DE3751997T2

DE3751997T2 - Aktives protein in humoraler hyperkalzemia, durch bösartigkeit verursacht

Info

Publication number: DE3751997T2
Application number: DE3751997T
Authority: DE
Inventors: Bruce Kemp; Thomas Martin; Jane Moseley; Richard Wettenhall
Original assignee: University of Melbourne
Current assignee: University of Melbourne
Priority date: 1986-07-18
Filing date: 1987-06-04
Publication date: 1997-07-10
Anticipated expiration: 2007-06-05
Also published as: JP2598801B2; EP0273928A4; JPH09216899A; US5460978A; EP0273928A1; DE3751997D1; US5116952A; JPH08211053A; JP2657053B2; US5703207A; JP2807660B2; WO1988000596A1; CA1341030C; US5872221A; EP0273928B1; JPH01501148A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein in bösartiger humoraler Hyperkalzämie aktives Protein, das nachstehend als PTHrP (parathyroid hormone related protein, mit Nebenschilddrüsenhormon verwandtes Protein), ACSF (Adenylatcyclase-stimulierender Faktor) oder BRF (bone releasing factor, Knochenfreisetzungsfaktor) bezeichnet wird.
Die Erfindung betrifft weiters Peptidfragmente von PTHrP und die Reinigung und teilweise Sequenzbestimmung von PTHrP. Die Erfindung betrifft außerdem Antikörper gegen PTHrP oder Fragmente davon und Sets, die diese Antikörper enthalten und sich zur Identifizierung von PTHrP eignen. [ANMERKUNG: Hier zitierte Literaturstellen sind mit vollständigem Wortlaut am Ende der Beschreibung angegeben.]
Bösartige humorale Hyperkalzämie (HHM) ist eine sehr häufige Komplikation bei bestimmten Krebsarten, besonders beim schuppenförmigen (squamösen) Lungenkarzinom, bei dem sie einen wesentlichen Morbiditäts- und Mortalitätsfaktor darstellt (1,2). Vom Krebs stammende humorale Faktoren können die Kalziumwerte im Blut erhöhen, indem die Knochenresorption gefördert und die Kalziumausscheidung durch die Niere eingeschränkt wird (1-3). Obwohl man viele Jahre lang der Ansicht war, daß die "ektopische" Produktion von Nebenschilddrüsenhormon (PTH) durch diese Krebsarten die Ursache für das HHM-Syndrom ist (4, 5), stellte sich nun heraus, daß andere Faktoren als PTH dafür verantwortlich sind (1-3, 6-8), darunter die Umwandlungswachstumsfaktoren (TGF's), die Substanzen sind, die die Knochenresorption hochwirksam fördern (2, 3, 9-11). Es gibt auch Hinweise auf die Bildung eines Faktors von bestimmten Krebsarten, der sich immunologisch von PTH unterscheidet, diesem jedoch bezüglich der Stimulierung der Adenylatcyclase-Aktivität in PTH- Zielzellen (Niere und Knochen) ähnelt, indem er entweder direkt auf den PTH-Rezeptor oder auf eine eng verwandte Membrankomponente einwirkt. Eine solche Möglichkeit wurde auf der Grundlage klinischer Beweise vermutet (7), wobei man die Aktivität in Tumorextrakten aus Patienten mit HHM (12, 13), in konditioniertem Medium aus einer Nierenrindenkarzinomzelle (14), in Tumorextrakten und kulturkonditionierten Medien aus Tiermodellen von HHM (15, 16) feststellte.
Die Anmelder entdeckten, daß die BEN-Zellinie, die ursprünglich aus einem Patienten mit Hyperkalzämie und einem squamösen Zellkarzinom der Bronchie gebildet wurde (1 7), beträchtliche Mengen dieser PTH-ähnlichen Aktivität (bislang als PTHrP beschrieben) erzeugt, die Adenylat-Cyclase in osteoblast-ähnlichen Zellen stimuliert.
Babbani et al. (54) offenbaren die Reinigung PTH-ähnlicher Peptide aus menschlichen squamösen Zellen und Leydig-Zeilen aus Ratten.
Den Anmeldern ist es nun gelungen, PTHrP zu reinigen und zu charakterisieren.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist im wesentlichen reines PTHrP nach Anspruch 1 bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Fragment einer Aminosäurevariante von PTHrP mit PTHrP-Aktivität nach Anspruch 4 bereitgestellt.
Die Erfindung bietet weiters eine modifizierte Untereinheit von PTHrP nach Anspruch 5.
Die Isolierung und Reinigung von PTHrP ermöglicht die Durchführung von Forschungsarbeiten zur Charakterisierung seier Rolle bei humoraler bösartiger Hyperkalzämie.
PTHrP oder Peptidfragmente davon können dazu dienen, sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörperreagentien durch auf dem Gebiet an sich bekannte Verfahren zu bilden. Beispielsweise können Antikörperreagentien durch Immunisieren geeigneter Wirtstiere mit PTHrP oder Peptidfragmenten davon entweder alleine oder in Gegenwart von Adjuvantien und/oder Trägerproteinen gebildet werden. Beispiele geeigneter Wirte sind Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe, Pferde, Ziegen und Kühe. Wenn monoklonale Antikörperreagentien hergestellt werden, entsprechen die allgemein angewendeten Verfahren der durch Kohler et al. (18) und Kennet et al. (19) beschriebenen Vorgangsweise.
Antikörperreagentien gegen PTHrP können in Assays verwendet werden, um die PTHrP- Aktivität z.B. in Vollblut, Blutplasma oder anderen biologischen Flüssigkeiten nachzuweisen. Solche Reagentien sind insbesondere bei der Untersuchung und als Hilfe bei der Diagnose von Krebspatienten, Patienten mit chronischem Nierenversagen und anderen Knochenkrankheiten nützlich, bei denen man annimmt, daß PTH selbst eine Rolle spielt.
Antikörper gegen PTHrP und Peptidfragmente davon eignen sich auch als immunhistochemische Diagnosereagentien zur Immunlokalisierung von Zellen, die PTHrP in verschiedenen Geweben produzieren können.
Für Diagnosezwecke können Antikörperreagentien Antikörper gegen PTHrP umfassen, die günstigerweise mit einem nachweisbaren Marker markiert wurden, z.B. Rhodamin, Fluorescein, kolloidales Gold, Meerrettich-Peroxidase, β-Galactosidase, Urease, alkalische Phosphatase, Phycobiliproteine, Luciferase, Ferritin, ¹²&sup5;I, ³²P, ³H oder ¹&sup4;C.
Die Anmelder bildeten Antikörper gegen synthetische Peptide von PTHrP. Diese Antikörper können zum Nachweis von PTHrP oder Fragmenten davon z.B. durch Radioimmunassay (50) oder Western-Blot-Verfahren (51) herangezogen werden. PTHrP, das durch kultivierte Tumorzellen in vitro hergestellt wurde, oder durch Tumore in vivo erzeugtes PTHrP kann mittels dieser Antikörper oder anderer Antikörperreagentien gegen PTHrP nachgewiesen werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Antikörperreagentien gegen PTHrP und Fragmente davon bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Set zum Nachweis von PTHrP oder Fragmenten davon bereitgestellt, umfassend einen oder mehrere Antikörperreagentien, die sich an Epitope von PTHrP binden können.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Sets können Antikörper gegen PTHrP enthalten, die z.B. mit fluoreszierenden, radioaktiven oder proteinhältigen Markern - wie oben erwähnt - markiert wurden. Die Sets können auch einen oder mehrere markierte sekundäre oder tertiäre Antikörper enthalten. Zusätzlich können die Sets Puffer zur Verdünnung der Reagentien und verschiedene Träger wie z.B. Schalen oder Tabletts zur Durchführung von Assays enthalten. Antikörper gegen PTHrP oder Fragmente davon können gefriergetrocknet sein und sich daher in Pulverform zur Suspension in einer geeigneten wäßrigen Lösung eignen. Alternativ dazu können die Antikörper in einer lagerfähigen wäßrigen Lösung vorhanden sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von PTHrP oder seinen Fragmenten in einer bestimmten proteinhältigen Probe bereitgestellt, umfassend das In-Kontakt-Bringen der Probe oder des Trägers, auf dem das Protein in der Probe immobilisiert ist, mit Antikörperreagentien, die sich an Epitope von PTHrP binden können; und das anschließende Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörperbindung.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von PTHrP oder seinen Fragmenten in einer bestimmten Probe bereitgestellt, umfassend das Inkubieren der Probe mit einem Träger, an den Antikörper gebunden sind, die PTHrP-Epitope binden können, über einen Zeitraum, der zur Antikörperbindung ausreicht, und anschließend das Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von gebundenem PTHrP mit Antikörperreagentien, die PTHrP-Epitope binden können.
Die Reinigung von PTHrP und die Bestimmung seiner N-terminalen Aminosäuresequenz ermöglicht die Herstellung synthetischer Oligonukleotide, die der Aminosäuresequenz von PTHrP entsprechen. Diese Oligonukleotide können dann als Hybridisierungssonden verwendet werden, wodurch die Isolierung des oder der für PTHrP kodierenden Gene vereinfacht wird. Solche Oligonukotide eignen sich auch als diagnostische Reagentien, zum Nachweis der Expression von für PTHrP kodierender mRNA und für Untersuchungen der Steuerung der Expression des oder der für PTHrP kodierenden Gene.
Durch die menschliche Tumorlinie BEN hergestelltes PTHrP besteht in zwei Formen mit identischer biologischer Aktivität, die sich jedoch bezüglich Immunkreuzreaktivität, Molekulargewicht und Elutionsverhalten auf der HPLC voneinander unterscheiden. Beide dieser PTHrP-Formen liegen im Schutzumfang der Erfindung.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird PTHrP nach Anspruch 23 aus Medium gewonnen, in dem BEN-Zellen kultiviert wurden.
Die vorliegende Erfindung bietet weiters ein Verfahren nach Anspruch 22.
Es folgt eine ausführliche Beschreibung verschiedener Aspekte der vorliegenden Erfindung durch Beispiele und unter Bezugnahme auf die beigelegten Abbildungen, worin:
Fig.1 ein HPLC-Profil der Absorption bei 215 nm und der biologischen Aktivität beim Endreinigungsschritt von PTHrP zeigt:
A 220 µm gesammeltes Peak B-Material aus der Vydac-HPLC wurde auf eine C18- Bakerbond -Säule (25 x 0,46 cm) aufgegeben. Die Elution erfolgte unter Verwendung eines Gradienten von 0-60% Acetonitril/0,1% TFA bei einer Rate von 0,66% pro Minute. Fraktionen wurden gemäß den bei 215 nm beobachteten Proteinpeaks gesammelt. Die Adenylatcyclase-Aktivität wurde in 10 µl-Aliquoten aus jeder Fraktion untersucht, und die Werte wurden um die Fraktionsvolumina korrigiert.
B 6 µg hPTH- (1-34) Äquivalente, die aus Versuch A gepoolt wurden (Fraktionen 51-55), wurden erneut auf die Säule aus obigem Versuch A aufgebracht und in einem Gradienten von 0-68% Acetonitril/0,9% TFA bei einer Rate von 0,33% pro Minute eluiert.
Fig.2 zeigt ein SDS-Polyacrylamidgel der Fraktionen 31, 32 und 34 von Fig.1;
Fig.3 zeigt eine Kurve der biologischen Aktivität der Fraktion 31 ( ) von Fig.1, die gegen Rinder-PTH (1-34) (o) in intakten UMR 106-Zellen untersucht wurde;
Fig.4 zeigt ein HPLC-Profil von gereinigtem PTHrP, das nach SP Sephadex - Chromatografie und zwei Bakerbond-Chromatografieschritten, wobei auf einer RP- HPLC-Säule (Bakerbond C18, weitporig, 25 x 0,46 cm) chromatografiert wurde. Das Insert zeigt silbergefärbte Gelprofile aus der SDS-PAGE von Fraktion 47 und Molekulargewichtsstandards.
Fig.5 zeigt ein HPLC-Profil von PTHrP (100 pmol) nach Spaltung mit Trypsin. Die tryptische Spaltlösung wurde auf einer C8-Brownlee-Patrone (cartridge, 10 cm x 2,1 mm) bei einer Flußrate von 250 µl/min chromatografiert. Ein 0-50% Acetonitril-Gradient in 0,1% TFA (1%/min) wurde verwendet.
Fig.6 zeigt das gesammelte Material der Fraktionen 46 und 48 von Fig.4, chromatografiert auf einer Brownlee C8 (2,1 mm) Mikroporen-Säule (microbore column). Das Insert zeigt den Diodenarray-Nachweis des Hauptpeaks.
Fig.7 zeigt einen Radioimmunassay mit verschiedenen unmarkierten Peptiden, I¹²&sup5;- markiertes [Asn¹&sup0;, Tyr¹&sup7;]-PTHrP (1-17) als Tracer und Kaninchen-Antiserum gegen das synthetische PTHrP- (1-17) Peptid. Gebundenes Peptid/freies Peptid wird gegen die Menge an Peptid/ml aufgetragen.
A Unmarkierte Peptide waren: [Glu&sup8;, Asn¹&sup0;, Cys¹¹]PTHrP (1-11) (o), [Asn¹&sup0;]PTHrP (1-16) ( ), hPTH (1-10) ( ), hPTH (1-34) ( ), mit Ratten-Calcitoningen verwandtes Peptid (CGRP), menschliches Adrenocorticotropin und Rinderinsulin (alle bei 10 µg/ml, Δ).
B Unmarkierte Peptide waren: [Glu&sup8;, Asn¹&sup0;, Cys¹¹]PTHrP (1-11) (o), Ratten-PTH (1- 34) (1), Rinder-PTH (1-34) ( ), menschliches PTH (1-34) ( ), Ratten-CGRP (10µg/ml, Δ), Lachs-Calcitonin (10µg/ml, ).
Fig.8 zeigt einen Vergleich des biologischen Assays (o) und des Radioimmunassays ( ) von Fraktionen aus der HPLC von teilweise mit SP-Sephadex gereinigtem PTHrP.
Fig.9 zeigt:
A die biologische Aktivität von synthetischem PTHrP (1-34) ( ) bei der Steigerung der Bildung von zyklischem AMP in UMR 106-01-Zellen im Vergleich zu Rinder-PTH (1-34) (o) als Standard; und
B die Wirkung von synthetischem PTHrP (1-34) ( ) und Rinder-PTH (1-34) (o) auf die Plasminogenaktivator-Aktivität in auf ¹²&sup5;I-Fibrin ausplattierten UMR 106-01-Zellen, Der Assay erfolgte nach dem bereits beschriebenen Verfahren von Allan et al (52).
Fig.10 zeigt eine Western Blot-Analyse von PTHrP-Protein aus zwei Proben von Peaks A aus Beispiel 3 (A1 und A2, Spalten 2 und 3), von hochgereinigtem Rindernebenschilddrüsen-Hormon (Spalte 1) und von hochgereinigtem PTHrP aus Peak B aus Beispiel 3 (Spalte 4). Die Proben wurden auf SDS-PAGE getrennt, auf Nitrozeulose übertragen; mit Kaninchen-Antiserum gegen PTHrP (1-16) sondiert; gewaschen und mit ¹²&sup5;I- markierten Fab-Fragmenten von Ziegen-anti-Kaninchen-IgG&sub1; inkubiert sowie autoradiografiert. Die Molekulargewichtstandards sind mit horizontalen Pfeilen gekennzeichnet.

Definitionen:

"PTHrP" bezieht sich hierin auf ein bei der bösartigen humoralen Hyperkalzämie aktives Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1 5.000 und 25.000 Dalton, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, das weiters bei der Stimulierung der Adenylatcyclase-Aktivität in geeigneten Zielzellen (wie z.B. in UMR 106-01-Zellen) in ähnlicher Weise wie Nebenschilddrüsen-Hormon aktiv ist.
Wie bereits erwähnt, ist aus BEN-Zellen gereinigtes PTHrP polymorph und besteht in zwei unterschiedlichen Formen mit im wesentlichen identischer biologischer Aktivität. Eine dieser Formen besitzt ein Molekulargewicht von 15-18 K, bestimmt durch SDS- PAGE, und eine in Tabelle 1 dargelegte N-terminale Sequenz. Die andere Form besitzt ein Molekulargewicht von 18-25 K. Diese zweite Form zeigt eine Kreuzreaktion mit Antiseren gegen die erstere Form von PTHrP. Beide Formen von PTHrP liegen im Schutzbereich der Erfindung und werden durch den Ausdruck "PTHrP" abgedeckt.
Weiters liegen allele Varianten von PTHrP, die PTHrP-Aktivität aufweisen, im Schutzbereich der Erfindung und werden ebenfalls durch den Ausdruck "PTHrP" abgedeckt. Solche Varianten werden durch Deletion, Substitution oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren zur Sequenz von PTHrP dargestellt, die (teilweise) in Tabelle 1 veranschaulicht ist. Varianten, in denen die in Tabelle 1 gezeigten natürlich vorkommenden Aminosäuren gelöscht und/oder durch andere Aminosäuren substituiert sind oder weitere Aminosäuren der natürlichen Sequenz von PTHrP addiert wurden, können durch herkömmliche Proteinsynthese-Verfahren (41) oder durch rekombinante DNA-Technologie (53) hergestellt werden. Solche Varianten, die PTHrP-Aktivität aufweisen, sind im Schutzbereich der Erfindung enthalten und werden ebenfalls durch den Ausdruck "PTHrP" abgedeckt.
"Im wesentlichen rein" bezieht sich im Zusammenhang mit PTHrP auf PTHrP, wenn es im wesentlichen frei von Protein und anderem kontaminierendem Material ist, das normalerweise mit PTHrP assoziiert ist; das im allgemeinen zu einer einzigen Bande in der SDS-PAGE führt; und worin allgemein etwa 95-100 Gew.-%, üblicherweise etwa 97 Gew.-% des gesamten Proteins PTHrP ist. "PTHrP" unterscheidet sich gemäß der Praxis der Erfindung von uncharakterisierten Rohpräparaten aus Material mit PTH-ähnlicher Aktivität, die in Veröffentlichungen des Stands der Technik beschrieben sind. Diese Präparate des Stands der Technik (54 und 55) bestanden aus einer großen Anzahl von Proteinen, wobei der aktive Faktor im Vergleich zur Gesamtmenge an Protein und anderem Material in sehr kleinen Mengen vorhanden war. Diese Präparate eigneten sich nicht zur Proteinsequenz-Analyse oder zur Bildung von für PTHrP spezifischen Antikörpern.
Die Ausdrücke "Untereinheit" oder "Fragment" beziehen sich hierin auf Abschnitte des PTHrP-Proteins, die für PTHrP einzigartig sind. Man beachte, daß dies explizit eine einzelne Aminosäure ausschließt. Im allgemeinen sind Peptide mit einer Länge von weniger als 5 Aminosäuren nicht einzigartig.
"Epitop" bezieht sich hierin auf jeden antigenen Abschnitt von PTHrP oder seine Fragmente oder Untereinheiten, die eine Immunreaktion hervorrufen können.

Abkürzungen:

HPLC Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie
SDS-PAGE Natriumdodecylpolyacrylamidgel-Elektrophorese
PTH Nebenschilddrüsen-Hormon
hPTH menschliches Nebenschilddrüsen-Hormon
PTHrP (1-11) ein den Aminosäuren 1 bis 11 aus Tabelle 1 entsprechendes synthetisches Peptid von PTHrP
PTHrP (1-16) ein den Aminosäuren 1 bis 16 aus Tabelle 1 entsprechendes synthetisches Peptid von PTHrP
PTHrP (1-17) ein den Aminosäuren 1 bis 17 aus Tabelle 1 entsprechendes synthetisches Peptid von PTHrP
TPHrP (1-34) ein den Aminosäuren 1 bis 34 aus Tabelle 2 entsprechendes synthetisches Peptid von PTHrP
CGRP mit dem Ratten-Calcitoningen verwandtes Peptid
TFA Trifluoressigsäure

BEISPIEL 1

Biologischer Assay hinsichtlich PTHrP-Aktivität

Der biologische Assay verwendet die dosisabhängige Bildung von zyklischem AMP als Reaktion auf PTH in osteoblast-ähnlichen Zellen, wie z.B. in der weit verbreiteten UMR 106-01-Zellinie (20-40). Es gibt verschiedene Durchführungsmöglichkeiten des Assays, einschließlich der direkten Messung der Adenylatcyclase-Aktivität in Membranen von Homogenaten osteoblast-ähnlicher Zellen und des Assays von durch intakte Zellen gebildetem zylischen AMP. Aus Gründen der Einfachheit und Bequemlichkeit sowie um die Untersuchung sehr vieler Proben zu ermöglichen, untersuchten die Anmelder die Reaktionen durch Züchten von UMR 106-01-Zellen als identische Kulturen in 12-Napf- Kunststoffschalen, Markieren des zellulären ATP-Pools mit ³H durch zweistündiges Präinkubieren mit ³H-Adenin, kurzes Waschen der Zellen und anschließendes Zugeben von 1 mM Isobutylmethylxanthin, einem Phosphodiesterase-Hemmer. Nach 10 Minuten wurden die Reaktionen abgebrochen und zyklisches ³H-AMP durch aufeinanderfolgende Chromatografie auf Dowex und neutralem Aluminiumoixd von Inkubaten gereinigt. Die Zellen reagieren auf PTH und Prostaglandine der E-Reihe (vor allem PGE&sub2;) mit dosisabhängigen Zunahmen der Bildung von zyklischem AMP. Dies wurde zu einem einfachen reproduzierbaren biologischen Assay hinsichtlich PTH oder PTH- ähnlicher Aktivität entwickelt (34, 40). Die Reaktion auf PTH, jedoch nicht jene auf PGE&sub2;, wird in diesem System durch vorhergehende Inkubation der Proben mit Peptidantagonisten von PTH (40) oder mit einem anderen Antiserum gegen PTH, das gegen synthetisches menschliches PTH (1-34) hergestellt wurde (40), gehemmt.

BEISPIEL 2

Von BEN-Zellen gebildete PTHrP-Aktivität

Wenn BEN-Zellkulturmedium direkt im in Beispiel 1 beschriebenen biologischen Assay geprüft wird, zeigt es die Fähigkeit, die Bildung von zyklischem AMP zu stimulieren. Die Aktivität ist in Reihenverdünnungen des Mediums nachweisbar, oft in Verdünnungen bis zu 1:100. Verdünnungen von rohem Kulturmedium stimulieren die Aktivität parallel zu der durch PTH bewirkten; die Präinkubation von Medium mit Ziegen-antimenschlichem PTH (1-34) übt keinen Einfluß auf die PTHrP-Aktivität aus, obwohl das gleiche Antiserum die Aktivität von hPTH (1-34) selbst völlig auschaltet (40). Die synthetischen Peptide, [³&sup4;Tyr]hPTH(3-34)amid und [³&sup4;Tyr]hPTH(5-34)amid, hemmen jeweils Reaktion vin die zyklischem AMP auf PTHrP und hPTH(1-34) in den UMR 106- 01-Zellen, doch diese Antagonisten haben keine Wirkung auf die Reaktion auf PGE&sub2; in den gleichen Zellen (40).
Die Inkubation von BEN-Zellmedium mit Trypsin führt zum Verlust der biologischen Aktivität von PTHrP, wie es zu erwarten war, da es sich um ein Protein handelt. Es ist mäßig wärmestabil, da es einer Temperatur von 100ºC zwei Minuten lang standhält. Die Gelfiltration von serumfreiem, von BEN-Zellen konditioniertem Medium auf Biogel P60 in 0,1 M Essigsäure, wobei ein biologischer Assay der Auffangröhrchen zeigte, daß die Aktivität in einem Makromolekül mit einem Molekulargewicht von etwa 40.000 liegt. Dies erwies sich später als eine zu hohe Schätzung, was wahrscheinlich auf die Assozuerung des aktiven Materials mit einem anderen Protein im Rohzustand zurückzuführen war.
Der PTH-Radioimmunassay erfolgte mit einigen unterschiedlichen Antiseren, zwei mit carboxyterminaler Spezifität, einem Molekül für die Mitte und einem aminoterminalen Assay. Immunreaktives PTH wurde in keinem Fall in BEN-Zellenmedium festgestellt.
Es stellte sich heraus, daß BEN-Zellen bis zur Konfluenz gezüchtet, frei von Serum gewaschen und 24 Stunden lang in serumfreiem Medium (50% Dulbecco modifiziertes Eagles-Medium-50% Medium 199) inkubiert werden konnten, wobei große Mengen an PTHrP-Aktivität (nachweisbar bei Verdünnungen bis zu 1/100) erzeugt werden konnten. Dies wird daher als das Standardverfahren zur Ansammlung großer Mengen von aktives Material enthaltendem Medium angewendet, das bis zum Beginn der Reinigung bei - 20ºC gelagert wird.

BEISPIEL 3

Reinigung von PTHrP aus BEN-Zellkulturmedium

BEN-Zellkulturmedium (serumfreie 24-Stunden-Inkubationen) wird gesammelt und die PTHrP-Aktivität durch biologischen Assay gegen menschliches PTH(1-34) als Standard im Assay der Reaktion von UMR 106-01 auf zyklisches AMP bestimmt. Die gesammelten Chargen des Mediums - jeweils 5 Liter - werden nach dem Ansäuern auf einen pH-Wert von 4,8 mit 1 M Essigsäure auf eine SP-Sephadex-Säule (35 ml Volumen) aufgebracht. Nach gründlichem Waschen der Säule mit 0,1 M Natriumacetat (pH 4,8), wobei die Messungen von E&sub2;&sub8;&sub0; in einzelnen Röhrchen durchgeführt werden, wird die Chargenelution von Protein durch Zugabe von 250 ml-Chargen von NaCl mit 0,1, 0,2 und 0,3 M sowie von 500 ml mit 0,5 M durchgeführt. Die biologische Aktivität wird in 100 µl-Proben einzelner Säulenrohre geprüft und ein Großteil der biologischen Aktivität durch das Sammeln der 0,5 M NaCl-Fraktionen erhalten. Die Gewinnung biologischer Aktivität in diesem Schritt beträgt 90-100%, wobei eine zehnfache Reinigung erzielt wird. Sie dient als hilfreiches Konzentrierungsverfahren und nicht als wesentlicher Reinigungsschritt.
Das gesammelte aktive Material aus einem solchen 5 Liter-Schritt wird als SP1, SP2 usw. bezeichnet. Der aktive Pool (0,5 M NaCl) wird mit TFA auf eine Konzentration von 0,10/0 angesäuert und auf eine RP-HPLC- (RP300) Säule gepumpt, von der er mittels eines Acetonitrilgradienten von 0,66% pro Minute eluiert wird. Einzelne Säulenfraktionen aus dem RP300-Säuleneluat (10 µl pro 1 ml-Fraktion) werden einem Bioassay unterzogen und die aktiven Fraktionen gepoolt und rotationsverdampft. Die Wiederfindung beträgt in diesem Schritt 60%. Sechs solche SP-Pools werden für den nächsten Reinigungsschritt kombiniert, der demnach 30 Liter Kulturmedium darstellt.
Eine Proteinschätzung wird gemäß dem Bradford-Verfahren (56) unter Verwendung von BSA als Standard vorgenommen und das Material in Chargen von 2 mg einer HPLC Vydac C18-Säule (10 µ, 2,54 x 22 cm) zugeführt, von der es in einem Acetonitrilgradienten von 0,5% pro Minute eluiert wird. Zwei Peaks biologischer Aktivität werden zuverlässig mit der Vydac-Säule erhalten, Peak A bei 32% Acetonitrol und Peak B bei 37% Acetonitril. Peak B ist weniger mit anderem Protein kontaminiert als Peak A und wird üblicherweise zur weiteren Reinigung ausgewählt. Die gesamte Wiederfindung an Aktivität beträgt 30%. Die Verhältnisse zwischen Peak A und Peak B variieren zwischen den Chargen und reichen von 2:1 bis 0,5:1.
Peak B-Material wird gepoolt und auf eine weitporige (300 Å) Bakerbond C18-RP-Säule aufgebracht und in einem Acetonitrilgradienten (Fig.1A) eluiert. Die Absorption wird bei 215 nm überwacht. Einzelne Säulenfraktionen werden einem Bioassay unterzogen und die Fraktionen mit der höchsten Aktivität (Fraktionen 50-55) gepoolt. Das aktive Material wird durch RP-HPLC unter modifizierten Elutionsbedingungen (flacherer Acetonitrilgradient von 0,33% Acetonitril pro Minute) weiter gereinigt, wie dies aus Fig.1B ersichtlich ist. Die schraffierten Bereiche aus Fig.1 zeigen biologische Assaydaten in µg-Äquivalenten von menschlichem PTH(1-34), wobei die Säulenfraktions- Röhrchenzahlen 28 bis 38 angegeben sind. Die höchste biologische Aktivität wird in Fraktion 31 festgestellt (stimmt mit einem von vier nahen Proteinpeaks überein). Der Inhalt von Fraktion 31 wurde zur Aminosäuresequenz-Bestimmung und SDS-PAGE- Analyse herangezogen. Die Anfangssequenzbestimmung dieses Materials ergab die Aminosäuren 1-24 in Tabelle 1.
Die Peakfraktion wurde durch SDS-PAGE analysiert, wobei ein Teil des Gels dazu diente, Proteinbanden durch Silberfärbung nachzuweisen. Das übrige Gel wurde in Streifen geschnitten und das aus den Gelstreifen eluierte Material hinsichtlich biologischer Aktivität untersucht.
Das Aufbringen von 20% der Fraktion 31 (etwa 6 µmol, oder 120 ng) auf ein 17%- Polyacrylamidgel führt zu einer Hauptbande silbergefärbten Materials, das einem durch Molekulargewichtstandards bestimmten Molekulargewicht von 18-19 K entsprach (Fig.2). Zwei schwache Banden waren bei 35 K und 67 K zu sehen, die möglicherweise Dimere und Tetramere von PTHrP waren. Wenn ein identisches Gel zu 3 mm breiten Teilen geschnitten und mit 0,1 % SDS eluiert wurde, befand sich die einzige eluierte Aktivität in einer einzelnen Bande, die dem mit Silber gefärbten Peak bei 18-19 K entsprach (Fig.3). Die auf das Gel aufgebrachte Menge entsprach laut biologischem Assay 1,4 µg hPTH(1-34). Die Proteinschätzung wurde nicht direkt vorgenommen, sondern anhand der Aminosäuresequenz-Daten errechnet.
Die spezifische biologische Aktivität des zum Sequenzieren verwendeten reinen Materials betrug laut Schätzungen 6 µg-Äquivalente Rinder-PTH(1-34) pro µg PTHrP- Protein (Fig.3).
In einer getrennten Reinigungscharge wurde das aus HPLC-Schritt B gewonnene bioaktive Material (Fig.1, Fraktionen 31-32) kombiniert und auf einer weitporigen (300 Å) Bakerbond-C&sub1;&sub8;-RP-Säule mit einem Acetonitrilgradienten bei einer Rate von 0,33% pro Minute erneut chromatografiert. Wie aus Fig.4 ersichtlich, enthält ein einzelner, klar definierter Peak, Peak 47, ein Protein mit einem Molekulargewicht von 18-19 K. Keine anderen kontaminierenden Proteine sind laut SDS-PAGE in dieser Fraktion nachweisbar.
Dieses Material war gemäß dem in Beispiel 1 dargelegten Assay biologisch aktiv und wurde zur Aminosäuresequenz-Bestimmung mit einem Applied Biosystems Gas Phase Microsequencer verwendet. Die Sequenzbestimmung dieses Materials ergab 41 Aminosäuren, wie dies aus dem folgenden Beispiel ersichtlich ist.

BEISPIEL 4

Teilweise Sequenzbestimmung von PTHrP

Gereinigtes, gemäß Beispiel 3 gebildetes PTHrP wurde einem sequentiellen Edman- Abbau und der Analyse unter Verwendung eines Applied Biosystems Gas Phase Sequenators unterzogen (57). Die Sequenzbestimmung erfolgte in dreifacher Ausführung und ergab die in Tabelle 1 dargelegten Ergebnisse. Es wurden 41 Aminosäuren durch die N-terminale Sequenzanalyse von gereinigtem PTHrP identifiziert. Die Aminosäuresequenz von PTHrP wurde mit tryptischen Fragmenten von PTHrP bis Rest 50 verlängert Die Aminosäuren aus Tabelle 1 sind gemäß dem Einbuchstaben-Code bezeichnet (58).
Die tryptische Spaltung von gereinigtem PTHrP erfolgte durch 24-stündiges Inkubieren von 75 µg PHT-ähnlicher Bioaktivität (PHT-ähnliche Bioaktivität wird durch Untersuchen von PTHrP-Präparaten im biologischen UMR-106-Zellassay gegen einen synthetischen PTH-Standard bestimmt) mit Trypsin (1:10 Gew./Gew.) bei 37ºC. Diese tryptische Spaltlösung wurde auf der HPLC in 18 Peaks aufgelöst (Fig.5). Die Aminosäuresequenzen mehrerer dieser Peaks wurden bestimmt, wobei man feststellte, daß die in Peak 7 enthaltene Sequenz die NH&sub2;-terminale Sequenz von PTHrP bei Rest 38 beginnend überlappte. Dieses Peptid verlängerte die Aminosäuresequenz von PTHrP bis Rest 50.
Die ersten 24 Aminosäuren von PTHrP wurden mittels eines Computerprogramms mit Proteinsequenzen in der NBRF-Datenbank (59) verglichen. Es zeigte sich eine beträchtliche Homologie mit den ersten 24 Aminosäuren von menschlichem und Ratten-PTH, wobei die Gesamtsequenzidentität 45-80% betrug. Die strukturelle Ähnlichkeit war besonders bei den ersten 13 Aminosäuren von menschlichem PTH und danach viel weniger stark ausgeprägt. Es ist bekannt, daß die Sequenz, die die ersten 10 Aminosäuren von PTH enthält, äußerst schwach immunogen ist; dies kann anhand der tatsächlichen Sequenz und mithilfe eines computerisierten Prognoseverfahrens vorausgesagt werden. Wenn die PTHrP-Sequenz in gleicher Weise analysiert wird, stellt sie sich als deutlich immunogener heraus als PTH. TABELLE 1 PTHrP-Aminosäuresequenz

BEISPIEL 5

Aminosäureanalyse von gereinigtem PTHrP

Eine hoch gereinigte Probe von PTHrP (die Röhrchen 46 und 48 aus dem Säuleneluat von Fig.4; gesamte PTH-ähnliche Bioaktivität 7 µg) wurde auf einer Brownlee C8-Säule (2,1 mm) chromatografiert, wie dies aus Fig.6 ersichtlich ist. Der Diodenarraynachweis des Hauptpeaks (Insert von Fig.6) zeigte in den Peakschultern eine Kontaminierung mit aromatischem Aminosäureanteil. Der Mittelteil des Hauptpeaks wurde 25 Stunden lang bei 110ºC hydrolisiert und einem Beckman 6300 Amino Acid Analyser analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 veranschaulicht. Die analysierte Menge betrug 20 pMol, und es zeigte sich, daß sie die gleiche biologische Aktivität wie 8,8 µg Rinder- PHT(1-24) auwies. Dies bedeutete, daß die spezifische Aktivität dieses gereinigten Präparats etwa 20mal größer war als jene PTH. Die Aminosäureanalyse ergibts, daß PRHrP 154 Aminosäure enthält. TABELLE 2 Aminosäurezusammenzetzung von gereinigtem PTHrP

BEISPIEL 6

Peptidsynthese von PTHrP-Peptiden und die Herstellung von Antiseren gegen diese Peptide

Synthetische Peptide, die der aminoterminalen Sequenz von PTHrP entsprachen, wurden gemäß dem Merrifield-Verfahren (41) unter Verwendung eines automatischen Peptidsynthetisierers, Applied Biosystems Model 430A, synthetisiert. Die synthetischen Peptide wurden mit wasserfreiem HF vom Harz abgespalten (42), mit 60% Acetonitril und 0,1% Trifluoresssigsäure extrahiert, rotationsverdampft, lyophilisiert und auf einer Niederdruck-RP-Säule (2,5 x 30 cm, Amicon C&sub1;&sub8;-RP, 15-70 µ 250 Å Porengröße) mit einem Gradienten von 0-60% Acetonitrol (Gesamtvolumen 1000 ml) chromatografiert. Das gereinigte Peptid wurde lyophilisiert. Die Aminosäureanalyse bestätigte die Zusammensetzung der Peptide. Kaninchen wurden mit synthetischem Peptid, das über ein carboxyterminales Cystein an Sojabohnen-Trypsininhibitor konjugiert war (43), immunisiert.
Basierend auf der Sequenzinformation in Tabelle 1 wurden die folgenden Peptidanaloge synthetisiert:
Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Glu-His-Asn-Cys ([Glu&sup8;, Asn¹&sup0;, Cys¹¹] PTHrP(1-11), Ala-Val- Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asn-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln ([Asn¹&sup0;] PTHrP(1-16)), [Asn¹&sup0;, Tyr¹&sup7;] PTHrP (1-17) und PTHrP(1-34). Die Analoge, [Glu&sup8;, Asn 10, Cys¹¹] PTHrP(1-11) und [Asn¹&sup0;] PTHrP(1-16) waren im Adenylatcyclase-Assay inaktiv und antagonisierten die Wirkung von PTH selbst oder von konditioniertem Medium aus BEN-Zellen nicht. [Glu&sup8;, Asn¹&sup0;, Cys¹¹] PTHrP(1-11), das an Sojabohnen-Trypsininhibitor konjugiert war, diente dazu, Kaninchen zu immunisieren, und ein Antiserum wurde hergestellt, das im Radioimmunassay verwendet wurde. Ein Antiserum gegen [Asn¹&sup0;] PTHrP(1-16) wurde in ähnlicher Weise in Kaninchen gebildet.

BEISPIEL 7

Assays mit Antiseren gegen PTHrP

Ein Radioimmunassay wurde mit I¹²&sup5;-markiertem [Asn¹&sup0;, Tyr¹&sup7;] PTHrP(1-17) als Tracer für den Radioimmunassay durchgeführt und Kaninchen-Antiserum in gleicher Weise wie in Beispiel 5 bei einer Endverdünnung von 1/1000 hergestellt. Primäre Inkubationen wurden über Nacht bei 4ºC in 0,05 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, mit 0,10/ Rinderserum-Albumin durchgeführt. Die Trennung von gebundenem von freiem Peptid erfolgte mit einem zweiten Festphasen-Antikörper (Sac Cell - Wellcome, Australien). Die Iodierung des synthetischen Peptids wurde wie für Calcitonin beschrieben (44) bis zu einer ungefähren spezifischen Aktivität von 1 50 µCi/µg durchgeführt.
Wie aus Fig.7A ersichtlich, erkannte der Assay PTHrP(1-10) und (1-16) in gleicher Weise. Die Kreuzreaktivitäten von hPTH(1-10) und hPTH(1-34) betrugen 0,5 bzw. 0,3%. Die Kreuzreaktivität von Ratten-PTH(1-34), Rinder-PTH(1-34) und menschlichem PTH(1-34) betrugen 7, 5 bzw. 0,4% (Fig.7B).
PTHrP kann durch Immunaffinitäts-Chromatografie unter Verwendung von Antikörpern, die sich an Epitope von PTHrP binden können, gereinigt werden. Bei diesem Verfahren werden Antikörper, die sich an PTHrP binden können, an einer Trägermatrix befestigt. PTHrP enthaltendes Material wird durch die Trägermatrix perkoliert, wenn diese sich in einer Chromatografiesäule befindet, oder alternativ dazu mit der Matrix vermischt, wenn man ein Chargenverfahren anwendet. Das gesamte im Material vorhandene PTHrP bindet sich an die Matrix, die zur Entfernung von kontaminierendem Material gewaschen werden kann. Gereinigtes PTHrP kann dann unter Bedingungen, die die Antikörperbindung beeinträchtigen wie z.B. Bedingungen mit hohem oder niedrigem pH-Wert, aus der Matrix eluiert werden. Ein ähnliches Verfahren eignet sich zur Reinigung von Antikörpern, die sich an PTHrP binden können. In dieser Hinsicht sind die durchgeführten Schritte die gleichen wie oben, außer daß PTHrP an einer Trägermatrix befestigt wird.
Fig.8 zeigt die Anwendung des Radioimmunassays bei HPLC-Fraktionen von teilweise gereinigtem PTHrP (d.h. dem Eluat der SP-Sephadex-Chromatografie).
Das teilweise gerinigtes PTHrP (entspricht 35 µg bPTH) wurde auf einer C&sub1;&sub8;-RP-Guard- Säule (RP300, 7 µ 0,3 x 4,0 cm) chromatografiert. Die Elution erfolgte in einem Gradienten in 0-60% Acetonitril/0,1% TFA bei einer Rate von 1 ml/min über einen Zeitraum von 90 Minuten. Der biologische Assay wird mit einem offenen Kreis (o), der Radioimmunassay mit einem geschlossenen Kreis ( ) dargestellt. Fig.8 zeigt die zusammenfallende Elution biologischer und immunologischer Aktivität.
Das PTHrP(1-34)-Peptid wurde gegen Rinder-PTH(1-34) bei der Reaktion auf zyklisches AMP in UMR 106-01-Zellen untersucht und zeigte die gleiche Wirksamkeit (Fig.9A). Ebenso glich es PTH(1-34) bezüglich der Fähigkeit, die Plasminogenaktivator-Aktivität in UMR 106-01-Zellen zu steigern (Fig.98). Es handelt sich um ein PTH-Reaktionssystem, das die Anmelder beschrieben und vollständig charakterisierten (52).

Western Blot-Analyse

Protein aus zwei Proben von Peak A aus Beispiel 3, hochgereinigtes PTHrP von Peak B aus Beispiel 3 und reines Rinder-Nebenschilddrüsenhormon wurden SDS-PAGE ausgesetzt, auf Nitrozellose übertragen, mit dem schwachen (low) Detergens "Blotto" 1 Stunde lang blockiert, mit Kaninchen-Antiserum gegen [Asn¹&sup0;]PTHrP(1-16) (siehe Beispiel 5) bei einer Verdünnung von 1:200 inkubiert, 1 Stunde lang mit einem ¹²&sup5;I- markierten Fab-Fragment von Ziegen-anti-Kaninchen-Serum inkubiert und autoradiografiert (Fig.10). Wie erwartet zeigt Spalte 4, die hochgereinigtes PTHrP enthielt, eine Bande bei 18 kDa, die dem Molekulatgewicht von PTHrP entsprach. Im Gegensatz dazu zeigen die Spalten 2 und 3, die Protein aus Peak A von Beispiel 3 enthielt, Banden bei etwa 22 kDa. Dies läßt den Schluß zu, daß PTHrP in zumindest zwei Formen besteht, die beide die gleiche biologische Wirksamkeit aufweisen, sich jedoch hinsichtlich des Molekulargewichts und des Elutionsverhaltens auf RP-HPLC unterscheiden. Reines Rinder-Nebenschilddrüsenhormon (Spalte 1) zeigte unter diesen Bedingungen keine Bande.
Antikörper gegen PTHrP können dazu dienen, das Vorhandensein oder das Fehlen dieses Proteins in einer biologischen Probe nachzuweisen.
Die biologische Probe kann an einen festen Träger, wie z.B. Nitrozellulose oder PVC, gebunden und mit anti-PTHrP-Antikörpern umgesetzt werden. Die Antikörperbindung kann dann mittels eines nachweisbaren, an den Antikörpern befestigten Markers oder durch Verwendung eines zweiten markierten Reagens, das für gebundene Antikörper spezifisch ist, bestimmt werden. Reagentien wie z.B. Protein A oder anti-Fab- oder anti- Fc-Antikörper sind geeignet.
Alternativ dazu können die anti-PTHrP-Antikörper an einen festen Träger wie z.B. PVC- Platten, Polystyrolperlen usw. gebunden werden. Das zu untersuchende Material wird dann dem Träger zugegeben, der über einen Zeitraum inkubiert wird, der ausreicht, um Antikörperbindung zu ermöglichen, gefolgt vom Abwaschen von ungebundenem Material. Ein zweiter markierter PTHrP-Antikörper kann dann dem Träger zugegeben werden, um die Antikörperbindung nachzuweisen. Wenn der zweite Antikörper nicht markiert ist, können zusätzliche markierte Reagentien dem Träger zugegeben werden, um Antikörperbindung nachzuweisen. Man beachte, daß man bei diesem Ansatz davon ausgeht, daß PTHrP zumindest zwei Epitope enthält, wobei sich eines an den Antikörper bindet, der am festen Träger gebunden ist, und sich das andere an einen zweiten Antikörper bindet.
Geeignete nachweisbare Marker umfassen ¹²&sup5;I, ³²P, ³H, ¹&sup4;C, Biotin, Avidin, Protein A, kolloidales Gold oder Silber, Urease, alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase oder Phycobiliprotein.

BEISPIEL 7

Genetische Analyse

Da das PTHrP-Protein eine beträchtliche Homologie mit PTH aufwies, erachtete man es als notwendig zu bestimmen, ob ein einzelnes, nicht alleles Gen dafür kodierte oder ob es eine mutierte Form des PTH-Gens selbst war.
Es wurden Versuche mit einer Sonde durchgeführt, die für das Einzelkopie-PTH-Gen und den flankierenden 3'-Bereich (45) spezifisch war und die mit ³²P markiert war. Eine Northern-Gelanalyse wurde wie bereits beschrieben (46) mit 5 mg PolyA&spplus;-mRNA pro Bahn durchgeführt, die entweder aus BEN-Zellen oder aus chirurgisch entferntem menschlichem Nebenschilddrüsen-Adenomgewebe stammte. Die Southern-Gelanalyse war eine Modifikation des Standardverfahrens (47) unter Verwendung von 10 mg restriktionsgespaltener genomischer DNA pro Bahn, die entweder aus BEN-Zellen oder aus menschlichen Leukozyten (48) hergestellt wurde. Die menschliche PTH-Sonde wurde statistisch mit ³²P-Nukleotiden auf eine spezifische Aktivität von mehr als 10&sup8; cpm/mg geprimt (26). Die Hybridisierung und Waschbedingungen wurden bereits beschrieben (46).
Die Northern-Gelanalyse von polyA&spplus;-Messenger-RNA zeigte, daß BEN-Zellen das PTH- Gen im Vergleich zu Nebenschilddrüsen-Adenomgewebe nicht in nachweisbaren Werten exprimierten (nicht dargestellt). Die Southern-Gelanalyse restriktionsgespaltener genomischer DNA entweder aus BEN-Zellen oder menschlichen Leukozyten ergab identische PTH-enthaltende Restriktionsfragmente, z.B. die EcoRI-Fragmente mit 4,2 und 3,8 kb. Daher enthalten BEN-Zellen sowohl das nichtexprimierte PTH-Gen und - durch Folgerung aus der Expression von PTHrP mit der angegebenen Proteinsequenz -ein homologes Gen, das für ein mit PTH verwandetes Protein kodiert.

BEISPIEL 8

Herstellung von PTHrP durch verschiedene Gewebe

Die PTHrP-Produktion scheint nicht auf Tumorzellen beschränkt zu sein. Versuche mit Extrakten aus Lammföten- und Mutterschafgewebe sowie Plazenta erfolgten, um diese Frage zu klären. Durch Durchführung der Assays nach der Präinkubation mit anti-PTH- Antiserum oder mit PTH-Antagonist konnten die Anmelder feststellen, ob die biologische Aktivität einzig auf PTH oder PTHrP oder auf ein Gemisch der zwei zurückzuführen ist.
Es zeigte sich, daß die Lammföten-Nebenschilddrüse biologische Aktivität aufwies, von der nur 50% PTH zuzuschreiben und der Rest möglicherweise auf PTHrP zurückzuführen war. Etwas PTHrP (etwa 20%) wurde in der Mutter-Nebenschilddrüse gefunden.
Das auffallendste Ergebnis war jedoch, daß die Plazenta beträchtliche Mengen an Aktivität enthielt, die voll und ganz durch PTHrP erklärt werden konnte und die sich in der HPLC ähnlich wie PTHrP aus BEN-Zellmedium verhielt. Außerdem wurde die Menge an in der Plazenta nachweisbarem PTHrP in Plazenten aus Mutterschafen, worin Nebenschilddrüsen aus den Föten entfernt wurden, nicht geringer. Dies legt nahe, daß die Plazenta eine wichtige PTHrP-Quelle darstellen könnte.
Die Anmelder reinigten PTHrP aus dem Harn von Patienten mit bösartiger humoraler Hyperkalzämie (Daten nicht dargestellt). Auf der Grundlage dieser Ergebnisse kann PTHrP in Serum, Harn oder anderen biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung der Antikörperreagentien der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden. Die Antikörperreagentien der vorliegenden Erfindung besitzen daher das Potential, als diagnostische Reagentien bei der Identifizierung von Bösartigkeit eingesetzt zu werden.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sowie ihre Modifizierungen und Variationen ergeben sich für Fachleute auf dem Gebiet aus der vorliegenden Beschreibung, wobei alle diese anderen Aspekte, Modifizierungen und Variationen als im Schutzbereich der Erfindung enthalten anzusehen sind.

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Claims

1. Im wesentlichen reines, mit Nebenschilddrüsen-Hormon verwandtes Protein (PTHrP) mit:

(a) einer N-terminalen Aminosäuresequenz

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLH HLIAEIHTAEIRATSEXTXN

worin X eine nicht identifizierte Aminosäure ist;

(b) einem Molekulargewicht zwischen 15 und 25 kDa, bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese; und

(c) einer spezifischen biologischen Aktivität von zumindest etwa 6 mg Äquivalenten eines Peptids, das aus den Aminosäuren 1 bis 34 des Nebenschilddrüsen- Hormons besteht, pro mg Protein, gemessen in einem Adenylatcyclase-Reaktionsassay.

2. Im wesentlichen reines PTHrP nach Anspruch 1, das weiters folgendes aufweist:

(a) eine aus Tabelle 2 ersichtliche Aminosäurezusammensetzung;

(b) die Fähigkeit, Adenylat-Cyclase in Nebenschilddrüsenhormon-Zielzellen zu aktivieren; und

(c) die Fähigkeit, die Plasminogenaktivator-Aktivität in osteoblasten-ähnlichen Zellen zu steigern, wobei die Wirksamkeit größer ist als jene eines Peptids, das aus den Aminosäuren 1 bis 34 des Nebenschilddrüsen-Hormons besteht.

3. Im wesentlichen reines PTHrP nach Anspruch 1 mit einem Molekulargewicht zwischen 18 und 25 kDa, bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel- Elektrophorese.

4. Fragment von PTHrP, umfassend die Aminosäuren 1 bis 34 aus Tabelle 1.

5. Allelvariante des PTHrP nach Anspruch 1, in welcher Variante zumindest eine natürlich in PTHrP vorkommende Aminosäure deletiert und/oder durch eine andere Aminosäure substituiert ist oder zumindest eine weitere Aminosäure der natürlichen Sequenz von PTHrP angefügt ist, welche Variante nicht PTH ist und PTHrP-Aktivität aufweist, bestimmt in einem Adenylatcylase-Reaktionsassay.

6. Fragment des PTHrP nach Anspruch 1, umfassend zumindest fünf Aminosäuren, wobei dieses Fragment nach der Immunisierung eines geeigneten Wirts, gegebenenfalls in Gegenwart eines Proteinträgers, in der Lage ist, Antikörper zu bilden, die sich an das in Anspruch 1 definierte PTHrP binden.

7. Modifizierte Untereinheit von PTHrP, ausgewählt aus:

(a) den Aminosäuren 1 bis 11 aus Tabelle 1, worin die Aminosäuren 8, 10 und 11 durch Glu, Asn bzw. Cys substituiert sind;

(b) den Aminosäuren 1 bis 16 aus Tabelle 1, worin Aminosäure 10 durch Asn ersetzt ist; und

(c) den Aminosäuren 1 bis 17 aus Tabelle 1, worin die Aminosäuren 10 und 17 durch Asn bzw. Tyr substituiert sind.

8. Antikörperreagentien, die sich an Epitope von PTHrP nach einem der Ansprüche 1 bis 3 binden können.

9. Antikörperreagentien nach Anspruch 8, die gegen Peptidfragmente von PTHrP gemäß Anspruch 4 oder 5 gerichtet sind.

10. Antikörperreagentien nach Anspruch 8 oder 9, die mit einem oder mehreren nachweisbaren Markern markiert sind.

11. Set zum Nachweis von PTHrP oder Fragmenten davon, umfassend ein oder mehrere Antikörperreagentien, die sich an Epitope von PTHrP nach einem der Ansprüche 1 bis 3 binden können.

12. Set zum Nachweis von PTHrP oder Fragmenten davon nach Anspruch 11, worin die Antikörperreagentien gegen Peptidfragmente von PTHrP nach einem der Ansprüche 4 bis 7 gerichtet sind.

13. Set zum Nachweis von PTHrP oder Fragmenten davon nach Anspruch 11 oder 12, worin die Antikörperreagentien mit einem nachweisbaren Markier markiert sind.

14. Set nach einem der Ansprüche 11 bis 13, das zusätzlich ein oder mehrere Reagentien zum Nachweis von Antikörperbindung an PTHrP oder Peptidfragmente davon enthält.

15. Set nach einem der Ansprüche 11 bis 14, zusätzlich enthaltend:

(i) eine Trägermatrix, auf der ein Assay zum Nachweis von PTHrP-Bindung durchgeführt werden kann; und/oder

(ii) einen oder mehrere Puffer oder andere geeignete Lösungen zur Verdünnung der Reagentien.

16. Verfahren zum Nachweis von in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiertem PTHrP oder von in einem der Ansprüche 4 bis 7 definierten Fragmenten davon in einer bestimmten proteinhältigen Probe, umfassend das In-Kontakt-Bringen der Probe oder einer Trägermatrix, auf der das Protein in der Probe mit Antikörperreagentien, die sich an Epitope von PTHrP binden können, immobilisiert wird, und das anschließende Nachweisen des Vorhandenseins oder Fehlens von Antikörperbindung.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Antikörper, die Epitope von PTHrP binden können, mit einem nachweisbaren Marker markiert sind.

18. Verfahren nach Anspruch 16, worin das Vorhandensein oder Fehlen von Antikörperbindung an PTHrP durch Reagentien nachgewiesen wird, die mit einem nachweisbaren Marker markiert sind, der sich an Antikörper binden kann.

19. Verfahren zum Nachweis von in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiertem PTHrP oder von in einem der Ansprüche 4 bis 7 definierten Fragmenten davon in einer bestimmten Probe, umfassend das Inkubieren der Probe mit einer Trägermatrix (auf der Antikörper gebunden sind, die Epitope von PTHrP binden können) über einen Zeitraum, der ausreicht, Antikörperbindung zu ermöglichen, und das anschließende Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von gebundenem PTHrP mit Antikörperreagentien, die Epitope von PTHrP binden können.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von PTHrP in einer bestimmten Probe verwendeten Antikörperreagentien mit einem nachweisbaren Marker markiert sind.

21. Verfahren nach Anspruch 19, worin die Bindung oder das Fehlen der Bindung von Antikörperreagentien an PTHrP mit Reagentien nachgewiesen wird, die mit einem nachweisbaren Marker markiert sind.

22. Verfahren zur Reinigung von PTHrP nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend das Gewinnen von PTHrP aus Medium, in dem BEN-Zellen kultiviert wurden.

23. Verfahren zur Reinigung von mit Nebenschilddrüsen-Hormon verwandtem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Kultivieren von BEN-Zellen in Kulturmedium;

(b) Ansäuern des Kulturmediums auf einen pH von etwa 4,8 und anschließendes Aufbringen des Kulturmediums auf ein Kationenaustausch-Harz mit einem pH von etwa 4,8;

(c) Eluieren von Fraktionen aus dem Kationenaustausch-Harz, wobei das Medium und das Harz bei einem pH von etwa 4,8 gehalten werden, und Testen der Fraktionen auf mit Nebenschilddrüsenhormon verwandte Hormon-Aktivität; und

(d) Durchführen von RP-HPLC mit jenen Fraktionen, die mit Nebenschilddrüsen hormon verwandte Hormon-Aktivität aufweisen, und anschließendes Isolieren von im wesentlichen reinem mit Nebenschilddrüsenhormon verwandtem Hormon.