DE3750571T2

DE3750571T2 - Herstellung von rekombinantem, menschlichem PSTI.

Info

Publication number: DE3750571T2
Application number: DE3750571T
Authority: DE
Inventors: Kenichi Matsubara; Michio Ogawa
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1986-10-14
Filing date: 1987-10-14
Publication date: 1995-03-30
Anticipated expiration: 2007-10-15
Also published as: JPH0616716B2; ATE111955T1; CA1340393C; AU597115B2; EP0267692B1; ES2064319T3; KR950010817B1; DE3750571D1; EP0267692A3; EP0267692A2; JPS6398397A; AU7976487A; KR880005264A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem sezerniertem Trypsin-Inhibitor aus dem Pankreas (nachstehend als menschlicher PSTI bezeichnet), insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem PSTI, bei dem man einen Wirt, Saccharomyces cerevisiae, mit einem Vektor transformiert, der ein menschlichen PSTI codierendes Gen trägt, und die erhaltene Transformante unter geeigneten Bedingungen züchtet.
Trypsin-Inhibitoren, die aus dem Pankreas stammen, werden in den pankreatischen sezernierten Trypsin-Inhibitor und den basischen pankreatischen Trypsin-Inhibitor unterteilt. Der erstere, PSTI, wird in Niere, Lunge, Milz, Leber und Gehirn und auch im Pankreas von Säugern gefunden. Der letztere kommt im Pankreas und anderen Organen von Wiederkäuern vor, aber nicht in anderen Säugern, einschließlich des Menschen.
Pubols et al., J. Biol. Chem. 249 (1974), 2235 und Freinstein et al., Eur. J. Biochem. 43 (1973), 569 trennten und reinigten unabhängig voneinander menschlichen PSTI aus menschlichem Pankreassaft. Greene et al., Meth. Enzymol. 45 (1976), 813 bestimmten die Primärstruktur des PSTI.
Menschlicher PSTI ist ein aus 56 Aminosäuren bestehendes Peptid mit einem Molekulargewicht von 6242. Die SH-Gruppen der Cysteine an den Positionen 9 und 38, 16 und 35 bzw. 24 und 56 bilden S-S-Brücken und das Peptid enthält keine freien SH-Gruppen. Die Aminosäuresequenz, die von Greene et al. (a. a. O.) bestimmt wurde, weicht geringfügig von der Sequenz ab, die von den gegenwärtigen Erfindern bestimmt wurde, indem die Positionen 21 und 29 in der ersteren jeweils Asparagin (Asn) und Asparaginsäure (Asp) darstellen, während sie, im Gegensatz dazu, in der letzteren Asparaginsäure und Asparagin darstellen.
Eddeland et al., Hoppe-Seyler's z. Physiol. Chem. 359 (1978), 671 und Kitahara et al., Biomed. J. 3 (1979), 1119 erstellten unabhängig voneinander ein Radioimmuntest-System, bei welchem als Antigen menschlicher PSTI aus Pankreassaft verwendet wird, wobei das System eine immunologische Messung von PSTI im Blut ermöglicht. Yamamoto et Aa., Biochem. Biophys. Res. Commun. 132 (1985), 659 bestimmten die Basensequenz eines Gens, das menschlichen PSTI codiert.
Die Autolyse bei akuter Pankreatitis wird durch die Wirkung von proteolytischen Enzymen verursacht. Eine kleine Menge Trypsin, welche aus unbekanntem Grund aktiviert wird, scheint eine kettenreaktionsartige Aktivierung von Trypsinogen und verwandten Zymogenen auszulösen. PSTI, welcher in pankreatischen Acinuszellen vorkommt, wird zusammen mit anderen pankreatischen Enzymen in den Pankreassaft sezerniert und hemmt die Aktivierung von Trypsin im Pankreasgang. Ein Teil des PSTI gelangt in den Blutstrom und bleibt hier als ein ausgeströmter ("escaped") Inhibitor (Cholecyst und Pancrea 2 (1982), 231).
Der PSTI-Spiegel im Blut variiert beträchtlich bei pankreatischen Erkrankungen, besonders bei akuten pankreatischen Erkrankungen. Die Verweildauer des hohen PSTI- Spiegels im Blut ist länger als die von Amylase. Die Schwankung des PSTI-Spiegels im Blut spiegelt deutlich die Größe des Schadens im Pankreas wieder, unabhängig von den Protease-Inhibitoren (Cholecyst und Pancrea 3 (1982), 383). Folglich erlaubt die Messung des PSTI-Spiegels im Blut die Diagnose von pankreatischen Erkrankungen und die Überwachung des Verlaufs der Erkrankung.
Dem kürzlichen Fortschritt in der Gentechnologie ist es zu verdanken, daß es einfacher geworden ist, große Mengen eines gewünschten Peptids zu erhalten, indem man ein das Peptid codierendes Gen in einen Vektor inseriert und einen bakteriellen Wirt, wie Escherichia coli, mit dem Vektor transformiert. Jedoch hat die Expression in Bakterien mehrere Nachteile. Zum Beispiel häuft sich das exprimierte Peptid in Bakterien innerhalb der Zelle an, was das Zellwachstum behindern oder die Peptidproduktion durch ein Rückkoppelungssystem unterdrücken kann, wenn es zu sehr angehäuft wird. Zusätzlich werden Peptide, die von kleiner Größe sind und in Bakterien exprimiert werden, oft durch bakterielle Peptidasen abgebaut. Des weiteren erfordert die Gewinnung des gewünschten Peptids das Sammeln und die Zerstörung der gezüchteten Zellen und die Trennung und Reinigung des Peptids aus der Kultur, die die zerstörten Zellen enthält. Die Kultur enthält verschiedene Bestandteile, die von den zerstörten Zellen stammen, wovon ein Teil toxisch ist, und deswegen ist es nicht einfach, das gewünschte Peptid aus der Kultur in reiner Form zu gewinnen.
In eukaryotischen Zellen werden sezernierte Proteine wie auch andere Proteine, die die Zellwand aufbauen, in der Form eines Vorläufer-Polypeptids synthetisiert, welches eine zusätzliche Aminosäuresequenz an einem Ende des Proteins enthält, das sogenannte "Signalpeptid", welches für das Protein notwendig ist, damit es durch die Zellmembran gelangen kann. Das Signalpeptid wird durch eine Peptidase, die in der Membran vorliegt, abgespalten, wenn der Vorläufer durch die Membran tritt, wobei ein aktives und funktionelles reifes Protein erhalten wird.
Es wurden Versuche unternommen, das vorstehend beschriebene sezernierende System für die Expression von gewünschten Proteinen anzuwenden, um die zuvor erwähnten Nachteile, die der Expression in prokaryotischen Zellen innewohnen, zu überwinden. Für diesen Zweck ist S. cerevisiae als ein bevorzugter Wirt bekannt und ist für die Expression von verschiedenen Peptiden verwendet worden. Vgl. zum Beispiel die japanischen Patentveröffentlichungen (Kokai) Nos.
Die Messung von PSTI im Radioimmuntest wird seit langem für die Diagnose von pankreatischen Erkrankungen und für die Beobachtung des Verlaufs der Erkrankung nach der Behandlung angewendet. Da menschlicher PSTI nur aus dem Pankreassaft erhältlich war, gab es einige Schwierigkeiten, eine gute Versorgung an PSTI zu gewährleisten.
Es wurde nun gefunden, daß eine beträchtliche Menge an menschlichem PSTI erhalten werden kann, wenn man das Gen, das menschlichen PSTI codiert, in einen Vektor inseriert, S. cerevisiae mit dem das Gen tragenden Vektor transformiert, und den Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen, die die Expression von menschlichem PSTI erlauben, züchtet.
Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren für die Gewinnung von menschlichem PSTI bereit, bei dem man S. cerevisiae mit einem Expressionsvektor transformiert, der ein menschlichen PSTI codierendes Gen trägt, und die erhaltene Transformante unter geeigneten Bedingungen züchtet, die die Expression und Sezernierung von menschlichem PSTI erlauben, die Kultur zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, und den sezernierten menschlichen PSTI aus dem Überstand gewinnt.
In den beigefügten Abbildungen:
Fig. 1 zeigt eine Basensequenz, die menschlichen PSTI codiert und eine davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
Fig. 2 zeigt eine Basensequenz, die menschlichen PSTI codiert und eine davon abgeleitete Aminosäuresequenz, die von einer Leadersequenz und einem nicht-codierenden 3'-Bereich begleitet werden.
Fig. 3 zeigt die Konstruktion des Plasmids pYI AM8, welches ein Gen trägt, das menschlichen PSTI codiert.
Die Basensequenz des natürlichen Gens, das menschlichen PSTI codiert, wurde bereits von Yamamoto et al. (a. a. O.) bestimmt. Folglich kann die DNA, die menschlichen PSTI codiert, chemisch synthetisiert werden, obwohl sie auch durch reverse Transkription von mRNA, die aus menschlichem Gewebe gemäß der Veröffentlichung von Yamamoto gewonnen wurde, erhältlich ist. Die DNA für menschlichen PSTI, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, kann eine DNA sein, die genau die gleiche Basensequenz hat, wie in Fig. 1 dargestellt oder ihre degenerierten Varianten, die die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz codieren.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Gen, das menschlichen PSTI codiert" und der Begriff "Gen für menschlichen PSTI" normalerweise das Strukturgen, welches menschlichen PSTI codiert, aber manchmal bezeichnet es eine längere DNA-Sequenz, welche einen Promotorbereich, einen ein Signalpeptid codierenden Bereich, einen Terminator und ein Polyadenylierungssignal sowie das Strukturgen umfaßt.
Der Vektor, in welchen das Gen für menschlichen PSTI inseriert werden soll, kann ausgewählt werden aus, aber ist nicht beschränkt auf solche, die üblicherweise für die Transformation von S. cerevisiae verwendet werden, wie YIp (z. B. YIp5, YIp32), pJDB2, YEp (z. B. YEp13), YRp (z. B. YRp7, YRp16), YCp (Ycp19), Cosmidvektoren (z. B. pYc1, pYc2), Vektoren, die von der 2 um DNA abstammen und ähnliche. Andere bekannte Expressionsvektoren können verwendet werden, wie pAM82, pAT77, YEp52, AH5, AH9, AH10, AH21, pGPD-2 und ähnliche.
Der Expressionsvektor für menschlichen PSTI wird so konstruiert, daß das Strukturgen stromabwärts eines geeigneten Promotors eingebaut werden kann. Wenn notwendig, werden ein Terminator und Polyadenylierungssignal stromabwärts des Strukturgens gleichzeitig inseriert. Als Promotor, Terminator und Polyadenylierungssignal können solche verwendet werden, die mit der Expression von Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Alkohol- Dehydrogenase, saurer Phosphatase, Isocytochrom C, Enzymen, assoziiert mit der Galactoseverwertung, und ähnlichen verbunden sind. Eine Kombination der oben genannten Bestandteile von verschiedenen Ursprüngen kann auch verwendet werden. Eine DNA, die ein geeignetes Signalpeptid codiert, muß mit dem Strukturgen verbunden werden. Die DNA, die das Signalpeptid codiert, kann ausgewählt werden aus, aber ist nicht begrenzt auf solche, die in genomischer DNA für den α- Faktor, a-Faktor, saure Phosphatase, Invertase oder ähnliche gefunden werden.
Wenn das Gen für menschlichen PSTI, das aus menschlichem Gewebe stammt, verwendet werden soll, ist es günstig, das Gen zu clonieren, so daß es ein ein Signalpeptid codierendes Gen, einen Terminator und, wenn notwendig, bin Polyadenylierungssignal enthalten kann, die alle mit dem Strukturgen für menschlichen PSTI verbunden sind. Das erhaltene Gen wird dann stromabwärts eines geeigneten Promotors in einen Expressionsvektor eingebracht, so daß man einen Vektor erhält, der in der Lage ist, menschlichen PSTI zu exprimieren. Wie zuvor festgestellt, kann das Strukturgen für menschlichen PSTI chemisch synthetisiert werden, da es relativ kurz in der Länge ist.
S. cerevisiae ist der bevorzugte Wirt für die Expression von menschlichem PSTI. [Beispiele von S. cerevisiae-Expression von menschlichem PSTI.] Beispiele von S. cerevisiae- Wirtstämmen sind unter anderem, Saccharomyces cerevisiae KM- 46 (ATCC No. 26923), H-42 (ATCC No. 26922), BH-64-1A (ATCC No. 28339) und ähnliche.
Exprimierter menschlicher PSTI kann in üblicher Weise aus der Kultur gereinigt werden, zum Beispiel durch Chromatographie, Affinitätschromatographie, Zentrifugation oder eine Kombination davon.
Das folgende ausführliche Beispiel dient zur Erläuterung.

Beispiel

A. Clonierung von cDNA' die menschlichen PSTI codiert

Gesamt-RNA wurde aus menschlichem Pankreas erhalten, welcher in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70ºC nach der Guanidinium-Phenol/Chloroform-Methode (Gene 28 (1984), 263-270) aufbewahrt worden war. Speicheldrüsen, Magen oder Leber können anstelle von Pankreas verwendet werden. Poly(A)-RNA wurde von der Gesamt-RNA durch wiederholte Oligo (dT) Cellulose-Säulenchromatographie getrennt. In Übereinstimmung mit der Methode von Schibler (Cell 15 (1978), 1495-1509) wurde doppelsträngige cDNA unter Verwendung von poly(A)-RNA hergestellt. Die erhaltene cDNA wurde gemäß der Lehre von Roychondhury et al. (Methods in Enzymology 65, 43-62) mit S1-Nuklease behandelt und dann mit dC unter Verwendung der terminalen Transferase verlängert. Die erhaltene DNA wurde mit pBR322 aneliert, welches mit dem Restriktionsenzym PstI gespalten und dann mit dG verlängert worden war. Das anelierte Gemisch wurde verwendet, um E. coli K12 HB101 nach der Methode von Dagert (Gene 6 (1979), 23-28) zu transformieren. Auf die Transformante wurde auf einer Tetracyclin enthaltenden Agarplatte selektiert und eine cDNA- Genbank daraus hergestellt.
Eine Reihe von Oligonucleotidsonden, jede aus 14 Basenpaaren bestehend, wurde nach der Phosphotriester-Methode (Nucleic Acids Research 10 (1982), 4467-4482), wie nachstehend gezeigt, auf der Grundlage der Kenntnis der Aminosäuresequenz von menschlichem PSTI (Methods Enzymology 45, 813-825) hergestellt. Sonde
Die hergestellten Oligonucleotide wurden nach Reinigung über HPLC mit ³²P am 5'-Ende unter Verwendung von T4- Polynucleotid-Kinase markiert und als Sonden für die Hybridisierung verwendet, wie nachstehend beschrieben.
Ungefähr 1800 Kolonien von der zuvor erwähnten cDNA-Genbank wurden auf einen Nylonfilter transferiert und die Filter wurden einem Hybridisierungsverfahren mit diesen Sonden unterworfen, wobei 9 positive Clone erhalten wurden. Ein Clon, welcher einen Teil der cDNA, die menschlichen PSTI codiert, zu enthalten schien, wurde durch Restriktionsenzym- Analyse ausgewählt und als pHT19 bezeichnet. Die cDNA, die in pHT19 inseriert war, wurde gereinigt und als eine zweite Sonde für ein weiteres Absuchen nach cDNA verwendet. Dies lieferte ein Plasmid, das ein cDNA-Insert von 431 bp trug, das als pHT112 bezeichnet wurde (Yamamoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 132 (1985), 605-612). Unter Verwendung der clonierten cDNA von pHTI112 wurde eine Basensequenz in vollständiger Länge des PSTI-Gens nach der M13 Methode (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 74 (1977), 560-564) bestimmt.

B. Konstruktion des Expressionsvektors

Plasmid pHTI112 (20 ug) wurde mit 20 Einheiten des Restriktionsenzyms StuI in 400 ul einer StuI-Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 7 mM 2- Mercäptoethanol, 0.01% Rinderserumalbumin) bei 37ºC für 60 Minuten gespalten. Nach der Reaktion wurde das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und dann mit Ethanol durch Zugabe von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 5.3 und 2.5 Volumina Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde unter leichtem Vakuum getrocknet, in Wasser gelöst und in der nachfolgenden Reaktion verwendet. Die Phenol/Chloroform-Extraktion und die Ethanol-Fällung wurden routinemäßig durchgeführt, wenn eine Enzymbehandlung in den folgenden Verfahren durchgeführt wurde.
Die erhaltene Plasmid-DNA wurde mit SalI-Linker verknüpft, welcher ein selbst-komplementäres Oligonucleotid mit der Sequenz pdGGTCGACC ist, um hieran eine SalI- Restriktionsstelle anzufügen, die für die Insertion der gewünschten DNA in die SaII-Stelle des Plasmids pUC9 im späteren Stadium hilfreich ist. Dazu wurden 2 mg des mit StuI gespaltenen pHTI112 mit 32 Picomolen des 5'-phosphorylierten synthetischen Oligonucleotids pdGGTCGACC unter Verwendung von 350 Einheiten T4 DNA-Ligase in 40 ul eines T4 DNA-Ligase- Puffers (66mM Tris-HCl, pH 7.4, 1.0 mM ATP, 66mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiotreit, 0.01% Rinderserumalbumin) bei 18ºC für 12 Stunden vereinigt. Das Gemisch wurde 10 Minuten auf 70ºC erhitzt, um die Ligase-Reaktion zu beenden, und für die Transformation von E. coli K12 HB101 verwendet, um die gewünschte Transformante zu erhalten.
Das erhaltene Plasmid (20 ug) wurde dann mit SaII gespalten. Für diesen Zweck wurde das Reaktionsgemisch mit folgenden Komponenten zu den angegebenen Konzentrationen versetzt, um SaII-Puffer zu erhalten:
10 mM Tris-HCl, pH 7.5
7 mM MgCl&sub2;
175 mM NaCl
0.2 mM EDTA
7 mM 2-Mercaptoethanol
0. 01% Rinderserumalbumin
Das Gemisch wurde mit 10 Einheiten SalI bei 37ºC für 60 Minuten behandelt. Die mit SalI gespaltene DNA wurde weiter mit PstI gespalten und das DNA-Fragment, welches das PSTI- Strukturgen und PstI- und SalI-cohäsive Enden enthält, wurde abgetrennt. Dazu wurden 20 ug der mit SalI gespaltenen DNA mit 32 Einheiten PstI in 200 ul PstI-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM Ammoniumsulfat, 0,01 Rinderserumalbumin) bei 37ºC für 60 Minuten behandelt. Das Gemisch wurde einer 5%igen Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Ethidiumbromid gefärbt, um das im Gel enthaltene gewünschte Fragment unter UV-Licht sichtbar zu machen. Das entsprechende Gelstück wurde ausgeschnitten und gewonnen und in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, das 1 mM EDTA enthielt, homogenisiert. Der Überstand wurde mit Ethanol behandelt, um das gewünschte DNA-Fragment zu erhalten. Das PstI-SalI- Fragment, das das PSTI-Strukturgen enthielt, wurde unter Verwendung der T4 DNA-Ligase in das PstI-SalI-gespaltene Plasmid pUC9 inseriert. Dazu wurden 0.1 ug des PstI-SalI- gespaltenen pUC9 bei 18ºC für 12 Stunden mit 0.5 ug des PstI- Sall-Fragments in Gegenwart von 350 Einheiten T4 DNA-Ligase in 30 ul T4 DNA-Ligasepuffer vereinigt. Das Gemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 nach der Methode von Mandel und Higa (J. Mol. Biol. 53 (1970), 154) zu transformieren. Auf die Transformante wurde auf Agarplatten, die Ampicillin enthielten, selektiert. Mehrere Ampicillin-resistente Kolonien wurden gewählt und die Plasmid-DNA abgetrennt. Die Anwesenheit des gewünschten Fragments wurde durch Analyse des Restriktionsspaltmusters bestätigt. Das erhaltene Plasmid wurde als pYI bezeichnet.
Das Plasmid pYI wurde mit PstI verdaut und der nichtcodierende 5'-Bereich des menschlichen PSTI-Gens wurde mit BAL 31-Nuclease entfernt. Der XhoI-Linker, der das selbstkomplementäre Oligonucleotid mit der Sequenz pdCCTCGAGG enthält, wurde an das gespaltene lineare Plasmid angehängt, um es mit XhoI-Restriktionsstellen zu versehen, was für die Insertion der cDNA in die XhoI-Stelle von pAM82 hilfreich ist.
Dazu wurde das Plasmid pYI mit PstI gespalten und das gespaltene pYI (3 ug) wurde mit 2.6 Einheiten BAL 31-Nuclease bei 30ºC für eine bis zehn Minuten in 75 ul BAL 1 Nucleasepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 12 mM CaCl&sub2;, 12 mM MgCl&sub2;, 1 mM EDTA, 0.6 M NaCl) behandelt. In ähnlicher Weise wie zuvor wurde der XhoI-Linker unter Verwendung der T4 DNA- Ligase an das mit BAL 31 gespaltene pYI ligiert. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 nach der Methode von Mandel und Higa zu transformieren. Auf die Transformanten wurde auf einer Agarplatte, die Ampicillin enthielt, selektiert, und die Plasmid-DNA wurde aus den transformierten Kolonien abgetrennt. Das Ausmaß der Nucleotiddeletion durch die BAL 31-Nuklease wurde durch die Bestimmung der Basensequenz nach der Dideoxy-Methode bestätigt, wobei M13 DNA-Sequenzprimer nach der Methode von Sanger (J. Mol. Biol. 143 (1980), 161-178) verwendet wurden. Ein Plasmid, bei welchem der nicht-codierende 5'-Bereich bis zu 25 bp stromaufwärts des ATG-Codons deletiert worden war, wurde für die nachfolgende Konstruktion ausgewählt.
Die ausgewählte Plasmid-DNA wurde mit XhoI und SalI gespalten und ein Fragment, das das PSTI-Strukturgen und XhoI- und SalI-cohäsive Enden enthielt, wurde abgetrennt. Dazu wurde die Plasmid-DNA (10 ug) mit 24 Einheiten XhoI bei 37ºC für 60 Minuten in 100 ml eines XhoI-Puffers (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 7 mM 2-Mercaptoethanol) behandelt. Die XhoI-gespaltene DNA wurde dann mit SalI verdaut und das erhaltene Gemisch wurde einer 5%igen Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterworfen, um das gewünschte DNA-Fragment zu erhalten.
Ein Expressionsvektor aus S. cerevisiae, pAM82 (Miyanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 80 (1983), 1-5, FERM-BP 313, umgewandelt von Bikoken No. 6668) wurde mit XhoI gespalten und in der Art, wie nachstehend beschrieben, mit dem XhoI-SalI-Restriktionsfragment, welches das PSTI- Strukturgen enthält, ligiert.
XhoI-gespaltenes pAM82 (0.5 ug) wurde mit dem XhoI-SaII- Fragment (2 ug) in Gegenwart von 350 Einheiten T4 DNA-Ligase bei 18ºC 12 Stunden in 30 ul T4 DNA-Ligasepuffer vereinigt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 nach der Methode von Mandel und Higa zu transformieren. Auf die Transformanten wurde auf Agarplatten, die Ampicillin enthielten, selektiert, und die Plasmid-DNA wurde von den transformierten Kolonien isoliert. Die Anwesenheit des gewünschten Fragments und die Orientierung des inserierten Fragments wurden aufgrund des Restriktionsspaltmusters bestimmt.

C. Expression und Reinigung von menschlichem PSTI

Isolierte Plasmid-DNA wurde verwendet, um S. cerevisiae gemäß der Lehre von Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. ins (1978), 1929-1933) zu transformieren. Auf die Transformanten wurde auf einer überschichteten Agarplatte, die Histidin enthielt, selektiert. Die erhaltene Leucinunabhängige Zelle, als pYIAM82/AH22 bezeichnet, wurde in den folgenden Experimenten verwendet.
Der Clon pYIAM82/AH22, von dem bestätigt worden war, daß er das Expressions-Plasmid enthält, trägt den PHO5-Promotor, welcher ein leichtes An- und Abschalten der Expression in Abhängigkeit von der Anwesenheit oder Abwesenheit von anorganischem Phosphat im Kulturmedium erlaubt (Nakao et al., Molec. Cell. Biol. 6 (1986), 2613-2623). Der vorstehend erhaltene Clon wurde in dem nachfolgenden Expressionsverfahren eingesetzt.
Die folgenden Experimente wurden im wesentlichen nach der Methode von Miyanohara durchgeführt (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 80 (1983), 1-5).

i) Herstellung des Kulturmediums

Burkholder-Minimalmedium, welches 1,5 g Kaliumphosphat/L enthält, und das Medium, welches kein Phosphat (1,5 g Kaliumchlorid/L) enthält, wurden verwendet. 250 ml einer 4- fach konzentrierten Stammlösung der Phosphat-enthaltenden Lösung (P+Medium) oder der Phosphat-freien Lösung (P-Medium), wie nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt, 1 ml einer Vitamin- Stammlösung, wie nachstehend in Tabelle 2 aufgeführt, 20 g Glucose und 2 g Asparagin wurden zusammen in genügend Wasser vereinigt, um ein Gesamtvolumen von einem Liter zu erhalten.
Nach Rühren wurden 50 mg Histidin-Hydrochlorid hinzugefügt. Durch Zugabe von 0.2N NaOH wurde das P+Medium auf einen pH- Wert von 6.0 und das P-Medium auf einen pH-Wert von 7.5 eingestellt. Das P+Medium und das P-Medium wurden bei 120ºC für 10 Minuten bzw. bei 10ºC für 10 Minuten autoklaviert.

Tabelle 1 4fach konzentrierte Stammlösung

P+ KH&sub2;PO&sub4; 6 g
P- KCl 6 g
MgCl&sub2;·7H&sub2; 0.2 g
CaCl&sub2;·2H&sub2; 0.32 g
0.05% KI 0. 8 ml
Metallverbindungen (x10&sup4;) (Tabelle 1')*
B, Mn, Zn, Cu 0.2 ml
Fe 0.2 ml
Mo 0.2 ml
Wasser q.l.
1000 ml
Das Gemisch wurde nicht autoklaviert

*Tabelle 1' Herstellung einer Stammlösung aus Metallverbindungen

H&sub3;BO&sub3; 30 mg
MnSO&sub4;·7H&sub2; 0.50 mg
ZnSO&sub4;·7H&sub2; 0.150 mg
CuSO&sub4;·5H&sub2; 0.20 mg
Steriles, destilliertes Wasser q.l.
50 ml
Na&sub2;MoO&sub4;·2H&sub2; 0.100 mg
Steriles, destilliertes Wasser q.l.
50 ml
FeCl&sub2;·6H&sub2; 0.125 mg
Steriles, destilliertes Wasser q.l.
50 ml
Die vorstehenden Lösungen wurden nicht autoklaviert.

Tabelle 2 Vitamin-Stammlösung

Vitamin B&sub1; 20 mg
Pyridoxin 20 mg
Nicotinsäure 20 mg
Calcium-Pantothenat 20 mg
Biotin 0.2 mg
Inosit 1 g
Wasser q.l.
100 ml
Die Lösung wurde durch Millipore-Filtration sterilisiert.
ii) Induktion der PSTI-Expression
Die Kolonien, die auf einer Platte gewachsen waren, wurden in 10 ml P+Medium überführt und unter Schütteln bei 30ºC für zwei Tage gezüchtet. Ein Teil der Kultur (0.2ml) wurde für die Züchtung in P-Medium verwendet, und der Rest wurde verschiedenen Analysen, wie nachstehend beschrieben, unterworfen.
Die vorstehende Kultur (0.2 ml) des P+Mediums wurde zu 10 ml P- Medium gegeben, welches 0.05 ml 2M Tris-HCl, pH 7.0 enthielt, und das Gemisch wurde bei 30ºC für zwei Tage gezüchtet und als P-Medium-Probe verwendet.

iii) Fraktionierung der Kultur und Bestimmung von PSTI

Gezüchtetes P+Medium und gezüchtetes P-Medium wurden nach dem Schema I, wie nachstehend beschrieben, fraktioniert. Jedes Medium wurde bei 1500·g für 5 Minuten zentrifugiert. Zellpräzipitate wurden gewonnen und der Überstand wurde als Sezernierungsfraktion aufbewahrt.
Zu den Zellpräzipitaten, die vorstehend erhalten wurden, wurde 1 ml eines Sphäroplasten-Puffers (1.2M Sorbit, 50 mM Phosphatpuffer, pH 7.2, 300-500 mg/ml Zymolyase (60,000 Einheiten, Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) und 14 mM 2- Mercaptoethanol), der 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), eines Protease-Inhibitors, enthielt, hinzugefügt und das erhaltene Gemisch wurde mit einem Vortexgerät (Scientific Industries Inc.) gemischt und bei 30ºC eine Stunde inkubiert. Die Zentrifugation des Gemisches bei 2500·g für 5 Minuten ergab Periplasma-Komponenten im Überstand und Sphäroplasten- Komponenten im Niederschlag.
Zu dem so erhaltenen Sphäroplasten-Niederschlag wurde 1 ml eines Lyse-Puffers (0.2% Triton, 10 mM Phosphat-Puffer, pH 7.2, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF) hinzugefügt und das Gemisch wurde mit einem Vortexgerät gemischt und für eine Stunde auf Eis reagieren gelassen, um die Lyse der Sphäroplasten zu bewirken. Die Zentrifugation des Lysats bei 15000·g für 20 Minuten ergab als Überstand einen Zellextrakt. Schema 1 Fraktionierung der S. cerevisiae-Kultur S. cerevisiae-Kultur Zentrifugation (2500·g, 5 min) Überstand (Sezernierte Fraktion) Niederschlag (Zellen) Sphäroplasten-Puffer (mit 1 mM PMSF) Mischen mit dem Vortexgerät (30ºC, 1 Std) Zentrifugation (2500·g, 5 min) Überstand (Periplasma-Schicht) Präzipitat (Sphäroplast) Lyse-Gemisch Mischen mit dem Vortexgerät (1 Std Stehen bei 0ºC) Zentrifugation (15000·g, 20 min) Überstand (Zellextrakt) Niederschlag
Die PSTI-Produktion wurde in einem Immuntest der sezernierten Fraktion, der Periplasma-Fraktion und der Zellextrakt- Fraktion gemessen. Tabelle 3, nachstehend, zeigt die Ergebnisse der Untersuchung.

Tabelle 3 PSTI-Gehalt in jeder Fraktion

PSTI-Gehalt (ng/ml)
Fraktionen
P-Medium P+Medium Sezernierte Fraktion 1619 0.7
Periplasma-Fraktion 596 8.1
Zellextrakt-Fraktion 321 0
Tabelle 3 zeigt, daß eine große Menge des produzierten PSTI extrazellulär sezerniert wird.

iv) Züchtung im großen Maßstab

Auf der Grundlage der vorstehenden Ergebnisse wurde die Züchtung im großen Maßstab durchgeführt (3L) und PSTI wurde in der Weise, wie nachstehend beschrieben, gewonnen und gereinigt.
Die Kolonie auf der Platte wurde verwendet, um 10 ml P+Medium anzuimpfen und bei 30ºC für 2 Tage unter Schütteln gezüchtet. Fünf ml der erhaltenen Kultur wurden zu 100 ml P+Medium gegeben und bei 30ºC für 2 Tage unter Schütteln hochgezogen. 60 ml der Kultur wurden zu 3L P-Medium gegeben und unter Schütteln bei 30ºC 2 Tage gezüchtet. Die Kultur wurde bei 7000·g 10 Minuten zentrifugiert, um die sezernierte Fraktion im Überstand zu erhalten.

v) Reinigung

Die sezernierte Fraktion (700 ml) wurde auf einen pH-Wert von 8.0 durch Zugabe von 1N Natriumhydroxid eingestellt und auf eine Rindertrypsin-CH-Sepharose 4B-Säule (1·3.2 cm) geladen. Nachdem die Säule erfolgreich mit 0.05M Tris-HCl, pH 8.0, welches 0.5M NaCl enthielt, und destilliertem Wasser gewaschen war, wurde PSTI mit 10 mM HCl eluiert. Das eluierte Produkt wurde lyophilisiert, wobei 0.69 mg gereinigter PSTI erhalten wurden.
Der erhaltene menschliche PSTI (12 ug) wurde in ein Testreaktionsgefäß (10x90 mm) gegeben und unter vermindertem Druck bei 110ºC 24 Stunden nach Zugabe von 50 ul 4M Methansulfonsäure, die 0.2% 3-(2-Aminoethyl)indol enthielt, hydrolysiert. Eine Aminosäureanalyse wurde unter Verwendung des Hitachi Model 835-Aminosäureanalysators durchgeführt. Die erhaltene Aminosäurezusammensetzung, die in Tabelle 4 wiedergegeben ist, stimmte vollkommen mit der von natürlichem menschlichem PSTI überein.
Die Sequenz der drei Aminosäurereste am N-Terminus wurde nach der Methode von Edman, welche eine Abänderung der Methode von Iwanaga (Eur. J. Biochem. 8 (1969), 189-199) ist, als Asp- Ser-Leu bestimmt. Die Sequenz des N-Terminus stimmte ebenfalls mit der von natürlichem menschlichem PSTI überein. Zusätzlich hemmte das erfindungsgemäße Produkt Rindertrypsinaktivität stöchiometrisch, d. h. im Verhältnis 1 : 1. Schließlich stimmte die Immunreaktivität des menschlichen PSTI der Erfindung mit dem Antikörper gegen natürlichen menschlichen PSTI (polyclonales Kaninchenantiserum) mit der von natürlichem PSTI überein, wenn verschieden verdünnte Proben verglichen wurden. Tabelle 4 Aminosäure gefunden theoretisch Asparaginsäure Threonin Serin Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin Cystin Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Lysin Histidin Tryptophan Arginin
Angesichts des vorstehenden beinhaltet die Erfindung einen rekombinanten menschlichen PSTI. Sie umfaßt auch ein Polypeptid, das die Aktivität von menschlichem PSTI und die in Fig. 1 gezeigte Sequenz hat und das im wesentlichen frei von anderen Peptiden ist, wobei das Polypeptid eine Leadersequenz haben kann. Die Erfindung schließt natürlich auch DNAs ein, die das zuvor beschriebene codieren, wobei allelischen Äquivalenten und der Degeneration des genetischen Codes voll Rechnung getragen wird.
Die Erfindung umfaßt weiterhin einen PSTI-Expressionsvektor für die Verwendung in Saccharomyces cerevisiae, der ein menschlichen PSTI codierendes Gen oder eine wie vorstehend beschriebene DNA-Sequenz trägt.
Ebenso wird allgemein durch die Erfindung die Verwendung von rekombinantem menschlichem PSTI in der in vitro-Diagnose oder Erkrankungsüberwachung bereitgestellt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem PSTI, bei dem man Saccharomyces cerevisiae mit einem Expressionsvektor transformiert, der ein menschliches PSTI-codierendes Gen trägt und, falls in dem Gen nicht enthalten, einen Signalpeptid-codierenden Bereich dafür, und die erhaltene Transformante unter geeigneten Bedingungen züchtet, die die Expression und Sezernierung von menschlichem PSTI gestatten, die Kultur zentrifugiert, um einen überstand zu erhalten, und das sezernierte menschliche PSTI aus dem überstand gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Gen die in Fig. 1 oder Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen abgebildete Aminosäuresequenz codiert, oder wobei das Gen der in Fig. 1 oder Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen abgebildeten Basensequenz entspricht.