DE3779914T2

DE3779914T2 - Neue lectine, abgeleitet von bakteriellen haaren.

Info

Publication number: DE3779914T2
Application number: DE8787902927T
Authority: DE
Inventors: C Brinton; Mark Hanson
Original assignee: Bactex Inc
Current assignee: Bactex Inc
Priority date: 1986-03-24
Filing date: 1987-03-20
Publication date: 1992-12-10
Anticipated expiration: 2007-03-21
Also published as: CA1282323C; DE3779914D1; EP0298991A1; ATE77392T1; US4801690A; WO1987005910A1; EP0298991B1; EP0298991A4

Description

Es war schon seit langer Zeit bekannt, daß die Pili von krankheitserregenden Organismen, welche solche Pili aufweisen eine bedeutende Rolle in Bezug auf den Grad der Pathogenität dieser Organismen spielen. Es wurde gezeigt, daß diese Pili sich an Erythrozyten und andere Zellen anheften, wodurch dann Bakterien daran festgehalten werden. Auch der Mechanismus, mit welchem sich Pili an Erythrozyten und ähnliche Zellen anheften war lange studiert worden. Es wird angenommen, daß beim Anheften ein besonderes Protein mit Affinität für eine spezielle Gruppe oder Gruppen auf der Oberfläche von Säugerzellen eine Rolle spielt. Vordem wurde angenommen, daß die Anheftung über einen Teil des Pilus-Stammproteins bewerkstelligt wurde.
Es wurde ein Lectin isoliert, welches aus den Pili von E. Coli und S. Newport stammt, wobei das Lectin nicht-kovalent an das Pilus-Stammprotein gebunden ist. Lectine sind Proteine mit einer spezifischen Bindungsstelle für Kohlenwasserstoffe (Annual Review of Plant Physiology 27, 291 (1976)). Sie werden weiter anhand ihrer Herkunft unterteilt, nämlich in Zoolectine oder Phytolectine. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine neue Untergruppe, das heißt Baktolectine (aus Bakterien). Dieses Lectin tritt in monovalente Wechselwirkung mit Mannosestellen auf der Oberfläche der Säugerzellen. In diesem Kontext bedeutet der Ausdruck monovalent, daß nur eine einzige Bindungsstelle für jedes Lectin vorliegt. Das Lectin stellt eine mehrerer kleiner Proteinkomponenten der Pili selbst dar. Unter den Organismen, welche solche Lectine aufweisen können benannt werden: Escherichia Coli, insbesondere E.
Coli mit Typ I und Salmonellenarten, insbesondere S. Newport. Die Lectine weisen ein Molekulargewicht im Bereich zwischen 27-35 Kd auf. Die für das Anheften an den zuvor erwähnten Mannoserest auf den Säugerzellen verantwortliche Bindungsstelle kann mit wässrigem Papain in Gegenwart von Harnstoff inaktiviert werden, vorausgesetzt, daß die Harnstoffkonzentration mindestens 4 M ist. Ist die Harnstoffkonzentration kleiner als 4 M, findet nur eine sehr geringe Denaturierung statt und selbst bei Konzentrationen von 8 M Harnstoff tritt keine Inaktivierung in Abwesenheit von Papain auf. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Lectine werden im wesentlichen reine Pili hergestellt. Diese Pili werden dann mit einem Detergens inkubiert, passenderweise Natriumdodecylsulfat oder Sarkorsinat in einer Konzentration im Bereich zwischen 2 bis ca. 5 Gew.-% und einem pH-Wert von ca. 7 bis ca. 9. Daraufhin werden die Pili dissoziiert. Die Inkubation wird vorzugsweise in 2 Schritten durchgeführt. Der erste Schritt wird zwischen ca. 20-40ºC durchgeführt, worauf das ungelöste Material vereinigt wird, der wässrige Rest verworfen und das ungelöste Material in einer ähnlichen Lösung wieder gelöst und bei höherer Temperatur wieder inkubiert wird, passenderweise zwischen ca. 80 und 100ºC. Das verbleibende ungelöste Material wird entfernt, geeigneterweise mittels Zentrifugation bei vorzugsweise mindestens 10 000 g, geeigneterweise bis zu ca. 100 000 g. Das wässrige Material wird zurückbehalten. Daraufhin wird das proteinhaltige Material in diesen wässrigen Lösungen gefällt. Geeigneterweise ist das Fällmittel eine 10-20 %-ige Lösung (vol/vol) eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels, wie z.B. ein Alkylketon, geeigneterweise Azeton; eine Carboxylsäure wie z.B. Essigsäure; oder ein tertiäres Amin wie z.B. Trialkylamin. Der Niederschlag wird dann abgetrennt, mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen und in der zuvor genannten Detergenslösung wieder gelöst aber bei niedrigeren Konzentrationen, geeigneterweise zwischen ca. 0,5 und 2 Gew.-% (SDS).
Die Proteine in dieser Lösung werden dann nach bekannten Verfahren aufgetrennt, beispielsweise mittels Gelfiltrationschromatographie oder Acrylamid-Gelelectrophorese und das erwünschte Protein mit einem Molekulargewicht wie oben angegeben isoliert. Die Lectine machen nährungsweise 1 Gew.-% des Proteingehalts der Pili aus. Es wurde gefunden, daß die Lectine aus den Pili des Typs 1 von E. Coli und des Typs 1 von Salmonella D-Mannose spezifisch sind.
Die Figuren 1 und 4 sind Photographien einer SDS Acrylamid-Gelelektrophorese der entpolymerisierten Pili nach Tabelle 1.
Die Figuren 2 und 3 sind Photographien einer SDS-Acrylamid-Gelelektrophorese der Produkte aus Beispiel III.
Bei der Präparation der erfindungsgemäßen Lectine ist es wünschenswert, von im wesentlichen reinen Pili auszugehen, welche frei von anderen Verunreinigungen sind. In der bevorzugten Ausführungsform werden die mit Pili behafteten Bakterien auf einem festen Vollmedium angezüchtet und vor dem Mixen, geeigneterweise bei ca. 10 000 Umdrehungen pro Minute über einen Zeitraum von ca. 1-5 Minuten, in 0,15 M wässriger Kochsalzlösung suspendiert. Der Überstand aus der Zentrifugation wird aufbewahrt und von den niedergeschlagenen Zellen abgetrennt. Durch Zugabe eines geeigneten Salzes, beispielsweise 0,1 M Magnesiumchlorid, bilden die Pili im Überstand Aggregate, welche durch abwechselndes Kristallisieren und wieder in Lösung bringen gereinigt werden, um damit lösliche bzw. teilchenförmige Trümmer abzutrennen.
Die mit Pili versehenen Organismen können in einem ziemlich breiten Temperaturbereich, beispielsweise zwischen ca. 20 und ca. 40ºC angezüchtet werden. Zwar ist Magnesiumchlorid als Fällmittel bevorzugt, doch können auch Calciumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Ammoniumsulfat in einer Sättigung von mindestens 5 % oder mehr verwendet werden.
Es wurde gefunden, daß die Pili in Gegenwart milder Detergenzien unversehrt bleiben. Somit lassen sich die Pili in einem alkalischen Puffer, geeigneterweise mit einem pH zwischen 7 bis ca. 9 mit einem Gehalt eines Detergens zwischen 2 und 5 %, vorzugsweise Natriumdodecylsulfat oder Sarkosinat suspendieren. Zur Steigerung der Löslichkeit kann Dithiothreitol (bis zu 50mM, vorzugsweise 5 bis 10mM) zugesetzt werden. Die suspendierten Pili werden in Lösung bei einer Temperatur zwischen ca. 20 bis 37ºC gemischt, um die Dispersion aller Material-Klumpen zu bewirken. Die Pili werden dann mittels Zentrifugation sedimentiert, geeigneterweise bei ungefähr 10 000 g oder höher. Dieses Verfahren stellt sicher, daß unerwünschte lösliche Verunreinigungen entfernt werden.

Vorkommen Pilus-assoziierter Proteine

Pili des Typs I aus E. Coli werden aus 20 verschiedenen Stämmen gereinigt (Nummer 1-19 mit freundlicher Genehmigung von H.J. Cho). Die Konzentrationen bewegen sich im Bereich von 0,36 mg/ml bis 2,46 mg/ml. Die Pili wurden entpolymerisiert (bei pH 2/100ºC), auf SDS-PAGE laufengelassen und mit Silber angefärbt. Die Reihenfolge der Stämme erfolgt wie in Tabelle 1 angegeben. Die Lage des 28 Kd-Bandes wird in Figur I angegeben. Der Streifen in Position 21 enthält die Molekulargewichts-Standards. TABELLE I Aktivitäten der Hämagglutinierung in der Familie des Typs I Stamm/Klon Endpunkt der Hämagglutination Konzentration (µg/ml) Serotyp Quelle für isolierten Stamm/Klon Enterotoxin-produzierende Bakterien im Schwein Enterotoxin-produzierende Bakterien im Menschen Enteroinvasive Bakterien des Menschen Enterotoxin-produzierende Bakterien in Rindern Pyelonephritis-verursachende Bakt.im Menschen Lab. (J. Adler) Cystitis-verursachende Bakterien im Menschen ABU im Menschen Pyelonephritis-verursachende Bakterien im Menschen Lab. (E. Kellenberger)
Die aggregierten Pili aus der Zentrifugation werden erneut im Detergens mit einer Konzentration über 1 mg/ml suspendiert. Bevorzugt ist eine Konzentration zwischen 5 bis ca. 10 mg/ml. Die Lösung wird sodann auf eine Temperatur von mindestens ca. 80ºC bis zu 100ºC über einen Zeitraum von mindestens 2 Minuten erhitzt, wobei eine Inkubation über einen Zeitraum von 5 Minuten bei 100ºC bevorzugt ist. Dieses Verfahren entfernt alles nicht kovalent gebundene proteinhaltige Material von den Pili unter Zurücklassung reiner Pilus-Stämme, welche dann mittels Zentrifugation bei mindestens 10 000 g, geeigneterweise bis zu 100 0000 g entfernt werden. Um eine Präzipitation des Detergens zu vermeiden, wird die Temperatur vorzugsweise im Bereich zwischen 10 bis ca. 20ºC gehalten. Das Pellet wird dann gewaschen, geeigneterweise mit Wasser niedriger Pufferstärke und, falls erwünscht, der vorstehende Inkubations-Schritt wiederholt, um gereinigte Pilus-Stämme zu erhalten. Soll der Überstand länger als ca. 12 Stunden aufbewahrt werden, werden vorzugsweise Protease-Inhibitoren, wie z.B. Diisopropyl-fluorophosphat, Phenylmethyl-sulfonylfluorid etc. zugesetzt. Die Aufbewahrungstemperatur liegt vorzugsweise bei ca. 4ºC.
Die restlichen kleinen Bruchstücke von Stämmen und Stamm-Aggregaten können aus dem Überstand geeigneterweise mittels Filtration (Porengröße 0,45 um oder weniger) bei einer Temperatur, geeigneterweise von ca. 20 bis ca. 25ºC entfernt werden, um damit die Präzipitation des Detergens zu verhindern.
Die löslichen Proteine werden dann mit organischen Lösungsmitteln gefällt. Solche Lösungsmittel sind wasserlösliche organische Lösungsmittel, wie z.B. niedrige Alkylketone (1-5 C-Atome), geeigneterweise Aceton, niedere Carboxylsäuren, geeigneterweise Essigsäure oder tertiäre Alkylaminverbindungen, geeigneterweise Trimethyl- oder Triethylamin oder Lösungsmittelmischungen wie z.B. Chloroform/Methanol. Der so gebildete Niederschlag aus kleinerem nicht-kovalent gebundenem Protein wird gesammelt, im Fällungsmittel gewaschen und erneut in einer verdünnteren Lösung des vorstehenden Detergens gelöst, passenderweise bei einer Konzentration zwischen ca. 0,05 und 2 Gew.-%. Vorzugsweise wird die Lösung der Proteine durch kurzes Erhitzen, passenderweise über einen Zeitraum von ca. 2-5 Minuten und zwischen 80 und 100ºC unterstützt.
Die Auftrennung der so wieder in Lösung gebrachten Proteine kann auf jede geeignete Weise durchgeführt werden. Es wurde gefunden, daß eine Auftrennung mittels Chromatographie auf Gelfiltrationsmedien des Trennbereichs zwischen ca. 10 000 bis ca. 100 000 d erreicht werden kann (mit Chromatographiemedien wie z.B. Sephadex G75, G100, Biogel P100 oder P150, Ultragel ACA54, ACA44 oder es können äquivalente Trennmedien verwendet werden). Die Chromatographie wird unter Verwendung einer niedrigeren Konzentration alkalischen SDS-DTT-Puffers durchgeführt (0,05 bis ca. 0,5 Gew.-% SDS). Um die Präzipitation des Detergens zu verhindern, wird wieder eine erhöhte Temperatur bevorzugt (das heißt, ca. 20 bis ungefähr 25ºC). Alternativ können die Proteine mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese im präparativen Maßstab aufgetrennt werden, in welcher Methode die Protein-Banden sichtbar gemacht, ausgeschnitten und das Protein aus den Gel-Schnitten eluiert wird. Die Sichtbarmachung der Banden kann auch mittels
Anfärben erreicht werden, beispielsweise mit Coomassie Blau in methanolischer Essigsäure oder mittels SDS-Fällung in Gegenwart von Salzen, wie z.B. Natriumazetat oder Kaliumchlorid. In diesem Verfahren ist das Vollsaugen des Gels mit Kaliumchlorid mit einer Konzentration zwischen 0,25 M und 1,0 M bevorzugt. Nach kurzzeitigem Wässern zur Entfernung der Färbemittel oder Salze, wird das Protein von der Schnitte mittels Elektroelution in einem SDS-Puffer einer Ionenstärke von ca. 0,1 M entfernt oder mittels Mazeration und Diffusion in eine Lösung von SDS (1 bis 10 % gew/vol).
Schließlich können die niedergeschlagenen Proteine auch mittels HPLC aufgetrennt werden, wobei sie zuvor in einem geeigneten ionischen Lösungsmittel (vorzugsweise 0,5 bis 0,05 %-ige Trifluoressigsäure) suspendiert wurden. Die Trennung kann auch mittels Reverse-Phase Chromotagraphie auf einem geeigneten hydrophoben Säulenmaterial durchgeführt werden und mittels Elution mit einem organischen Lösungsmittelgradienten in Wasser, beispielsweise mit Acetonitril von 0 bis 100 %.
Die in den gepufferten Detergentien gesammelten Fragmente können in einer Salzlösung niedriger Konzentrationen dialysiert werden (Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Kaliumphosphat sind besonders geeignet mit Konzentration von 0,05 bis 0,15 M), gefolgt von einer Dialyse zur Entfernung der Salze, Farbstoffe und höherer Gehalte von aus der Reinigung dieser Proteine erhaltenem SDS. Solche Proteine mit einem Molekulargewicht zwischen 25 und 50 Kd stellen die gewünschte Fraktion dar, welche aufbewahrt wird.

Charakterisierung der Adhäsions-Proteine

Es ist interessant, zu beobachten, daß kristalline (aggregierte) Pili eine Hämagglutination von Erythrozyten, Erythrozytenghosts und anderen Vertebratenzellen bewirken, während einzelne Stamm-Pili keine Hämagglutination hervorrufen. Wenn Erythrozyten einzelnen Stamm-Pili (das sind mit kleinen Proteinen assoziierte Pilus-Stämme), oder wenn mit Zuckern, wie z.B. D-Mannose beschichtete Latexbetten aus Polystyrol einzelnen Pili-Stämmen ausgesetzt werden und entweder mittels Elektronenmikroskop oder einem hochauflösenden Lichtmikroskop beobachtet werden, kann man sehen, daß nichtsdestoweniger sich die einzelnen Stamm-Pili mit einer nahe an ihrem Ende gelegenen Stelle an die oben erwähnten Erythrozytenghosts oder Mannose-behandelten Polystyrolbetten anheften. Interessanterweise jedoch konnte beobachtet werden, daß, wenn diese anheftenden einzelnen Stamm-Pili einen Anti-Pilusstamm-Antiserum ausgesetzt werden, welches Antikörper gegen den Pilusstamm selbst aufweist, unmittelbar eine Hämagglunitation auftritt, da eine Quervernetzung zwischen den einzelnen angehefteten Pilus-Stämmen stattfindet.
Ein weiterer Beweis für die Bindungseigenschaften der erfindungsgemäßen Lectine kommt aus Beobachtungen eines mutierten Stammes von E. Coli mit Pili des Typs I. Wenn der Stamm K12-AW4045 (Sammlung des Department of Microbiology, University of Pittsburgh, Charles C. Brinton, Quelle - J. Adler) bei 37ºC oder darüber angezüchtet wird, wurde gefunden, daß er Pili produziert, welche keine nachweisbare Hämagglunitations-Aktivitäten in Bezug auf Erythrozyten aufwies. Wenn er aber dem Abbau-Verfahren mit Detergens nach der vorliegenden Erfindung unterzogen wurde, wurde gefunden, daß dieser Stamm, obwohl er kleinere Proteine aufweist, keine Proteine im Bereich von 25-50 Kd hatte.
Es wurde gefunden, daß die Qualität der Anheftung von bestimmten einzelnen Stamm-Pili durch Wirkung von Papain in Harnstoff inaktiviert werden kann. Wenn die Harnstoffkonzentration eine Konzentration von 4 M nicht überschreitet, tritt nur eine vernachlässigbare Inaktivierung auf. Andererseits tritt keine Inaktivierung bei einer Konzentration von 8 M Harnstoff auf, wenn Papain fehlt. Keines der im vorstehenden Abbau mit Detergens beschriebenen kleineren Proteine verursacht eine Hämagglutination. Desweiteren heftet sich keines dieser Proteine, mit Ausnahme von Lectin, an Erythrozytenghosts. Gleichermaßen kann die wechselseitige Anheftung zwischen nativem Pilus-assoziiertem Lectin und Erythrozyten durch Behandlung der nicht-angehefteten Lectine mit Antilectin-Antikörpern verhindert werden.
Infolge ihrer Spezifität gegenüber Kohlenhydraten finden die so produzierten Lectine vielerlei Anwendung. Sie können mittels herkömmlicher Methoden, z.B. Bromcyan, an solche Substrate wie z.B. Polystyrolgel gebunden werden, wobei sie als Affinitätssubstrate für die Reinigung von speziellen Kohlenwasserstoffen aus komplexen Mischungen dienen können, z.B. können sie gegenüber Mannose-spezifischen Pili des Typs I aus E. Coli und Salmonella zur Isolierung von Mannose aus diese enthaltenden Mischungen verwendet werden. Gleichermaßen können monoklonale Antikörper von Lectinen hergestellt werden, welche ihrerseits zur Bildung anti-idiotypischer Antikörper verwendet werden, welche dann wieder als anti-idiotypische Impfstoffe verwendet werden, um spezifische Idiotypen gegen die endständigen Adhäsionsproteine in dem System, in welchem sie verabreicht wurden, zu bilden. Desweiteren ist es möglich, Marker an die Lectine anzuheften, wobei die Lectine dann als Biosensoren zum Nachweis und Test von vorgegebenem Kohlenwasserstoff, wie z.B. Mannose, verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren, bei denen eine Dissoziation der Pili unter dem Einfluß milder Detergentien erfolgt, ermöglichen die Abtrennung von mit Stammpili assoziierten Lipopolysacchariden von diesem Stammpili. Dies stellt eine bedeutende Entwicklung bei der Herstellung von ganzen Pilusimpfstoffen dar, da die Lipopolysaccharide Antigenreaktionen ohne einen Nutzen für die Immunisierung hervorrufen.
Über die etwas stärkere Dissoziation mit einem Detergens ermöglichen die Verfahren auch die Herstellung reiner Pilusstämme, welche über Verfahren, wie z.B. den ELISA-Test, als diagnostisches Hilfsmittel für die Charakterisierung von Pilusfamilien von Nutzen sind.

BEISPIEL I

Reinigung der Pili

Mit Pili des Typs I von E. Coli versehene Bakterien (ATCC Stamm Bam; Sammlung des Department of Microbiology, University of Pittsburgh, Charles C. Brinton - Quelle E. Kellenberger, Genf, Schweiz (1954)) werden auf einem festen Vollmedium nach herkömmlicher Art und Weise bei einer Temperatur im Bereich von 22-37ºC angezüchtet. Die Bakterienmasse wird dann in wässrigem Natriumchlorid (0,15 M) suspendiert und intensiv vermischt (10 000 g, über einen Zeitraum von 2 Minuten). Das Produkt wird sodann bei 10 000 Upm zentrifugiert, die restlichen Zelltrümmer abgetrennt und die in Lösung gebrachten Pili durch Zugabe wässrigen Magnesiumchlorids (0,1 M) aggregiert. Die aggregierten Pili werden dann durch ähnliche Zentrifugation gefällt und der Überstand verworfen. Der vorbeschriebene Lösungs/Fällungs-Zyklus wird mindestens dreimal wiederholt, um im wesentlichen reine Pili des Typs I aus E. Coli zu erhalten. Die Pili (100 mg) werden in SDS (40 ml, 4 % w/w) und Dithiothreitol (10mM) von pH 8 suspendiert und über einen Zeitraum von 15 Minuten bei 25ºC intensiv gerührt und danach bei 10 000 g zentrifugiert. Der Niederschlag enthält im wesentlichen von Lipopolysaccharid-Verunreinigungen freie Pili.

BEISPIEL II

200 mg Pili des Typs I von E. Coli wurden in einer wässrigen Lösung aus Natriumdodecylsulfat (10 ml 4%-ige Lösung) mit 10mM Dithiothreitol (DTT) und 10mM Tris bei pH 8 suspendiert und über einen Zeitraum von 5 Minuten gekocht. Die Mischung wurde auf 20 bis 25ºC abgekühlt und mittels Zentrifugation bei 100 000 g über einen Zeitraum von 1 Stunde sedimentiert, um als Niederschlag die mittels SDS aggregierten Pilinstämme zu erhalten.
Der Überstand enthält die drei kleineren Proteine mit Molekulargewichten von näherungsweise 28 Kd, 16,5 Kd und 14,5 Kd, was mittels SDS-Polyacrylamidelektrophorese nachgewiesen werden konnte.

BEISPIEL III

Abtrennung der kleineren Proteine

Die wässrige Lösung, welche die Proteine aus dem vorigen Beispiel enthielt, wurde mit Aceton (100 ml) behandelt. Infolge davon wurden die Proteine gefällt, sodann die Mischung bei 10 000 g über einen Zeitraum von 15 Minuten zentrifugiert, der Überstand verworfen und der Niederschlag in einer 10mM Tris, 1mM Dithiothreitol bei pH 8 enthaltenden SDS-Lösung (10 ml 1 %-ige Lösung) erneut suspendiert. Die Mischung wurde auf eine Sephadex G75-Säule (1,5 x 110 cm) aufgetragen und die Proteine mit einem ähnlichen SDS-Puffer (0,1 %-ig) eluiert. Die Ausflußrate betrug 8 ml/hr und es wurden 1 ml Fraktionen gesammelt. Die Gelchromatographie (Figur 2) zeigte, daß die Proteine von 28 Kd im wesentlichen in den Fraktionen 3 bis 8 enthalten waren, ausgehend vom Leervolumen.
Die Fraktionen wurden vereinigt und wie oben beschrieben mittels Aceton ausgefällt. TABELLE II Analyse der Aminosäuren von Pilus-assoziierten Proteinen aus den vorigen Versuchen Stamm-Untereinheit Aminosäsure Analysendaten für Aminosäuren der Pilus-assoziierten Proteine aus den Bakterienstämmen Salmonella Newport #37518 und E. Coli des Tys I vom Stamm BAM.

BEISPIEL IV

Inaktivierung der Pili mit Papain

Die Pili mit reinen Pilusstämmen (kristallin) wurden erneut in 50mM NaCl, 10mM Tris, 10mM Cystein-HCl, 5mM EDTA bei pH 7,4 mit unterschiedlichen Harnstoffkonzentrationen auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml suspendiert. Eine frisch zubereitete Lösung von wässrigem Papain wurde zur Hälfte einer jeden Pilus-Harnstoffsuspension bis zu einem endgültigen Verhältnis von Pilus: Papain von 25:1 (gew:gew) zugesetzt. Der restlichen Hälfte wurde kein Papain zugesetzt. Die Pili (0,5 ml) in Harnstoff mit oder ohne Papain wurden bei 37ºC über einen Zeitraum von 1 Stunde inkubiert, sodann in einzelne Dialyseschläuche überführt und genügend lange gegen destilliertes Wasser dialysiert. Der Nachweis der Proteolyse wurde mittels SDS-PAGE entpolymerisierter und nicht-entpolymerisierter mit Papain behandelter Pili beurteilt.
Die Behandlung mit Papain hatte keine Auswirkung auf irgendein mit einem ganzen Pilus assoziiertes Protein, falls Harnstoff nicht in einer Konzentration über 4 M vorhanden war. In diesen Proben blieb nur die 28 Kd-Bande aus. In 8 M Harnstoff in Abwesenheit von Papa in ereignet sich keinerlei Degradation irgendeiner Bande.
Die relative Adadhäsionsaktivität von mit Papain und Harnstoff behandelten Pili wurde mittels passiver Hämagglutination (Ha) bestimmt. Dialysierte lösliche Pili wurden zweimal nacheinander in Phosphat-gepufferter 50mM Natriumchloridlösung mit 4 % Sorbit gelöst. Ein gleiches Volumen mit 2 %-igem Blut von Meerschweinchen wurde zugegeben, die Mischung über einen Zeitraum von 30 Minuten inkubiert und dann zum gleichen Volumen eines gegen ganze Pili gerichteten Serums mit einem Titer von 1:100 gegeben. Als Titrationsendpunkte wurde die Stärke der relativen Hämagglutination genommen. Die Behandlung von Pili mit Harnstoff in einer Konzentration von 0-8 M in Abwesenheit von Papain hatte keinerlei Wirkung auf die Aktivität der Hämagglutination. Die Aktivität von mit Papain inkubierten Pili wurde bei Harnstoffkonzentrationen unter 4 M nicht berührt, fiel aber bei Harnstoffkonzentrationen von 4 M oder darüber in Gegenwart des Enzyms auf vernachlässigbare Werte ab. Obwohl keine Anstalten gemacht wurden, die restliche Papainaktivität im Agglitunationstest zu eliminieren, zeigten Kontrollversuche, daß Ergebnisse aus solchen Tests, welchen absichtlich aktives Papain zugesetzt worden war, identisch mit denen ohne Zugabe des Enzyms waren.

BEISPIEL V

Koppeln von Lectin mit einem Molekulargewicht von 28 Kd an Festbetträger zur Verwendung als spezifischer Mannose-Rezeptornachweis

100 mg Lectin aus Typ I von E. Coli (Stamm BAM), hergestellt gemäß Beispiel III, wird mit 10 ml Bromcyan-Sepharosegel (Pharmacia) in einer Mischung von 0,1 M NaHCO&sub3; und o,5 M NaCl bei pH 8,3 gemischt. Die Mischung wird über einen Zeitraum von 2 Stunden bei Zimmertemperatur gelinde gerührt und die nicht reagierten Bromcyan-Gruppen mit 1 M Ethanolamin über einen Zeitraum von 2 Stunden bei Zimmertemperatur blockiert. Das überschüssige ungebundene Protein wird zunächst mit Kopplungspuffer und sodann mittels 0,1 M Acetatpuffer (pH 4) mit 0,5 M NaCl ausgewaschen. Nach erneutem Auswaschen mit Kopplungspuffer zur Entfernung überschüssigen Blockierungsmittels kann die mit Lectin konjugierte Sepharose als Nachweis für Mannose-spezifische Rezeptorbindungsstellen-enthaltende Materialien verwendet werden.

Claims

1. Bactolectin aus den Typ I - Pili von E. Coli oder S. Newport mit einem Molekulargewicht zwischen ca. 27 und 35 Kd, welches nicht kovalent an das Strukturprotein dieser Pili gebunden ist und unter Einwirkung wässrigen Dodecylsulfats davon abgetrennt werden kann und welches eine einzelne D-Mannose spezifische Bindungsstelle für die Bindung an Erythrozytenghosts von Säugetieren aufweist.

2. Lectin nach Anspruch 1 mit einer D-Mannose -spezifischen Bindungsstelle mit Erythrozytenghosts von Säugetieren, welches durch Einwirkung wässrigen Papains in Gegenwart von mindestens 4M Harnstoff inaktiviert werden kann, jedoch bei niedrigeren Harnstoffkonzentrationen im wesentlichen unverändert bleibt und bei Harnstoffkonzentrationen unter 8M in Abwesenheit von Papain unbeeinflußt bleibt.

3. Verfahren zur Isolierung eines Lectins gemäß Anspruch 1 aus im wesentlichen reinen Pili in den Schritten:

a) Suspendieren der Pili in wässriger Lösung eines Detergens mit einer Konzentration von ca. 5 bis 2 Gew.% bei einem pH von ungefähr 7 bis 9,

b) Inkubieren dieser Mischung im Temperaturbereich von ca. 20 bis 40ºC,

c) Gewinnung des ungelösten Materials aus der Mischung,

d) Verwerfen der wässrigen Phase von c),

e) das ungelöste Material wieder in einer wässrigen Lösung gemäß a) lösen,

f) Inkubieren dieser Mischung im Temperaturbereich von ca. 80 bis 100ºC,

g) Entfernen des ungelösten Materials aus der Lösung,

h) Fällen des gelösten proteinhaltigen Materials in der verbleibenden wässrigen Phase nach g) durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkanols, Alkylketons, einer Carboxylsäure oder einem Lösungsmittel aus tertiärem Amin,

i) Abtrennen des Niederschlags und erneutes Lösen desselben in einer wässrigen Lösung wie unter a) in einer Konzentration im Bereich von ca. 0,5 bis 2 Gew.%, und

j) Abtrennen der Proteine und Isolierung der Fragmente mit Molekulargewichten zwischen ca. 25 und 50 Kd.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Detergens Natriumdodecylsulfat oder Sarkosin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Niederschläge mittels Zentrifugation bei mindestens 10.000 g abgetrennt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Niederschläge mittels Zentrifugation von bis zu 100.000 g abgetrennt werden.

7. Verfahren zur Reinigung einzelner Pilistäbchen durch Entfernung zumindest üblicherweise damit assoziierter Lipopolysaccharide unter Beibehaltung der Haftung allgemein daran assoziierter anderer Proteine in den Schritten:

a) Suspendieren dieser Pili in einer wässrigen Lösung eines Detergens in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 5 bis 2 Gew.% bei einem pH von ca. 7 bis 9,

b) Inkubieren dieser Mischung in einem Temperaturbereich von ungefähr 20 bis 40 ºC, und

c) Rückgewinnen und Aufbewahren des ungelösten Materials aus im wesentlichen reinen einzelnen Pilistäbchen aus dieser Mischung.

8. Verfahren zur Isolierung reinen Pilus-Proteins aus im wesentlichen reinen Pili eines Organismus aus E. coli oder Salmonella-Stämmen in den Schritten:

a) Suspendieren dieser Pili in einer wässrigen Lösung eines Detergens in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 5 bis 2 Gew.% bei einem pH von ungefähr 7 bis 9,

b) Inkubieren dieser Mischung in einem Temperaturbereich von ungefähr 20 bis 40ºC,

c) Rückgewinnung ungelösten Materials aus dieser Mischung,

d) Verwerfen der wässrigen Phase aus (c),

e) Wiederauflösen dieses ungelösten Materials in einer wässrigen Lösung wie in (a) angegeben,

f) Inkubieren dieser Mischung in einem Temperaturbereich von ungefähr 80 bis 100ºC, und

g) Rückgewinnen und Aufbewahren des ungelösten Materials, welches im wesentlichen aus weitgehend reinem Pilus-Protein aus dieser Mischung besteht.4