DE3751434T2

DE3751434T2 - Aufspüren von Zellen in vivo.

Info

Publication number: DE3751434T2
Application number: DE3751434T
Authority: DE
Inventors: Paul Karl Horan; Sue Ellen Slezak
Original assignee: Phanos Tech Inc
Current assignee: Phanos Technologies Inc Beverly Hills Calif
Priority date: 1986-10-31
Filing date: 1987-10-29
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2007-10-30
Also published as: ATE125710T1; IL84294A0; KR880005458A; JPS63126833A; PT86030B; EP0266195A1; DE3751434D1; IE872871L; CA1294545C; DK167850B1; AU8040187A; PH24539A; US4762701A; KR100298682B1; ES2076929T3; AU607165B2; IE70749B1; DK570487A; ZA878116B; IL84294A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Verfolgung von Zellen in vivo und Verfahren zur Bestimmung der in vivo-Lebensdauer von Zellen.
In vivo-Verfolgung von Zellen und -Lebensdauerbestimmung erfordert, dass Zellen mit einem Marker gekennzeichnet sind, der in der Zelle stabil ist, d.h. der der Zelle nicht verloren geht und der die Zellfunktion nicht wesentlich verandert. Gegenwärtig zur Verfügung stehende Marker besitzen die notwendigen Eigenschaften nicht. Fluoreszierende Antikörper sind zum Beispiel nicht geeignet, da sie sich leicht von den Zellen lösen. Andere potentielle Marker können nicht verwendet werden, da sie die Zellfunktion beeinträchtigen.
Zyanfarbstoffe wurden für verschiedene biologische Anwendungen verwendet. Dioxycarbozyaninfarbstoffe wurden zur Durchführung differentieller Zählungen weisser Blutkörperchen verwendet. Gunter Valet, Max Planck Ges. Wissensch.: Patenthinterlegungssnummer 84-102307/17, Simultaneous Quantitative Determination of Blood Cells by Selective Staining and Measuring Volume and Fluorescence. Die in diesen Untersuchungen verwendeten Farbstoffe sind jedoch kurzkettige Carbozyanfarbstoffe (weniger als zehn Kohlenstoffatome) und reagieren auf Änderungen des Membranpotentials. Darüber hinaus sind die kurzkettigen CarboZyanfarbstoffe, die in die Mitochondrien eintreten, cytotoxisch und wenn die Zellen gewaschen werden, laufen diese Farbstoffe leicht aus der Zelle aus, unabhängig davon, ob sich das Membranpotential verändert hat oder nicht. Andere kurze aliphatische, kettenförmige Zyanfarbstoffe werden in vielen anderen biologische Assays verwendet. Die kurzkettigen Moleküle reagieren jedoch auf Membranpotentiale, wandern durch die Zellmembran und treten in die Mitochondrien ein. H.M. Shapiro, U.S. Patent Nr. 4 343 782 vom 10 August 1982. Die kurzkettigen Farbstoffe sind für Zellen toxisch und können nicht verwendet werden, um Zellen in vivo zu verfolgen.
TricarboZyanfarbstoffe (Fox et al., Proc. Mayo Clinic, 32:478-484, 1957) und Evans-Blue-Farbstoff (Schad, H. et al., Pfluegers Arch. Eur. J. Phvsiol. 370(2):139-144, 1977) wurden in vivo verwendet, um den Herzaustoss durch ein Verdünnungsverfahren zu bestimmen. Dow (Dow, P., Physiol. Rev., 36:77-102, 1956) beschreibt das Verfahren als Injektion einer bekannten Menge eines intravaskulären Indikators in die Venusseite der Lungen und Messung des Zeitverlaufs der arteriellen Konzentration des Indikators, um das Voluinen zwischen den Punkten der Injektion und der Probenentnahme zu bestimmen. Diese Farbstoffe werden nicht zum Färben von Zellen verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfasst neue Verfahren zur Verfolgung von Zellen in vivo und zur Bestimmung der Lebensdauer der Zellen in vivo. Gemäss den vorliegenden erfundenen neuen Zellverfolgungsverfahren werden die Zellen zunächst mit einem Zyanfarbstoff markiert und dann in ein Versuchsobjekt injiziert, wobei der Zyanfarbstoff verwendet wird um die Zellen zu lokalisieren. In einer anderen Ausführungsform wird die Lebensdauer der Zellen durch Messen der Rate des Verschwindens markierter Zellen bestimmt.
In den vorliegenden erfundenen Verfahren zur in vivo- Verfolgung von Zellen und zur in vivo-Bestimmung der Lebensdauer der Zellen, werden die Zellen mit Zyanfarbstoffen gefärbt. Die Erfindung stellt Verbindungen mit Kationen der folgenden Struktur zur Verfügung, die hierin als Zyanfarbstoffe bezeichnet werden:
worin:
Y ein mit Sauerstoff, Schwefel, Methylen oder alkylsubstituiertes Methylen ist;
m 0 bis 3 bedeutet und
n 12 bis 22 bedeutet, zur Verwendung in diagnostischen Verfahren, die auf der in vivo-Zellverfolgung oder der in vivo-Bestimmung der Lebensdauer der Zellen basieren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich alkylsubstituiertes Methylen auf mono- oder disubstituiertes Methylen mit allen möglichen Kombinationen von Methyl-, Ethyl- oder Propylsubstituenten.
Verbindungen der oben gezeigten Struktur werden durch die folgende, allgemein verständliche Kurzformel dargestellt:
DiYCn(2m+1)
Sims, P.J. et al., Biochem., 13:3315 (1974). Daher wird zum Beispiel die Verbindung, in der Y ein Schwefel ist und in der drei Kohlenstoffatome die Ringe und zwei aliphatische Ketten mit 14 Kohlenstoffatomen miteinander verbinden, als DiSC&sub1;&sub4;(3) bezeichnet.
Auf gleiche Weise zeigt DiIC&sub1;&sub4;(5), dass die Verbindung, in der Y ein Isopropyl ist und in der fünf Kohlenstoffatome die Ringe und zwei aliphatischen Ketten mit 14 Kohlenstoffatomen verbinden.
Miteingeschlossen in die Verbindungen, die hier als Zyanfarbstoffe bezeichnet werden, sind Verbindungen der obengenannten Struktur, die eine oder mehr Substitutionen besitzen, vorausgesetzt, dass solche substituierten Verbindungen in Zellmarkierungsmedien mindestens solange löslich sind wie zum Markieren nötig ist und die einen ausreichend hohen Membrantrennungskoeffizienten besitzen, um mit den markierten Zellmembranen verbunden zu bleiben. Solche Verbindungen dürfen die Lebensfähigkeit der Zelle auch nicht wesentlich in den zum Markieren erforderlichen Konzentrationen beeinflussen. Löslichkeit in Zellmarkierungsmedien wird wie unten durch Verteilen eines Zyanfarbstoffes in dem markierenden Medium und durch standardsprektralfluorometrische Verfahren durch Messen der Fluoreszensintensität über einen Zeitraum hinweg bestimmt. Abnehmenede Fluoreszenzintensität zeigt eine Farbstofffällung und Adhäsion an Gefässwände. Ob die Farbstoffe mit den Zellmembranen verbunden bleiben, wird zum Beispiel durch Anwendung bekannter durchflusscytometrischer Verfahren zur Ueberwachung der Fluoreszenzintensität roter Blutzellen, die dem Versuchstier nach der Markierung injiziert wurden, bestimmt. Im wesentliche konstante Fluoreszenzintensität der markierten Zellen nach der Injektion bedeutet Stabilität des Farbstoffes in Zellmembranen.
Ebenfalls in die hier als Zyanfarbstoffe bezeichneten Verbindungen mit eingeschlossen sind Verbindungen der obengenannten Struktur, in die ein Atom inkorporiert wird, dass durch magnetische Resonanzdarstellung nachgewiesen werden kann. Solche Verbindungen werden unter Anwendung bekannter technischer Verfahren, zum Beispiel durch Einbau eines Fluoratoms in eine der Methylgruppen der aliphatischen Ketten hergestellt. Verbindungen der obengenannten Struktur, die mit einem Gammastrahler wie 125I versehen sind, werden hierin ebenfalls als Zyanfarbstoffe bezeichnet.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zyanfarbstoffe können von verschiedenen Quellen bezogen werden wie zum Beispiel Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon und von veschiedenen Ausgangsmaterialien unter Anwendung bekannter Verfahren hergestellt werden. Hamer, F.M., The Zyanine Dves and Related Compounds, Interscience Publisher (1964). Falls erwünscht, kann die Wellenlänge des Zyanfarbstoffes ausserhalb des für den Menschen sichtbaren Spektrums liegen.
Bei Anwendung der erfundenen Verfahren kann jede lebende Zelle mit Zyanfarbstoffen markiert werden. Wie hierin verwendet schliesst die Bezeichnung Zelle eukaryotische Zellen mit einem Zellkern, wie weisse Blutzellen, verschiedenen Tumorzellen, andere Säugerzellen (zum Beispiel in Kultur genommene Ovarzellen chinesischer Hamster), Hefe; und Zellen ohne Zellkern wie rote Blutzellen und Blutplättchen ein. Eine Zelle mit Zellkern ist lebensfähig, wenn sie in der Lage ist zu wachsen und im wesentlichen so funktioniert, wie es von Zellen dieser Art erwartet wird; eine Zell ohne Zellkern ist lebensfähig, wenn sie in der Lage ist, die von ihr erwarteten Funktionen durchzuführen, zum Beispiel ist eine lebende rote Zelle in der Lage Sauerstoff und Kohlendioxid zu transportieren; und lebensfähige Blutplättchen agieren im wesentlichen wie erwartet zum Beispiel bei Aggregations- und Freisetzungsassays.
Zellmarkierung wird in einem Medium durchgeführt, das für Zellen nicht letal ist und das reproduzierbare Zellmarkierung ermöglicht. Um den Medium notwendige Eigenschaften zu verleihen, werden osmolaritätsregulierende Agentien verwendet, in denen die Zyanfarbstoffe mindestens so lange stabile Lösungen bilden, wie es zum Markieren erforderlich ist. Geeignete Osmolarität regulierende Agentien schliessen. Agentien wie Zucker, zum Beispiel Monosaccharide wie Glukose, Fruktose, Sorbose, Xylose, Ribose, und Disaccharide wie Saccharose, Zuckeralkohole wie Mannitol, Glycerin, Inositol, Xylitol und Adonitol, Aminosäuren wie Glycin und Arginin und bestimmte Good-Puffer wie N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure ein. Good, N.E. et al., Biochem. 15, 467-477 (1966), Good, N.E. und S. Izawa, Methods Enzvmol. 24, Teil B, 53 (1968), Feguson, W.J. et al., Anal. Biochem. 104:301-310 (1980). Einige Zelllinien können jedoch gegenüber einem oder mehreren der die Osmolarität regulierenden Agentien empfindlich reagieren, insbesondere bei Zuckeralkoholen. Es werden daher vor dem Markieren Standardtest durchgeführt um sicherzustellen, dass die Zellen in dem beabsichtigten osmolaritätsregulierenden Agens lebensfähig sind. Zusätzlich können kleinere Mengen puffernder Agentien zu dem Markierumgsmedium gegeben werden, um die Wasserstoffionenkonzentration zu regulieren.
Die Wirkung der Aussetzung einer Reihe von osmolaritätsregulierenden Agentien auf die Lebensfähigkeit, wurde durch Messen der Verdopplungszeit von Yac-Zellen bestimmt, nachdem die Zellen während 30 Minuten einer Anzahl von osmolaritätsregulierenden Agentien ausgesetzt wurden. Yac-Zellen sind eine Mauslymphgewebszelllinie, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland erhalten werden kann und die in dem European Journal of Immuology 5:112-117 (1975) beschrieben ist. Wie die Tabelle 1 dargestellten Daten zeigen, resultierte im Vergleich zu phosphatgepufferter Salzlösung die Aussetzung von Saccharose, Glukose und den Good-Puffern TAPS, CAPS, EPPS, HEPPSO und DIPSO in vernachlässigbaren Wirkungen auf die Zellverdopplungszeit, wäs die Abwesenheit aussetzungsbedingter zellulärer Toxizität indiziert. Tabelle 1 Osmolaritätregulierende Agentien (Stunden) Verdopplungszeit phosphatgepufferte Salzlösung Saccharose Glukose 3-Amino-1-propansulfonsäure Natrium-3-(N-morpholino)propansulfonsäure (MOPS) 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol 2-Amino-2-methyl-1-propanol A - kein Wachstum oder teilweise cytoxisch B - akut cytotoxisch Tabelle 1 (Fortsetzung) Osmolaritätregulierende Agentien (Stunden) Verdopplungszeit N-Tris(hydroxymethyl)methylaminoethansulfonsäure (TES) N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminolthan-Sulfonsäure (BES) 3-(Cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propansulfonsäure (CAPSO) Triethanolamin Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIZMA) Bis-trispropan 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES) 3-[Dimethyl(hydroxymethyl)-methylamino]-2-hydroxypropansulfonsäure (AMPSO) N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycin (BICINE) 3-[(-3-Cholamidopropyl)dimethyl-ammonium]-1-propansulfonat (CHAPS) 3-[N-tris(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropansulfonsäure (TAPSO) A - kein Wachstum oder teilweise cytoxisch B - akut cytotoxisch Tabelle 1 (Fortsetzung) Osmolaritätregulierende Agentien (Stunden) Verdopplungszeit 3-(N-morpholino)-2-hydroxypropan-sulfonsäure (MOPSO) 2-[(2-Amino-2-oxoethyl)amino]ethan-sulfonsäure Bis(2-hydroxyethyl)imino-tris-(hydroxymethyl)methan (BIS-TRIS) 2-(N-Cycloheylamino)ethansulfonsäure (CHES) N-tris-(hydroxymethyl)methylglycin (TRICINE) Glukosamin Imidazol Glycylglycin A - kein Wachstum oder teilweise cytoxisch B - akut cytotoxisch
Tabelle II zeigt verschiedene osmolaritätsregulierende Reagentien, die auf Zyanfarbstofflöslichkeit untersucht wurden. Alle Konzentrationsmessungen wurden nach der Entsernung der Niederschläge durch Zentrifugation und Lösung kleiner Aliquots osmolaritätregulierender, Zyanfarbstoff enthaltender Agentien in Ethanol zur spektrofluorometrischen Analyse durchgeführt. Die verwendeten Farbstoffe waren DiSC&sub1;&sub4;(5) und DiOC&sub1;&sub4;(3) und die osmoloraritätsregulierenden Agentien lagen innerhalb iso-osmotischer Konzentrationen. Abnahmen der Fluoreszenzintensität des Ethanollösungsstandards korrelieren direkt mit der Abnahme der Zyanfarbstofflöslichkeit. Tabelle II Osmolaritätregulierendes Agens DiOC&sub1;&sub4;(3) DiSC&sub1;&sub4;(5) Relative Fluoreszenz-Intensität (Konz.) Ethanol Glukose Fruktose Sorbose Saccharose Xylose Ribose Lyxose Glycin Arginin Glycerin Inositol Xylitol Mannitol Adonitol Tris(hydroxymethyl)-methylaminopropansulfonsäure (TAPS) * Präzipitat in Alkohol, keine Daten erhältlich ** Artefakt aufgrund von grossen Kristallen, die sich nicht fällen liessen *** Präzipitat in Ethanol (Daten fraglich) ND nicht bestimmt Tabelle II (Fortsetzung) Osmolaritätregulierendes Agens DiOC&sub1;&sub4;(3) DiSC&sub1;&sub4;(5) Relative Fluoreszenz-Intensität (Konz.) 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure (CAPS) N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-3-propansulfonsäure (EPPS) N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-hydroxypropansulfonsäure (HEPPSO) 3-[N-N-bis(2-hydroxyethyl)amino)-2-hydroxypropansulfonsäure (DIPSO) NACL phosphatgepufferte Salzlösung Cholinchlorid Choliniodid * Präzipitat in Alkohol, keine Daten erhältlich ** Artefakt aufgrund von grossen Kristallen, die sich nicht fällen liessen *** Präzipitat in Ethanol (Daten fraglich) ND nicht bestimmt
Wie aus Tabelle II ersichtlich ist, sind Zyanfarbstoffe in der Gegenwart von klassischen Salzen weit weniger löslich als in Gegenwart von Zuckern, mit Ausnahme von Lyxose, Zukkeralkoholen, Aminosäuren und den Good-Puffern TAPS, HEPPSO, DIPSO, CAPS and EPPS. Ausserdem wurde die Stabilität von DiSC&sub1;&sub4;(5)-Lösungen in Zuckern wie Glukose, Fruktose, Ribose, Sorbose, Saccharose und Xylose, Zuckeralkoholen wie Glycerin, Inositol, Xylitol und Adonitol und Aininosäuren wie Glycin und Arginin bestimmt. Der Zyanfarbstoff war mindestens 20 Minuten in getesteten Lösungen stabil, was genügend lange fur ein reproduzierbares Markieren ist und in vielen der Agentien hatte die Menge an Zyanfarbstoff nach sechzig Minuten nicht wesentlich abgenommen.
Weiterhin wurde die Löslichkeit von Zyanfarbstoffen in einem Medium, das klassische Salze und Osmolaritätsregulatoren, in denen die Farbstoffe löslich sind, bewertet. Die Löslichkeit von DiSC&sub1;&sub4;(5) in einer iso-osmotischen Glukoselösung wurde nach Verdünnung mit destilliertem Wasser nicht wesentlich beeinflusst. DiSC&sub1;&sub4;(5)-Löslichkeit in isoosmotischer Glukoselösung wurde jedoch durch Verdünnung mit einer nur ungefähr 20%-igen iso-osmotischer Natriumchloridlösung wesentlich reduziert. Reproduzierbare Zellmarkierung mit Zyanfarbstoffen kann daher nur in Medien durchgeführt werden, die nicht mehr als kleine Mengen klassischer Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumacetat, Kaliumacetat, Natriumsulfat, Natriumiodid, Cholinchlorid oder Choliniodid enthalten und wird vorzugsweise in einem Medium durchgeführt, in dem keine klassischen Salze zur Regulierung der Osmolarität verwendet werden.
Zellen, die unter Anwendung der vorliegenden Erfindung mit Zyanfarbstoffen gefärbt wurden, wurden analysiert, um die Wirkung der Markierung auf die Lebensfähigkeit der Zelle zu untersuchen. V79-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland erhältlich sind und in Prescott, D.M., Ann. New York Acad. Sci., 397:101-109 (1982) beschrieben sind, wurden mit einer Lösung, die DiOC&sub1;&sub4;(3) in einer Konzentration von 10&supmin;&sup5; oder 4 x 10&supmin;&sup5; M markiert und die Wachstumskinetik der gefärbten Zellen wurden mit ungefärbten Zellen und einer Mischung aus gleichen Teilen gefärbter und ungefärbter Zellen verglichen. Die Zellverdopplungszeit wurde durch Färben mit Zyanfarbstoffen nicht beeinträchtigt. Die Markierung hatte daher keinen Einfluss auf das Zellwachstum. Auch verschiedene andere Standardtests zur Lebensfähigkeit der Zellen, wie Trypanblau- Ausschluss und Propidiumiodid-Ausschluss bestätigten, dass Zyanfarbstoffmarkierung gemäss den beschriebenen Verfahren keine Auswirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen hat.
Die Wirkung der Zyanfarbstoffmarkierung auf die Lebensfähigkeit der Zellen wurde auch durch Messen der Fragilität roter Zellen bestimmt. Markierte und unmarkierte rote Blutzellen wurden in Natriumchlorid-Medien unterschiedlicher osmotischer Stärken durch Variieren der Salzkonzentration bestimmt. Die Volumenverteilung der Zellen wurde mit einem Coulter Counter mit einem Kanalisierzusatz gemessen. Mittlere Volumen wurden bestimmt und für jede Salzkonzenztration aufgezeichnet und die Volumen erhöhten sich mit der Abnahme der Natriumchloridkonzentration bis ungefähr 0,5 Gramm/100 ml, bei der das Volumen einen steilen Abfall zeigt. An diesem Punkt lysierten die roten Zellen. Darüberhinaus waren die Volumenänderungen die gleichen, ob die Zellen mit Zyanfarbstoff gefärbt waren oder nicht. Auf gleiche Weise wurde die Hämolyse in parallelen Proben als Funktion der Natriumchloridkonzentration überwacht. Nachdem die roten Zellen für ungefähr 2 bis 3 Minuten in Natriumchlorid gegeben wurden, wurden die Lösungen zentrifugiert, um die die nicht lysierten Zellen zu fällen. Die Überstandslösungn wurden dann einer spektrophotometrischen Analyse unterzogen, um doe Hämoglobinkonzentrationen zu bestimmen. Die prozentuale Lyse wurde durch Vergleichen der Hämoglobinkonzentrationen jeder Probe mit einer vollständig lysierten Kontrolle bestimmt. Die Konzentration an freiem Hämoglobin war relativ niedrig, bis ungefähr 0,5 Gramm Natriumchlorid/100 ml erreicht wurde und das Hämoglobin dann sofort freigegeben wurde. Aus dem Vergleich mit den Ergebnissen der Fragilität der roten Zellen resultierte, dass die Volumenänderungen direkt mit der Freilassung des Hämoglobins korrelierten. Darüber hinaus war die Freisetzung des Hämoglobins die gleiche in markierten und unmarkierten Zellen.
Um die in vivo-Stabilität von mit Zyanblau gefärbten Zellen gemäss dem vorliegenden erfundenen Verfahren zu testen, wurden Hasen rote Zellen entnommen, mit DiSC&sub1;&sub4;(5) markiert und wieder zurückgegeben. Danach wurden periodisch Blutproben entnommen und prozentual auf markierte Zellen und Fluoreszenzintensität der markierten Zellen untersucht. Die Anzahl der zirkulierneden roten Zellen nahm linear als Funktion der Zeit ab und die festgestellten 52 Tage Lebenszeit der markierten Zellen korrelierten eng mit den berichteten durchschnittlichen 40 bis 60 Tagen Lebenserwartung der roten Hasenzellen. Zyanfarbstoffmarkierung beeinflusste daher die Clearance-Rate der roten Blutzellen nicht.
In allen, ausser einem der getesteten fünf Hasen blieb die Fluoreszenzintensität der gefärbten Zellen 60 Tage nach der Markierung und Reinjektion im wesentlichen unverändert. In dem fünften Tier wanderte nicht mehr als 20% des Zyanfarbstoffes von den markierten Zellen in den Kreislauf des Hasen. Diese Daten gemeinsam mit den Daten der Gewebekultur, die keinen Transfer des Farbstoffs von markierten zu unmarkierten Zellen zeigen, veranschaulichen, dass die Zellen mit dem Farbstoff stabil markiert sind.
Lebende, mit Zyanfarbstoffen markierte Zellen werden in der vorliegenden erfundenen in vivo-Zellverfolgung und der Analyse der in vivo-Lebendauer in Säugerversuchsobjekten, einschliesslich dem Menschen verwendet. Wie hierin verwendet, schliesst die zelluläre in vivo-Zellverfolgung die Bestimmung der Lokalisation der Zellen in dem Körper des Versuchsobjekts und das Messen der Rate mit der eine Zelle einen bestimmten Punkt passiert, zum Beispiel die Rate mit der eine Zelle durch ein Blutgefäss fliesst, ein.
Die Lebenszeit der übertragenen roten Blutzellen wird durch Einschliessen eines Aliquots mit Zyanfarbstoff markierten roten Blutzellen in die Transfusion bestimmt. Sofort nach der Transfusion wird mittels Standardtechniken eine Bestimmung der Fraktion der markierten roten Blutzellen in dem systemischen Kreislauf durchgeführt. Anschliessende Bestimmung der prozentual markierten Zellen wird verwendet, um die Lebenszeit der übertragenen Zelln zu berechnen. Weiterhin wird Posttransfusionsbluten von immunologischen Reaktionen durch Vergleichen der Veränderungen in der Fraktion der markierten Zellen und damit die Rate des Verschwindens der markierten Zellen von Änderungen des Hämatokrits unterschieden. Gleiche Reduktionsraten pneumatischer und prozentual markierter Zellen indiziert durch Bluten verursachten Blutverlust, wohingegen vergleichsweise höhere Reduktionsraten markierter Zellzählungen eine immunologische Reaktion der transfundierten Zellen indiziert. Um Autofluoreszenz und Selbst-Quenching durch Hämoglobin zu verhindern, werden rote Blutzellen vorzugsweise mit mit einem Zyanfarbstoff markiert, der innerhalb der roten Wellenlängen erregt und weiter zu rot hin emittiert als die Erregungswellenlänge des Hämoglobins. Beispiele socher Farbstoffe schliessen DiSC&sub1;&sub4;(5) und DiSC&sub1;&sub4;(3) ein.
Durch Anwendung von Techniken, die gleich den mit roten Blutzellen verwendeten sind, wird die in vivo-Lebendauer der Blutplättchen durch Markierung der Blutplättchen und Vergleich der Verschwindensrate der markierten Blutplättchen bestimmt, um Unterschiede zwischen durch Blutung oder abnehmende Blutplättchenproduktion und immunologische Reaktion verursachte Thrombocytopenie zu erhalten. Da Blutplättchen keine Moleküle besitzen, die Licht in den verwendeten Längenwellen absorbieren oder ausstrahlen wird jedoch eine grössere Anzahl von Zyanfarbstoffen zur Messung der Blutplättchen verwendet. Solche Messungen zur Lebenszeit der Blutplättchen werden unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren für rote Blutzellen angewendet, um Bluten nach der Transfusion von immunologischen Reaktionen zu unterscheiden und zum Diagnostizieren von Arteriosklerose oder anderen Erkrankungen, in denen sich die Lebenszeit der Blutplättchen des Patienten von denen gesunder Patienten unterscheidet. Ausserdem werden die beschriebenen Verfahren angewendet, um in vivo-Lebensdauerbestimmungen anderer Zellen, einschliesslich weisser Blutzellen durchzuführen.
In den in vivo-Zellverfolgungsanalysen werden die Zellen mit Zyanfarbstoffen markiert, die äusserlich nachweisbar sind. Solche äusserlich nachweisbaren Farbstoffe schliessen Zyanfarbstoffe wie mit 125I markiertes DiOC&sub1;&sub4;(3) ein. Zellverfolgung kann auch unter Verwendung von Zyanfarbstoffen durchgeführt werden, die eine kernmagnetische Resonanzmarkierung haben, die die Verwendung von kernmagnetischer Resonanzdarstellung ermöglicht, um markierte Zellen zu lokalisieren. Ausserdem wird die Floureszenz der Zyanfarbstoffe verwendet, um Zellen in Bereichen des Körpers zu verfolgen, die von ausserhalb des Körpers sichtbar sind. Am häufigsten wird die Fluoreszenz angewendet, um Zellen in der Macula, Retina und Blutgefässen des Auges zu verfolgen. In den folgenden Beispielen sind die Anwendungen der in vivo- Zellverfolgung beschrieben, die den Nachweis von primären Malignitäten und metastatischen malignen Zellen, Nachweis von Infektionsherden, Darstellung arterieller Konstriktionen, Auftreten von Arthritis und Bestimmung oder Überwachung von Transplantat- oder Organabstossung einschliessen. Zur Diagnose eines Infektionsherde sollten die markierten Zellen spezifisch mit einem infektiösen Organismus wie ein Bakterium oder Pilz interagieren und dabei den Infektionsherd bestimmen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung.

BEISPIEL 1

Verfahren zur Färbung von Gewebekulturzellen

I. Herstellung der Zellen

Um die besten Ergebnisse zu erhalten, werden Logphasen- Gewebekulturzellen verwendet. Suspensionskulturen werden den Kulturgefässen entnommen und in Polypropylenzentrifugenröhrchen gegeben.
Wenn Monolayerkuluren verwendet werden, müssen die Überstände entfernt und die haftenden Zellen mit calcium- und magnesiumfreier phosphatgepufferer Salzlösung gewaschen werden, um Serumproteine aus den Flaschen zu entfernen. Trypsin-EDTA-Lösung (Gibco Laboratories, Grand Island, New York, # 610-5300) wird zugegeben bis der Flaschenboden bedeckt ist und bei Raumtemperatur inkubiert bis sich der Zellmonolayer ablöst und zerfällt. Die resultierende Zellsuspension wird in ein Polypropylenzentrifugenröhrchen überführt und ein gleiches Volumen an 10% fetalem Rinderserum (FBS) (Hazelton) enthaltendes Kulturmedium wird zugegeben um die enzymatische Wirkung des Trypsins zu stoppen. Die Zellen werden 10 Minuten mit 400 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Überstände werden abgesaugt und ein gleiches Volumen iso-osmotisches Mannitol wird zum Resuspendieren des Zellpellets eingesetzt. Das Waschen mit Mannitol dient zur Entfernung der Plasmaproteine aus der Zell- Suspension und zur Vorbereitung der Zellen zum Färben. Die Zellen werden nochmals 10 Minuten mit 400 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Überstände werden abgesaugt und das resultierende Zellpellet wird in einer Mannitollösung in einer Konzentration von 2 x 10&sup6; Zellen/ml zum Färben resuspendiert. Einige Zelllinien sind jedoch gegenüber der Verwendung von Zuckeralkoholen (Mannitol) empfindlich; in solchen Fällen kann eine isoosmotische Glukoselösung (MW 180, 16; 54; 05 g/l verwendet werden.

II. Herstellung der Stammfarblösung

2 x 10&supmin;³ M Stammlösungen werden wie folgt in absolutem-Ethanol hergestellt.
DiO-C&sub1;&sub4;(3) MW 800 (1,600 mg/ml)
DiS-C&sub1;&sub4;(5) MW 814 (1,628 mg/ml)
DiO-C&sub1;&sub4;(3) MW 936 (1,872 mg/ml)
DiI-C&sub1;&sub4;(5) MW 650 (1,700 mg/ml)
Alle Farbstoffe werden von Molecular Probes, Eugene, Oregon erhalten.
Die Farbstoff-Stammlösungen werden ultraschallbehandelt um eine vollständige Lösung des Farbstoffs zu gewährleisten und die Haftung an das Röhrchen so gering wie möglich zu halten. Zur Herstellung der Stammlösung werden Polystyrolröhrchen verwendet, so dass die Lösung des Farbstoffs beobachtet werden kann. Zur Färbung der Zellen werden jedoch Polypropylenröhrchen verwendet, da Zyanfarbstoffe in einer wässrigen Umgebung im Vergleich weit weniger an Polypropylen als an Polystyrol haften.

III. Zellfärbung

Die Zellen werden in iso-osmotischem Mannitol auf eine Konzentration von 2 x 10&sup6; Zellen/ml gebracht. Um die Zellen zu färben, werden 5 ul Farbstoff einer 2 x 10&supmin;³ M Stammfarblösung pro 1 ml Zellsuspension zugegeben. Die zu färbende Probe wird pipettiert oder auf einem Vortexgerät gerüttelt, um die Probe gründlich zu mischen. Die Zellen werden 10 Minuten mit dem Fqarbstoff inkubiert, wonach ein kleines Aliqot zur Untersuchung unter einem Fluoreszenzmikroskop entnommen wird, um sicherzugehen, dass eine intensive undgleichmässige Färbung eingetreten ist. Die DiO-Farbserie verwendet Mikroskopfilter, die selektiv für Licht mit 488 nm Wellenlänge sind, während die DiS- und DiI-Farbserien zur Beobachtung der Floureszenz Wellenlängen nahe 575 nm benötigen.
Nach der Inkubationszeit wird ein gleiches Volumen PBS zu der Farb-Zell-Suspension gegeben. Die Zellen werden 10 Minuten mit 400 x g bei 20ºC zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und das Pellet in PBS resuspendiert. Die Zentrifugationsprozedur wird wiederholt und der resultierende Überstand wird auf die Anwesenheit von Farbe untersucht. Falls in dem Überstand noch Farbe erscheint, wird das Waschen wiederholt, bis die Überstände frei von Farbe sind was durch Spectrofluorometrie gemessen wird. Nach dem letzten Waschen wird der Überstand entfernt und das Pellet bis zur gewünschten Konzentration in einem geeigneten Kulturmedium resuspendiert. Alle Verfahren werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

BEISPIEL 2

Färben roter Blutzellen

I. Herstellung der Reagentien

A. Citratantikoagulans

1,66 g NaCitrat
0,206 g Zitronensäure
0,140 g NaH&sub2;PO&sub4;
1,61 g Glukose
Die aufgeführten Komponenten wrden in 63 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung auf einen pH von 5,6 gebracht. Die endgültige Lösung wird zur Sterilisation durch einen 0,22 Micronfilter gegeben.

B. Iso-osmotische Glukoselösung

Glukose (54,05 g) wird in einem Liter destilliertem Wasser gelöst. Die Osmolarität wird unter Verwendung eines Fiske- Osmometers geprüft und, wenn nötig, auf 320 mOsm eingestellt.

II. Herstellung der Stammfarblösung

Eine Stammlösung von 2 x 10&supmin;³ M DiIC&sub1;&sub4;(5) wird durch Lösen von 1,628 mg/ml Farbstoff in absolutem Ethanol hergestellt. Um den Farbstoff vollständig zu lösen, kann eine Ultraschallbehandlung notwendig sein.

III. Färbeverfahren

Gesamtblut wird aseptisch unter Verwendung von Natriumcitrat enthaltenden Vacutainern oder einer ein Antikoagulans enthaltenden Spritze gesammelt, wobei das Antikoagulans einem Zehntel des Spritzenvolumens entspricht. Ein kleines Aliquot wird für Flusscytometrie oder einen Funktionalitätstest zurückbehalten. Das Blut wird 10 Minuten mit 100 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die roten Zellen zu pelletieren. Das die Blutplättchen enthaltende Plasma wird entfernt und aufbewahrt und die roten Zellen durch Zugabe einer Menge von iso-osmotischer Glukose gewaschen, die dem fünffachen Volumen des gepackten roten Zellpellets entspricht. Die Zellen sollten nochmals 10 Minuten mit 100 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand abgesaugt werden. Dieses Waschen, das die Plasmaproteine entfernt und ein intensives und gleichmässiges Färben erlaubt, wird noch einmal wiederholt. Nach der letzten Zentrifugation und Absaugen des Überstands werden die roten Zellen in iso-osmotischer Glukose in einer Konzentration von 4 x 10&sup8; Zellen/ml resuspendiert.
Vor der Zugabe des Farbstoffs wird die Probe pipettiert oder auf einem Vortexgerät aufgeschüttelt, um sicherzugehen, dass keine Sedimentation aufgetreten ist. Fünfzehn Mikroliter der Stammlösung DiSC&sub1;&sub4;(5) (2 mM in EtOH) wird zu jedem Milliliter der Suspension aus roten Zellen zugegeben. Die Probe wird sofort gemischt, um eine schnelle und gleichmässige Verteilung des Farbstoffs in der Lösung zu gewährleisten. Nach ungefähr fünf Minuten wird ein kleines Aliquot zur mikroskopischen Untersuchung entnommen. Auf ein Glasmikroskopplättchen wird mit einem Wachsstift ein Ring gezeichnet und eine kleine Probe der Zellen in Färbelösung wird in den Wachsring gegeben. Ein Deckplättchen wird auf das Glasplättchen gelegt und die Probe betrachtet. Die Verwendug des Wachsrings verringert die Discocyten- Echinocyten-Transformation, die durch das Glasplättchen und Deckplättchen verursacht wird. Die Verwendung von Plättchen und Deckplättchen aus Plastik verhindert ebenfalls diese Transformation. Auf diese Weise kann gewährleistet werden, dass die Struktur der roten Zellen während des gesamten Färbeverfahrens erhalten bleibt, während man sichergeht, dass eine intensive und gleichmässige Färbung aufgetreten ist. Die Zellen sollten nach fünf Minuten gleichmässig gefärbt sein und Färbezeiten länger als 10 Minuten sollten nicht notwendig sein.
Nachdem festgestellt wurde, dass die Zellen gleichmässig gefärbt sind, wird ein gleiches Volumen phosphatgepufferter Salzlösung zu der Färbesuspension gegeben. Die Zellen werden 10 Minuten mit 400 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand entfernt. Gewöhnlich werden nach der Zentrifugation noch Spuren von freiem Farbstoff in den Überständen sichtbar sein und das Waschverfahren unter Verwendung von calcium- und magnesiumenthaltender phosphatgepufferter muss wiederholt werden, bis die Überstände keinen freien Farbstoff mehr enthalten, wie durch Spectrofluorometrie gemessen wird.
An diesem Punkt können die Zellen entweder in einer für Versuche geeigneten Lösung oder in Blutplättchen armen Plasma zur Reinjektion in ein Empfängertier suspendiert werden. Zur Reinjektion ist das allgemeine Verfahren die gefärbten Zellen in dem Plasmavolumen zu resuspendieren, das von der ersten Zentrifugation des entnommenen Gesamtbluts gewonnen worden ist und das mit 4000 x g zentrifugiert wurde, um die Blutplättchen zu entfernen. Alle Verfahren werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt:

BEISPIEL III

Färben der Blutplättchen

I. Präparation der Zellen

Gesamtblut wird in Natriumcitrat enthaltenden Vacutainern gesammelt oder in Spritzen, die ein vorbereitetes Natriumcitratantikoagulans in einer einem Zehntel des Gesamtspritzenvolumens entsprechenden Menge enthalten. Die Zellen werden 10 Minuten mit 100 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert um blutplättchenreiches Plasma zu erhalten. Plastikpipetten und Polypropylenzentrifugenröhrchen werden werden für alle Verfahren verwendet, die Plättchen einschliessen, um eine Aktivierung zu verhinden.
Das blutplättchenreiche Plasma wird abgesaugt und in ein anderes Zentrifugenröhrchen gebracht. Die Blutplättchen werden dann durch das Plasma durch 10 minütiges Zentrifugieren mit 1000 x g bei 20ºC pelletiert. Das Plasma wird gesammelt und entweder für funktionelles Testen aufbewahrt oder zur Verwendung als Suspensionsmedium zur Reinjektion. Dieses Plasma sollte 10 Minuten mit 4000 x g zentrifugiert werden, um sicherzugehen, dass alle restlichen Blutplättchen vor der Verwendung als Resuspensionsmedium entfernt werden und wird dann als Blutplättchenarmes Plasma (PPP) bezeichnet.
Das aus der Zentrifugation mit 1000 x g erhaltene Blutplättchenpellet sollte vorsichtig in einem kleinen Volumen Citratantikoagulans resuspendiert werden, um eine konzentrierte gleichmässige Suspension zu erhalten. Nachdem dies erreicht worden ist, kann iso-osmotische Glukose als Verdünnunglösung in einer Menge zugegeben werden, die derjenigen des ursprünglich vorhandenen Plasmas entspricht. Die Blutplättchen werden dann 5 Minuten mit 300 x g zentrifugiert und die Überstände abgesaugt. Dieses Waschen mit Glukose entfernt restliche Plasmaproteine und erlaubt gleichmässiges und intensiveres Färben. Das Blutplättchenpellet wird in der Glukoselösung resuspendiert und ist nun zum Färben bereit.
Die Konzentration der Blutplättchen wird auf 4 x 10&sup8; Zellen/ml eingestellt und 15 ul der DiOC&sub1;&sub4;(3) (2 mM in absolutem ETOH) wird pro ml Blutplättchenlösung zugegeben. Die Suspension wird sofort, jedoch vorsichtig und gründlich gemischt, um eine gleichmässige Verteilung des Farbstoffs zu gewahrleisten. Die Blutplättchen werden mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, um sicherzugehen, dass eine gleichmässige Färbung eingetreten ist, und falls dies so ist, sind sie nun zur Trennung von dem freien Farbstoff in der Suspension bereit.

II: Verwendung einer Sephadex G-100-Säule zur Trennung der mar kierten Blutplättchen

Sepharose 2B ist traditionell zum Isolieren von Blutplättchen aus blutplättchenreichem Plasma verwendet worden. Wir haben festgestellt, dass Sephadex G-100 sich ebenfalls sehr gut zur Isolierung von Blutplättchen eignet. Diese Technik wird mit der Färbetechnologie verwendet und funktioniert auffolgende Weise. Eine Blutplättchen-Farb-Suspension wird auf die Säule geladen. Die kleinen, niedermolekularen Farbmoleküle werden in den Partikeln festgehalten, während die grossen Blutplättchen direkt durch die Säule hindurchgehen. Auf diese Weise kann Sephadex G-100 verwendet werden, um mit Fluoreszenz markierte Blutplättchen von der freien Farbe in der Suspension zu trennen.

A. Herstellung der Säule

Sephadex G-100 (Pharmacia Laboratories, Piscataway, New Jersey) wird entsprechend den Anweisungen des Herstellers befeuchtet und in Aceton (100%) gewaschen, um es als Trennungsmedium für Blutplättchen zu verwenden. Dieses Waschverfahren wird durch 10 minütiges Zentrifugieren des Sephadex mit 300 x g bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei der Überstand entfernt wird und das Sephadex in Hanks Balanced Salt Solution resuspendiert wird. Das Sephadex sollte wiederholt in Hanks Balanced Salt Solution gewaschen werden, bis der Acetongeruch nicht mehr vorhanden ist. Die resultierende Lösung wird durch Einstellen in ein kochendes Wasserbad oder durch Vakuum entgast.
Der Sephadex-Schlamm wird dann zum Giessen der Säule verwendet. Eine 10 CC-Spritze ohne Stempel wird als Säulenstütze verwendet. Silikonschläuche werden mit der Nabe der Spritze verbunden und eine kleine einstellbare Schlauchklammer wird verwendet, um den Flüssigkeitsfluss durch die Säule zu regulieren. Ein siebenundvierzig Micron weites Nylonnetz wird als Verschluss des Spritzenbodens verwendet, um das Austreten der Sephadex-Kügelchen zu verhindern. Konventionelle Glassäulen mit Glasfilterstützen sollten vermieden werden, da diese die Blutplättchen aktivieren könnten. Die Säule wid mit Hanks gefüllt und kleine Mengen des Sephadex-Schlamms werden in die Säule gegeben. Die Klammer wird weit genug geöffnet, um einen langsamen, aber konstanten Fluss zu gewährleisten. Dieses Verfahren packt das Sephadex gleichmässig und verhindert die Bildung von Kanälen oder luftgefüllten Blasen. Das Verfahren HBSS- und Sephadex-Schlamm-Zugabe wird wiederholt, bis die gewünschte gepackte Säulengrösse erreicht ist. Die Säule sollte vor dem Gebrauch vollständig mit HBSS (2 Leervolumen) gespült werden.

B. Trennung der Blutplättchen

Der Blutplättchenfarbstoff und -suspension wird sorgfältig auf das Sephadex geschichtet. Die Klammer am Boden der Säule sollte geöffnet sein und das Flüssigkeitsniveau in der Säule sollte fallen können, bis es die Oberfläche des Sephadex erreicht. Der Fluss wird fortgesetzt, um der Suspension das Eindringen in das Sephadex zu erlauben. Der Fluss wird wieder angehalten, wenn das Niveau die Sephadexoberfläche erreicht hat. Ausreichend HBSS wird sorgfältig auf die Säulenoberfläche gegeben, um eine Pufferzone zu bilden, so dass zusätzliches HBSS einfach zugegeben werden kann, ohne das Sephadex zu stören. Der Säulenfluss wird wiederum fortgesetzt. Dieses Verfahren erlaubt der Blutplättchensuspension eine enge Bande zu in dem Gel zu bilden und in einer nahezu gleichmässigen Rate durch die Länge der Säule zu wandern. Auf diese Weise wird ein konzentrierteres Säuleneluat erhalten. Der Säulendurchfluss wird fortgesetzt und 0,5 bis 1 ml grosse Fraktionen werden gesammelt. Die die Blutplättchen enthaltenden Fraktionen sind aufgrund ihrer Undurchsichtigkeit erkennbar und können vereint werden. Die vereinten Fraktionen werden 10 Minuten mit 300 x g zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und das Pellet kann in einem für Versuche oder Analyse geeigneten Medium resuspendiert werden, oder der Plättcheüberstand wird zu Funktionsbestimmungen oder Reinjektionen verwendet.

BEISPIEL 4

Unterscheidung der post-Transfusionsblutung von immunologiscehn Reaktionen

Eine kleine Zahl roter Blutzellen von jeder der zu transfundierenden Bluteinheit wird vor der Infusion mit einer fluoreszierenden Form des Markierungsmoleküls markiert. Sofort nach der Operation und Bluttransfusion wird ein kleines Aliquot venöses Blut entnommen und die Prozentzahl der markierten Zellen (Fluoreszenz in Prozent) wird durch Standardflusscytometrie- oder Spektrofluorometrieverfahren ermittelt. In periodischen Intervallen nach der ersten venösen Entnahme werden zusätzliche Aliquots an Blut entnommen und auf gleiche Weise analysiert. Falls internes Bluten erfolgt, verändert sich das Verhältnis gefärbter zu ungefärbten Zellen nicht, obwohl der Ffämatokrit sinkt. Wenn der Patient eine post-Transfusionsreaktion durchläuft, werden die gefärbten Zellen (welche die übertragenen Zellen sind) vorzugsweise zerstört und das Verhältnis gefärbter zu ungefärbten Zellen sinkt. Diese Messung emöglicht eine Unterscheidung zwischen Bluten und post-Transfusionsimmunreaktionen.

BEISPIEL 5

Diagnose idiopathischer Thrombocytopenie

Die Verfahrensweise ist die gleiche wie in Beispiel 4 beschrieben mit Ausnahme, dass die Lebenszeit und Produktion der Blutplättchen bestimmt wird. Es werden daher vor der Transfusion die eigenen Blutplättchen des Patienten markiert (siehe Beispiel 3).
Sofort nach der Infusion der Blutplättchen wird eine kleine Menge venöses Blut entnommen und eine Bestimmung der Anzahl der markierten Blutplättchen pro ml (Fluoreszenz in Prozent) mittels Standardflusscytometrie- oder Spektrofluorometrieverfahren durchgeführt. In periodischen Intervallen nach der ersten venösen Entnahme werden zusätzliche Aliquots an Blut entfernt und auf den Prozentsatz positiver Fluoreszenz analysiert. Das Aufzeichen des Prozentsatzes gefärbter und ungefärbter Blutplättchen als Funktion der Zeit gibt dem Kliniker ein Mass der Zersörungsrate der markierten Blutplättchen und ein Mass der Produktion der ungefärbten Blutplättchen. Die Produktions- oder Zerstörungsrate ist ein dynamisches Mass des Thrombocytopenieprozesses. Auf diese Weise bestimmt der Kliniker ob das idiopathische thrombocytopenieähnliche Syndrom auf dem Niveau der Blutplättchenproduktion oder der Blutplättchenlebenszeit ist.
Transfundierte Blutplättchen können ebenfalls mit diesen Farbstoffen markiert werden. Darüberhinaus werden Lebenszeitmessungen von Spenderblutplättchen auf die gleiche Weise wie für die autologen Blutplättchen beschrieben durchgeführt.

BEISPIEL 6

Diagnose von Arteriosclerose

Die Diagnose von Arteriosklerose unter Verwendung dieses Verfahrens basiert auf der Hypothese, dass die Lebenszeit arteriosklerotischer Blutplättchen kürzer als die Lebenszeit normaler Blutplättchen ist. Eine kleine Zahl der Blutplättchen des Patienten wird mit der Fluoreszenz-, NMR- oder radioaktiven Markierungsform des Zellmarkierungsfabstoffs markiert.
Blutplättchen, die mit der Fluoreszenzform (gemäss des Protokolls in Beispiel 3) des Moleküls markiert sind, werden reinjiziert und die Lebenszeit der Blutplättchen wird serielle Venenpunktur und Bestimmung der restlichen Anzahl markierter Blutplättchen als eine Funktion der Zeit bestimmt (siehe Beispiel 5). Messung der Lebenszeit der Blutplättchen indiziert reduzierte Lebenszeit und diagnostiziert Arteriosklerose.
Eine andere diagnostische Annäherung verwendet ein Radioisotop des Moleküls (Gamma-Strahler) und markiert die Patientenblutplättchen in vitro (das Verfahren von Beispiel 3 anwendend). Markierte Blutplättchen werden reinfundiert und entweder wird die Lebenszeit der Blutplättchen unter Verwendung von Standardverfahren zur Zählung von Isotopen gemessen oder der Patient wird mit einer Standard-Gamma- Kamera dargestellt, um zu bestimmen, ob die markierten Blutplättchen an den Gefässwänden haften.

BEISPIEL 7

Nachweis primärer Tumoren oder Metastasen

Zwei verschiedene zelluläre Verfahrensweisen werden in Kombination mit einem Gamma-Strahler oder einer NMR- empfindlichen Form des Moleküls angewendet. Bei beiden Verfahrensweisen werden tumorzellsuchende Zellen verwendet. Eine Verfahrensweise verwendet aktivierte oder nichtaktivierte Lymphocyten und die andere Verfahrensweise verwendet Monocyten-, Neutrophile- oder Blutplättchenverfolgung.
Lymphocyten oder NK-Zellen werden in vitro durch bekannte Verfahren unter Verwendung von Interleukin-2 oder einem äquivalenten Molekül aktiviert. Diese Zellen werden dann mit der radioaktiven oder NMR-Form des Moleküls mittels den Verfahren von Beispiel 1 markiert und dem Patienten reinjiziert. Der Patient wird dann unter ein geeignetes Darstellungsgerät plaziert und die Lymphocytenwanderung überwacht, um Tumoren unbekannten Ursprungs zu lokalisieren.
Eine ähnliche Verfahrensweise verwendet Monocyten anstelle von Lymphocyten von dem zu testenden Patienten. Bei dieser Annäherung werden Monocyten mit menschlichen oder monoklonolalen Antikörpern von Mäusen markiert, die tumortypspezifisch sind, so dass eine Tumorzellerkennung gewahrt wird. Foris, G. et al., Cell Immuno. 78:276-284 (1983). Diese Zellen werden dann mit dem Radioisotop oder der NMR- Darstellungsform des markierten Moleküls markiert und dem Patienten reinjiziert. Sequenzdarstellung zeigt die Lokalisation der angezielten Monocyten.
Bei einer anderen Verfahrensweise zur Lokalisation primärer Tumoren oder Metastasen werden Monocyten, Neutrophile oder Blutplättchen wie in Beispiel 3 beschrieben markiert und zum Auffinden von Tumoren und Metastasen verwendet. Da diese Zellen früh an der Tumorstelle erscheinen, ermöglicht das Darstellen der Zellen die Lokalisation der Tumore.

BEISPIEL 8

Nachweis eines Infektionsherdes

Bei dieser Anwendung werden Neutrophile verfolgt. Neutrophile werden den zu testenden Patienten entnommen und mit dem Radioisotop oder der NMR-Darstellungsform des markierenden Moleküls (die Verfahren von Beispielen 1 und 2 werden zum Markieren verwendet) markiert. Diese Zellen werden dann zurückgegeben und die Darstellung der Neutrophilenwanderung mittels einer Gamma-Kamera oder nuklearmagnetischen Darstellungstechniken identifizieren den Herd der Infektion. Sequentielle Darstellungen werden zur Identifizierung dynamischer Veränderungen des Neutrophilenpools und zur Überwachung der Veränderungen, die aus therapeutischen Eingriffen resultieren, angewendet.

BEISPIEL 9

Überwachung diabetischer Retinopathie durch Überwachung der Maculadegeneration

Eine kleine Zahl roter Blutzellen (Typ 0 oder autologe Zellen) wird mit einer Form des Markermoleküls markiert (siehe Beispiel 2 bezüglich des Verfahrens), das durch eine Wellenlänge angeregt wird, die ausserhalb des für den Menschen sichtbaren Bereichs liegt (grösser als 700 nm). Die Zellen werden dem Patienten intravenös injiziert. Mit Standardfluoreszenzkameras für die Retina werden Fotoserien von Gefässen der Retina gemacht. Die Zellen, die Fluoreszenzspuren tragen, werden mit der entsprechenden Wellenlänge angeregt und die ausgestrahlte Fluoreszenz wird auf dem Film festgehalten. Da der Farbstoff in den roten Zellen gefangen ist und die rorten Zellen innerhalb der Gefässe bleiben, stammen die Fluoreszenzbilder ausschliesslich von den Retinagefässen.
In einer anderen Ausführung wird die Blutflussrate mittels eines Standardgeräts zur Anregung durch Doppelstrahllaser gemessen, das die gleiche Zelle an zwei Punkten innerhalb dieses Gefässes anregt. Der Abstand zwischen Punkten der Anregung ist jedoch festgelegt. Die Fluoreszenz wird bei jedem Anregungspunkt gemessen und die Zeitdauer, die zwischen den beiden Anregungspunkten erforderlich ist, ist ein Mass der Flussrate der Zellen im Gefäss.
Blutgefässintegrität und Blutflussraten werden angewendet, um Maculadegeneration zu messen. Solch ein Monitor wird verwendet, um den Grad der Sehbehinderung und den Behandlungserfolg von Diabetespatienten zu messen.

BEISPIEL 10

Nachweis eines bevorstehenden Schlaganfalls unmittelbar nach einem vorangegangenen Schlaganfall

Blutplättchen des zu untersuchenden Patienten (siehe Beispiel 3 für das Verfahren) werden mit einer Form des Markermoleküls markiert, das mit Licht einer Wellenlänge angeregt wird, die ausserhalb des für den Menschen sichtbaren Bereichs liegt (grösser als 700 nm). Die markierten Zellen werden dann dem Patienten intravenös injiziert. Eine Standardlichtquelle mit fokusiertem Licht (der Anregungswellenlänge) wird auf ein einzelnes Gefäss in dem Retinabett gerichtet. Fluoreszenz wird mittels geeigneter fokusierender Optik und einem Lichtverstärker gemessen. Der Output des Lichtverstärkers wird digitalsiert und mit einem Computer festgehalten. Die Fluoreszenzintensität ist ein Mass für einzelne, doppelte, Triplett, usw. Blutplättchen, die in den Venen festgestellt werden. Erhöhte Aggregation der Blutplättchen indiziert ein hohes Risiko für einen zweiten Schlaganfall

BEISPIEL 11

Darstellung arterieller Konstriktion

Eine Radioisotopform des Moleküls (Gamma-Strahler) wird verwendet, um die eigenen Blutplättchen des Patienten in vitro (das Verfahren von Beispiel 3 verwendend) oder rote Blutzellen (das Verfahren von Beispiel 3 verwendend) zu markieren. Markierte Zellen werden gegeben und der Patient wird mittels einer Standard-Gamma-Kamera dargestellt, um festzustellen ob das Lumen der Blutgefässe verengt ist. Die Markierung der roten Zellen kann mit autologem oder Typ 0- Blut von irgendeinem Spender durchgeführt werden.

BEISPIEL 12

Diagnose und Einstufung von Arthritis

Radioisotope oder NMR-Darstellungsformen des Moleküls werden verwendet, um Lymphocyten, Monocyte oder Neutrophile des zu testenden Patienten zu markieren (Verfahren von Beispiel 1 oder 2). Diese markierten Zellen werden dem Patienten wieder gegeben und Pooling wird mittels Standarddarstellungsausrüstung beobachtet. Verfolgung der Monocyten ist bei Arthritis nützlicher und bei degenerativen Gelenkskrankheiten ist die Lymphocytenverfolgung erfolgreicher. Diese erlaubt die Bestimmung der Anzahl der befallenen Gelenke und die Bewertung der Therapiewirkungen auf den Zustand des Patienten.

BEISPIEL 3

Schnelle Bestimmmung der Transplantatabstossung

Lymphocyten, Neutrophile oder Blutplättchen können jeweils eine wichtige Rolle bei der Transplantat- oder Organabstossung spielen. Patientenzellen werden entnommen und mit dem radioaktiven Isotop oder der NMR-Darstellungsform des Moleküls markiert (die Verfahren von Beispiele 1-3 verwendend). Markierte Zellen werden reinjiziert und sequentielle Darstellung des Patienten durchgeführt. Zu oder vor der Zeit der bevorstehenden Abstossung gibt es eine Ansammlung der injizierten Zelltypen in dem Transplantat, was durch dieses Verfahren nachgewiesen wird.

BEISPIEL 14

Diagnose von multipler Sklerose

Das Verfahren dieser Anwendung entspricht demjenigen von Beispiel 13, ausser dass der Aufenthaltsort der Zellen in dem Bereich des Rückenmarks oder anderen Bereichen mit hohem Myelingehalt bestimmt wird.

BEISPIEL 15

Messen der Zelllebenszeitspanne roter Blutzellen und Blutvolumen

Die Lebensspanne roter Blutzellen wird auf gleiche Weise wie oben für die Unterscheidung des Blutens von post- Transfusionsreaktionen (Beispiel 4) durchgeführt. Der einzige Unterschied ist, dass die eigenen Zellen des Patienten markiert und dann injiziert werden. Die Anzahl der markierten roten Blutzellen pro Milliliter wird als Funktion der Zeit nach der Injektion bestimmt (flusscytometrische oder spectrofluorometrische Verfahren verwendend), um die Lebensspanne dieser Zellen zu bestimmen.
Rote Zellmassen und Blutvolumen werden durch Färben einer bekannten Zahl roter Blutzellen (Autologe oder Typ 0) mit der Fluoreszenzform des Farbstoffs markiert. Eine bekannte Zahl gefärbter roter Zellen (10&sup9;) wird dem Individuum injiziert und beim Zeitpunkt 0 sowie 5 Minuten später wird ein Aliguot des Blutes entfernt. Die markierte Zellfraktion wird durch Flusscytometrie Oder Spectrofluorometrie bestimmt. Von diesem Verdünnungsfaktor und dem Wissen der Gesamtzahl der Zellen pro ml³, werden die roten Blutzellmassen und das Blutvolumen bestimmt.

Claims

1. Zyanfarbstoffe mit einem Kation der Struktur (I):

in der

Y Sauerstoff, Schwefel, Methylen oder alkylsubstituiertes Methylen darstellt;

m 0 bis 3 bedeutet und

n 12-22 bedeutet

zur Diagnose primärer Tumorzellen bzw. Metastasentumorzellen oder zur Diagnose eines Infektionsherds oder zur Diagnose von Retinopathie oder Blutgefäßdegeneration oder zur Diagnose von Arterienverengung oder zur Stadienbestimmung bei Arthritis oder zur Überwachung einer Transplantat- oder Organabstoßung mittels in vivo- Verfolgung von Zellen.

2. Zyanfarbstoffe nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Zyanfarbstoff um DiSC&sub1;&sub4;(5) oder DiOC&sub1;&sub4;(3) handelt.

3. Zyanfarbstoffe nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Zyanfarbstoff mit einem Gammastrahler markiert ist.

4. Zyanfarbstoffe nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Zyanfarbstoff mit einer Sonde für kernmagnetische Resonanz markiert ist.

5. Zyanfarbstoffe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungswellenlänge des Zyanfarbstoffs außerhalb des für den Menschen sichtbaren Spektrums liegt.

6. Verwendung von Zyanfarbstoffen mit einem Kation der Formel

in dem Y Sauerstoff, Schwefel, Methvlen oder alkylsubstituiertes Methylen darstellt, m 0-3 bedeutet und n 12-22 bedeutet, zur in vivo-Verfolgung von Zellen.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Zyanfarbstoff, mit dem die Zellen markiert sind, mit einem Gammastrahler oder mit einer Sonde für kernmagnetische Resonanz markiert ist.

8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei es sich bei den markierten Zellen um Lymphozyten, natürliche Killerzellen, Monozyten, Neutrophile, rote Blutkörperchen oder Thrombozyten handelt.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den markierten Zellen um Lymphozyten, natürliche Killerzellen, Monozyten, Neutrophile oder Throznbozyten handelt und daß die Zellen zwecks Diagnose von primären Tumorzellen bzw. Metastasentumorzellen verfolgt werden.

10. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den markierten Zellen um Neutrophile handelt und daß die Zellen zwecks Diagnose eines Infektionsherds verfolgt werden, wobei die markierten Zellen spezifisch mit einem infektiösen Organismus reagieren und so den Infektionsherd kennzeichnen.

11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Organismus um ein Bakterium oder einen Pilz handelt.

12. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der Zyanfarbstoff, mit dem die Zellen markiert werden, mit einem Gammastrahler markiert ist.

13. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den markierten Zellen um rote Blutkörperchen handelt und daß die Zellen zwecks Diagnose von Retinopathie oder von Blutgefäßdegeneration verfolgt werden.

14. Verwendung nach Anspruch 8, wobei es sich bei den markierten Zellen um mit einem Gammastrahler markierte Monozyten, Neutrophile, Lymphozyten oder Thrombozyten handelt.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die markierten Zellen zum Nachweis von Arterienverengung mittels Imaging-Verfahren verfolgt werden.

16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die markierten Zellen zur Stadienbestimmung bei Arthritis oder zur Überwachung einer Transplantat- oder Organabstoßung verfolgt werden.

17. Zyanfarbstoffe mit einem Kation der Struktur (I):

in der Y Sauerstoff, Schwefel, Methylen oder alkylsubstituiertes Methylen darstellt; m 0-3 bedeutet und n 12-22 bedeutet, zur Verwendung bei einem Diagnoseverfahren, ausgewählt aus Verfahren zum Unterscheiden zwischen einer Blutung und einer Immunreaktion gegen rote Blutkörperchen, Verfahren zum Unterscheiden zwischen einer Blutung oder einer verringerten Thrombozytenproduktion und einer immunologischen Reaktion gegen Thrombozyten, Verfahren zur Stadienbestimmung bei Arthritis und Verfahren zur Bestimmung des Atherosklerosegrads durch Bestimmung der Lebensdauer von Zellen in vivo.

18. Zyanfarbstoffe nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungswellenlänge des Zyanfarbstoffs außerhalb des für den Menschen wahrnehmbaren Spektrums liegt.

19. Verbindung von Zyanfarbstoffen mit einem Kation der Formel:

in der Y Sauerstoff, Schwefel, Methylen oder alkylsubstituiertes Methylen darstellt, m 0-3 bedeutet und n 12-22 bedeutet zur Bestimmung der Lebensdauer der Zellen in vivo.

20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei es sich bei den markierten Zellen um rote Blutkörperchen oder Thrombozyten handelt.

21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den markierten Zellen um rote Blutkörperchen handelt und daß die Lebensdauer der Zellen in vivo dadurch bestimmt wird, daß man die Geschwindigkeit, mit der die markierten Zellen verschwinden, mit hämatokritischen Veränderungen vergleicht und so zwischen einer Blutung und einer Immunreaktion gegen die roten Blutkörperchen unterscheiden kann.

22. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den markierten Zellen um Thrombozyten handelt und daß man die Lebenszeit der Zellen in vivo dadurch bestimmt, daß man die Geschwindigkeit, mit der die markierten Thrombozyten verschwinden, mit der Gesamtthrombozytenzahl vergleicht und so zwischen einer Blutung oder verminderten Thrombozytenproduktion und einer Immunreaktion gegen die Thrombozyten unterscheiden kann.

23. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den markierten Zellen um Thrombozyten handelt und daß man die Lebensdauer der markierten Thrombozyten als Maß für den Atherosklerosegrad bestimmt.