DE3751319T2

DE3751319T2 - VERWENDUNG UND ZUSAMMENSETZUNG ZUR VERBESSERUNG DES "TARGETING" VON ANTIKöRPERN, ANTIKöRPERTEILEN, SOWIE KONJUGATE DERSELBEN.

Info

Publication number: DE3751319T2
Application number: DE3751319T
Authority: DE
Inventors: Paul Abrams; Alton Morgan; Robert Schroff
Original assignee: Poniard Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Idec Pharmaceuticals Corp
Priority date: 1986-10-09
Filing date: 1987-10-09
Publication date: 1996-02-29
Anticipated expiration: 2007-10-10
Also published as: EP0288520B1; DE3751319D1; DK314688D0; EP0288520A1; ATE122894T1; AU8158787A; CA1340312C; DK314688A; AU616161B2; WO1988002594A2; JPH01501476A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verwendungen und Zusammensetzungen, um das Targeting von Antikörpern, Antikörperfragmenten, Peptidhormonen und Steroidhormonen, und Konjugaten davon zu verstärken. Genauer gesagt werden Verwendungen und Zusammensetzungen offenbart, die Blockierungsantikörper, Fragmente, Hormone und andere targetierende Agenzien, und Konjugate davon verwenden, um kreuzreaktives und unspezifisches Binden spezifischer Antikörper, Hormone und anderer targetierender Agenzien an Nicht-Ziel-Zellen zu verringern.

Hintergrundtechnik

Antikörper sind Proteine, die eine Bindungsstelle, die für eine spezielle Determinante spezifisch ist, z.B. Antigen oder Epitop, und andere Teile aufweisen, die auf nicht-spezifische Art und Weise an normales Gewebe binden. Es gibt eine Reihe immunologischer Begriffe, die alle im Zusammenhang mit Antikörperbindung stehen, die definiert werden müssen.

Target-spezifisches Binden:

Binden des Antikörpers, als Ganzes oder als Fragment, der Hormone, anderer targetierender Agenzien oder Konjugate davon, durch die Bindungsstelle des Antikörpers, an das von besagtem Antikörper erkannte Epitop auf Zellen, die einen Rezeptor für besagtes Epitop oder Hormon exprimieren, wobei besagte Zellen das erwünschte Target des ganzen Antikörpers oder eines Fragments, oder des Hormons, anderer targetierender Agenzien oder Konjugate davon, sind.
Ein Beispiel für Target-spezifisches Binden ist das Binden des Antikörpers, als Ganzes oder als Fragment, oder Konjugates davon, an Tumorzellen, wobei der fragliche Antikörper spezifisch auch an normale Zellen binden kann. Der Teil zum Binden an die Tumorzellen ist Target-spezifisch. Ein anderes Beispiel ist das Binden von Bombesin, oder Gastrin-freisetzendes Peptid, an kleinzelliges Lungenkarzinom.

Kreuzreaktives Binden:

Binden des Antikörpers, als Ganzes oder als Fragment, oder Hormons, anderer targetierender Agenzien oder Konjugate davon, durch die Bindungsstelle des Antikörpers an das durch besagten Antikörper erkannte Epitop auf Zellen, die besagtes Epitop oder Hormonrezeptor exprimieren, wobei besagte Zellen nicht das erwünschte Target des ganzen Antikörpers oder eines Fragments davon, oder Hormons oder Konjugates davon ist.
Ein Beispiel für kreuzreaktives Binden ist das Binden des Antikörpers, als Ganzes oder als Fragment, oder Konjugates davon, an normales Lungengewebe durch die Antikörperbindungsstelle an dasselbe oder strukturell homologes Epitop, wie es auf einer Tumorzelle vorkommt. Der Teil zum Binden an normale Lungenzellen durch die Antigen-Bindungsstelle des Antikörpers ist kreuzreaktiv. Ein anderes Beispiel ist das Binden von Bombesin, oder Gastrin-freisetzendes Peptid, an normale Zellen im Magen oder Pankreas.

Nicht-spezifisches Binden:

Binden eines Antikörpers, als Ganzes oder als Fragment, oder Hormons oder Konjugates davon, durch irgend einen Mechanismus, der verschieden ist von der Antigen-Erkennungs-Bindungsstelle des Antikörpers oder Hormons, an andere Zellen als die Ziel-Zellen.
Ein Beispiel für nicht-spezifisches Binden ist die Aufnahme von Antikörper in die Leber und Milz aufgrund der Bindung des Antikörpers durch ihre Fc-Rezeptoren an Zellen in diesen Organen.
Ein zweites Beispiel wäre das Binden von Mannose, die im Ricin von Antikörper-Ricin-Konjugat vorhanden ist, an Mannose-Rezeptoren auf Leberzellen.

Spezifischer Antikörper:

Ein Antikörper, der an das Epitop auf erwünschten Ziel-Zellen mittels seiner Antigen-Erkennungsstellen bindet. Spezifische Antikörper können auch an ein Epitop oder Strukturhomologes binden, das auf Nicht-Ziel-Zellen vorhanden ist.

Irrelevanter Antikörper:

Ein Antikörper, der an Ziel-Zellen nicht mittels seiner Antigen-Erkennungsstellen bindet, sondern an Nicht-Ziel- und Ziel-Zellen binden kann durch unspezifische Mechanismen, z.B. Binden des Fc-Teils des Antikörpers an Fc- Rezeptoren auf Zellen im retikuloendothelialen System (RES).

Blockierungsantikörper:

Ein Antikörper, der das nicht-spezifische Binden von pharmazeutisch aktiven spezifischen Antikörpern inhibiert. Blockierungsantikörper können irrelevante Antikörper oder pharmazeutisch inaktiven spezifischen Antikörper oder Fragmente oder Kombinationen davon einschließen. Der Letztgenannte kann auch als "kalt-spezifischer" Antikörper bezeichnet werden.

Pharmazeutisch aktive Antikörper:

Ein Antikörper, der diagnostisch oder therapeutisch wirksam ist.
Die Verwendung von Antikörpern als Träger für Radionuklide und Zytotoxine ist ein Ziel der Krebsdiagnose und -behandlung gewesen seit Pressman et al. zeigten, daß ¹³¹I-markierte Kaninchen-anti-Rattenieren-Antikörper nach intravenöser Injektion sich in der Niere lokalisierten (Pressman, D., Keighly, G. (1948) J. Immunol. 59:141-46). Nur wenige Jahre später berichteten Vial und Callahan von einer dramatischen, vollständigen Reaktion bei einem Patienten mit einem stark metastatischen malignen Melanom, der mit gegen seinen eigenen Tumor erzeugten ¹³¹I-Antikörpern behandelt wurde (Vial, A.B. und Callahan, W. (1956), Univ. Mich. Med. Bull. 20:284-86). In den 60er Jahren dieses Jahrhunderts zeigten Bale und Mitarbeiter, daß sich markierte Antikörper gegen Fibrin, das oft in schnell wachsenden Tumoren abgelagert wird, in Tumoren von Ratten, Hunden und Menschen (65% von 141 Patienten) lokalisieren konnten (Bale, W. F., et al. (1960) Cancer Res. 20:1501-1504 (1960); McCardle, R. J., Harper, P. V., Spar, I. L., et al. (1966) J. Nucl. Med. 7:837-44; Spar, I. L., Bale, W. F., Manack, D., et al. (1969) Cancer 78:731-59; Bale, W. F., Centreras, M. A., Goody, E. D. (1980) Cancer Res. 40:3965-3972). Einige Jahre später zeigten Chao und Mitarbeiter die selektive Aufnahme von Antikörperfragmenten in Tumore (Chao, H. F., Peiper, S. C., Philpott, G. W., et al. (1974) Res. Comm. in Chem. Path. & Pharm. 9:749-61).
Monoklonale Antikörper (Kohler, G. und Milstein, C. (1975) Nature 256:495-97) weisen aufgrund ihrer verbesserten Spezifität, Reinheit und Konsistenz zwischen den Chargen Vorteile gegenüber den in diesen Studien verwendeten polyklonalen Antikörpern auf. Diese Faktoren, und zusätzlich ihre weite Verfügbarkeit, haben zu verbesserten klinischen Anwendungen von Antikörpern und ihren Konjugaten geführt.
EP-A-0 063 988 betrifft Medikamente, die bei der Behandlung von Melanomen verwendet werden, wobei die Medikamente einen anti-Melanom-Antikörper umfassen, der kovalent an eine Ricin- A-Kette gebunden ist.
WO 85/00522 betrifft ein Verfahren zur Verstärkung der Target- Spezifizität der Antikörperlokalisierung durch Verabreichen eines ersten Antikörpers, der für alle Targets spezifisch ist, gefolgt von einem für den ersten Antikörper spezifischen zweiten Antikörper.
Jedoch sogar mit monoklonalen Antikörpern weisen die meisten Antikörper gegen menschliche Tumoren eine gewisse Kreuzreaktivität mit normalem Gewebe auf. Verglichen mit Tumoren können diese kreuzreaktiven Stellen injizierten Antikörper oder Konjugat in gleichem Umfang oder bevorzugt binden und folglich einen wesentlichen Teil der verabreichten Dosis adsorbieren, speziell dann, wenn sich diese Stellen in gut durchbluteten Organen konzentrieren. Wenn der Antikörper an ein toxisches Agens konjugiert ist, kann sich für die normalen Gewebe eine Toxizität ergeben, die dosislimitierend sein könnte. Deshalb wäre eine Verringerung des Bindens des Antikörpers oder Konjugate an normales Gewebe, ohne daß sich das nachteilig auf ihre Tumorlokalisierung auswirkte, vorteilhaft.
Auch werden in der Technik Verfahren benötigt, um das Targetieren von Immunkonjugaten an Tumorzellen zu verbessern. Die meisten Immunkonjugate werden durch chemisches Verbinden eines Antikörpers mit einem anderen Agens hergestellt. Eine andere Möglichkeit ist das Herstellen eines Fusionsproteins. Der Antikörper selbst, der Verbindungsprozeß, oder das konjugierte Agens selbst kann eine verringerte Lokalisierung an den Tumor durch nicht-spezifisches oder kreuzreaktives Binden verursachen.
In der Technik wird auch ein Verfahren benötigt, um die Zufuhr von Zytotoxinen oder von die biologische Antwort modifizierenden Agenzien (BRMs) zu Tumoren unter Verwendung von Antikörpern als Träger zu verbessern, während die Toxizität minimiert wird.
In der Technik werden auch vergleichbare Verfahren benötigt, um die Zufuhr von Zytotoxinen oder von die biologische Antwort modifizierenden Agenzien (BRMs) zu Tumoren unter Verwendung von Hormonen oder anderen targetierenden Agenzien als Träger zu verbessern, während die Toxizität minimiert wird.
Auch wird in der Technik ein Verfahren benötigt, um die Bildung von Antiglobulinen gegen injizierten Antikörper oder Immunkonjugate zu verringern, da es zu einer Inhibierung des Bindens oder sogar zu Toxizität kommen kann, wenn derselbe Antikörper zu einem späteren Zeitpunkt injiziert wird.
All diese Punkte können mit den beschriebenen Verfahren angesprochen werden, die kreuzreaktives und nicht-spezifisches Binden von Antikörper und Antikörperkonjugaten verringern und im gleichen Maße auf jede beliebige Substanz angewendet werden können, die eine nicht-spezifische Aufnahmestelle aufweist oder deren Rezeptoren von Nicht-Ziel-Zellen geteilt werden.
Die Zusammensetzungen und Verwendungen der vorliegenden Erfindung verringern kreuzreaktives und/oder nicht-spezifisches Binden spezifischer Antikörper oder Hormone, wenn diese zu Zwecken der Diagnose, Bestimmung des Stadiums, Bewertung oder Behandlung von Krankheiten, wie z.B. Krebs, Menschen verabreicht werden. Das Merkmal Spezifität macht Antikörper zu potentiell nützlichen Agenzien für das Targetieren definierter Zellpopulationen, wie z.B. Tumorzellen, die Tumor-spezifische (ausschließlich von den Tumorzellen exprimierte) oder Tumorassoziierte (von den Tumorzellen und von einer Subpopulation normaler Zellen exprimierte) Antigene exprimieren. Der klinische Nutzen dieser spezifischen Antikörper ist jedoch durch das Phänomen des kreuzreaktiven und nicht-spezifischen Bindens beeinträchtigt.
Ein Verfahren, um die nicht-spezifische Aufnahme merklich zu verringern, besteht darin, einen unspezifischen Bindungsteil des Antikörpers zu entfernen und den Antigen-Bindungsteil beizubelassen (z.B. F(ab)'2', Fab', Fab oder Fv). Fragmente können sich schneller als ganze Antikörper auf der Tumorzelle ans ammeln aufgrund ihrer geringeren Größe, die den Austritt aus der Zirkulation über Blutgefäß- und Kapillarwände in das Tumorbett erleichtert. Dies ist normalerweise kein Ausgleich für die herabgesetzte Serumhalbwertszeit des Fragmentes, die zu einer verringerten Ansammlung im Tumor verglichen mit dem ganzen Antikörper führt. Folglich besteht eine Notwendigkeit, die Serumhalbwertszeit der Fragmente zu verlängern, um von ihrer schnelleren Akkumulierung in Ziel-Zellen zu profitieren und daher die Lokalisierung in einen Tumor zu verbessern. Zusätzlich muß ein nicht-spezifisches Binden spezifischer Antikörper in normalen Organen verringert werden.
Im allgemeinen war mangelhafte Zufuhr zu den Ziel-Zellen ein Haupthindernis für die erfolgreiche klinische Verwendung von Antikörpern und Konjugaten davon. Zu dieser Einschätzung kam man sowohl durch immunhistochemische Untersuchungen von Gefrierschnitten von Tumoren, die nach Verabreichung von Antikörper entfernt wurden (Oldham, R. K., Foon, K. A., Morgan, A. C., et al. (1984) J. of Chem. Oncol. 2(11) :1235-44; Abrams, P. G., Morgan, A. C., Schroff, C. S. (1985) In: Monoclonal Antibodies und Cancer Therapy (Deisfeld und Sell, Eds.), Alan R. Liss Inc., S. 233-36) als auch durch Berechnung des Anteils der radioaktiv markierten Antikörperdosis pro Gramm im Tumor (Murray, J. L., Rosenblum, M. G., Sobol, R. E., et al. (1985) Cancer Res. 45: 2376-81; Carrasquillo, J. A., Abrams, P. G., Schroff, R. W., et al. (eingereicht); Epenetos, A. A., Mather, S., Gwanowska, M., et al. (1982) Lancet II: 999-1004; Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Krohn, K. A., et al. (1983) J. Clin. Investigation 72:2101-2114 (1983). In den früheren Studien gab es einen eindeutigen Beleg für erhöhte Antikörperlokalisierung im Tumor bei höheren Dosen spezifischen Antikörpers. Die quantitativen Studien mit radioaktiv markiertem Antikörper haben gezeigt, daß sich 0,0001 % bis 0,004 % der injizierten Dosis/Gramm im Tumor lokalisierten (Carrasquillo, aaO.).
Radioaktives Markieren von Antikörpern erlaubt die quantitative Bewertung des prozentualen Zuwachses in die Tumore und normalen Organe und das Verschwinden aus dem Blut und dem ganzen Körper. Dies dient als Musterbeispiel für die Bioverteilung und Kinetiken von Antikörpern und Immunkonjugaten. Konjugierte oder markierte Peptide oder Steroidhormone sehen eine analoge Strategie vor.
Studien mit radioaktiv markierten Antikörpern haben gezeigt, daß ein Teil des Problems, das zu geringer Akkumulation im Tumor führt, die Lokalisierung von radioaktiv markiertem Antikörper in andere Organe, wie z.B. Leber, Milz, Knochenmark, Lunge oder Niere, ist. Der Stand der Technik ist voll mit Beispielen, die die Masse spezifischer Antikörper erhöhen, um die Tumorlokalisierung zu verbessern (z.B. Abrams, aaO.; Murray, aaO.; Carrasquillo, aaO.; Epenetos, aaO.; Larson, aaO.) . Die vorliegende Erfindung verwendet irrelevanten Antikörper, um an diese nicht-spezifischen Stellen zu adsorbieren und damit dem Bedarf an hohen Dosen unkonjugierten spezifischen Antikörpers, die im Stand der Technik notwendig sind, vorzubeugen. Ein Vorteil dieser Strategie besteht darin, daß nicht-konjugierter irrelevanter Antikörper nicht mit dem konjugierten spezifischen Antikörper um die spezifischen Stellen auf den Ziel-Zellen konkurriert. Ein weiterer Vorteil ist, daß ein irrelevanter Antikörper die immunologische Antwort des Patienten vom spezifischen Antikörper ablenkt (vide infra).
Ein Maßstab für verringerte Adsorption spezifischer Antikörper an unspezifischen Stellen ist eine erhöhte Serumhalbwertszeit des Antikörpers. Ein weiteres unerwartetes Ergebnis der Vorabverabreichung von isotypischem und bezüglich der Subklasse passendem ganzen irrelevanten Immunglobulin ist die verlängerte Serumhalbwertszeit, reduzierte nicht-spezifische Adsorption und verbesserter Tumornachweis mit Fragmenten von spezifischem Antikörper.
Der Stand der Technik kennt das Problem der Lokalisierung spezifischen Antikörpers und Fragmente und Konjugate davon aufgrund von nicht-spezifischem und kreuzreaktivem Binden an Nicht-Ziel-Epitopen, z.B. Murray, aaO.. Aber die verwendete Lösung bestand darin, die Probleme nicht-spezifischer und kreuzreaktiver Aufnahme zusammenzufassen und eine einzige Strategie - gleichzeitige Verabreichung großer Mengen spezifischen, nicht-konjugierten Antikörpers - zu verwenden, um die Probleme zu überwinden. Die vorliegende Erfindung unterscheidet nicht nur diese Probleme, sondern liefert auch für jedes verschiedene Lösungen: (1) Die Verwendung eines irrelevanten Antikörpers (Immunglobulin), um nicht-spezifisches und kreuzreaktives Binden des spezifischen Antikörpers zu verringern und (2) die Verabreichung von nicht-konjugiertem spezifischen Antikörper&sub1; um an kreuzreaktive Stellen vor der Verabreichung von konjugiertem spezifischen Antikörper zu binden. Die letztgenannte Lösung ist gleichermaßen auf Steroid- und Peptidhormone anzuwenden.
Da Antikörper Proteine, in den meisten Fällen nicht-menschlichen Ursprungs, sind, wurde das Schreckgespenst vom menschlichen Antiglobulin und Anti-Idiotyp beschworen (Oldham, aaO.; Abrams, aaO.; Murray, aaO.; Carrasquillo, aaO.; Epenetos, aaO.; Larson, aaO.). Diese Erfindung zeigt, daß die gleichzeitige Verabreichung größerer Mengen irrelevanten Antikörpers diese Antiglobulinantwort auf den irrelevanten Antikörper und nicht auf den spezifischen Antikörper lenken kann, so daß zusammen mit entweder demselben oder einem zweiten irrelevanten Antikörper, derselbe Target-spezifische Antikörper wieder injiziert werden kann und sich in Tumoren ohne signifikante Bildung von Antiglobulinen gegen den spezifischen Antikörper lokalisieren kann.
Trotz ihrer erhöhten Spezifität sind monoklonale Antikörper bisher nicht vollständig tumor-spezifisch gewesen, sondern erkannten eher Tumor-assoziierte Antigene. Wenn ihre Kreuzreaktivität für ein Organ dominiert, das selektiv durchströmt werden kann, liefert die vorliegende Erfindung Verfahren zum Targetieren spezifischer Antikörperkonjugate durch selektive direkte Infusion von nicht-konjugiertem spezifischen Antikörper in ein Gefäß, das ein normales Organ versorgt, von dem man weiß, daß es konjugierten Antikörper durch kreuzreaktives Binden anreichert. Für ein therapeutisches Konjugat ist die Verringerung der Toxizität ein wesentlicher Vorteil.
Konjugate von spezifischem Antikörper können sich an nicht- spezifischen Stellen dank des an den Antikörper gekoppelten Moleküls eher als aufgrund des Antikörpers selbst lokalisieren. Die Proteintoxine (z.B. Ricin, Abrin, Diphtherietoxin, Pseudomonas-Toxin) können an Säugerzellen durch spezielle Teile dieser Moleküle binden. Diese Eigenschaft hatte große Bemühungen zur Folge, ihre nicht-spezifische Bindungsfähigkeit unter Erhaltung der Wirksamkeit des Toxins zu entfernen. Entsprechend den Verfahren der vorliegenden Erfindung können detoxifizierte Proteintoxine, wenn sie an einen nicht-spezifischen Antikörper konjugiert sind, das Binden der spezifischen Antikörper-Toxinkonjugate an nicht-spezifische Stellen verringern. Diese Methodik verringert die Ganzkörpertoxizität und erlaubt die Verabreichung größerer Dosen des spezifischen Toxinkonjugates.

Offenbarung der Erfindung

Die Verwendungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung dienen der Verstärkung der Zufuhr von Antikörpern oder Fragmenten davon oder anderen Rezeptor-vermittelten Zufuhrsystemen, wie z.B. Peptide, die spezifisch für eine Zellpopulation eines Säugetiers sind, zu Ziel-Zellen. Das Verfahren, bei dem Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindungen verwendet werden können, umfaßt die Schritte, besagtem Säugetier eine angemessenen Menge Blockierungsantikörper oder Fragmente davon oder anderer Rezeptor-vermittelter Zufuhrsysteme, wie z.B. Peptide, zu verabreichen und besagtem Säugetier eine wirksame Dosis besagter Antikörper oder Fragmente davon oder anderer Agenzien zu verabreichen, die eine definierte Zellpopulation über Rezeptoren, die spezifisch für besagte Zellpopulation sind, targetieren, wie z.B. Hormone, wobei die Blockierungsantikörper oder Fragmente davon oder andere targetierende Agenzien geeignet sind, an Nicht-Ziel-Zellen nicht-spezifisch und/oder kreuzreaktiv zu binden. Die Antikörperfragmente entweder der Blockierungsantikörper oder der spezifischen Antikörper werden aus der Gruppe ausgewählt, die F(ab)', F(ab)'&sub2;, Fab, Fv und Mischungen davon umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Ziel-Zellen dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Tumor-assoziiertes Antigen aufweisen. Sowohl die Blockierungsantikörper als auch die spezifischen Antikörper können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper sein. Weiterhin können die spezifischen Antikörper und Fragmente davon an Zytotoxine, Radionuklide oder die biologische Antwort modifizierenden Agenzien konjugiert sein.
Die Verabreichung der Blockierungsantikörper erfolgt vor der Verabreichung der spezifischen Antikörper. Die für eine besagte Zellpopulation spezifische wirksame Dosis der Antikörper oder Fragmente davon ist entweder diagnostisch oder therapeutisch wirksam. Das bevorzugte Säugetier für die hier offenbarten Verwendungen ist der Mensch.
Eine zusätzliche bevorzugte Ausführungsform der hier offenbarten Verwendungen und Zusammensetzungen dient der Verstärkung der Lokalisierung von Antikörpern oder Fragmenten davon, die für ein kreuzreaktives Antigen spezifisch sind, das im Gewebe oder Organ eines Säugetiers enthalten ist. Diese Verwendung umfaßt die Schritte direktes Durchströmen besagten Gewebes oder Organs mit einer angemessenen Dosis von Blockierungsantikörpern oder Fragmenten davon und dann systemische Verabreichung einer wirksamen Dosis besagter Antikörper oder Fragmente davon an das Säugetier, die spezifisch für besagtes Antigen sind, das in besagtem Gewebe oder Organ enthalten ist und auch auf den Ziel-Zellen vorhanden ist.
Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart die Verwendung einer Zusammensetzung, um in einem Säugetier die Produktion von Anti-Immunoglobulin zu verringern, das gegen die Antikörper oder Fragmente davon gerichtet ist, die für eine Population von Ziel-Zellen spezifisch sind.
Diese Verwendung umfaßt die Schritte, dem besagten Säugetier eine angemessene Dosis von Blockierungsantikörpern oder Fragmenten davon zu verabreichen, die geeignet sind, die Produktion von Anti-Immunoglobulin zu stimulieren, die gegen besagte Blockierungsantikörper oder Fragmente davon gerichtet sind, und besagtem Säugetier eine therapeutisch wirksame Dosis von besagten Antikörpern oder Fragmenten davon zu verabreichen, die für besagte Ziel-Zellen spezifisch sind, wobei die besagte therapeutisch wirksame Dosis geringer ist als die besagte angemessene Dosis von Blockierungsantikörpern oder Fragmenten davon.

Beste Form der Ausführung der Erfindung

1. Reduzieren von nicht-spezifischer Aufnahme

Ein irrelevanter Antikörper kann an einen spezifischen Antikörper durch die Spezies, Isotyp und/oder Subklasse angepaßt werden und wird gewöhnlicherweise als Mehrfaches oder in größeren Mengen dem Patienten vor der Injektion des spezifischen Antikörpers oder spezifischer Antikörperkonjugate verabreicht. Alternativ braucht ein solches Anpassen nicht notwendig zu sein. Der Stand der Technik hat eine verbesserte Tumorlokalisierung ganzer Antikörper mit zunehmenden Dosen spezifischen Antikörpers gezeigt. Zu diese Ergebnissen kam man entweder mittels Tracer-markierten spezifischen Antikörpern oder mittels Immunhistochemie nach Verabreichung des Antikörpers (Oldham, aaO.; Abrams, aaO.; Murray, aaO.; Carrasquillo, aaO.). Im ersten Fall wurde der nicht-markierte, spezifische Antikörper gewöhnlicherweise gleichzeitig mit dem markierten Präparat gegeben. Das zugrundeliegende Konzept umfaßte das zur Verfügungstellen einer ausreichenden Masse von Antikörper, der an nicht-spezifische Stellen bindet, und Überlassen von spezifischerem Antikörper, um an den Tumor zu binden. Es trat eine gewisse Verringerung des markierten Antikörpers an nicht-spezifischen Stellen (z.B. Leber) und eine deutliche Zunahme der Serumhalbwertszeit des radioaktiv markierten ganzen Immunglobulins auf (Carrasquillo, aaO.) . Es besteht jedoch die Gefahr der Kompetition durch spezifische Bindung von markiertem und nicht-markiertem Antikörper an der Tumorstelle. Wenn die Markierung symbolisch verwendet wird, um jedes Agens, das mit Antikörper konjugiert ist, zu repräsentieren, wird die Kompetition des nicht-markierten Antikörpers um das Tumorantigen an den am stärksten zugänglichen (perivasculären) Stellen die Zufuhr dieses Agens zum Tumor gefährden. Zusätzlich verhält sich ein Prozentsatz des markierten Antikörpers, wenn er gleichzeitig injiziert wird, als echter Tracer und lagert sich in normalen nicht-spezifischen und kreuzreaktiven Stellen ab.
Das hierin beschriebene Verfahren verwendet einen irrelevanten Antikörper (Blockierungsantikörper), der bevorzugterweise vor dem spezifischen Antikörper verabreicht wird (siehe Beispiel I), um die nicht-spezifische Aufnahme zu verringern, ohne um das Tumorantigen zu konkurrieren. Die durch Vorabverabreichung irrelevanten Antikörpers beobachteten positiven Ergebnisse war nicht erwartet worden, da menschliche Gammaglobuline in großen Mengen (> 1 g) keine verringerte Lokalisierung von radioaktiv markiertem Antikörper in nicht-spezifische Stellen zeigten (Carrasquillo, aaO.).
Weiterhin ist das hier beschriebene Verfahren sowohl auf Fragmente eines spezifischen Antikörpers als auch auf ganze spezifische Antikörper anwendbar. Es ist auch gezeigt worden, daß das Verfahren die Serumhalbwertszeiten der Fragmente erhöht.
Besonders unerwartet war die verlängerte Serumhalbwertszeit in der Anfangsphase der Serum-Clearance, die dadurch erreicht wurde, daß ganze irrelevante Antikörper vor spezifischen Antikörperfragmenten verwendet wurden. Dies war überraschend, da man angenommen hatte, daß die nicht-spezifischen Bindungsstellen am Antikörper entfernt werden würden durch das Erzeugen von Fragmenten, denen der Fc-Teil des Moleküls fehlt. Dieses Verfahren ist nützlich, um nicht-spezifisches Binden von spezifischem Antikörper, als Ganzes oder als Fragment, oder von Konjugaten eines solchen Antikörpers, als Ganzes oder als Fragment, mit Radionukliden, Medikamenten, Toxinen, die biologische Antwort modifizierenden Agenzien oder differenzierend wirkenden Agenzien zu verringern.

2. Verringern der Kreuzreaktivität mit normalem Gewebe

Normale Gewebe können ein Epitop, oder Strukturhomologes eines Epitops, enthalten, das auf der Ziel-Zelle exprimiert wird. Mehrere Verfahren, um die Lokalisierung in Nicht-Zielgeweben zu verringern, werden hierin aufgezeigt. Für normale Gewebe, die in gleichem Maße oder stärker als Tumore für spezifischen Antikörper zugänglich sind, wird nicht-konjugierter spezifischer Antikörper (Blockierungsantikörper) vor konjugiertem spezifischen Antikörper verabreicht (siehe Beispiel II) . Die Antigen-Bindungsstellen auf normalen Geweben, wie z.B. Blutgefäßen oder Leber, werden zuerst die zuvor injizierten, nicht- konjugierten ganzen Antikörper binden. In einer Ausführungsform ist der Blockierungsantikörper bivalent (als Ganzes oder F(ab)'&sub2;) und der konjugierte Antikörper ist monovalent (Fab', Fab oder Fv). Dieser Ansatz nutzt den Vorteil der höheren Antigenaffinität der bivalenten Moleküle und verringert hierdurch die Kompetition der nachfolgend verabreichten, konjugierten monovalenten Form um die kreuzreaktiven Stellen.
Die genauen Dosen des kalt-spezifischen Antikörpers und der Zeitpunkt der Verabreichung werden von der Größe des Patienten, der quantitativen Expression des Antigens oder Epitops im normalen Gewebe, der relativen Zugänglichkeit des Tumors verglichen mit normalen Gewebestellen und vom Ziel abhängen, das man mit der ganzen Prozedur verfolgt. Zum Beispiel kann ein Nicht-Tumor-Targeting in bescheidenem Umfang in einer therapeutischen Studie akzeptabel sein, solange die Toxizität erträglich ist, aber es ist weniger akzeptabel in einem Abbildungsverfahren, wo falsch-positive Ergebnisse ein Problem sein könnten.
Die Dosis des kalt-spezifischen Antikörpers kann durch Zugabe steigender Dosen des kalt-spezifischen Antikörpers vor Biodistributionsstudien mit einem markierten Antikörper oder markiertem Konjugat approximiert werden. Wenn normale Gewebestellen, die Aufnahme des radioaktiv markierten Antikörpers, oder des Konjugates mit keinem kalt-spezifischen Antikörper zeigen, nicht länger sichtbar gemacht werden, dann wird eine angemessene Dosis des kalt-spezifischen Antikörpers erreicht worden sein. Alternativ kann man ein größeres Intervall zwischen der gegebenen Dosis an kalt-spezifischem Antikörper und der nachfolgenden Verabreichung von konjugiertem spezifischen Antikörper erlauben, um ein stärkeres Eindringen des kalt-spezifischen Antikörpers in normales Gewebe zuzulassen.
Ein anderer Ansatz besteht darin, die Serumhalbwertszeit eines irrelevanten Antikörpers oder Fragments zu bestimmen und vorab genügend kalt-spezifischen Antikörper oder Fragment zu verabreichen&sub1; um die Halbwertszeit des konjugierten Antikörpers oder Fragmentes auf einen Wert nahe der Halbwertszeit des irrelevanten Antikörpers zu erhöhen. Dies wäre ein indirekter Beweis dafür, daß eine normale Gewebeantigen-"Senke" vollständig oder weitestgehend gesättigt wurde.
Ein zusätzliches Verfahren zur Bestimmung der angemessenen Dosis ist durch Eger et al. beschrieben. Unter Verwendung von Daten, die sie von Patienten erhielten, die den Antikörper 9.2.27 erhielten, konstruierten sie ein mathematisches Modell, das, mittels Regressionsanalyse, eine Antikörperdosis vorhersagen konnte, die die "Antigen-Senke" in normalen Geweben sättigen würde.
Einmal für ein bestimmtes Antigen-Antikörpersystem bestimmt, kann die Dosis und die zeitliche Abfolge auf der Basis der Körperoberfläche oder des Gewichts für diesen speziellen Antikörper berechnet werden.
Innerhalb eines weiten Bereiches wird jedoch die Verabreichung von mehr als einer Dosis, die normales Gewebe absättigt, einen geringen Einfluß auf die Zufuhr des konjugierten Antikörpers zum Tumor haben. Die Hauptüberlegungen sind Sättigung der zugänglicheren Tumorstellen und Affinitätsunterschiede zwischen unkonjugiertem, "kaltem" Antikörper und dem Konjugat. Wenn das Konjugat eine wesentlich geringere Affinität aufweist, dann wird eine zu große Dosis unkonjugierten Antikörpers das Konjugat verdrängen und folglich die Effizienz - therapeutisch oder diagnostisch - verringern.
Ein zweites Verfahren um Kreuzreaktivität mit normalen Geweben zu reduzieren, die das kreuzreagierende assoziierte Antigen enthalten, umfaßt gesteuert vorherige oder gleichzeitige Verabreichung von unkonjugiertem Antikörper (siehe Beispiel III). Im allgemeinen wird ein venöser oder arterieller Zugang durch Legen eines perkutanen Katheters erreicht. Zum Beispiel können die renalen Arterien oder Venen katheterisiert werden, um die Nieren selektiv zu durchströmen. Alternativ kann während einer Operation ein Katheter in ein geeignetes Gefäß gelegt werden (z.B. Leberarterie für Leber). Der nicht-konjugierte Antikörper wird durch den Katheter injiziert, um mit den Antigenstellen des normalen Organs bei der "ersten Passage" des Antikörpers in Berührung zu kommen. Der Antikörper kann vollständig oder ein Fragment sein. Der konjugierte Antikörper wird entweder gleichzeitig oder danach in den allgemeinen Blutkreislauf des Säugetiers injiziert. Binden des spezifischen konjugierten Antikörpers an die vor kurzem durchströmten Stellen in den normalen Organen ist verringert und demzufolge die Verfügbarkeit des konjugierten spezifischen Antikörpers für die Ziel- Zellen erhöht. Das führt auch zu einer verringerten Toxizität für das kreuzreagierende Nicht-Zielorgan durch den spezifischen konjugierten Antikörper.
Ein drittes Verfahren bezieht entweder ein peripheres Blutgefäß oder gesteuerte Infusion, wie oben beschrieben, ein. Statt nicht-konjugierten Antikörper als den Blockierungsantikörper zu verwenden, wird ein Konjugat aus Antikörper und detoxifiziertem Zytotoxin oder BRM infundiert, wobei der Vorgang des Detoxifizierens (d.h. reduzierte Toxizität) die Erkennungsstellen und/oder Bindungsstellen für normale Zellen schont (siehe Beispiel IV). In einer bevorzugten Ausführung ist das detoxifizierte Agens entweder frei oder an den nicht-spezifischen Antikörper gebunden, und das detoxifizierte Konjugat wird vor der Verabreichung von spezifischem Antikörperkonjugat injiziert, und, falls notwendig, kann als Dauerinfusion verabreicht werden.
In einem anderen Verfahren, wo sich der zu behandelnde Tumor in einem Organ oder einer Extremität befindet, wird konjugierter Antikörper nach peripherer Blockade der kreuzreaktiven und nicht-spezifischen Stellen mit nicht-konjugiertem spezifischen und/oder detoxifiziertem, konjugiertem irrelevanten und/oder nicht-konjugiertem irrelevanten Antikörper mittels eines geführten Katheters in das Organ oder die Extremität injiziert.
Ein zusätzliches Verfahren umfaßt die Injektion von nicht-konjugiertem spezifischen Antikörper mittels Katheter oder anderer Vorrichtungen, um die erste Verabreichung des Antikörpers in ein Organ zu steuern&sub1; das das kreuzreaktive Antigen enthält, wobei der zu behandelnde Tumor außerhalb des Organs verbreitet ist. Nicht-konjugierter irrelevanter Antikörper und/oder detoxifizierter, konjugierter, nicht-spezifischer Antikörper werden durch ein peripheres Blutgefäß injiziert. Konjugierter spezifischer Antikörper wird dann intravenös injiziert.

3. Verringerung der gegen den spezifischen Antikörper gerichteten Antiglobulinantwort

Irrelevanter Antikörper wird vor oder zugleich mit spezifischem Antikörper oder spezifischem Antikörperkonjugat verabreicht. Der irrelevante Antikörper kann in höheren Dosen als der spezifische Antikörper verabreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der irrelevante Antikörper ein ganzes Immunglobulin und der spezifische Antikörper ein Antikörperfragment (siehe Beispiel V). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform reicht das Verhältnis von spezifischem zu nicht-spezifischem Antikörper von ca. 1:1 bis ca. 1:100 und beträgt bevorzugterweise 1:5. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der nicht-spezifische Antikörper ein ganzes Immunglobulin und der spezifische Antikörper ist Fab oder Fv. Die Grundlage für diese Strategie ist, daß die höhere Dosis und Verwendung von ganzem, nicht als Fragment vorliegendem, irrelevanten Antikörper wahrscheinlicher eine immunologische Antwort hervorrufen kann als die geringere Dosis und die weniger immunogenen Fragmente von spezifischem Antikörper.
Wenn ein Patient Antiglobuline bildet, die den irrelevanten Antikörper, aber nicht den spezifischen Antikörper binden, dann kann derselbe irrelevante Antikörper in einer nachfolgenden Dosis vor dem spezifischen Antikörper verabreicht werden, um das zirkulierende Antiglobulin zu adsorbieren und nicht spezifische Stellen in normalen Geweben in höheren Dosen zu blockieren. Alle Antiglobuline gegen irrelevanten Antikörper, die mit spezifischem Antikörper kreuzreagieren, würden komplexiert und in der Niere oder dem retikuloendothelialen System, abhängig von der Größe des Komplexes, abgelagert werden. Von äußerster Wichtigkeit ist, daß nachfolgend gegebener konjugierter spezifischer Antikörper nicht komplexiert werden würde, sondern frei wäre, um an Ziel-Zellen zu binden. Alternativ kann ein zweiter irrelevanter Antikörper, der nicht von der Antiglobulinantwort erkannt wird, in nachfolgenden Injektionen eingesetzt werden. Eine Kombination irrelevanter Antikörper kann auch verwendet werden.

BEISPIELE

I. Verringerung nicht-spezifischer Aufnahme.

Der monoklonale Antikörper (MAB) NR-2AD ist ein murines IgG2a- Immunglobulin, das als ein Anti-Idiotyp konstruiert wurde, der an ein B-Zelllymphom eines einzelnen Patienten band und an sonst kein anderes menschliches Gewebe. MAb 9.2.27 ist ein muriner IgG2a-Antikörper, der das Melanom-assoziierte 250 Kilodalton Glycoprotein/Proteoglycan Antigen erkennt. Beide wurden durch in vitro Zellkultur produziert, mittels Säulenchromatographie gereinigt und hinsichtlich Reinheit und Sterilität getestet, um dem Richtlinienentwurf für injizierbare monoklonale Antikörper des "Office of Biologics", Food & Drug Administration ("Points to consider in the manufacture of injectable monoclonal antibody products intended for human use in vivo: Revised draft of 6/11/84") zu entsprechen. MAb 9.2.27 wurde mit Pepsin verdaut und das F(ab)'&sub2;-Fragment wurde vom restlichen intakten Antikörper gereinigt.
50 mg NR-2AD wurden in normaler physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und dem Patienten 8501.08 intravenös injiziert, der ein metastatisches malignes Melanom hatte. Eine Stunde später wurden 2,5 mg Tc-99m-markiertes 9.2.27 F(ab)'&sub2; intravenös verabreicht. Das Blut des Patienten wurde abgenommen und mit einem Tc-99m-Standard gezählt. Überraschenderweise war die Serumhalbwertszeit (t½) des markierten F(ab) '&sub2; 17 Stunden. Die mittlere Serumhalbwertszeit t½) des markierten 9.2.27 F(ab)'&sub2; von Patienten, die NR-2AD erhielten, betrug 12 Stunden verglichen mit 6 Stunden bei jenen, die NR-2AD nicht vor dem markierten Fragment erhielten. Der Tumor des Patienten wurde mittels Gammakameraabbildung sichtbar gemacht und dann herausgeschnitten. Ein anderes unerwartetes Ergebnis war der Nachweis eines Tumors, der nur 0,25 g wog.

II. Verringerung kreuzreaktiven Bindens von spezifischen Antikörperkonjugaten.

A. Kalt-spezifischer Antikörper blockiert Aufnahme von konjugiertem spezifischen Antikörper in normale Organe.

Die Wirkung der Verringerung der kreuzreaktiven Aufnahme eines radioaktiv markierten monoklonalen Antikörperpräparates wurde im Rahmen eines klinischen Versuchs zur diagnostischen Abbildung beurteilt. Der in der Studie untersuchte Patient (#8501.22) war ein 32-jähriger Mann mit einer metastatischen Melanomläsion am linken hinteren Teil des Nackens. Die Läsion bestand aus einem vom Tumor betroffenen Lymphknoten und maß 2 x 2 cm.
Der Patient erhielt zwei Behandlungen mit radioaktiv markiertem Antikörper, die 3 Tage auseinanderlagen. Die erste Behandlung mit Antikörper bestand aus zwei Dosen: eine intravenös verabreichte 50 mg-Dosis von nicht radioaktiv markiertem intakten irrelevanten Antikörper (NR-2AD), gefolgt von einer 2,5 mg Dosis von mit Tc-99m radioaktiv markiertem Fab-Fragment von MAB 9.2.27 eine Stunde später. Die Lokalisierung der radioaktiven Markierung im Patienten wurde durch Gammakameraaufnahmen über eine Zeitspanne von 7 Stunden beurteilt. Die zweite Behandlung war identisch, ausgenommen, daß 7,5 mg von nicht radioaktiv markiertem F(ab)'&sub2;-Fragment von 9.2.27 5 Minuten vor dem radioaktiv markierten Fab-Präparat verabreicht wurden. Die 50 mg Dosis von intaktem irrelevanten Antikörper wurde bei beiden Behandlungen verabreicht, um die nicht-spezifische Aufnahme des radioaktiv markierten Antikörpers in normalem Gewebe zu verringern. Das nicht radioaktiv markierte Target-spezifische F(ab')&sub2;-Präparat wurde zu Zwecken der Verringerung der kreuzreaktiven Aufnahme des radioaktiv markierten Antikörpers durch Nicht-Zielgewebe verabreicht.
Die Ergebnisse der Studie zeigten, daß Weglassen des nicht radioaktiv markierten Target-spezifischen Antikörpers (9.2.27 F(ab')&sub2;) 7 Stunden nach der Infusion mit einer Aufnahme von radioaktiv markiertem Antikörper in Nicht-Zielgewebe, speziell Milz, Knochenmark und Niere, einherging. Die bekannte Tumorstelle wurde nicht abgebildet. Vorausgehende Infusion des nicht radioaktiv markierten Target-spezifischen Antikörpers (9.2.27 F(ab')&sub2;) ging zum gleichen Zeitpunkt mit Aufnahme in der Niere einher, aber es gab keine nachweisbare Aufnahme in der Milz, Knochenmark oder andere normale Organe. Dieses Ergebnis war unerwartet, da die Aufnahme durch Mark und Milz früher als nicht-spezifisch gegolten hat. Zusätzlich war der bekannte Tumor im Nacken deutlich zu sehen, was bestätigt, daß Blockieren kreuzreaktiver Bindungsstellen durch vorausgehende Infusion von nicht radioaktiv markiertem Target-spezifischen Antikörper sowohl Nicht-Zielgewebe-Lokalisierung reduzierte, als auch Tumorlokalisierung des radioaktiv markierten zielspezifischen Antikörpers erhöhte.

B. Kalt-spezifischer Antikörper blockiert Aufnahme des markierten spezifischen Antikörpers durch einen Epitop-spezifischen Mechanismus.

Patient 8501.29 war ein 49jähriger männlicher Kaukasier, der mit einem Melanom auf seinem Rücken vorgestellt wurde, das sich damals zu den Lymphknoten unter seinem Arm ausbreitete. Zum Zeitpunkt der Abbildung mit den 99mTc-markierten Antikörpern hatte der Patient ein vermutetes Leiden unter der rechten Achsel (rückläufig), zweifelhafte kleine subkutane Metastasen auf seinem Arm und Rücken und unklare hepatische Beteiligung, wie durch ein CT-Bild und erhöhte Lebertransaminasen belegt wurde.
Das Ziel des Tests bei diesem Patienten war, zu bestimmen, ob der kalt-spezifische Antikörper normale Gewebeakkumulation des markierten Antikörpers auf Antigen-Bindungsstellen-spezifische Art und Weise (d.h. Epitop-spezifisch) blockiert. Zwei Antikörper, NR-ML-05 und 9.2.27, von denen jeder verschiedene Epitope des Melanom-assoziierten 250 Kd. Glycoprotein/Proteoglycan Antigens erkannte, wurden für diese Studie ausgewählt.
Im ersten Durchgang erhielt der Patient irrelevanten Antikörper NR-2AD (NRK 900.00), kalt-spezifischen 9.2.27 (NRX-112) und danach radioaktiv markierten NR-ML-05 (NRK 118.03), so daß der kalt-spezifische Blockierer und der markierte Antikörper verschiedene Epitope desselben Antigens erkannten. Gammakameraaufnahmen 4 und 8 Stunden nach der Injektion zeigten Metastasen in der Leber, eine Kette von Knoten in der Achselhöhle aber auch Bilder von Mark (Sternum und Pelvis) und Milz. Ein Wiederholungsdurchgang war identisch, aber 9.2.27, der im ersten Durchgang verwendet wurde, wurde durch NR-ML-05 (NRX 118) als der kalt-spezifische Blockierer ersetzt. Gammakameraufnahmen zeigten dieselben Krankheitsherde, aber diesmal ohne Aufnahme der Markierung durch Mark (Sternum und Pelvis) und Milz.
Dieses Beispiel, bei dem derselbe Patient als seine eigene Kontrolle verwendet wurde, zeigte schlüssig, daß der kalt-spezifische Antikörper die Aufnahme des markierten spezifischen Antikörpers in normale Organe auf Epitop-spezifische Art und Weise blockierte.

III. Gesteuerte Infusion, um kreuzreaktives Binden zu verringern.

Perkutane Katheterisierung der Abdominal- und/oder Pankreatoduodenalarterien wird durch die Femoralarterie vorgenommen. MAB NR-CO-1, der mit Colonkarzinom reagiert und mit normalem Pankreas kreuzreagiert, ist mit Tc-99m markiert. Nicht-markierte NR-CO-1 F(ab)'&sub2;-Fragmente (10 mg) werden durch 10-minütige Infusion durch den Katheter injiziert, gefolgt von einem Schwall normaler physiologischer Kochsalzlösung (gesteuerte Infusion). Am Ende der gesteuerten Infusion wird der markierte NR-CO-1 (2,5 mg) durch eine periphere Vene injiziert. Weglassen der gesteuerten Infusion führt zu einer verstärkten Lokalisierung des nachfolgend verabreichten, markierten Antikörpers im Pankreas, was zeigt, daß die gesteuerte Infusion selektiv das Binden von Konjugaten in Organen verringern kann, die kreuzreaktives Antigen enthalten.

IV. Reduzierung nicht-spezifischen Bindens von Konjugaten.

Pseudomonas Exotoxin (PE) und Diphtherietoxin (DT) sind bakterielle Proteine, die die Proteinsynthese in Zellen durch ADP- Ribosylierung von Elongationsfaktor 2 (EF-2) stören. DT bindet an Nikotinamid an Glutaminsäure in Position 148 im Molekül. Substitution von Asparaginsäure an dieser Position (DTASP) verringert die Aktivität von DT auf 1% des nativen Moleküls, beeinflußt aber nicht sein Binden an Zellen. PE soll eine "Tasche" aufweisen, um an sein Substrat zu binden, die ein Tyrosin (Position 481) und Glutaminsäure (Position 553) enthält. Man erwartet von einer Jodierung von Tyrosin 481 (PetyrI), daß sie mit einem > 50 %-igen Verlust an Aktivität von PE (PEtyrI), aber Beibehaltung seiner Bindungsfähigkeit einhergeht.
Man läßt NR-2AD (irrelevantes Immunglobulin) mit 25 mM Dithiothreitol und PEtyrI oder DTASP mit SMPB [Succinimidyl(4-p- maleimidophenyl)-butyrat] reagieren und entfernt die nicht- umgesetzten Agenzien. Der derivatisierte Antikörper und das Toxin werden zusammengemischt, wobei NR-2AD-S-C-PEtyrI oder NR- 2AD-S-C-DTASP (detoxifizierte Konjugate) entstehen, die mittels Säulenchromatographie gereinigt werden. 20 - 500 mg des detoxifizierten Konjugates werden intravenös vor Verabreichung von NR-ML-05-S-C-PE oder NR-ML-05-S-C-DT (spezifische Toxinkonjugate) verabreicht. NR-ML-05 ist ein muriner monoklonaler Antikörper, der ein menschliches Tumor-assoziiertes 250 Kilodalton Glycoprotein/Proteoglycan Antigen erkennt.
Man erwartet von der Vorabverabreichung der detoxifizierten Konjugate, daß das spezifische Binden von Konjugat an normale nicht-spezifische Stellen reduziert wird (nicht-spezifisch besteht in diesem Beispiel aus zwei Teilen, viz, das nicht- spezifische Binden des irrelevanten Immunglobulinteils des Konjugates und das nicht-spezifische Binden des modifizierten Toxins). Das spezifische Toxinkonjugat wird dann intravenös in doppelten oder höheren Dosen injiziert als es ohne die Blokkierung von nicht-spezifischen Stellen mit detoxifizierten Konjugaten gegeben werden könnte. Zusätzlich wird nicht-konjugierter NR-2AD und nicht-konjugierter NR-ML-05 vor den spezifischen Toxinkonjugaten gegeben. Diese Verfahren erlauben die Verabreichung höherer Dosen wirkungsvoller Immunkonjugate zur verstärkten Lokalisierung und verbesserten Tumorverkleinerung.

V. Reduzierung von Antiglobulinantwort, die gegen einen spezifischen Antikörper gerichtet ist.

Die Wirkung von gleichzeitiger Verabreichung eines irrelevanten monoklonalen Antikörpers (NR-2AD) auf nachfolgende Antiglobulinentwicklung gegen einen spezifischen MAB (9.2.27) wurde im Zusammenhang mit einem Versuch zur diagnostischen Abbildung bewertet. 16 Patienten mit metastatischem maligenen Melanom erhielten Dosen von 1 bis 25 mg Tc-99m-radioaktiv markierten 9.2.27 monoklonalen Antikörper oder Fragmenten davon, wobei Dosen von 7,5 bis 9 mg nicht radioaktiv markiertem 9.2.27 oder Fragmenten davon 5 Minuten vorausgingen. Folglich erhielten die Patienten eine Gesamtdosis von 10 mg des 9.2.27 Antikörpers und seiner Fragmente. Eine Stunde vor Verabreichung des spezifischen Antikörpers wurde 11 der 16 Patienten 50 mg Dosen eines nicht radioaktiv markierten intakten irrelevanten Antikörpers (NR-2AD) verabreicht.
Der serologische Beweis für eine Antiglobulinantwort wurde mittels eines enzymgekoppelten Festphasen-Immunoassay (ELISA) unter Verwendung entweder des Target-spezifischen (9.2.27) oder des irrelevanten (NR-2AD) Antikörpers als Fangantigen beurteilt. Serumproben wurden von Zeitpunkten, die von zwei Wochen bis mehr als 6 Monate nach der Behandlung reichten, beurteilt. 6 der 11 beurteilten Patienten, die NR-2AD erhielten, erbrachten den Beweis einer Antiglobulinantwort gegen den irrelevanten NR-2AD Antikörper, die stärker war als jene, die im oberen 95. Perzentil von 60 gesunden Kontrollen erhalten wurde. In derselben Gruppe von 11 Patienten zeigte nur einer eine Antiglobulinantwort gegen den Target-spezifischen 9.2.27 Antikörper oberhalb des 95. Perzentils der gesunden Kontrollpopulation.
Diese Daten zeigen, daß Vorabverabreichung eines 5-fachen Überschusses eines irrelevanten Antikörperpräparates, bei denjenigen Individuen, die eine Antiglobulinantwort entwickelten, zu einer Antiglobulinantwort führte, die eher auf den irrelevanten als den Target-spezifischen MAB gelenkt war.

VI. Wiederholte Verabreichung von Antikörper in Gegenwart von Antiglobulinen

Patient #8501.08 erhielt in dem Versuch zur Melanomabbildung mit 99mTc innerhalb eines Zeitraumes von einer Woche zwei Durchgänge zur Abbildung mit dem Melanom-spezifischen Antikörper 9.2.27 und dem irrelevanten Antikörper NR-2AD. Der Patient kam nach 8 Monaten wieder und wurde erneut mit dem Melanomspezifischen Antikörper NR-ML-05 und dem Antikörper NR-2AD abgebildet. Zu diesem Zeitpunkt hatte der Patient eine 19-fache Erhöhung des gegen den Antikörper NR-2AD gerichteten Antiglobulins entwickelt. Nach Prämedikation mit 50 mg Diphenhydramin erhielt der Patient langsam über 60 Minuten 41 mg in normaler physiologischer Kochsalzlösung verdünnten NR-2AD. Danach erhielt er 10 mg NR-ML-05 kalt-spezifischen Antikörper, gefolgt von NR-ML-05 Fab markiert mit 99mTc. Der markierte Antikörper zeigte keinen Hinweis auf geänderte Biodistribution und targetierte erfolgreich bekannte subkutane Tumore und Lebertumore.
Im Gegensatz dazu zeigten Studien an normalen Meerschweinchen, die mit murinen monoklonalen Antikörpern immunisiert und mit entweder denselben oder einem irrelevanten 99mTc markierten Antikörper abgebildet worden waren, daß das Vorhandensein spezifischen Antiglobulins die Biodistribution von markiertem Antikörper veränderte. Verabreichung eines radioaktiv markierten Antikörpers, mit dem das Antiglobulin reagierte, führte zu einer Biodistribution der radioaktiven Markierung in Leber und Milz. Wenn das zirkulierende Antiglobulin nicht spezifisch für den radioaktiv markierten Antikörper war, dann war die Biodistribution nicht zu unterscheiden von der Biodistribution im nicht-immunisierten Tier.

Claims

1. Verwendung einer Zusammensetzung, die nicht-konjugierte irrelevante Antikörper oder Fragmente davon, die nicht an Zielzellen mittels ihrer Antigen-Erkennungsstellen binden, die aber in der Lage sind, an Nicht-Ziel- und Ziel- Zellen durch unspezifische Mechanismen zu binden, und/oder nicht-konjugierte zielspezifische Antikörper oder Fragmente davon umfaßt die an Nicht-Ziel-Zellen durch einen kreuzreaktiven, epitopspezlfischen Mechanismus binden können, zur Herstellung eines Medikaments, um die Zuführung von anschließend verabreichten pharmazeutisoh aktiven Antikörpern oder Fragmenten davon zu Zielzellen zu erhöhen.

2. Verwendung einer Zusammensetzung, die nicht konjugierte irrelevante Antikörper oder Fragmente davon umfaßt, die an Zielzellen nicht mittels ihrer Antigen-Erkennungsstellen binden, die aber in der Lage sind, an Nicht-Ziel- und Ziel-Zellen durch einen unspezifischen Mechanismus zu binden, zur Herstellung eines Medikaments, um in einem Säugetier die Produktion von Anti-Immunglubolin zu verringern, das gegen anschließend verabreichte pharmazeutisch aktive Antikörper oder Fragmente davon gerichtet ist.

3. Die Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 2, wobei die besagten Antikörperfragmente aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus F(ab)', F(ab')&sub2;, Fab, Fv und Mischungen hiervon besteht.

4. Die Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 2, wobei die besagten Zielzellen dadurch charakterisiert sind, daß sie tumorassoziiertes Antigen aufweisen.

5. Die Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 2, wobei die Antikörper monoklonale Antikörper einschließen.

6. Die Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 2, wobei die Antikörper polyklonale Antikörper einschließen.

7. Die Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 2, wobei die pharmazeutisch aktiven Antikörper oder Fragmente davon an ein Zytotoxin konjugiert sind.

8. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutisch aktiven Antikörper oder Fragmente davon an ein Radionuklid konjugiert sind.

9. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutisch aktiven Antikörper oder Fragmente davon an ein die biologische Antwort modifizierendes Agens gekoppelt sind.

10. Die Verwendung nach Anspruch 2, wobei besagte irrelevanten Antikörper an ein detoxifiziertes Zytotoxin oder an ein die biologische Antwort modifizierendes Agens gekoppelt sind.

11. eine Zusammensetzung, die drei Komponenten umfaßt, wobei die erste ein nicht-konjugierter irrelevanter Antikörper ist, der nicht an die Zielzellen mittels seiner Antigen-Erkennungsstellen bindet, aber in der Lage ist, durch unspezifische Mechanismen an Nicht-Ziel- und Ziel-Zellen zu binden, die zweite ein nicht markierter spezifischer Antikörper oder ein Fragment davon ist, der an ein melanomassoziiertes Antigen bindet, und die dritte ein markierter spezifischer Antikörper oder ein Fragment davon ist, der an das identische Epitop des melanomassoziierten Antigens bindet, wie der nicht markierte spezifische Antikörper, zur gleichzeitigen, getrennten oder aufeinanderfolgenden Verwendung für das Targeting von Melanomen in Menschen.

12. Die Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der Antikörper oder das Fragment davon, der an das melanomassoziierte Antigen bindet, das 250 Kd. Glycoprotein/Proteoglycan erkennt.

13. Die Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Antigen- Bindungsregion des Antikörpers oder des Fragmentes davon aus einer Klasse ausgewählt ist, die die Antigen-Bindungsregion von 9.2.27 und Klonen, Chimären und Derivaten davon beinhaltet.

14. Die Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Antigen- Bindungsregion des Antikörpers oder Fragments davon das melanomassoziierte GD&sub3;-Glycolipid Antigen erkennt.

15. Die Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Antigen- Bindungsregion des Antikörpers oder Fragments davon das melanomassoziierte p97 Antigen erkennt.

16. Verwendung einer Zusammensetzung, die drei Komponenten umfaßt zur gleichzeitigen, getrennten oder aufeinanderfolgenden Verwendung, wobei die erste ein nicht-konjugierter Antikörper ist, der an die Zielzellen nicht mittels seiner Antigenerkennungsstellen bindet, aber in der Lage ist, an Nicht- Ziel- und Zielzellen durch unspezifische Mechanismen zu binden, der zweite ein nicht markierter spezifischer Antikörper oder ein Fragment davon ist, der an ein melanomassoziiertes Antigen bindet, und der dritte ein markierter spezifischer Antikörper oder ein Fragment davon ist, der an das identische Epitop des melanomassoziierten Antigens bindet wie der nicht markierte spezifische Antikörper, zur Herstellung eines Medikaments zum Targeting von Melanomen in Menschen.