DE3751870T2

DE3751870T2 - REKOMBINANTES PLASMID, UMFASSEND EIN FRAGMENT EINES DNA-SEGMENTES, DAS FüR EIN 47 KDA OBERFLäCHENIMMUNOGEN VON TREPONEMA PALLIDUM KODIERT

Info

Publication number: DE3751870T2
Application number: DE3751870T
Authority: DE
Inventors: Michael Norgard
Original assignee: University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas at Austin
Priority date: 1986-09-30
Filing date: 1987-09-21
Publication date: 1997-03-20
Anticipated expiration: 2007-09-22
Also published as: AU8021487A; DK293988D0; DK293988A; EP0324774B1; EP0324774A1; US4868118A; ATE141325T1; IL84006A; CH676606A5; WO1988002403A1; CA1336692C; DE3751870D1; JPH02500403A; IL84006A0

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie zur Schaffung eines Mikroorganismus, der Antigene erzeugen kann, die mit Antikörpern reaktiv sind, die als Reaktion auf Treponema pallidum entwickelt werden.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart von Treponema pallidum in einer klinischen Probe.
Eine Infektion mit Treponema pallidum ist die gut etablierte Ursache von Syphilis. Trotz der anhaltenden Verfügbarkeit wirksamer Antibiotika führt Syphilis weiterhin weltweit zu Elend und Krankheit. Die Unfähigkeit, in vitro-Kulturen von Treponema pallidum zu etablieren, hat die Erforschung und Untersuchung dieses Organismus eingeschränkt. Dieser Mikroorganismus wird üblicherweise mit in vivo-Kulturen in Hamsterlymphknoten oder Kaninchenhoden propagiert, die nützlich sind, aber keine Verfahren, die einer Erzeugung von Treponema pallidum oder seiner Antigene, insbesondere reiner Antigene, im großen Maßstab zugänglich sind. Es hat sich als schwierig erwiesen, Treponema pallidum-Antigene, die frei von Hamsteroder Kaninchenantigenen sind, aus in vivo kultiviertem Treponema pallidum zu erhalten. Gereinigte treponemale Antigene sind daher mit den herkömmlichen Verfahren der Mikroorganismuserzeugung nicht verfügbar gewesen.
Modernere Verfahren der Molekularbiologie sind im Zusammenhang mit der Charakterisierung und dem Nachweis von Treponema pallidum, Treponema pallidum-Antigenen und Treponema pallidum Infektionen angewendet worden. Verschiedene polyklonale und monoklonale Antikörper gegen Treponema pallidum-Antigene sind ebenfalls hergestellt worden.
Das US-Patent Nr. 4,514,498 (Kettman und Norgard, 30. April 1985) beschreibt eine Vielzahl monoklonaler Antikörper, die gegen T. pallidum-Antigene gerichtet sind. Zwei Hybridomaklone, 8G2 (ATCC HB 8134) und 11E3, erzeugten für das 47 kDa- Oberflächenantigen von T. pallidum sepzifische Antikörper. Diese speziellen zwei Antikörper wurden in der vorliegenden Erfindung zur Selektion von E. coli-Klonen, die das 47 kDa- Antigen erzeugen, verwendet.
Norgard et al., (1983) (Infect. and Immun., Band 42, Seiten 435-445) beschrieben die Konstruktion hybrider pBR322-Plasmidklonbanken in E. coli K-12, die das gesamte Treponema pallidum-Genom repräsentieren. Zum Nachweis von E. coli-Klonen, die T. pallidum-Antigene synthetisieren, wurde Kaninchen-anti-T. pallidum-Serum in Radioimmunkolonieblottests verwendet. Von einem Klon wurde festgestellt, daß er ein Genprodukt von 44 kDa kodiert. Es wurde entweder Kaninchenimmunserum oder humanes syphilitisches Serum verwendet, um die E. coli-Klone nachzuweisen, die T. pallidum-Antigen erzeugen. Der methodische Unterschied zwischen dieser Publikation und der vorliegenden Offenbarung ist der erste Unterschied zur vorliegenden Erfindung. Zusätzlich ist festgestellt worden, daß für das T. pallidum-47 kDa-Oberflächenantigen spezifische monoklonale Antikörper nicht mit dem 44 kDa-Antigen reagieren konnten.
Stamm et al., (1982) (Infect. and Immun., Band 36, Seiten 1238-1241) beschrieben die Etablierung einer T. pallidum-DNA- Klonbank. T. pallidum-DNA wurde mit Bam HI-Endonuklease gespalten und die Spaltfragmente mit Bam ill-gespaltenem Plasmid pBR322 ligiert. Von vier transformierten E. coli-Klonen wurde festgestellt, daß sie allgemein T. pallidum-Antigene erzeugten.
Stamm et al., (1983) (Infect. and Immun., Band 41, Seiten 709- 721) beschrieben die Expression von Treponema pallidum-Antigenen in Escherichia coli K-12. Stamm et al. (1983) beschreiben die Verwendung einer pBR322-Bank rekombinanter Plasmide, die Treponema pallidum-DNA-Inserts enthalten, in E. coli. und die Identifizierung von Klonen, die Treponema pallidum-Anti gene exprimieren. Die Molekulargewichte von Antigenen, die von mit dem Plasmid pLV32 transformierten E. coli erzeugt werden, hatten eine Größe von 25 kDa, 35 kDa und 39 kDa. Ein E. coli-Klon, der das Plasmid pLV55 trug, kodierte für ein T. pallidum-Proteinantigen von 35 kDa. Eine Aufgabe der Stamm et al. (1983)-Referenz war es, T. pallidum-Oberflächenantigene zu erzeugen. In der Stamm et al. (1983)-Referenz wurde gesamtes humanes oder Kaninchenserum gegen Syphilis verwendet, um transformierte E. coli-Klone zu selektionieren.
Van de Donk et al., (1984) (in Innovations in Biotechnology, herausgegeben von Houwink et al., Elsevier Science, Amsterdam) beschrieben die Entwicklung von Hybridomazellinien, die gegen T. pallidum-Antigene gerichtete Antikörper erzeugen. Sie offenbaren weiterhin, daß bestimmte monoklonale Antikörper, die aus den Hybridomzellinien erhalten worden waren, mit einem 46 kDa und einem 44 kDa-Polypeptidantigen von Treponema pallidum reagieren. Die Referenz wies weiter darauf hin, daß diese monoklonalen Antikörper für die Reinigung von Treponema pallidum-Antigenen verwendet werden können, die von E. coli erzeugt werden, die rekombinante Treponema pallidum-DNA tragen, wie zuvor von Norgard et al. (1983) (Infect. and Immun., Band 42, Seiten 435-445) vorgeschlagen worden ist.
Van Embden et al., (1983) (Infect. and Immun., Band 42, Seiten 187-196) beschrieben die Erzeugung von E. coli K-12 Klonen, die mit Plasmiden transformiert sind, die T. pallidum-DNA tragen. Es wurden E. coli-Transformanten gefunden, die eine Vielzahl von T. pallidum-Polypeptidantigenen erzeugten, einschließlich von Polypeptiden mit apparenten Größen von unter anderem 35 kDa, 41 kDa, 44 kDa und 58 kDa.
Coates et al., (1985) (Abstracts of the 85th Annual Meeting of the Amer. Soc. for Microbiol., Abstract C29, Seite 304) beschrieben eine E. coli-Transformante, die ein 18 kDa-T. pallidum-Polypeptidantigen erzeugt.
Fehniger et al.&sub1; (1985) (Abstracts of the 85th Annual Meeting of Amer. Soc. for Microbiol., Abstract B156, Seite 44) beschrieben ein hydrophobes 38 kDa-T. pallidum-Antigen, das von einem mit einem rekombinanten Plasmid transformierten E. coli erzeugt wurde.
Rodgers et al., (1985) (Abstracts of the 85th Annual Meeting of Amer. Soc. for Microbiol., Abstract C30, Seite 305) beschrieben die Auswertung der Reaktivität eines 37 kDa-T. pallidum-Polypeptidantigens, das von einer E. coli-Transformante erzeugt wurde.
Die PCT-Patentanmeldung (1984) PCT/U583/01718 (internationale Veröffentlichungs-Nr. W084/01961 mit dem Titel "Recombinant DNA Derived Antigens of Treponema pallidum"; Lovett) beschrieben transformierte E. coli-Klone, die plasmidgebundene T. pal lidum-DNA enthielten und T. pallidum-Peptidantigene exprimierten. Verschiedene Klone erzeugten Antigene mit Molekulargewichten oder Molekulargewichtsbereichen von 16-20 kDa, 43 kDa, 37-46 kDa, 18-23 kDa, 150 kDa oder 180 kDa.
Potentiell bedeutsame Antigene oder Immunogene von T. pallidum sind in verschiedenen Labors identifiziert worden (Alderete et. al. (1980) Infect Immun., Band 30, Seiten 814-823; Baker- Zander et al. (1985) (J. Infect. Dis., Band 151, Seiten 264- 272; Baker-Zander et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 634-638; Baker-Zander et al., (1984) Infect. Immun., Band 46, Seiten 116-121; Hanff et al., (1982) J. Immunol., Band 129, Seiten 1287-1291; Jones et al., (1984) J. EXD. Med., Band 160, Seiten 1404-1420; Lukehart et al., (1982), J. Immunol., Band 129, Seiten 833-838; Lukehart et al., (1986), Sex. Trans. Dis., Band 13, Seiten 9-15; Lukehart et al., (1985) J. Immunol., Band 134, Seiten 585-592; Marchitto et al., (1984) In(1986) Infect. Immun., Band 51, Seiten 168-176; Moskophidis et al., (1984) Infect. Immun., Band 43, Seiten 127-132; Norris et al., (1984) J. Immunol., Band 133, Seiten 2686-2692; Penn et al., (1985) J. Gen. Microbiol., Band 131, Seiten 2349-2357; Strugnell et al., (1986) Infect. Immun., Band 51, Seiten 957-960; Thornburg et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 623-627; Thornburg et al., (1985) Genitourin. Med., Band 61, Seiten 1-6 und van Eijk et al., (1982) J. Microbiol., Band 48, Seiten 486-497). Eine potentielle biologische Signifikanz war zuvor einem größeren immunogenen oberflächenantigen von T. pallidum zugeschrieben worden, das eine Molekularmasse von 47 Kilodalton (kDa) hat (Jones et al., (1984), J. Exp. Med., Band 160, Seiten 1404-1420 und Marchitto et al., (1984) Infect. Im-Antikörper (maks) wurden in Kombination mit verschiedenen in vitro- und in vivo-Tests zur Charakterisierung des Immunogenes verwendet (Jones et al., (1984) J. Exp. Med., Band 160, Seiten 1404-1420; Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., Band 45, 51, Seiten 168-176 und Norgard et al., (1984) J. Clin. Microbiol., Band 20, Seiten 711-717). Vom 47 kDa-Antigen wurde folgendes gezeigt: (i) es ist Oberflächen-assoziiert; (ii) es ist abundant (Jones et al., (1984) J. EXI,. Med., Band 160, Seiten 1404-1420; Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., Band 45, Band 51, Seiten 168-176); (iii) es ist hochimmunogen sowohl in Ratten als auch in Menschen (Baker-Zander et al., (1985) J. Infect. Dis., Band 151, Seiten 264-272; Hanff et al., (1982) J. Immunol., Band 129, Seiten 1287-1291; Jones et al., (1984) J. Exp. Med., Band 160, Seiten 1404-1420; Lukehart et al., (1986) Sex. Trans. Dis., Band 13, Seiten 9-15; Strugnell et al., (1986) Infect. Immmun., Band 51, Seiten 957-960 und van Eijk et al., (1982) J. Microbiol., Band 48, Seiten 486-497); (iv) es ist proteinähnlich; (v) es wird in mindestens drei pathogenen Unterarten von T. pallidum, dem etiologischen Agenz der venerischen Syphilis, der endemischen Syphilis und der Frambösie gefunden; und (vi) es ist in nichtpathogenen, saprophytischen Treponemen nicht vorhanden (Jones et al., (1984) J. Exp. Med., Band 160, Seiten 1404-1420; Marchitto et al.,
al., (1986) Infect. Immun., Band 51, Seiten 168-176 und Norgard et al., (1984) J. Clin. Microbiol., Band 20, Seiten 711- 717). Anti-47 kDa-maks besitzen einen diagnostischen Wert; sie binden in Immunfluoreszenztests stark an T. pallidum, das aus humanen syphilitischen Läsionen isoliert worden ist. Anti-47 kDa-mak blockieren außerdem teilweise das Anheften von T. pallidum an Wirtszellen in vitro (Jones et al., (1984) J. Exp. Med., Band 160, Seiten 1404-1420). Anti-47 kDa-mak binden an T. pallidum im T. 1pallidum-Immobilisierungs(TPI)-Test, was zu einer Komplement-abhängigen Immobilisierung motiler Organismen führt, und diese Antikörper neutralisieren (töten) T. pallidum im in vitrolin vivo-Neutralisationstest von Bishop und Miller (Bishop et al., (1986) J. Immunol., Band 117, Seiten 197-207; Jones et al., (1984) J. Exp. Med., Band 160, Seiten 1404-1420 und Marchitto et al., (1986) Infect. Immun., Band 51, Seiten 168-176) in Gegenwart von Komplement.
Die potentielle biologische Signifikanz des 47 kDa-Immunogens wird durch die Arbeit an ähnlichen oder identischen Immunogenen gestützt. Lukehart et al. (Lukehart et al., (1982) J. Immunol., Band 129, Seiten 833-838) und Baker-Zander und Lukehart (Baker-Zander et al., (1983 Infect. Immun., Band 42, Seiten 634-638 und Baker-Zander et al., (1984) Infect. Immun., Band 46, Seiten 116-121) berichteten, daß ein 48 kDa-Immunogen von T. pallidum T. pallidum-spezifische Epitope enthielt, die in den treponemalen pathogenen T. pallidum, T. pertenue (Frambösieorganismus), T. paraluis-cuniculi (Agenz der venerischen Kaninchenspirochaetose) und T. hvodvsenteriae (Agenz der Schweinedysentene) nachgewiesen werden konnten. Lukehart beobachtete außerdem eine frühe und signifikante humorale Antwort auf das 47 kDa-Immunogen von T. pallidum in Patienten, die mit T. carateum (Pintaorganismus) infiziert waren (S.A. Lukehart, persönliche Mitteilung). Hanff et al. (Hanff et al., (1982) J. Immunol., Band 129, Seiten 1287-1291) zeigten eine frühe humorale Immunantwort während der humanen Syphilis gegen T. pallidum-Antigene mit molekularen Massen von 45-47 kDa. Baker-Zander et al. (Baker-Zander et al., (1985) J. Infect. Dis., Band 151, Seiten 264-272) bestätigten die starke Reaktivität von syphilitischen Seren mit einem 48 kDa-Antigen von T. pallidum früh im Verlauf der humanen Infektionen. Diese frühe und signifikante humorale Immunantwort wurde auch in experimentellen Kaninchen beobachtet (Lukehart et al., (1986) Sex. Trans. Dis., Band 13, Seiten 9-15). Van Eijk und van Embden (van Eijk et al., (1982) J. Microbiol., Band 48, Seiten 486- 497) berichteten über eine frühe humorale Immunantwort gegen ein 46 kDa-T. pallidum-Immunogen bei Menschen mit primärer Syphilis und späteren Krankheitsstadien. Strugnell et al. (Strugnell et al., (1986) Infect. Immun., Band 51, Seiten 957- 960) berichteten, daß die heftigsten humoralen Immunantworten, die im experimentellen Kaninchen früh nachweisbar waren, gegen ein Polypeptid von 47 kDa gerichtet waren. Thornburg und Baseman (Thornburg et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 623-627) und Thornburg et al. (Thornburg et al., (1985) Genitourin. Med., Band 61, Seiten 1-6) beschrieben auch ein größeres 45 kDa-Immunogen von T. pallidum, das in T. pallidum und T. pertenue gefunden wurde. Penn et al. (Penn et al., (1985) J. Gen. Microbiol., Band 131, Seiten 2349-2357) folgerten kürzlich, daß T. pallidum ein immundominantes äußeres Membranprotein von 47 kDa enthält. Zusätzlich sind unsere früheren Feststellungen (Marchitto et al., (1986) Infect. Immun., Band 51, Seiten 168-176 und Norgard et al., (1984) J. Clin. Microbiol., Band 20, Seiten 711-717), daß anti-47 kDa-mak diagnostisch verwendet werden können, um relativ wenig T. pallidum nachzuweisen, von Lukehart et al. (Lukehart et al., (1985) J. Immunol., Band 134, Seiten 585-592) und Hook et al. (Hook et al., (1985) J. Clin. Microbiol., Band 22, Seiten 241-244) bestätigt worden. Hook et al. (Lukehart et al., (1986) Sex. Trans. Dis., Band 13, Seiten 9-15) berichteten außerdem über eine Korrelation zwischen der frühen Immunclearance infizierender T. pallidum und dem Abheilen der Primärläsion im experimentellen Kaninchen; es wurde postuliert, daß die Heilung der primären Läsion von Antikörpern beeinflußt werden kann, die gegen immundominante Moleküle gerichtet sind, beispielsweise das 47 kDa-Immunogen (Lukehart et al., (1986) Sex Trans. Dis., Band 13, Seiten 9-15).
Unter Verwendung von Serum aus T. pallidum-infizierten Kaninchen oder monoklonalen Mausantikörpern, die gegen das 47 kDa- Immunogen von T. pallidum gerichtet waren, wurde zuvor berichtet, daß das 47 kDa-Immunogen pathogenspezifisch wäre (Jones et al., (1984) J. Exp. Med., Band 160, Seiten 1404-1420; Marchitto et al., (1984) Infest. Immun., Band 45, Seiten 660-666; Marchitto et al., (1986) Infect. Immun., Band 51, Seiten 168- 176 und Norgard et al., (1984) J. Clin. Microbiol., Band 20, Seiten 711-717); die Gegenwart eines analogen 47 kDa-Antigens wurde in den nichtpathogenen Treponemen T. phagedenis Biotyp Reiter, T. denticola, T. scoliodontum, T. vincentii oder T. refrinpens nachgewiesen, wobei Kaninchenimmunserum oder gegen das 47 kDa-Immunogen gerichtete monoklonale Antikörper verwendet wurden. Lukehart et al. (Lukehart et al., (1982) J. Immunol., Band 129, Seiten 833-838; Lukehart et al., (1985) J. Immunol., Band 134, Seiten 585-592) postulierten, daß ein 48 kDa-T. pallidum-Immunogen "pathogenspezifische" Determinanten besitzen kann, die auf unterschiedlichen Polypeptiden lokalisiert sein können, die in Polyacrylamidgelen zusammen wandern. Wenn entweder ein 3,85 kb Hindill DNA-Fragment aus der 5,4 kb umfassenden kodierenden Sequenz oder intakte Hybridplasmid-DNA (die die gesamte 5,4 kb kodierende Sequenz enthielt) als DNA- Hybridisierungssonden bei moderater oder niedriger Stringenz der DNA-Hybridisierung verwendet wurden, wurde keine Hybridisierung mit einem homologen DNA-Fragment aus nichtpathogenen Treponemen beobachtet. Weiterhin reagierte der Inak C2-1 von Lukehart, der gegen ein "gemeinsames" treponemales Epitop eines 47 kDa-Immunogenes gerichtet war (Hook et al., (1985) J. din. Microbiol., Band 22, Seiten 241-244 und Lukehart et al., (1985) J. Immunol., Band 134, Seiten 585-592) nicht mit den erfindungsgemäßen, das 47 kDa Immunogen exprimierenden Klonen, während der pathogenspezifische mak H9-1 (Hook et al., (1985) J. Clin. Microbiol., Band 22, Seiten 241-244; Lukehart et al., (1985) J. Immunol., Band 134, Seiten 585-592) mit diesen Klonen reagierte. Genetische und immunologische Daten stützen daher die Existenz eines pathogenspezifischen 47 kDa-Immunogenes.
Die Klonierung und Expression des Genes für das T. pallidum 47 kDa-Immunogen-Gen in Escherichia coli wird hierin als ein Bestandteil der vorliegenden Erindung beschrieben.
Die Inhalte der obenerwähnten Publikationen werden durch Verweis wegen ihrer Beschreibungen von Mikroorganismen, Materialien und Methoden, die auf diesem Gebiet etabliert sind, einbezogen.
Es wurden monoklonale Antikörper, die gegen das äußere 47 kDa- Hauptmembranoberflächenimmunogen von virulenten Treponema pallidum gerichtet sind, zur Selektion rekombinanter E. coli Klone verwendet, die das 47 kDa-Immunogen exprimieren. Der Phenotyp dieser Klone war von der Gegenwart rekombinanten Plasmides in der Wirtszelle abhängig. Southern-Hybridisierungen zeigten, daß die klonierte T. pallidum-DNA-Sequenz eine genaue Darstellung der genomischen T. pallidum-DNA-Anordnung war. Gereinigtes IgG aus Kaninchen, die experimentell mit T. pallidum oder humanen sekundären syphilitischen Seren infiziert waren, reagierte spezifisch mit den Klonen, während normales menschliches Serum oder IgG aus normalem Kaninchenserum das nicht tat. Die Ergebnisse der Southern-Hybridisierung weisen darauf hin, daß ein homologes 47 kDa-Immunogen in mindestens 4 Spezies nichtpathogener getesteter Treponemen nicht vorhanden war sowie in der gesamten genomischen Kaninchen-DNA fehlte. Kaninchen-anti-T. phagedenis-Biotyp Reiter (treponemales Nonpathogen)-Antiserum und ein gegen eine "gemeinsame" treponemale Determinante gerichteter monoklonaler Antikörper waren mit den Klonen nicht reaktiv. Western-Blotten und Radioimmunpräzipitations-Experimente mit spezifischen monoklonalen Antikörpern zeigten, daß die rekombinanten (E. coli) und nativen (T. pallidum) Formen des Antigenes identische elektrophoretische Mobilitäten hatten. Die Verfügbarkeit des rekombinanten 47 kDa-Immunogenes stellt eine neue Möglichkeit für die biochemische Analyse des Proteines, Strukturfunktionsuntersuchungen, Untersuchungen seiner Rolle bei der mikrobiologischen Pathogenese und die direkte Feststellung seines diagnostischen und vaccinogenen Potentials zur Verfügung.
Abb. 1: Radioimmun-Kolonieblottest von Kolonien rekombinanter DNA-Klone in E. coli, die das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von T. pallidum exprimieren. T. Idallidum-Zellen (Spur 1) wurden auf jeden Filter als eine positive Kontrolle aufgetragen. Negative Kontrollklone umfassen pMN7 (Spur 2) und pBR322 in E. coli RRI (Spur 3). Die Filter wurden mit maks 11E3 (Reihe A), 8G2 (Reihe B) und 385 (Reihe C) (Negativkontrolle) vor der Hybridisierung mit ¹²&sup5;I-markierten Kaninchen-anti-Maus-IgG umgesetzt.
Abb. 2: Partielle Restriktionsenzymkarte des 5,4 kb-Inserts von pMN23, das für das 47 kDa-Immunogen von T. pallidum kodiert. Die EcoRI-Stelle von pBR322 ist an der rechten Seite der Abbildung angeordnet. Die Transkriptionsrichtung des 47 kDa-Antigenes scheint von links nach rechts zu verlaufen, entgegengesetzt der des Beta-Lactamasegenes. Das Insert wird von PstI-Stellen gerade außerhalb kurzer GC-Schwänze flankiert und besitzt ein internes 3,85 kb-HINDIII-Fragment.
Abb. 3: Southernblot-Hybridisierung HindIII-restringierter genomischer DNAS und des rekombinanten Plasmides pMN23, das für das 47 kDa-Immunogen von T. pallidum kodiert. Teil A: 1%iges Agarosegel, enthaltend HindIII-restringierte genomische DNA von Kaninchen (Spur 2), T. pallidum (Spur 3), T. denticola (Spur 4), T. phagedenis (Spur 5), T. scoliodontum (Spur 6), T. vincentii (Spur 7), rekombinantes Plasmid pMN23 (Spur 8) und Plasmid pBR322. Die Spuren 1 und 10 enthielten kombinierte pBR322-AluI- und Bakteriophagen Lambda-HINDIII-Molekulargewichtsmarker. B: Southernblot vom Teil A; ein Fragment der Plasmid-DNA aus Klon pMN23 wurde als markierte Hybridisierungssonde verwendet. Beachte die Gegenwart des homologen 3,85 kb-DNA HINDIII-Fragmentes, das nur in genomischer T. pallidum DNA (Spur 3) und dem rekombinanten Plasmid pMN23 (Spur 8) vorhanden ist.
Abb. 4: Radioimmunpräzipitation des 47 kDa-Immunogens von T. pallidum aus ¹²&sup5;I-markiertem T. pallidum und dem ³&sup5;S-markierten rekombinanten E. coli-Klon pMN23. Die Spuren 1-3, 4-6 und 7-9 wurden mit den monoklonalen Antikörpern 11E3, 8G2 bzw. 385 (Kontrolle) immunopräzipitiert. Die Spuren 1, 4 und 7 enthielten ¹²&sup5;I-markierte T. pallidum-Antigene. Die Spuren 2, 5 und 8 enthielten ³&sup5;5-markierte Produkte aus dem das 47 kDa-Immunogen exprimierenden Klon pMN23. Die Spuren 3, 6 und 9 enthielten ³&sup5;5-markierte Produkte aus Klon pMN20, der ein 34 kDa- Immunogen aus T. pallidum exprimiert, das vom monoklonalen Antikörper 385 erkannt wird. Die Proteinmolekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite angegeben (in kDa), abgeleitet von ¹&sup4;C-Molekulargewichtsmarkern, die auf dem Gel elektrophoretisiert worden sind. Pfeile zeigen den Ort der 47 kDa- und 34 kDa-Immunogene.
Abb. 5: Westernblot des 47 kDa-Immunogens, das von den rekombinanten Klonen pMN23 und pMN23 exprimiert wird. Die solubihsierten Antigene wurden nach der Gelelektrophorese und dem Proteintransfer durch Inkubation mit dem monoklonalem anti-47 kDa-Antikörper 8G2 nachgewiesen, der sein charakteristisches Reaktivitätsprofil mit dem 47 kDa-T. pallidum-Immunogen (Spur 1) erzeugte. Die Spuren 2 und 3 enthielten die 47 kDa-Immunogen exprimierenden Klone pMN23 bzw. pMN24. Die Spuren 4, 5 und 6 enthielten den das 34 kDa-Immunogen exprimierenden Klon pMN20, pBR322 in E. coli RR1 bzw. den 44 kDa-Immunogen exprimierenden Klon pMN7 als negative Kontrollen.
Die vorliegende Erfindung bezieht die Verwendung einer Klonbank ein, die mittels konventioneller rekombinanter DNA-Verfahren erzeugt wurde, wobei Treponema pallidum-DNA-Fragmente in einen geeigneten Vektor insertiert und die DNA-Fragmente in einen Mikroorganismus-Rez ipienten transferiert werden. Obwohl jede Klonbank, die Treponema pallidum-DNA umfaßt, verwendet werden kann, wurde die zuvor etablierte (9. Juni 1982) pBR322- Hybridklonbank, die vom Erfinder beschrieben worden ist, als eine bevorzugte Quelle rekombinanter E. coli-Klone verwendet (Norgard et al., (1983) Infection and Immunitv, Band 42, Seiten 435-445). Diese Klonbank von Mikroorganismen wurde auf Klone durchmustert, die ein besonderes Treponema pallidum Antigen erzeugen. Das Durchmustern wurde durchgeführt, indem Wechselwirkungen der Klonkolonien mit Antikörpern beobachtet wurden, die an das interessierende Treponema pallidum-Antigen spezifisch banden. Klone, die das interessierende Antigen erzeugten, wurden ausgewählt, abgetrennt und propagiert, um Treponema pallidum-Antigen für die weitere Identifizierung, Charakterisierung oder Verwendung zu erzeugen. Diese Verwendung kann beispielsweise in dem Nachweis von Antikörpern gegen Treponema pallidum oder in der Erzeugung eines Impfstoffes liegen, der für die Induktion einer Immunität gegen Syphilis nützlich ist.
Ein beispielhaftes Verfahren zum Erzeugen mikrobieller Klone, die das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum exprimieren, ist das folgende: Anfangs wird die DNA eines mikrobiellen Vektors gespalten, bevorzugt mittels einer Restriktionsendonuklease, um ein erstes DNA-Fragment zu erzeugen. Das erste DNA-Fragment wird mit einem zweiten DNA-Fragment verbunden, wobei das zweite DNA-Fragment aus Treponema pallidum stammt. Das erste und das zweite DNA-Fragment sind dadurch gekennzeichnet, daß sie rekombinieren können, und ein rekombinanter Vektor, der Treponema pallidum-DNA trägt, wird durch Ligation gebildet. Im nächsten Schritt wird ein geeigneter mikrobieller Wirt mit dem rekombinanten Vektor transfiziert, um mikrobielle Klone zu erzeugen, die Treponema pallidum-Antigene exprimieren. Diese mikrobiellen Klone werden dann kultiviert, bevorzugt auf der Oberfläche eines Nährstoffagars, um sichtbare Kolonien zu bilden. Die Kolonien werden dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der eine spezielle Affinität für das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum hat. Kolonien mikrobieller Klone, die eine Affinität für den Antikörper haben, werden dann identifiziert und selektiert. Die ausgewählten Kolonien sind durch ihre Expression des 47 kDa- Oberflächenimmunogens von Treponema pallidum gekennzeichnet.
Das oben beschriebene 47 kDa-Oberflächenimmunogen kann dadurch definiert werden, daß es eine spezifische Affinität für einen monoklonalen Antikörper hat, der von der Maushybridomzellinie 8G2 (American Type Culture Collection, Hinterlegungs-Nr. HB8134) erzeugt wird. Obwohl die meisten auf diesem Gebiet Tätigen hinsichtlich der Größe von 47 kDa für dieses immundominante Treponema pallidum-Oberflächenimmunogen übereinstimmen, können solche Molekulargewichtsbestimmungen in einem geringen Umfang schwanken. Der mikrobielle Vektor ist bevorzugt ein Plasmid, obwohl andere nützliche Vektoren, beispielsweise viele Phagen, im Stand der Technik gut bekannt sind. Der am stärksten bevorzugte mikrobielle Vektor ist das Plasmid pBR322. In dem oben beschriebenen Verfahren wird der mikrobielle Vektor bevorzugt mit PstI gespalten und mit dG verlängert, um das erste DNA-Fragment zu bilden. In der Praxis involviert das oben beschriebene Verfahren die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers als einen Antikörper für die Identifizierung und Selektion von Kolonien von Klonen, die das 47 kDa-Oberflächenimmunogen erzeugen. Der am stärksten bevorzugte monoklonale Antikörper ist der von der Maushybridomzellinie 8G2 (American Type Culture Collection Nr. H88134) erzeugte.
Ein für die Durchführung dieser Erfindung besonders bevorzugter mikrobieller Wirt gehört der Art Escherichia coli an. Das zweite DNA-Fragment, das für die Bildung eines rekombinanten Vektors für die Erzeugung eines rekombinanten Mikroorganismus verwendet wird, stammt bevorzugt aus einem partiellen Restriktionsenzymabbau von Treponema pallidum oder anderen pathogenen Unterarten von Treponema. Das zweite DNA-Fragment wird bevorzugt von diesem partiellen Restriktionsenzymabbau erhalten und mit dC-Resten verlängert.
Das rekombinante Plasmid, das für die Transformation eines mikrobiellen Wirtes und Bildung eines Treponema pallidum-Immuno gens angepaßt ist, umfaßt einen Plasmidvektor, in den ein Desoxyribonukleinsäure(DNA)-Segment insertiert worden ist, das für das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum kodiert.
Dieses Fragment umfaßt DNA-Sequenzen, die links von der dal- Stelle beginnen und sich bis ungefähr 70 Basenpaare zur rechten der zweiten internen PstI-Stelle des in Abb. 2 gezeigten klonierten Inserts erstrecken. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße rekombinante Plasmid Plasmid pMN23, das bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, als ATCC Hinterlegung Nr. 67204 hinterlegt worden ist. Die transformierten erfindungsgemäßen Mikroorganismen umfassen, wie oben erwähnt, ein rekombinantes Plasmid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Mikroorganismus ein Escherichia coli-Stamm mit der Hinterlegungs-Nr. ATCC 67204, wobei der Mikroorganismus das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum erzeugen kann, das mit Antikörpern gegen Treponema pallidum reaktiv ist. Das insertierte Treponema pallidum-DNA-Segment, das für das 47 kDa-Oberflächenimmunogen kodiert, ist als ein 5,4 kb-Fragment, das teilweise Restriktionsenzym-kartiert ist, in Abb. 2 gezeigt.
Die Gegenwart von Antikörpern gegen Treponema pallidum in biologischen Flüssigkeiten kann mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen werden. Eine Probe einer biologischen Flüssigkeit wird zunächst erhalten und dieser Probe einer biologischen Flüssigkeit wird dann ein 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum, das mittels der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Verfahren erzeugt wurde, zugesetzt. Anschließend kann mit irgendeinem der vielfältigen immunologischen Verfahren für solche Bestimmungen, die dem Fachmann bekannt sind, festgestellt werden, ob in der Probe vorhandene Antikörper gegen Treponema pallidum mit dem Immunogen reagieren.
Ein Mikroorganismus des Stammes Escherichia coli, der das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum erzeugen kann, ist mittels der hier beschriebenen Verfahren erzeugt worden und bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, als ATCC Hinterlegung Nr. 67204 hinterlegt worden. Dieser Mikroorganismus hat das ihn identifizierende Merkmal, das er mit Antikörpern gegen Treponema pallidum reaktiv ist, insbesondere Antikörpern gegen das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum.
Solche rekombinant-synthetisierten 47 kDa-Antigene, identifiziert durch Molekularmasse (Größe) und immunologische Merkmale (Bindung des monoklonalen Antikörpers 8G2 [ATCC Nr. HB-8134] und 11E3 [Patent-Nr. 4,514,498 und Patentanmeldung Serien-Nr. 702,327]), wie das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum, können verwendet werden, um einzigartige Zusammensetzungen herzustellen, die für die Diagnose von oder die Impfung gegen pathogene treponemale Infektionen, wie z.B. mit Treponema pallidum oder anderen pathogenen Unterarten von Treponema, nützlich sind.
Ein Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart von Treponema pallidum in einer klinischen Probe kann vorgesehen werden, wobei das erfindungsgemäße Plasmid pMN23 verwendet wird, das für das 47 kDa-Obeflächenimmunogen von Treponema pallidum kodiert, oder ein Fragment davon.
Solche Nukleotidfragmente sind innerhalb des 5,4 kb-Inserts von Plasmid pMN23, das in Abb. 2 gezeigt ist, enthalten. Dieses Plasmid ist bei der American Type Culture Collection als ATCC Hinterlegung Nr. 67204 hinterlegt worden. Markierte Nukleotidfragmente können direkt aus dem 5,4 kb-Insert hergestellt werden, oder von komplementären Nukleotidfragmenten, die an den Nukleotidsequenzen des Inserts synthetisiert werden. Ein 1,28 kb-Fragment, das ungefähr zwischen der ClaI- Spaltstelle und der zweiten internen PstI-Spaltstelle liegt, schien das kleinste Fragment darzustellen (wobei jede Signalsequenz unberücksichtigt blieb), das tatsächlich für da3 47 kDa-Strukturoberflächenimmunogen kodierte. In der Praxib können die Verfahren und Reagenzien, die im US-Patent Nr. 4,358,535 beschrieben sind, das hier durch In-Bezugnahme einbezogen ist, verwendet werden, aber mit den oben beschriebenen Treponema pallidum-Nukleotidfragmenten oder den darin enthaltenen Nukleotidseguenzen.
Anfänglich wurden die klinischen Proben eines Patienten auf einem inerten Träger deponiert. Diese deponierte Probe wurde dann behandelt, um das genetische Material jedweden pathogenen Treponema pallidum, der in der Probe vorhanden ist, in im wesentlichen einzelsträngiger Form an im wesentlichen der gleichen Stelle an den Träger, auf dem die Probe deponiert worden war, anzuheften. Das fixierte einzelsträngige genetische Material wird dann mit einer markierten Sonde in Kontakt gebracht, wobei die markierte Sonde das Plasmid pMN23 (ATCC63240) oder ein Fragment davon ist und mindestens ungefähr 25 Basenpaare hat, die einer Nukleotidsequenz von Treponema pallidum im wesentlichen komplementär sind, die für das 47 kDa-Oberflächenimmunogen kodiert. Dieses In-Kontakt-Bringen findet unter Hybridisierungsbedingungen bei einer vorher bestimmten Stringenz statt. Die Duplexbildung auf dem Träger zwischen angehefteter Treponema pallidum-DNA und der markierten Sonde kann durch Messen der Menge des an den festen Träger gebundenen Markers nachgewiesen werden.
Das erfindungsgemäße, besonderes interessierende Treponema pallidum-Antigen war das 47 Kilodalton(kDa)-Oberflächenimmunogen, das zuvor beschrieben worden ist (Jones et al., (1984) J. Exp. Med., Band 160, Seiten 1404-1420, und Marchitto et al., binante Klone zu durchmustern, die das 47 kDa-Antigen erzeugen, wurden monoklonale Antikörper verwendet, die dieses Antigen spezifisch binden. Diese Antikörper und die sie erzeugenden Hybridomas (8G2 [ATCC HB3184] und 11E3) sind im US-Patent Nr. 4,514,498 und der anhängigen US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 702,327 beschrieben.

Material und Methoden

Bakterielle Stämme. Plasmide und DNAs.
Die virulenten Nichols-Stämme der Treponema pallidum-Unterart pallidum (T. pallidum) wurden in dieser Untersuchung als re präsentatives Pathogen verwendet. Sie wurden gehalten und kultiviert in den Testikeln von weißen Neuseeland-Kaninchen, wie zuvor beschrieben (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 435-445 und Robertson et al., (1982) Infect. Immun., Band 36, Seiten 1076-1085). Nichtpathogene Stämme der Treponemen T. i,hapedenis Biotyp Reiter, T. denticola, T. scoliodontum und T. vincentii wurden in vitro kultiviert (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110- 119). Escherichia coli RRI wurde als Wirtsrezipientenstamm für die Klonierungs- und Transformationsexperimente verwendet (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119). Eine Zusammenfassung der relevanten rekombinanten Plasmide, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, ist in Tabelle 1 gegeben. Tabelle 1 Merkmale rekombinanter Plasmide
a Steht nicht im Zusammenhang mit dem 47 kDa-Antigen der Klone pMN23 und pMN24, wie mittels mak und genetischer Untersuchungen gezeigt worden ist.
b Kaninchenimmunserum, erhalten aus T. pallidum-infizierten Kaninchen.
c - (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 435-445)
d - (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119)
E. coli RR1, das das Plasmid pMN7 beherbergt (alte Bezeichnung: RICB2-1), ist beschrieben worden (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 435-445); pMN7 stammte aus der unten angegebenen Klonbank und enthält ein 3,7 Kilobasen(kb) DNA-Insert von T. pallidum-DNA, das durch GC-Verlängerung in die PstI-Stelle von pBR322 kloniert worden ist. Es kodiert für ein 44 kDa-Rekombinationsantigen, das mit dem 47 kDa-Antigen nicht im Zusammenhang steht. Das 44 kDa-Antigen des Klones pMN7 ist mittels Kaninchenimmunserum immunprazipitierbar (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 435- 445), aber nicht mit einem unserer gegenwärtigen maks. Klon pMN20, der ein 34 kDa-Oberflächenantigen von T. pallidum kodiert und exprimiert, ist beschrieben worden (Swancutt et a., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119). Alle Plasmidderivate wurden in E. coli RRI propagiert und isoliert und gereinigt nach Norgard (Norgard et al., (1981) Anal. Biochem., Band 113, Seiten 34-42). Die DNA aus der Leber weißer normaler männlicher Neuseeland-Kaninchen und die treponemalen DNAS wurden isoliert, wie zuvor beschrieben (Norgard et al., (1981) Science, Band 213, Seiten 553-555).

Klonierungsverfahren und Restriktionsenzvmanalvse.

Eine zuvor etablierte pBR322-Hybridplasmidklonbank (9. Juni 1982) wurde als mögliches Reservoir Antigen-exprimierender Klone verwendet (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 435-445). Die Bank wurde unter Verwendung kombinierter AluI- und HeaIII-Restriktionsenzympartialverdaus von T. pallidum-DNA konstruiert, die anschließend mit dC-Resten verlängert und in pBR322 (dG-verlängert an einer PstI-Stelle, um die PstI-Stellen zu regenerieren, die die klonierten Inserts flankieren) (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 435-445). Die Restriktionsenzyme für die Analyse von Plasmiden und den Abbau genomischer DNA wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) erworben.

Radiomarkierung von Bakterien. DNA und Proteinen.

T. pallidum wurde aus Kaninchentestikelgewebe durch Percoll- Dichtegradientenverfahren gereinigt (Hanff et al., (1984) Sex. Trans. Dis., Band 11, Seiten 275-286); die Bakterien wurden mit Na-¹²&sup5;I unter Verwendung eines Laktoperoxidaseverfahrens radiomarkiert (Alderete et al., (1980) Infect. Immun., Band 30, Seiten 814-823; Jones et al., (1984) J. EXD. Med., Band 160, Seiten 1404-1420). E. coli RRI-Stämme, die verschiedene pBR322-Plasmidderivate beherbergen, wurden metabolisch mit L-³&sup5;5-Methionin wie zuvor beschrieben markiert (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 435-445). Alle Sonden-DNA wurden mit Alpha- P-DCTP unter Verwendung eines Nicktranslationskits von New England Nudear (Boston, MA) radiomarkiert. Antikörpersonden wurden mit Na-¹²&sup5;I unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens (Hunter et al., (1962) Nature, Band 194, Seiten 495-496) radiomarkiert.

Southern-Gel-Hybridisierungen.

Southernblots wurden entsprechend dem zuvor publizierten Verfahren durchgeführt (Norgard et al., (1981) Science, Band 213, Seiten 553-555, Southern (1975) J. Mol. Biol., Band 98, Seiten 503-517, Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119). Für eine Sonde wurde ein DNA-Restriktionsenzymfragment aus niedrigschmelzender Agarose mittels Elutip -(Schleicher & Schuell, Keene, NH) Affinitätschromatographie (Schmitt et al., (1983) Anal. Biochem., Band 13, Seiten 462- 464) isoliert. Die Hybridisierung mit DNA-Sonden wurde in 2x Denhardt's-Lösung (Southern (1975) J. Mol. Biol., Band 98, Seiten 503-517) plus 6x SSC-Puffer (1x SSC = 0,15 M NaCl + 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), 1 InM EDTA und 100 µg/ml gescherter, denaturierter Lachssperma-DNA (Southern (1975) J. Mol. Biol., Band 98, Seiten 503-517) durchgeführt. Nach 16 h Hybridisierung bei 68CC wurden die Filter 3 mal bei Raumtemperatur mit 500 ml Portionen 2x SSC+0,1% Natriumdodecylsulfat gewaschen (30 min pro Schritt), gefolgt von zusätzlichen 3 Waschschritten bei Raumtemperatur (30 min pro Waschschritt) unter Verwendung von 500 ml Portionen 0,1x SSC+0,1% Natriumdodecylsulfat. Die Filter wurden getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen (Laskey (1977) FEBS Lett., Band 82, Seiten 314-316).
Monoklonale Antikörder. Antiseren und Antikörersonden. Die Maus-Iftaks 8G2 (IgG1), 11E3 (IgG2a) und 385 (IgGl), die spezifisch gegen T. pallidum gerichtet sind, wurden erzeugt, gehalten und charakterisiert wie zuvor beschrieben (Jones et al., (1984) J. EXD. Med., Band 160, Seiten 1404-1420; Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., Band 45, Seiten 660-666; Marchitto et al., (1986) Infect. Immun., Band 51, Seiten 168- 176; Norgard et al., (1984) J. Clin. Microbiol., Band 20, Seiten 711-717; Robertson et al., (1982) Infect. Immun., Band 36, Seiten 1076-1085 und Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119). MAK 11E3 ist im einzelnen beschrieben worden (Jones et al., (1984) J. EXD. Med., Band 160, Seiten 1404-1420; Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., Band Band 51, Seiten 168-176 und Norgard et al., (1984) J. Clin. Microbiol., Band 20, Seiten 711-717). Die Maks 8G2 und 11E3 sind gegen das 47 kDa-Hauptimmunogen (Jones et al., (1984) J. EXD. Med., Band 160, Seiten 1404-1420, Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., Band 45, Seiten 660-666; gerichtet. MAK 385 reagiert mit einem 34 kDa-Oberflächenimmunogen von T. Dallidum (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119).
Die Maks wurden innerhalb von Hybridomklonüberständen verwendet oder wurden aus den Hybridomklonüberständen unter Verwendung individueller Protein-A-Sepharose-Säulen affinitätsgereinigt (Ey et al., (1978) Immunochemistrv, Band 15, Seiten 429-436). Die Maks C2-1 (IgM) und H9-1 (IgG1) waren gegen "gemeinsame" und "pathogenspezifische" Epitope von T. pallidum gerichtet (Hook et al., (1985) J. Clin. Microbiol., Band 22, Seiten 241-244, Lukehart et al., (1985) J. Immunol., Band 134, Seiten 585-592). Normales Kaninchenserum wurde aus nichtreaktiven männlichen weißen Neuseeland-Kaninchen aus dem Venereal Disease Research Laboratory gewonnen. Kaninchen-anti-T. palli dum-Serum (Kaninchenimmunserum) wurde erhalten und aus 4 Tieren 3 bis 12 Monate nach einer schweren Orchitis in beiden Testikeln nach einer intratestikulären T. pallidum-Infektion gewonnen; von immunen Kaninchen wurde gezeigt, daß sie "Schanker-immun" sind, wenn sie intradermal mit 1 x 10&sup5; motilen T. pallidum pro Stelle behandelt wurden (Jones et al., (1984) J. Exo. Med., Band 160, Seiten 1404-1420). Kaninchenanti-T. Dhapedenis Biotyp Reiter Antiserum wurde von S.A. LUkehart zur Verfügung gestellt. Sieben Humanserumproben mit sekundärer Syphilis wurden von Dr. George Wendel zur Verfügung gestellt; diese Seren wurden für eine routinemäßige serologische Diagnostikbestätigung (innerhalb des vergangenen Jahres) aus Frauen mit bestätigter sekundärer Syphilis gewonnen. Das überschüssige Serum jedes Patienten, gelagert bei -70ºC und in dieser Untersuchung verwendet, wurde aus dem klinischen Labor erhalten, anstatt durch das Labor regulär entsorgt zu werden. IgG wurde aus den Seren unter Verwendung von Natriumsulfat- Präzipitation und DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie isoliert.

Radioimmunkolonieblottest.

Der Radioimmunkolonieblot(RICB)-Test für den Nachweis von Kolonien von E. coli-Klonen, die T. pallidum-Antigene synthetisieren, wurde entsprechend Norgard und Miller (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 435-445) mit geringfügigen Modifikationen (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119) durchgeführt.

Radioimmundräzipitation.

Radioimmunpräzipitation (RIP) wurde durchgeführt, wie kürzlich beschrieben (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119) mit geringfügigen Modifikationen. Für die Radioimmunpräzipitation von T. pallidum wurden ungefähr 5 x 10&sup6; cpm in ¹²&sup5;I-markierter Treponemen (1-3 cpm pro Treponema) in 1,0 ml Solubilisierungspuffer (10 Trim Tris-HCl[pH 7,8], 150 mM NaCl, 10 InM EDTA und 0,2% Zwittergent 3-12 [Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, CA] inkubiert). Für S³&sup5;-Methionin-markierten E. coli wurden ungefähr 7 x 10&sup7; cpm verwendet. Zehn µg Ziegeanti-Maus-IgG wurde nach dem primären mak (30 min bei 4ºC unter Bewegung) als eine Brücke für die IgGl-maks 8G2 und 3B5 zugefügt. Solubilisierte Immunpräzipitate wurden schließlich einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel(10%) -Elektrophorese nach Reduktion bei 100ºC in 5% 2-Merkaptoethanol unterworfen (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119). C-markierte Molekulargewichtsmarker wurden, wie zuvor beschrieben, verwendet (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119). Verschiedene radiomarkierte Verbindungen (³&sup5;S, ¹&sup4;C und ¹²&sup5;I) wurden auf dem gleichen Gel nach Behandlung mit Enhance (New England Nudear Corp.) für S und C, gefolgt von Autoradiographie (Laskey (1977) FEBS Lett., Band 82, Seiten 314-316) nachgewiesen.

Westernblots.

Westernblots wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., Band 45, Seiten 660- 666). für die Analyse von T. pallidum-Antigene wurden ungefähr 1 x 10&sup7; solubilisierte Treponemen pro Polyacrylamidgelspur geblottet. Für rekombinante E. coli-Derivate wurden ungefähr 1 x 10&sup8; solubilisierte E. coli pro Gelspur verwendet.

Ergebnisse

Identifizierung von Antiaen-exdrimierenden Klonen.

Abb. 1 zeigt die Ergebnisse von RICB-Tests, die maks verwendeten. Zwei rekombinante DNA-Klone, pMN23 und pMN24, wurden isoliert, die mit anti-47 kDa-maks 11E3 und 8G2 reagierten, aber nicht mit der Negativkontrolle mak 385. Alle 3 maks reagierten nicht mit den Negativkontrollklonen pMN7 und pBR322. MAK 3B5, gerichtet gegen ein 34 kDa-Oberflächenimmunogen von T. pallidum (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119), reagierten nur mit T. pallidum.
Kaninchenimmunserum-IgG reagierte in dem RICB-Test mit den Klonen pMN23, pMN24 und pMN7, wie erwartet, während IgG aus normalem Kaninchenserum das nicht tat (nicht gezeigt). Kaninchen-anti-T. Dhaaedenis Biotyp Reiter Antiserum, das Antikörper gegen gewöhnliche treponemale Determinanten besitzt, reagierte ebenfalls nicht mit den Klonen pMN23 und pMN24 (nicht gezeigt). MAK H9-1, spezifisch gerichtet gegen das 47 kDa- Immunogen (Hook et al., (1985) J. Clin. Microbiol., Band 22, Seiten 241-244, Lukehart et al., (1985) J. Immunol., Band 134, Seiten 585-592) reagierte mit den Klonen pMN23 und pMN24 stark, jedoch nicht mit pMN7 oder pBR322 (nicht gezeigt). In zusätzlichen RICB-Tests reagierte mak C2-1, der gegen ein gewöhnliches treponemales Epitop gerichtet ist (Hook et al., (1985) J. Clon. Microbiol., Band 22, Seiten 241-244, Lukehart et al., (1985) J. Immunol., Band 134, Seiten 585-592) mit T. pallidum und T. Dhaclendenis Biotyp Reiter, aber nicht mit irgendwelchen E. coli-Klonen (nicht gezeigt).
Weitere Hinweise für den Plasmid-kodierten, Antigen-exprimierenden Phenotyp lagen in der Tatsache, daß gereinigte Plasmid- DNA aus RICB-positiven rekombinanten Klonen den 47 kDa-Antigen-exprimierenden Phenotyp in normale E. coli-Wirtszellen mit einer Frequenz von 100% transformieren konnte. (200 von 200 zufällig getesteten Transformanten).

Restriktionsenzvmkarte des 47 kDa-Immunoaen-exdrimierenden Klones DMN23.

Abb. 2 zeigt eine vorläufige Restriktionsenzymkarte des 5,4 kb-Inserts vom Plasmid pMN23. Das pMN23-Insert wird von kurzen DGC-Schwänzen innerhalb der PstI-Stellen flankiert, wobei 5 interne PstI-Stelien innerhalb des Inserts angeordnet sind. Ein strategisches Fragment für die Strukturanalyse des für das 47 kDa-Immunogen kodierenden Bereiches umfaßte ein 3,85 kb HINDIII-Fragment; Subklonieren dieses Fragmentes in die Hindill-Stele von pBR322 führte jedoch nicht zur Expression der relevanten Epitope, wenn 54 Ampicillin-resistente, Tetracyclin-sensitive, das 3,85 kb HINDIII-Fragment-enthaltende Subklone im RICB-Test unter Verwendung der mAks 11E3 oder 8G2 getestet wurden. Eine analoge Restriktionsenzymkartierung des Klones pMN24 zeigte die Gegenwart von Restriktionsenzymfragmenten, die denen von pMN23 ähnlich waren. pMN23 und pMN24 könnten daher identisch sein.
Sdezifität der klonierten 47 kDa-Immunoaen-Gensequenz in T. pallidum-DNA.
Infolge der möglichen Gegenwart von kontaminierender Kaninchen-Wirts-DNA in T. pallidum-DNA-Preparationen, die als eine Quelle der DNA für die Klonierung verwendet wurden, war es notwendig, die Herkunft der klonierten DNA-Sequenzen aus T. pallidum zu bestätigen. Es war außerdem wichtig, zu bestimmen, ob homologe Genseguenzen unter immunologisch verwandten, nichtpathogenen Treponemen existierten. Um diese Möglichkeiten zu überprüfen, wurde das 3,85 kb HINDIII-Fragment von pMN23 isoliert, markiert und als eine Hybridisierungssonde bei Southernblot-Analysen verwendet (Abb. 38). Das Agarosegel (1%) (Abb. 3A) enthielt Hindill-restringierte Preparationen genomischer DNAS aus T. pallidum, Kaninchenleber und vier nichtpathogenen Treponemen. Die Gelspuren 2 und 4-7 der Abb. 3A, enthaltend andere als T. pallidum-DNA, wurden überladen, um ein eindeutiges Ergebnis sicherzustellen. In den Spuren 3 und 8 der Abb. 38 hybridisierte die 3,85 kb Hindill-Sond mit einem 3,85 kb HINDIII-Fragment der T. pallidum-DNA und mit sich selber; es wurde keine Hybridisierung mit Kaninchen-DNA, den DNAs von vier nichtpathogenen Treponemen oder Kontroll-DNA (Lambda oder pBR322) beobachtet. Multiple hybridisierende Banden, die in Hindil-gespaltenem pMN23 (Abb. 38, Spur 8) beobachtet wurden, stellen den kleinen Anteil nicht vollständig durch die Hindill-Behadlung gespaltenen pMN23 dar.
Wenn Southernblots, die der Abb. 38 identisch waren, hybridisiert und weniger intensiv bis zu einem Punkt gewaschen wurden, wo das Auftreten nichthomologer DNA-DNA-Hybridisierung mit entweder Lambda-DNA oder pBR322-DNA beobachtet werden konnte&sub1; wurde immer noch keine Hybridisierung der 3,85 kb HINDIII-Fragmentsonde mit irgendeinem HINDIII-Fragment nichtpathogener Treponemen beobachtet (nicht gezeigt). Intaktes Plasmid pMN23 (das die gesamte 5,4 kb-Sequenz enthielt), das als markierte Sonde unter Bedingungen reduzierter Stringenz verwendet wurde, hybridisierte ebenfalls nicht mit irgendeinem HINDIII-Fragment von Nichtpathogenen (nicht gezeigt). Die Unfähigkeit, eine homologe 47 kDa-Immunogensequenz in den nichtpathogenen Treponemen nachzuweisen, schien daher nicht das Er.gebnis von zu stringenten Hybridisierungsbedingungen, die beim Southernblot verwendet wurden, zu sein.
Wenn mit der Abb. 3B identische Southerngelblots mit markierten pBR322 (Vektor-DNA) hybridisiert wurden, wurde keine Hybridisierung eines 3,85 kb HINDIII-Fragmentes mit T. pallidum DNA oder mit dem 3,85 kb HINDIII-Fragment aus Klon pMN23 beobachtet (nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu hybridisierte intakte markierte pMN23-Plasmid-DNA, wenn sie als Hybridisierungssonde verwendet wurde, mit der entsprechenden T. pallidum-DNA Sequenz sowohl in genomischer T. pallidum-DNA als auch in Klon pMN23, sowie mit den pBR322-DNA-Sequenzen, aber nicht mit der Kaninchen-DNA oder den genomischen DNAS der nichtpathogenen Treponemen, wie vorhergesagt (nicht gezeigt).
Exdresslon des 47 kDa-Immunoaens in T. pallidum und E. coli. Abb. 4 zeigt die Ergebnisse von RIP-Tests, die unter Verwendung 1251-markierten T. pallidum und der 35S-markierten rekombinanten Klone pMN23 und pMN20 als Antigene durchgeführt worden sind. Die solubilisierten Antigene wurden unter Verwendung der maks 11E3, 8G2 und 385 immunpräzipitiert. MAK 385, gerichtet gegen ein 34 kDa-Immunogen von T. pallidum (Spur 7), wurde als eine Kontrolle verwendet. Maks 11E3 und 8G2 immunpräzipitierten das 47 kDa-Immunogen aus 1-markiertem T. pallidum (Abb. 4, Spuren 1, 4). Ein Antigen mit einem offensichtlich identischen Mr zu dem 47 kDa-Immunogen von T. pallidum wurde durch die maks 11E3 und 8G2 aus Klon pMN23 immunpräzipitiert (Spuren 2, 5), aber nicht aus E. coli, der das Kontrollhybridplasmid pMN20 enthielt (Spuren 3, 6), das ein 34 kDa-T. pallidum-Antigen kodiert (Spur 9). In den Spuren 1, 4 und 7 stellt die Extrabande bei einer Molekularmasse von 50 kDa eine schwere Immunglobulinkette aus dem Kaninchenwirt dar, die mit T. pallidum kopurifiziert und die durch eine Laktoperoxidasekatalysierte lodierung markiert wird (Marchitto et al., (1986) Infect. Immun., Band 51, Seiten 168-176); andere irrelevante Banden in den Spuren 1-9 sind eine Folge der nichtspezifischen Adsorption der markierten Produkte an S. aureus-Zellen.
Ein Ergebnis, das dem mit RIP erhaltenen analog war, wurde unter Verwendung von Westernblots erhalten (Abb. 5). Anti-47 kDa mak 8G2 reagierte mit 47 kDa-Antigenen aus T. pallidum, Klon pMN23 und Klon pMN24, aber nicht mit einem der Negativkontrollklone pMN20, pBR322 oder pMN7 (Abb. 5). Ein ähnlicher Westernblot, der mit anti-47 kDa-mak 11E3 hybridisiert wurde, ergab identische Ergebnisse (nicht gezeigt). Wenn ein weiterer Blot mit IRAK 385 hybridisiert wurde, zeigte er die Gegenwart des 34 kDa-Antigenes in T. pallidum und Klon pMN20, aber nicht in den Klonen pMN23, pMN24, pMN7 oder pBR322, wie erwartet (nicht gezeigt)
Weitere Westernblot-Experimente zeigten, daß mindestens sechs von sieben humanen Seren von Patienten mit sekundärer Syphilis mit der rekombinanten Form des 47 kDa-Immunogenes reagierten (ein Ergebnis war fragwürdig), während normale Humanseren nicht reagierten (nicht gezeigt). Die gleichen humanen Syphilisseren waren mit E. coli, der den Klonierungsvektor allein beherbergte, nicht reaktiv. Die Experimente bestätigten die Reaktivität humaner Antikörper, die in Antwort auf eine natürlich erworbene Infektion mit T. pallidum hervorgerufen werden, mit dem von rekombinanter DNA abgeleiteten 47 kDa-Immunogen, das in E. coli exprimiert wird.
Für die Klonierung und Expression des 47 kDa-Hauptoberflächenimmunogens von T. pallidum in E. colj werden Beweise vorgestellt. Das 5,4 kb DNA-Insert, das für das 47 kDa-Immunogen kodiert, besitzt eine großzügig bemessene Kodierungskapazität für das Immunogen; ungefähr 1,3 kb DNA wären erforderlich, um ein reifes 47 kDa-Antigen zu kodieren. Ein 3,5 kb HINDIII-DNA- Fragment-Subklon des 5,4 kb DNA-Gesamtinserts konnte die relevanten Epitope nicht exprimieren, wenn Subklone unter Verwendung der maks 11E3 oder 8G2 analysiert wurden. Weitere neuere vorläufige Subklonierungsexperimente legen nahe, daß die rechts liegenden drei PstI-Fragmente des Klones pMN23 (Abb. 2) für die Expression des 47 kDa-Immunogenes nicht notwendig sind. Teile aller drei der links liegenden PstI-Fragmente von pMN23 scheinen für die Expression des 47 kDa-Genproduktes erforderlich zu sein, aber anscheinend ist nur ein kleiner rechts liegender Teil des linken 1.150 bp PstI-Fragmentes für die Expression erforderlich. Das 510 bp PstI-Fragment ist für die Expression erforderlich. Die Deletion des 510 PstI-Fragmentes führt zu einem verstümmelten Genprodukt mit einer Molekularmasse von ungefähr 44,5 kDa (reaktiv mit mak 11E3). Diese vorläufigen Ergebnisse legen nahe, daß die Transkriptionsrichtung von links nach rechts im Verhältnis zur Abb. 2 ist, daß die Transkription des 47 kDa-Strukturgenes unmittelbar links von der Clai-Stelle beginnt und bis ungefähr 70 Basenpaare zur rechten der zweiten internen PstI-Stelle in dem klonierten Insert fortschreitet. Für präzisere Bestimmungen sind weitere Experimente notwendig.
Auf der Grundlage weiterer Untersuchungen (Fehniger et al., (1984) Infect. Immun., Band 46, Seiten 598-607; Hansen et al., (1985) J. Baceriol., Band 162, Seiten 1227-1237; Norgard et al., (1983) Infect. Immun., Band 42, Seiten 435-445; Stamm et al., (1983) Infect. Immun., Band 41, Seiten 709-721 und Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., Band 52, Seiten 110-119) ist es wahrscheinlich, daß E. coli den T. pallidum-Promoter für die Transkription des 47 kDa-Genes verwendet. Vorläufige Experimente legen jedoch nahe, daß der Expressionsspiegel des 47 kDa-Genproduktes in E. coli ungefähr 10&supmin;¹ bis 10&supmin;&sup4; mal weniger effizient ist (auf Grundlage der Expression pro Zelle) im Vergleich mit T. pallidum. Die anfängliche Verwendung des von Tabor und Richardson (Tabor et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 82, Seiten 1074-1078) beschriebenen Expressionsvektorsystemes erhöhte die Expression des 47 kDa-Genproduktes mehr als 100-fach (nicht publiziert).
Die Verfügbarkeit des gereinigten rekombinanten 47 kDa-Immunogens, hergestellt wie hier beschrieben, stellt eine Möglichkeit für die direkte Diagnostik, Untersuchungen der Pathogenese und Entwicklung von Impfstoffen zur Verfügung. Daß sowohl die native als auch die von rekombinanter DNA abgleitete Form des 47 kDa-Immunogenes identische elektrophoretische Beweglichkeiten auf Polyacrylamidgelen aufweisen, und daß Antikörper, die in humanen syphilitischen Seren vorhanden sind, an die rekombinante Form des Antigenes binden, legt nahe, daß das rekombinante Molekül anstelle des nativen Immunogens in diesen Untersuchungen verwendet werden kann.
Die Expression des 47 kDa-Immunogens in E. coli wird eine präzisere biochemische Analyse des 47 kDa-Proteines erlauben. Lukehart et al. schlugen vor, daß das 48 kDa-Immunogen von T. pallidum ein Glykoprotein sein könne (Lukehart et al., (1982) J. Immunol., Band 129, Seiten 833-838). Obwohl F-Pilin von E. coli als ein Glykoprotein angesehen werden kann (es enthält nur eine Glucose und möglicherweise jeweils eine Galaktose und Didesoxyhexose) (Willetts et al., (1980) Ann. Rev. Genet., Band 14, Seiten 41-76), gibt es wenig Beispiele für Glykoproteine in Prokaryonten. Die Tatsache, daß E. coli ein 47 kDa- Antigen mit identischer elektrophoretischer Beweglichkeit im Verhältnis zu nativem 47 kDa-Immunogen von T. pallidum exprimiert, legt nahe, daß das 47 kDa-Immunogen kein Glykoprotein ist.
Das native 47 kDa-Immunogen erscheint oft als eine "47-48 kDa- Dublette" auf Westernblots des Immunogens (Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., Band 45, Seiten 660-666 und Norgard et al., (1984) J. Clin. Microbiol., Band 20, Seiten 711-717). Das Auftreten der "Dublette" ist bei der RIP-Analyse verschleiert (Jones et al., (1984) J. Exp. Med., Band 160, Seiten 1404- 1420), wahrscheinlich infolge der Intensität der breiten radioaktiven Bande, die auf dem Polyacrylamidgel auftritt. Die zweidimensionale Gelanalyse des 47 kDa-Antigens löst eine Gruppe von 2-3 Flecken mit ähnlichen isoelektrischen Punkten von ungefähr pH 5,5-5,7 auf, die in der zweiten Dimension das Verhalten der 47-48 kDa-Dublette zeigen (nicht veröffentlichte Ergebnisse). Dies ist konsistent mit anderen nicht publizierten zweidimensionalen Geldaten, die im Labor von S.J. Norris unabhängig erhalten worden sind (S.J. Norris, persönliche Mitteilung). Die Natur der Gruppe von Polypeptidflecken mit ähnlichen isoelektrischen Punkten ist nicht klar, aber das "Dubletten"-Phänomen verhält sich bei eindimensionaler Gelanalyse konsistent. Der 48 kDa-Bestandteil der 47-48 kDa-Dublette tritt jeweils als eine schwächere Bande auf. Der 48 kDa-Bestandteil kann nichtprozessierten äußeren Membranproteinvorläufer darstellen, der anschließend zur niedermolekulargewichtigen (reifen) 47 kDa-Form während der Transmembransekretion gespalten wird. Alternativ kann der 48 kDa-Bestandteil eine posttranslationale Modifikation des 47 kDa-Produktes darstellen. Für das von rekombinanter DNA abgeleitete 47 kDa-Immunogen ist bis jetzt das 47-48 kDa-Dubletten-Phänomen nicht beobachtet worden, wobei dies eine Folge der nicht nachweisbar niedrigen Spiegel des in E. coli exprimierten 48 kDa-Produktes sein kann. Subklonieren des 47 kDa-Genes in einen Expressionsvektor (Tabor et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 82, Seiten 1074-1078) sollte helfen, diese Beobachtung zu klären. DNA-Sequenzuntersuchungen werden bei der Etablierung der primären Aminosäuresequenz eines reifen 47 kDa-Immunogenes und jeder möglichen Vorläuferform ebenfalls hilfreich sein.
Die Klonierung und Expression des 47 kDa-Immunogenes von T. pallidum in E. colj stellt Werkzeuge zur Verfügung, die die chemische Zusammensetzung des Proteines und die Struktur- Funktionsbeziehung des nativen 47 kDa-Immunogenes in T. Dallidum bestimmen helfen, was möglicherweise zu einem verbesserten Verständnis der Biologie dieses schwer faßbaren Pathogens führt. Die für das 47 kDa-Antigen kodierende DNA kann als eine diagnostische DNA-Sonde nützlich sein (Moseley et al., (1980) J. Infect. Dis., Band 142, Seiten 892-898), um treponemale Pathogene in Genitalgeschwuren, Hautläsionen und anderen Körperflüssigkeiten zu identifizieren. Gereinigtes 47 kDa-Immunogen kann verwendet werden, um sowohl humorale als auch zellvermittelte Immunantworten gegen gereinigte Antigene unter Verwendung von in vitro- und in vivo-Verfahren zu untersuchen; dies mag dabei helfen, die jeweiligen Rollen beider Seiten der Immunantwort gegen T. pallidum-Infektionen im Wirt weiter zu klären. Das von rekombinanter DNA abgeleitete Immunogen kann außerdem die Grundlage für einen verbesserten serologischen Test für Syphilis darstellen, der möglicherweise eine erhöhte Spezifität und Einfachheit im Vergleich zu gegenwärtig verwendeten Verfahren besitzt. Zusätzlich sollte das rekombinante Immunogen eine direkte Feststellung des immunogenen Potentials des 47 kDa-Immunogenes erlauben. Insoweit, als das 47 kDa- Immunogen mindestens pathogenspezifische Epitope enthält, kann die Demonstration eines vaccinogenen Potentials des rekombinanten Moleküles auf einen treponemalen Impfstoff mit einem weiten Spektrum ausgeweitet werden.
Bei den Bestandteilen, beispielsweise den Vektoren, Plasmiden, T. pallidum-DNA-Inserts oder Wirtsmikroorganismen, die hier beschrieben werden, oder bei den Schritten oder der Abfolge von Schritten der hier beschriebenen Verfahren können Veränderungen vorgenommen werden, ohne das Konzept und den Umfang der durch die folgenden Ansprüche definierten Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Rekombinantes Plasmid, das für eine Transformation eines mikrobiellen Wirtes angepaßt ist, wobei das Plasmid einen Plasmidvektor umfaßt, in den ein Fragment des DNA-Segmentes der Abb. 2, das für das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum kodiert, insertiert worden ist, wobei das Fragment DNA-sequenzen uinfaßt, die links von der ClaI-Stelle beginnen und sich bis zu ungefähr 70 Basenpaare zur rechten der zweiten internen PstI-Stelle des in Abb. 2 gezeigten klonierten Inserts erstrecken.

2. Rekombinantes Plasmid pMN23 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 67204.

3. Transformierter Mikroorganismus, der ein rekombinantes Plasmid gemäß Anspruch 1 umfaßt.

4. Mikroorganismus des Stammes E. coli mit der Hinterlegungsnummer ATCC 67204, wobei der Mikroorganismus das 47 kDa- Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum, das mit Antikörpern gegen Treponema pallidum reaktiv ist, erzeugen kann.

5. Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart von Treponema pallidum in einer klinischen Probe, wobei das Verfahren umfaßt:

a) das Ablagern der Probe auf einem inerten Träger;

b) das Behandeln der Probe, um das genetische Material der pathogenen Subspezies von Treponema pallidum, das in der Probe vorhanden ist, in einzelsträngiger Form an der gleichen Stelle auf dem Träger zu fixieren, wo die Probe abgelagert wurde;

C) das Inkontaktbringen des fixierten einzeisträngigen genetischen Materials mit einem markierten Plasmid pMN23 (ATCC 67204) oder einem Fragment davon, wobei das Inkontaktbringen unter Hybridisierungsbedingungen stattfindet, die ausreichend sind, um eine Duplexbildung zuzulassen;

d) das Nachweisen der Duplexbildung auf dem Träger mittels der Markierung.