte von 250 Zellen pro Gewebekultur-Petrischale (35 mm Durchmesser, 9,65 cm²) entweder auf Plastik, bioadhäsivem polyphenolischem Protein, Kollagen, Laminin, Poly-D-Lysin oder Fibronektin ausgesät. Die Zellen durften 5 Tage wachsen und wurden dann für jede Variable hinsichtlich Koloniegröße (Anzahl Zellen pro Kolonie) und Anzahl der Kolonien pro Platte durch Anfärben der Zellen mit Kristallviolett ausgewertet. Die erhaltenen Daten wurden benutzt, um den Einfluß jedes dieser Faktoren auf Anhaftung (Anzahl der Kolonien ) und Wachstum (Größe der Kolonien) zu bestimmen. Zellen und mit bioadhäsivem polyphenolischem Protein beschichtete Schalen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Beschichtung der Schalen mit anderen Anhaftungsfaktoren wurde gemäß den vom Hersteller vorgeschlagenen Verfahren durchgeführt.

Kollagen -

Kollagen-beschichtete Platten wurden hergestellt, indem 1 Teil kalte (4ºC) Kollagendispersion in 6 Teilen kaltem 50%igem Methanol verdünnt wurde. Diese Mischung wurde einige Minuten lang kräftig gemischt und auf eine Petrischale pipettiert, so daß nur der Schalenboden bedeckt war. Innerhalb von 20 Sekunden wurde das Kollagen durch Absaugen wieder entfernt, und die Schale wurde zum Trocknen kopfüber im 30º-Winkel gegen einen Deckel gekippt. Nach 1 Std. waren die Schalen bereit für den Gebrauch.

Laminin -

Laminin ist im Handel in Mengen von 1 mg in 1 ml einer 50 mM Tris (hydroxymethyl)aminomethan enthaltenden physiologischen Salzlösung erhältlich. Im Anschluß an ein langsames Auftauen der Lamininlösung von -20ºC auf 0 bis 4ºC wurden 10 bis 15 ug Lamininlösung in Petrischalen in 0,5 ml 0,01M Natrium-Phosphat-Puffer, pH 7,4, pipettiert. Die Schalen wurden bei 37ºC getrocknet. Sofort nach dem Trocknen waren die Schalen zum Gebrauch bereit.

Fibronektin -

Fibronektin ist im Handel als lyophilisierter Puder in Mengen von 1 mg erhältlich. Nach einer Lagerung bei 4ºC kann Fibronektin vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht werden. Der Puder wird in 1 ml sterilem destilliertem Wasser rekonstituiert und 30 Minuten zum Auflösen stehen gelassen. Jeder Schale wird 10 bis 20 ug Fibronektinlösung in 0,5 ml zugegeben und lufttrocknen gelassen. Dann ist die Schale für die Zellaussaat bereit.

Poly-D-Lysin -

Poly-D-Lysin ist im Handel als lyophilisierter Puder in Mengen von 5 mg erhältlich. Nach einer Lagerung bei 4ºC läßt man vor dem Gebrauch diesen Puder sich auf Raumtemperatur erwärmen. Schalen werden mit 50 mg in 1 ml sterilem destilliertem Wasser beschichtet und bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehen gelassen. Danach wird die Lösung abgesaugt, und die Schalen werden zweimal mit 1,5 ml sterilem destilliertem Wasser gespült. Nach jedem Spülen wird die Flüssigkeit vollständig abgesaugt. Die Schalen werden getrocknet und sofort gebraucht.
Die Fähigkeit, sich abzuflachen, ist bei den auf jedem der Faktoren ausgesäten Zellen nach Anfärben der Zellen mit Kristallviolett ausgewertet worden. Dazu wurden zuerst die die Kolonien enthaltenden Schalen mit serumfreiem Medium gespült, um überschüssige Proteine zu entfernen, und die Zellen mit 10% neutral gepuffertem Formalin 10 Minuten fixiert. Dann wird das Formalin durch Absaugen von den Platten entfernt und anschließend 0,1% Kristallviolett in Leitungswasser für eine Dauer von 7 Minuten auf die Platten aufgetragen. Sofort nach dem Anfärben wird das Kristallviolett abgegossen und die Zellen in einem Becherglas unter fließendem Leitungswasser gespült, um überflüssige Farbe zu entfernen. Nach dem vollständigen Trocknen der Platten werden in jedem der die einzelnen Variablen repräsentierenden Parallelansätze die Kolonien gezählt und pro Platte werden die Zellen in 10 zufällig ausgewählten Kolonien gezählt. Die in diesem Beispiel gewonnenen Daten erscheinen in Tabelle 6 und sind in Fig. 4 als Balkendiagramm graphisch dargestellt. Wie man in Fig.4 sieht, wird die Anzahl der Kolonien auf den mit bioadhäsivem polyphenolischem Protein (U) beschichteten Platten nur von Poly-D-Lysin (PDL) erreicht. Alle anderen Faktoren, inklusive Kollagen (C), Plastik (P), Fibronektin (F) und Laminin (L) liefern im Vergleich schlechtere Ergebnisse. Ähnlich wird die durchschnittliche Anzahl Zellen pro Kolonie, die auf den mit bioadhäsivem polyphenolischem Protein beschichteten Platten gefünden wurde, mit Poly-DLysin erreicht. Kollagen, Plastik, Fibronektin und Laminin zeigen eine geringere Wachstumsfähigkeit. Obwohl keine signifikanten Unterschiede zwischen bioadhäsivem polyphenolischem Protein und Poly-D-Lysin gefunden wurden (möglicherweise aufgrund des hohen Lysinpegels, der in jedem dieser Moleküle gefunden wurde), ist die Verwendung von bioadhäsivem polyphenolischem Protein als Anhaftungsfaktor dennoch vorteilhafter als Substrat, aufgrund seiner Fähigkeit, (1) Wasser zu verdrängen, (2) sich an Materialien inklusive Metall und Teflon (zum Beispiel prothetische Vorrichtungen) anzuhaften, (3) in vivo und in vitro verwendbar zu sein und (4) sehr starke Bindungen auf der Basis von L- Dopa, hydroxilierten und Lysin- Aminosäureresten auszubilden. Tabelle 6 Anzahl und Größe der Kolonien nach Zellwachstum auf verschiedenen Gewebekultursubstraten Kolonie pro Variable Tag 5 Durchschnittliche Anzahl Zellen pro Kolonie Zubereitung 2 Poly-D-Lysin Kollagen Plastik Fibronektin Laminin

Beispiel 5

Die Verwendung von bioadhäsivem polyphenolischem Protein auf künstlichen Gefäßimplantaten

Polyterafluorethylen (PTFE) ist ein Substrat, das gewöhnlich für Gefäßimplantate verwendet wird. Das Hauptproblem bei der Verwendung dieses Materials besteht darin, daß das Aussäen von Gefäßzellen auf PTFE sehr schwierig ist aufgrund seiner stark wasserabweisenden Eigenschaften. Bei vielen Implantaten würde ein geschlossener Zellmonolayer auf ihrer Oberfläche die Bildung von Klumpenbildung vermeiden. Um die Wirksamkeit von bioadhäsivem polyphenolischem Protein, als Vermittler für die Anhaftung endothelialer Zellen an PFTE zu fungieren, zu testen, wurde Gefäßimplantatmaterial mit 200 ug pro cm² bioadhäsivem polyphenolischem Protein (Zubereitung 2) beschichtet. Anschließend ließ man fünfhunderttausend endotheliale Zellen sich an dem bioadhäsiven polyphenolischen Protein anheften. Die Zellen wurden ebenso auf Teflon ohne Beschichtung mit bioadhäsivem polyphenolischem Protein ausgesät; und als Kontrolle diente mit bioadhäsivem polyphenolischem Protein beschichtetes Teflon ohne aufgesäte Zellen. 15 Minuten nach der Anhaftung wurden überschüssige Zellen von dem Gefäßimplantatmaterial abgespült, und die Gefäßimplantate wurden mit Formalin fixiert, mit Kristallviolett angefärbt und getrocknet wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnisse dieses Beispiels erscheinen in Fig. 5 und zeigen, daß, obwohl sowohl auf mit bioadhäsivem polyphenolischem Protein behandeltem Teflon ohne Zellen (Probe 1) als auch auf dem mit Adhäsiv unbehandeltem aber mit Zellen besäten Teflon (Probe 2) eine leichte Anfärbung beobachtet werden kann, bei weitem die stärkste Anfärbung oder Zellanhaftung auf dem behandelten, die endothelialen Zellen enthaltenden Teflon stattfand (Probe 3). Infolgedessen verbessern bioadhäsive polyphenolische Proteine das Besäen oder Belegen von Gefäßimplantaten mit endothelialen Zellen und liefern gleichzeitig ein Mittel, mit dem die Bildung von Verklumpungen nach einer Gefäßimplantat-Operation minimiert oder vermieden werden kann.

Beispiel 6

Verfahren zur Extraktion von 45%igem reinem bioadhäsivem polyphenolischem Protein

300 g Fuß der marinen Miesmuschel, M. edulis, werden mit 900 ml neutralem Salzpuffer, der 1 M Natriumchlorid, 0,05M Tris(hydroxymethyl)aminomethan (pH 7,5), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 mM N-Ethylmaleimid, 0.025M Ethylendiamintetraessigsäure und 1 mM Kaliumzyanid und 9 ml eines Antischaumkonzentrats enhält, in einem kommerziellen Mixer bei hoher Geschwindigkeit vermischt und gründlich zerkleinert, wobei das bioadhäsive polyphenolische Protein ausfällt. Die Mischung wird bei 10 kU/min 15 Minuten lang zentrifugiert. Das Pellet wird in 900 ml einer 5% igen Essigsäure unter Verwendung des Mixers bei hoher Geschwindigkeit resuspendiert. Bioadhäsives polyphenolisches Protein bleibt während einer Zentrifugation bei 10 kU/min für 45 Minuten in dem Überstand erhalten. Die etwa 1000 ml Überstand werden unter ständigem Rühren in ein Eisbad gestellt. 5 ml 2 M Natriumborat und 95 ml 5 M Natriumchlorid werden dem gerührten Überstand zugegeben. Diese Mischung wird bei 10 kU/min 15 Minuten lang zentrifugiert. Der neue Überstand wird unter Zugabe von viermal soviel 2 M Natriumborat und 5 M Natriumchlorid genauso wie zuvor behandelt. Die Mischung wird nochmals bei 10K 15 Minuten lang zentrifugiert. Das Pellet wird in der folgenden Mischung resuspendiert: 7,5 ml 2 M Natriumborat, 50 ml 5 M Natriumchlorid, 50 ml destilliertes Wasser, 37,5 ml 8 M Harnstoff in 5% Essigsäure und 5,6 ml konzentrierte Essigsäure. Die Mischung wird etwa 16 Stunden lang langsam gerührt. Die Suspension wird bei 10 kU/min 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird gewonnen und etwa 16 Stunden lang gegen 5% Essigsäure dialysiert (8-12 K Molekulargewicht Trennmembranen). Aminosäureanalysen beweisen, daß das Extrakt 45%iges reines bioadhäsives polyphenolisches Protein enthält. Die Reinheit des Extrakts wird durch die Anzahl der durchgeführten Extraktionen bestimmt. Der Ertrag an reinem bioadhäsivem polyphenolischem Protein sinkt mit steigender Anzahl Extraktionen. Alle hier beschriebenen Prozesse wurden bei 4ºC durchgeführt.

Zusätzliche chromatographische Reinigung

Mit der Flüssigkeitschromatographie werden polyphenolische Proteine in SE Sephadex Harzen in 5,5% Guanidinhydrochlorid (GuHCl) in 5% Essigsäure zurückgehalten. Das Protein wird dann mit einem Gradient von 5,5 -20% GuHCl in Essigsäure aus dem Harz eluiert, die Spitzenbereiche zusammengenommen und gegen 5% Essigsäure dialysiert, um das GuHCl zu entfernen. Die Lagerung der Proteine ist am stabilsten bei 4ºC in 5% Essigsäure. Vor dem Gebrauch als Adhäsiv, in vivo oder im Kontakt mit lebenden Zellen, müssen bioadhäsive polyphenolische Proteine gegen Wasser dialysiert werden, um den pH der Lösung in die Nähe des Neutralpunkts anzuheben, und die Präparation muß auf 3 bis 10 mg/ml konzentriert werden. Das wird durch Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran erreicht, mit einer Porengröße, die den Durchlaß auf 30.000 oder weniger begrenzt. Wenn bioadhäsive polyphenolische Proteine vor dem Gebrauch auf inertem Substrat angetrocknet werden, ist dies nicht notwendig.

Beispiel 7

Bioadhäsives polyphenolisches Protein, 45% rein (Zubereitung 2), wurde dazu verwendet, um Heparin, ein Mucopolysaccharid mit spezifischen Antikoagulat - Eigenschaften, und Peroxidase, ein Proteinenzym, das Peroxyde oxidiert, zu immobilisieren. Damit sollte gezeigt werden, daß andere Substanzen über einen bioadhäsiven polyphenolischen Proteinvermittler wirksam an Plastikgegenstände gebunden werden können.
Für beide wurde 7 ug bioadhäsives polyphenolisches Protein auf Gewebekultur- Plastikschalen mit 2 cm² Grundfläche für eine Endkonzentration von 3,5 ug/cm² aufgetrocknet. Das Protein wurde mit 100% Ethanol und anschließend zweimal mit Wasser gewaschen, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Heparin wurde den Schalen in 5 verschiedenen Konzentrationen zugegeben: 90, 60, 30, 15, und 5 Einheiten/Schale. Heparin wurde ebenfalls auf unbehandelte Plastikschalen aufgetrocknet. Alle Tests wurden mit zweifachen Ansätzen durchgeführt. Die Platten wurden vor dem Gebrauch mit 0,1 M Phosphatpuffer gewaschen, um locker gebundenes Heparin zu entfernen.
Zur Durchführung der Tests für die Heparin-Aktivität wurde jeder Schale 0,5 ml frisches menschliches Blut zugegeben und bei 23ºC inkubiert. Die Gerinnungszeiten wurden visuell beobachtet und notiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 Gerinnungszeit (Minuten)* Heparin Einheiten mit bioadhäsivem polyphenolischem Protein ohne bioadhäsives polyphenolisches Protein *die angeführten Zahlen stammen aus je zwei Ansätzen ** NC = keine Gerinnung nach 24 Stunden
Bei Verwendung von bioadhäsivem polyphenolischem Protein wurde Heparin sehr wirksam an Plastik immobilisiert. Selbst bei der niedrigsten Heparinmenge wurde innerhalb von 24 Stunden keine Gerinnung beobachtet. Alle Mengen unter 60 Einheiten waren innerhalb von 2 Stunden oder weniger in den Schalen geronnen, in denen Heparin direkt an dem Plastik befestigt worden war. Bei den größeren Mengen bindet genügend Heparin an das Plastik, um Gerinselbildung zu vermeiden.
Peroxidase wurde in einer ähnlichen Weise immobilisiert: 5 verschiedene Konzentrationen von Peroxidase, 1, 0,5 , 0,1 , 0,05, 0,025 ug/Schale, wurden sowohl unbeschichteten Plastikschalen als auch Plastikschalen, die mit bioadhäsivem polyphenolischem Protein beschichtet waren, zugegeben (zweifache Ansätze). Wie mit Heparin wurde eine 0,1M Phosphatpufferspülung zum Entfernen von locker gebundenem Enzym durchgeführt. Der Peroxidasetest beinhaltet die Zugabe eines Substratgemisches aus Peroxyd und o- Phenyldiamin (OPD) in Phosphat gepufferter Salzlösung. Das Substratgemisch enthält pro ml 100 ul Peroxyd (40 ul von 30% Peroxyd in 50 ml Wasser) und 100 ul OPD (10,7 mg in 8,56 ml Wasser) und 800 ul Phosphat gepufferte Salzlösung. Jeder Schale wird 1 ml zugegeben. Nach 5 Minuten Inkubation bei 23ºC werden 100 ul einer 4 N Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Es handelt sich um einen kolorimetrischen Test mit einem Wellenlängenoptimum bei 490 nm. Das Ergebnis der Doppelansätze ist in Tabelle 8 in Absorptionseinheiten bei 490 nm dargestellt. Tabelle 8 ug Peroxidase mit bioadhäsivem polyphenolischem Protein ohne bioadhäsives polyphenolisches Protein
Wie mit Heparin ist bei höheren Konzentrationen keine Verstärkung zu sehen, wenn bioadhäsives polyphenolisches Protein angewendet wird, es bindet genügend Enzym an das Plastik. Bei den niedrigen Konzentrationen ist eine deutliche Steigerung oder Erholung bei Verwendung von bioadhäsivem polyphenolischem Protein zu sehen.

Beispiel 8

Bioadhäsives polyphenolisches Protein hat sich als ein erfolreiches Substrat für Gewebe und Zellen in Histologie und Cytologie erwiesen. In diesem Beispiel wurde 45%iges bioadhäsives polyphenolisches Protein (Zubereitung 2) verwendet, um die Descemetsche Membran von Rindern mit Präparationen endothelialer Zellen auf Glasträgerplättchen zu befestigen. Frisch getöteten Kühen wurde die vollständige Kornea entnommen und entweder in physiologische Salzlösung oder in 10% neutral gepuffertes Formalin überführt. Die Descemetsche Membran wurde anschließend von der posterioren Seite der Kornea durch vorsichtiges Abziehen entfernt. Das Gewebe wurde auf ( mit 5% Essigsäure vorgereinigte) Objektträgerplättchen übertragen und mit 50 ug bioadhäsivem polyphenolischem Protein beschichtet. Die Gewebepräparationen wurden dann auf dem bioadhäsiven polyphenolischen Protein bei Raumtemperatur oder auf einer 55ºC Wärmplatte 20 Minuten lang getrocknet. Wenn formalinfixiertes Gewebe verwendet wurde, wurde das Gewebe vor dem Anheften an das bioadhäsive polyphenolische Protein mit Salzlösung gespült, um überschüssiges Formalin zu entfernen. Nach dem Trocknen wurden die Gewebepräparationen auf den Objekträgerplättchen 5 Minuten mit Formalin behandelt, um das Gewebe an dem bioadhäsiven polyphenolischen Protein zu fixieren. In dieser Weise behandelte Gewebe wurden in wässriger Lösung über Wochen auf dem bioadhäsiven polyphenolischen Protein festgehalten. Auch nach extensiver Bewegung durch Schütteln in Wasser, Salzlösung, verdünntem und 100% Ethanol und Xylol blieben die Gewebe noch intakt. In der Abwesenheit von bioadhäsivem polyphenolischem Protein überstand der Haftkontakt der Gewebe an den Objekträgerplättchen nicht einmal die erste Formalinbehandlung.

Claims

1. Verfahren zur Befestigung biologisch aktiver Komponenten an einem Substrat, bei dem:

(1) ein Substrat mit einer sterilen Zubereitung beschichtet wird, die polyphenolisches Protein enthält, das etwa 35 bis 100 Gewichtsprozent reines bioadhäsives polyphenolisches Protein enhält mit der sich wiederholenden Dekapeptideinheit:

wobei N eine ganze Zahl von etwa 10 bis etwa 100 ist, wobei jedes X unabhängig aus der aus Hydroxyl und Wasserstoff bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und wobei jedes R unabhängig aus der aus Wasserstoff und Methyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist;

(2) die Beschichtung auf dem Substrat getrocknet wird;

(3) die Beschichtung auf dem Substrat fixiert wird;

(4) das beschichtete Substrat gespült wird, um nicht fest an dem Substrat anhaftendes fremdes Material zu entfernen; und

(5) biologisch aktive Komponenten auf das beschichtete Substrat aufgetragen werden, wodurch die biologisch aktiven Komponenten an dem beschichteten Substrat befestigt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Substrat mit 0,1 bis 2 ul der Zubereitung pro cm² Substrat beschichtet wird, die etwa 10 bis 60 ug/ul bioadhäsives phenolisches Protein enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Beschichtung auf dem Substrat fixiert wird, indem das Substrat mit einem wasserfreien biologisch kompatiblen sterilisierenden Medium gespült wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das sterilisierende Medium 30 bis 100% Ethanol ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das sterilisierende Medium 30 bis 100% Isopropanol ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das beschichtete Substrat zum Entfernen fremden Materials mit Wasser oder Pufferlösung gespült wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Substrat aus der Gruppe bestehend aus synthetischen polymeren Materialien, Glas , Metallen und mikroporösen Filtern ausgewählt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Substrat Polytetrafluorethylen ist.

9. Verfahren zur Befestigung lebender Zellen an einem Substrat, bei dem:

(1) ein Substrat mit einer sterilen Zubereitung beschichtet wird, die polyphenolisches Protein enthält, das etwa 35 bis 100 Gewichtsprozent reines bioadhäsives polyphenolisches Protein enthält mit der sich wiederholenden Dekapeptideinheit:

(2) bei dem die Beschichtung auf dem Substrat getrocknet wird;

(3) bei dem die Beschichtung auf dem Substrat fixiert wird;

(4) bei dem das beschichtete Substrats gespült wird, um nicht fest an dem Substrat anhaftendes fremdes Material zu entfernen; und

(5) bei dem lebende Zellen auf das beschichtete Substrat aufgetragen werden, wodurch die Zellen an dem beschichteten Substrat befestigt werden und in Anwesenheit einer nährstoffhaltigen Umgebung normale Zellstoffwechselfunktionen durchführen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Substrat mit 0,1 bis 2 ul der Zubereitung pro cm² Substrat beschichtet wird, die etwa 10 bis 60 ug/ul bioadhäsives polyphenolisches Protein enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Beschichtung auf dem Substrat fixiert wird, indem das Substrat mit einem wasserfreien, biologisch kompatiblen, sterilisierenden Medium gespült wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das sterilisierende Medium 30 bis 100% Ethanol ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das sterilisierende Medium 30 bis 100% Isopropanol ist.

14. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das beschichtete Substrat zum Entfernen fremden Materials mit sterilem, wässrigem, serumfreiem Gewebekulturmedium gespült wird.

15. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das beschichtete Substrat zum Entfernen fremden Materials mit Wasser oder Pufferlösung gespült wird.

16. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die lebenden Zellen in einem serumhaltigen Medium auf das beschichtete Substrat aufgetragen werden.

17. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die lebenden Zellen in einem serumfreien Medium auf das beschichtete Substrat aufgetragen werden.

18. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Substrat ein in vitro Substrat ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Substrat aus der Gruppe, bestehend aus synthetischen polymeren Materialien, Glas, Metallen und mikroporösen Filtern ausgewählt ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das Substrat Polytetrafluorethylen ist.

21. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Substrat ein in vivo Substrat ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das Substrat aus der Gruppe, bestehend aus Kollagen, Laminin, Fibronektin, prothetischen Transplantations- oder Implantationsmaterialien und Polylysin ausgewählt ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das Substrat Polytetrafluorethylen ist.

24. Zellkultursystem, umfassend: ein Substrat; eine Beschichtung darauf aus einer sterilen Zubereitung, die polyphenolisches Protein enhält, das etwa 35 bis 100 Gewichtsprozent reines bioadhäsives polyphenolisches Protein enthält mit der sich wiederholenden Dekapeptideinheit:

wobei N eine ganze Zahl von etwa 10 bis etwa 100 ist, wobei jedes X unabhängig aus der aus Hydroxyl und Wasserstoff bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und wobei jedes R unabhängig aus der aus Wasserstoff und Methyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist; lebende Zellen, die an dem beschichteten Substrat befestigt sind; und ein nährstoffhaltiges Medium, das mit den Zellen in Berührung steht, wodurch die Zellen normale Zellstoffwechselfunktionen durchführen.

25. Zellkultursystem nach Anspruch 24, bei dem das Substrat ein in vitro Substrat ist.

26. Zellkultursystem nach Anspruch 25, bei dem das Substrat aus der Gruppe, bestehend aus synthetischem polymerem Material, Glas, Metallen und mikroporösen Filtern ausgewählt wird.

27. Zellkultursystem nach Anspruch 26, bei dem das Substrat Polytetrafluorethylen ist.

28. Zellkultursystem nach Anspruch 24, bei dem das Substrat ein in vivo Substrat ist.

29. Zellkultursystem nach Anspruch 28, bei dem das Substrat aus der Gruppe, bestehend aus Kollagen, Laminin, Fibronektin, prothetischen Transplantations- oder Implantationsmaterialien und Polylysin ausgewählt ist.

30. Zellkultursystem nach Anspruch 29, bei dem das Substrat Polytetrafluorethylen ist

31. Verfahren zur Befestigung biologisch aktiver Komponenten an einem Substrat, bei dem:

(1) die biologisch aktiven Komponenten in einer serumfreien Lösung dispergiert (feinst verteilt)werden;

(2)bei dem eine sterile Zubereitung, die polyphenolisches Protein enthält, das etwa 35 bis 100 Gewichtsprozent reines bioadhäsives polyphenolisches Protein enthält mit der sich wiederholenden Dekapeptideinheit :

wobei N eine ganze Zahl von etwa 10 bis etwa 100 ist, wobei jedes X unabhängig aus der aus Hydroxyl und Wasserstoff bestehenden Gruppe ausgewählt ist und wobei jedes R unabhängig aus der aus Wasserstoff und Methyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist; mit der Dispersion biologisch aktiver Komponenten gemischt wird, wodurch das bioadhäsive polyphenolische Protein an die biologisch aktiven Komponenten angeheftet wird;

(3) bei dem die entstehenden biologisch aktiven Komponenten zurückgewonnen werden; und

(4) bei dem die zurückgewonnenen biologisch aktiven Komponenten an dem Substrat befestigt werden.