DE3689191T2

DE3689191T2 - Gereinigtes protein mit angiogenischer wirkung und dessen herstellung.

Info

Publication number: DE3689191T2
Application number: DE86902741T
Authority: DE
Inventors: James Fett; Bert Vallee
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1985-04-17
Filing date: 1986-04-16
Publication date: 1994-03-10
Anticipated expiration: 2006-04-17
Also published as: US4727137A; DE3689191D1; EP0220241B1; CA1338453C; JPS62502544A; EP0220241A1; JPH0662677B2; WO1986006079A1; EP0220241A4

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Angiogenese-Faktoren und ihre Herstellung. Die Erfindung bezieht sich genauer auf ein neues angiogenes Protein und seine Herstellung aus Zellkultur- Medien.

Technischer Hintergrund

Angiogenese ist der Entwicklungsprozeß eines Blutgefäßsystems. Angiogenese ist essentiell für das Wachstum von festen Tumoren und ist eine Komponente des normalen Wundheilungs- und Wachstumsprozesses. Angiogenese scheint auch an der Pathophysiologie der Atherogenese, der Arthritis und der diabetischen Retinopathie beteiligt zu sein. Sie ist durch das gerichtete Wachstum von neuen Kapillaren auf einen spezifischen Stimulus hin gekennzeichnet. Dieses Wachstum wird hervorgerufen durch die Wanderung von Endothelzellen und kann unabhängig von mitotischen Teilungen der Endothelzellen vonstatten gehen.
Die molekularen Botenstoffe, die für den Prozeß der Angiogenese verantwortlich sind, wurden seit langem gesucht. Greenblatt und Shubik (J. Natl. Cancer Inst. 41 : 111-124, 1968) folgerten, daß eine tumor-induzierte Gefäßneubildung durch eine diffundierbare Substanz hervorgerufen wird. Seitdem wurden verschiedene lösliche Botenstoffe mit der Induktion der Gefäßneubildung in Verbindung gebracht, wie z. B. Prostaglandine (Auerbach, in Lymphokines, Pick and Landy, eds., 69-88, Academic Press, New York, 1981), menschliche Urokinase (Berman et al., Invest. Opthalm. Vis.
Sci. 22 : 191-199, 1982), Kupfer (Raju et al., J. Natl. Cancer Inst. 69 : 1183-1188, 1982) und verschiedene "angiogene Faktoren".
Angiogene Faktoren wurden aus Tumorzellen, Wundflüssigkeit (Banda et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 79 : 7773-7777, 1982; Banda et al., US-PS 4, 503,038) und Retinalzellen gewonnen (D'Amore, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3068- 3072, 1981). Angiogene Faktoren aus Tumorzellen wurden im allgemeinen wenig charakterisiert. Folkman et al. (J. E)m. Med. 133 : 275-288, 1971) isolierten einen angiogenen Faktor aus Zellen des Walker 256 Ascites-Tumors der Ratte. Der Faktor war für kapillare Endothelzellen mitogen und konnte durch RNase inaktiviert werden. Tuan et al. (Biochemistry 12: 3159-3165, 1973) fanden eine mitogene und angiogene Wirkung in den Nichthiston-Proteinen des Walker 256-Tumors. Die wirksame Fraktion war ein Gemisch aus Proteinen und Kohlenhydraten. Für verschiedene tierische und menschliche Tumore konnte gezeigt werden, daß sie einen oder mehrere angiogene Faktoren produzieren (Phillips und Kumar, Int. J. Cancer 23 : 82-88, 1979), aber die chemische Zusammensetzung des Faktors bzw. der Faktoren wurde nicht bestimmt. Auch bei einer Nicht-Protein Komponente des Walker 256-Tumors mit niedrigem Molekulargewicht konnte eine angiogene und mitogene Wirkung nachgewiesen werden (Weiss et al., Br. J. Cancer 40 : 493-496, 1979). Ein angiogener Faktor mit einem Molekulargewicht von 400-800 Dalton wurde von Fenselau et al. (J. Biol. Chem. 256: 9605-9611, 1981) bis zur Homogenität gereinigt, aber nicht näher charakterisiert. Für menschliche Lungentumor-Zellen konnte gezeigt werden, daß sie einen angiogenen Faktor sekretieren, der aus einem Träger mit hohem und einer aktiven Komponente mit niedrigem Molekulargewicht besteht. Die aktive Komponente ist wahrscheinlich kein Protein (Kumar et al., Int. J. Cancer 32 : 461-464, 1983). Vallee et al. (Experientia 41 : 1-15, 1985) haben angiogene Aktivität bei drei Fraktionen aus Walker 256 Tumoren gefunden. In der US-PS 4, 229 531 ist die Gewinnung eines angiogenen Faktors aus der menschlichen Adenokarzinom-Zellinie HT-29 beschrieben. Das Material wurde aber lediglich teilweise aufgereinigt und chemisch nicht charakterisiert.
Methodisch umfaßte die Isolierung von angiogenen Faktoren die Auftrennung durch HPLC (High Performance Liquid Chromatography; Banda et al., ibd.), die Lösungsmittel-Extraktion (Folkman et al., ibd.), die Chromatographie an Kieselgel (Fenselau et al., ibd.), an DEAE Cellulose (Weiss et al., ibd.) oder Sephadex (Tuan et al., ibd.) sowie die Affinitäts-Chromatographie (Weiss et al., ibd.).
Angiogenese-Faktoren spielen eine wichtige Rolle im Wundheilungsprozeß (Rettura et al., FASEB abstract #4309, 61st annual meeting, Chicago, 1977) und könnten in der Entwicklung von Untersuchungstests auf bösartige Tumore (Klagsburn et al., Cancer Res. 36: 110-114, 1976; Brehm et al., Science 195 : 880-881, 1977) Anwendung finden. Es wäre daher von Vorteil, eine homogene Präparation eines gut charakterisierten angiogenen Faktors in der Hand zu haben.

Die Erfindung

Die Erfindung betrifft im wesentlichen reine Proteine menschlichen Ursprungs mit angiogener Wirkung. Die Erfindung betrifft ferner ein im wesentlichen reines Protein mit angiogener Wirkung, das gekennzeichnet ist durch ein Molekulargewicht zwischen 12.500 und 17.500 Dalton (vorzugsweise zwischen 14.000 und 15.000 Dalton) und einen isoelektrischen Punkt größer als 9,5. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt das Protein aus der menschlichen Adenokarzinom-Zellinie HT-29 und es besitzt ein Molekulargewicht von ca. 14.193 Dalton, welches aus der Aminosäuren- Sequenz berechnet wurde. Das Protein hat keine mitogene Wirkung auf 3T3-Zellen, wie durch konventionelle Testverfahren bestimmt wurde.
Außerdem betrifft die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung, die ein im wesentlichen reines Protein mit angiogener Wirkung und einem Molekulargewicht zwischen 12.500 und 17.500 Dalton (vorzugsweise zwischen 14.000 und 15.000 Dalton) und einem isoelektrischen Punkt größer als 9,5 sowie eine pharmazeutisch akzeptable Trägersubstanz enthält.
Ferner betrifft die Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung, die ein im wesentlichen reines Protein mit angiogener Wirkung enthält, das gekennzeichnet ist durch ein Molekulargewicht zwischen 12.500 und 17.500 Dalton und einem isoelektrischen Punkt größer als 9,5.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines im wesentlichen reinen Proteins mit angiogener Wirkung aus einem konditionierten Zellkultur-Medium. Das Verfahren umfaßt folgende Schritte: (a) das Entfernen von Proteinen mit hohem Molekulargewicht aus dem Medium; (b) das Binden eines Teils des vorbehandelten Mediums an eine Kationenaustauscher-Säule; (c) die Elution des gebundenen Anteils aus dem Kationenaustauscher; (d) das Auftrennen (Fraktionieren) des Eluats durch HPLC; (e) das Sammeln der Fraktion, die das Protein enthält.
Andere Aspekte der Erfindung sind aus der Beschreibung und den angefügten Zeichnungen ersichtlich.

Erläuterung der Zeichnungen

Abbildung 1 stellt das HPLC-Profil des Eluats einer Carboxymethylcellulose-Säule dar. Das eluierte Material stammt aus der Auftrennung mittels Reversed Phase HPLC mit einem Gradienten aus Isopropanol/Acetonitril/Wasser (5 : 5 : 4 v/v/v) und 0,08% TFA. Im Test zeigten die Fraktionen C und D angiogene Wirkung.
Abbildung 2 zeigt die Aminosäuren-Sequenz des Angiogenins.

Beste Ausführungsform der Erfindung

Zunächst sollen einige Begriffe definiert werden, die im Folgenden häufig verwendet werden.
Angiogene Wirkung bzw. Aktivität ist die chemische Stimulierung der Entwicklung von Blutgefäßen im Gewebe. Sie ist generell verbunden mit diffundierbaren Substanzen, die von verschiedenen Zelltypen produziert werden. Angiogene Aktivität kann gekennzeichnet sein durch ein positives Resultat im Hühnerembryo-Chorioallantoismembran-Test (Knighton et al., Br. J. Cancer 35 : 347-356, 1977; auf den vollständigen Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichung wird hier Bezug genommen) und/oder durch ein positives Resultat im Hornhautimplantat-Test bei Kaninchen (Langer und Folkman, Nature 263 : 797-800, 1976; auf den vollständigen Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichung wird hier Bezug genommen).
Mitogene Aktivität ist die chemische Stimmulierung der Zellteilung. Sie ist durch die Stimmulierung des Einbaus von ³H-Thymidin in 3T3-Zellen gekennzeichnet (Klagsburn et al., Exp. Cell Res. 105 : 99-108, 1977; auf den vollständigen Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichung wird hier Bezug genommen).
Ribonuklease-Aktivität ist durch den Abbau langer RNA-Moleküle, wie 285 und 185 ribosomaler RNA, zu Molekülen mit niedrigerem Molekulargewicht gekennzeichnet.
Wie erwähnt, wurden bisher angiogene Faktoren aus verschiedenem Material isoliert. Diese Faktoren wurden jedoch weder bis zur Homogenität aufgereinigt noch wurden ihre chemische Zusammensetzung und ihre physikalischen Eigenschaften aufgeklärt. Durch ein neues, mehrstufiges Verfahren, das hier beschrieben wird, wurde ein Protein mit angiogener Wirkung entdeckt, das in Tumorzellen gebildet wird, ein Molekulargewicht zwischen 12.500 und 17.500 Dalton und einen isoelektrischen Punkt größer als 9,5 besitzt. Das angiogene Material, das man durch dieses Verfahren erhält, besteht, wie durch konventionelle Testverfahren bestimmt wurde, im wesentlichen aus einer einzigen homogenen Proteinkomponente, die sich für therapeutische und diagnostische Anwendungen eignet.
Das angiogene Protein der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt aus Tumorzellen gewonnen, obwohl bekannt ist, daß auch normale Zellen, wie z. B. Retinalzellen, angiogene Faktoren produzieren. Bevorzugt wird die menschliche Adenokarzinom-Zellinie HT-29 (Fogh und Trempe, in Human Tumor Cells In Vitro, Fogh, ed., 115-160, Plenum, New York, 1975). Isolate dieser Zellinie sind unter den Nummern ATCC HTB38 und ATCC CRL8905 hinterlegt. Die Zellen können nach bekannten Methoden kultiviert werden, z. B. als Monolayer in "Dulbecco's modified Eagle's-Medium" oder anderen brauchbaren Medien. Bevorzugt wird "Dulbecco's modified Eagle's-Medium", das mit 2 mM L-Glutamin und 5% hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum angereichert wird (=DME/5). Das Medium wird regelmäßig gewechselt und die Zellen werden nach bekannten Verfahren subkultiviert.
Nachdem die Zellen ein konfluentes Wachstum erreicht haben, werden sie bevorzugt in ein serumfreies Erhaltungsmedium überführt, was die Isolierung des oder der angiogenen Proteine wesentlich erleichtert. Ein bevorzugtes Erhaltungsmedium ist DME/5 ohne Serum aber mit 5 mM L- Glutamin.
Das Medium, in dem die Zellen kultiviert oder gehalten wurden, wird als konditioniertes Medium bezeichnet. Dieses konditionierte Medium wird filtriert, um Zellreste zu entfernen. Anschließend werden Proteine mit hohem Molekulargewicht (in der Regel größer als 50.000 Dalton) abgetrennt.
Bevorzugt wird dafür das Ansäuern des Mediums durch den Zusatz von Eisessig zu einer Konzentration von 5% (v/v) mit anschließender Zentrifugation. Vor den weiteren Reinigungsschritten kann es wünschenswert sein, das filtrierte und angesäuerte Medium zu konzentrieren.
Das filtrierte und vorbehandelte Medium wird dann an einem Kationenaustauscher -vorzugsweise Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose)- chromatographiert. Vor dem Auftragen wird das angesäuerte, konditionierte Medium lyophilisiert und in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 6,6 rekonstituiert. Der bzw. die angiogenen Faktoren binden unter diesen Bedingungen an den Austauscher und können vorzugsweise mit 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 6,6/1 M Natriumchlorid eluiert werden.
Das Eluat aus der Kationenaustauscher-Säule wird mittels Reversed Phase-HPLC weiter aufgetrennt. Dazu wird das Eluat lyophilisiert, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. 0,1% Trifluor-Essigsäure (TFA) in Wasser, rekonstituiert und auf die Säule aufgetragen. Eluiert wird mit einem Gradienten eines zweiten Lösungsmittels, vorzugsweise mit einem linearen Gradienten aus Isopropanol/Acetonitril/Wasser (5 : 5 : 4 v/v/v/) mit 0,08% TFA. Das eluierte Material aus der HPLC-Säule kann anschließend dialysiert, lyophilisiert und rekonstituiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das lyophilisierte Eluat aus der Kationenaustauscher-Säule in einem geeigneten Lösungsmittel, wie 0,01 M Tris pH 8,0, rekonstituiert und zunächst auf eine Kationenaustauscher-HPLC-Säule aufgetragen. Eluiert wird z. B. mit einem linearen Gradienten aus Natriumchlorid in 0,01 M Tris pH 8,0. Dieses zweite Eluat wird anschließend mittels Reversed Phase-HPLC - wie oben beschrieben - aufgetrennt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das rekonstituierte HPLC-Eluat mittels einer zweiten Kationenaustauscher-Säule chromatographisch weiter aufgereinigt. Bevorzugt wird als Austauscher CM-Cellulose unter den Bedingungen, wie sie oben beschrieben sind. Das eluierte Material wird lyophilisiert und in Wasser rekonstituiert.
Das rekonstituierte Eluat aus der HPLC-Säule bzw. aus der zweiten Kationenaustauscher-Säule wird anschließend auf biologische Aktivität getestet, um die Fraktion(en) mit angiogenen Faktoren zu identifizieren. Mehrere Tests auf angiogene Wirkung sind einschlägig bekannt, darunter der Hühnerembryo-Chorioallantoismembran-Test (Knighton et al., Br. J. Cancer 35 : 347-356, 1977) und der Hornhautimplantat- Test (Langer und Folkmann, Nature 263 : 797-800, 1976).
HT-29 Zellen als Ausgangsmaterial lieferten zwei aktive Fraktionen aus der HPLC-Säule. Eine Fraktion enthält hauptsächlich eine Proteinkomponente mit einem Molekulargewicht (Mr) von ca. 16.000 und in geringeren Mengen ein Protein mit einem Molekulargewicht (Mr) von ca. 14.000. Die zweite Fraktion enthält ausschließlich ein Protein mit einem Molekulargewicht (Mr) von ca. 14.000, das als Angiogenin bezeichnet wurde. Das Angiogenin besitzt einen isoelektrischen Punkt von größer als 9,5 und sein Molekulargewicht, das aus der Analyse der Aminosäuren-Sequenz bestimmt wurde, beträgt ca. 14.193 Dalton. Im Gegensatz zu den meisten kürzlich beschriebenen angiogenen Faktoren zeigt das Angiogenin in den konventionellen Tests keine mitogene Wirkung. Die Aminosäuren-Sequenz des Angiogenins wurde bestimmt. Die Sequenz weist 35% Homologie zur pancreatischen Ribonuklease auf. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß das Angiogenin eine hochspezifische Ribonuklease-Aktivität besitzt.
Es ist verständlich, daß auch andere Formen des Angiogenins vorkommen können, entweder aufgrund eines genetischen Polymorphismus oder durch eine in vivo Modifizierung des Proteins oder seines Vorläufermoleküls. Weiterhin können angiogene Proteine, wie sie diese Erfindung beschreibt, durch in vitro-Methoden modifiziert werden und trotzdem ihre angiogene Wirkung beibehalten (Vallee et al., ibd.). Aufgrund der Homologie zur Ribonuklease können z. B. die Disulfid-Brücken (zwischen Cys-26 und Cys-81, Cys-39 und Cys-92, Cys-57 und Cys-107) oder die Histidine an den Positionen 13 und 114 oder das Lysin an der Position 40 einzeln oder in Kombination chemisch modifiziert werden, um die biologische Aktivität des Moleküls zu verändern. Eine Erhöhung der biologischen Aktivität könnte eine niedrigere Dosierung erlauben. Ein Molekül mit verminderter oder mit gar keiner angiogenen Wirkung könnte - falls bestimmte strukturelle Merkmale erhalten bleiben - trotzdem noch an Rezeptoren der Endothelzellen oder anderer Zellen binden. Dieses veränderte Molekül würde damit einen Antagonisten zur Wirkung des natürlichen Angiogenins darstellen, da es den Wirkort des Angiogenins blockiert. Dies könnte in der Therapie von Krankheiten Anwendung finden, die im Zusammenhang mit der Angiogenese stehen. Solche modifizierten Formen des Angiogenins liegen ebenfalls im Bereich der Erfindung. Im Bereich der Erfindung liegen ferner Proteine mit geringer oder ohne angiogener Wirkung, die aber im wesentlichen die Sequenz der Abbildung 2 besitzen oder eine oder mehrere Modifikationen an folgenden Amino- Säurepositionen aufweisen: Cys-26; Cys-39; Cys-57; Cys-81; Cys-92; Cys-107; His-13; His-14; Lys-40.
Angiogene Proteine, die entsprechend dieser Erfindung hergestellt werden, können -in Verbindung mit einer geeigneten Trägersubstanz- verwendet werden, um therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen herzustellen. Die therapeutischen Zusammensetzungen können verwendet werden, um die Ausbildung eines Blutgefäßsystems in Säugern zu fördern. Sie können z. B. verwendet werden, um einen kollateralen Kreislauf nach einem Herzinfarkt zu induzieren oder um die Wundheilung zu fördern, z. B. an Nahtstellen oder an anderen Bereichen. Die therapeutische Zusammensetzung der Erfindung wird vorzugsweise intravenös verabreicht oder direkt auf die Wundstelle aufgetragen. Beispielsweise bei Meniskusverletzungen des Knies oder der Schulter, wie sie häufig bei Sportunfällen vorkommen, oder bei einer Osteoarthritis kann die Injektion eines angiogenen Proteins in die verletzte Stelle die Heilung des gezerrten oder traumatisierten Bindegewebs- und Knorpelmaterials fördern. Die effektive Dosierung wird den Bedingungen und dem behandelten Gewebe angepaßt. Angiogene Proteine können in der Diagnostik zum Test auf maligne Tumore angewendet werden. Hierbei wird entweder mit dem Protein getestet, ob Antikörper vorhanden sind, oder es werden mit dem Protein Antikörper für immundiagnostische Reagentien hergestellt. Eine diagnostische Zusammensetzung, die das Protein enthält, wird mit der biologischen Probe unter Bedingungen inkubiert, bei denen sich Antigen-Antikörperkomplexe ausbilden. Diese Komplexbildung (d. h. die Anwesenheit von Antikörpern in der Probe) wird anschließend nachgewiesen. Die Techniken für solche Tests sind einschlägig bekannt, z. B. der "Enzyme Linked Immunosorbent Assay" (ELISA; Voller et al., The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech Laboratories, Inc., 1979) oder der Western Blot-Test (vgl. z. B. Tobwin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76 : 4350, 1979). In ähnlicher Weise kann eine diagnostische Zusammensetzung, die einen Antikörper gegen ein angiogenes Protein enthält, zum Nachweis der Anwesenheit des Proteins in der Probe verwendet werden. Die angiogenen Proteine können auch verwendet werden, um Hemmstoffe gegen die Angiogenese zu entwickeln. Mit diesen Hemmstoffen können Funktionsstörungen behandelt werden, die durch die Angiogenese hervorgerufen werden.

EXPERIMENTELLER TEIL

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Sie sind nicht beschränkend aufzufassen.

Material und Methoden

CM-Cellulose (CM-52) war ein Produkt von Whatman Ltd. Alle Dialysen erfolgten in Schläuchen mit einem Molekulargewichts-Ausschluß von 6.000-8.000 (Spectra/Por). Entionisiertes, steriles Wasser stammte aus dem "Milli RO-20 reverse osmosis/MilliQ"-Wasserreinigungssystem (Millipore Corp., Bedford, MA). HPLC-taugliches Wasser stammte von J. T. Baker Chemical Co. Pepstatin A und Hühnereiweiß-Lysozym waren Produkte von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Acetonitril (J. T. Baker Chemical Co.) und Isopropanol (Millipore, Waters Associates) waren von HPLC-tauglicher Qualität.
Die Reagentien für die Sequenzierapparatur stammten von Beckman Instruments, Inc. und die Lösungsmittel für dieses Gerät waren von Burdick and Jackson Laboratories, Inc. Muskegon, MI.
Glasgeräte für die Proteinlösungen wurden stets mit Dimethyldichlorsilan (Sigma Chemical Co.) silikonisiert.
Angiogenese wurde nach dem Hühnerembryo-Chorioallantoismembran-Test (CAM) nach der Methode von Knighton et al., ibd., mit den früher beschriebenen Modifikationen (Vallee et al., Exoerientia 411 : 1-15, 1985) getestet. Negative oder positive [d. h. das Auftreten des typischen "Speichenrad- Musters" (Folkman, Cancer Res. 34 : 2109-2113, 1974)] Wirkungen wurden mikroskopisch nach 1, 2 und 3 Tagen ausgewertet und aufgezeichnet als die Anzahl der positiven angiogenen Wirkungen pro Anzahl der überlebenden Eier multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor. Die statistische Auswertung wurde anhand der Daten des zweiten Tages durchgeführt. Da nur "Alles-oder-Nichts"-Entscheidungen vorkommen, entspricht der Test Bernoulli-Versuchen und kann als Binomialverteilung (Kendall and Stuart, in The Advanced Theory of Statistics, Vol.I, 3rd ed., S. 120, Hafner, New York, 1969) analysiert werden. Die Häufigkeit von positiven Resultaten unter 1.834 Kontrollen beträgt 0,0676 (124 positive und 1.710 negative Resultate) mit einer Standardabweichung von 0,0059 (Kendall and Stuart, in The Advanced Theory of Statistics, Vol.II, 3rd ed., Hafner, New York, 1973). Dies ergibt eine obere und untere 0,1% Vertrauensgrenze von 0,0857 und 0,0495. Falls nicht anders angegeben, wurde die obere Vertrauensgrenze von 0,0857 angewendet als die Wahrscheinlichkeit, in einer Testgruppe von N Eiern ein positives Resultat zu erhalten. Diese Entscheidung erhöht zwar die Wahrscheinlichkeit, daß eine Probe fälschlicherweise als "inaktiv" eingestuft wird. Sie erniedrigt aber die Wahrscheinlichkeit, daß eine Probe fälschlicherweise als "aktiv" eingestuft wird. Tabellen der kumulativen Wahrscheinlichkeiten von positiven Resultaten für N=2 bis N=30 wurden angefertigt mit 0,0857 als der Wahrscheinlichkeit eines positiven Resultats. Die Testergebnisse wurden anhand dieser Tabellen interpretiert. Für Werte von N größer als 30 wurde die kumulative Verteilung anhand der "Unvollständigen Beta-Funktion" (Kendall and Stuart, 1969, ibd.) festgesetzt. Analoge Dosis/Wirkung-Kurven wurden angefertigt, indem die resultierenden Wahrscheinlichkeiten gegen das Gewicht der applizierten Probe pro Ei aufgetragen wurden. Solche Darstellungen können jedoch nicht unter quantitativen Gesichtspunkten interpretiert werden (d. h. daß eine 50%ige Wirkung aus einer definierten Dosis resultiert). Vielmehr-geben sie den Bereich an, in dem ein positives Resultat signifikant ist bzw. die untere Grenze, an der ein positives Resultat signifikant ist. Um als "aktiv" zu gelten, muß eine Probe ein Signifikanz-Niveau von ≤5% erreichen. Da sich die kumulativen Wahrscheinlichkeiten auf diskrete Ereignisse beziehen, sind sie selbst diskret. Daher dürfen Ungleichheiten nur im allgemeinen spezifiziert werden.
Nach einem etablierten Verfahren (Langner and Folkman, ibd.) wurde angiogene Wirkung auch in der Hornhaut von Kaninchen bewertet. Modifiziert wurde dieses Verfahren, indem als Implantat Methylcellulose anstelle von Elvax-Pellets verwendet wurde. Alle 5 Tage wurde mit einem Stereomikroskop untersucht, ob Blutgefäße aus dem Limbus der Hornhaut das implantierte Probenmaterial infiltrieren.
Kationenaustauscher-HPLC umfaßte eine Synchropak CM 300- Säule (250 · 4,1 mm; Synchrom,Inc.) mit einer Flußrate von 0,8 ml/min, die mit 20 mM Natriumphosphatlösung pH 7 äquilibriert worden war. Eluiert wurde mit einem linearen Gradienten von NaCl im oben genannten Puffer. Als Standards wurden Ribonuklease A (pI=9,5), Cytochrom C (pI=10,2) und Lysozym (pI=10,5) verwendet.
Die analytische Isoelektrofokussierung wurde mit einer "LKB 2117 multiphor unit" mit vorgeformten Platten (PAG-Platten, PH-Bereich 3,5-9,5; LKB) durchgeführt. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau nach den Angaben des Herstellers gefärbt. Ribonuklease A, Cytochrom C und Lysozym wurden als Standards verwendet.
Proteinkonzentrationen wurden nach der Farbstoffbindungs- Methode von Bradford (Anal. Biochem. 72 : 248-254, 1976) mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard durchgeführt.
Die Gelfiltrations-HPLC wurde mit einer "LKB Ultropac TSK- G3000SW"-Säule (300 · 7,5 mm) durchgeführt. Die Säule wurde mit PBS mit 6 M Guanidin-Hydrochlorid äquilibriert, die Flußrate betrug 0,5 ml/min. Die Absorption des Säulenefflux wurde bei einer Wellenlänge von 206 nm gemessen. BSA (Mr = 25.000), Lysozym (Mr = 14.400) und Insulin (Mr = 6.000) wurden als Standards verwendet. PBS=phosphat-gepufferte Kochsalzlösung.

Beispiel 1: Reinigung des Angiogenins

Zellen der menschlichen kolorektalen Adenokarzinom-Zellinie HT-29 (Fosh and Trempe, ibd.) wurden routinemäßig bei 37ºC als Monolayer-Kulturen in T-Gefäßen (Costar, Cambridge, MA) in einer angefeuchteten Atmosphäre mit einem CO&sub2;-Gehalt der Luft von 7,5% kultiviert. Als Medium wurde "Dulbecco's modified Eagles's-Medium" (M.A. Bioproducts, Walkersville, MD) verwendet, das 4,5 g/l Glukose, 50 mg/l Gentamycin und 500 mg/l Fungizon enthält (DME). Ergänzt wurde dieses Medium mit 2 mM L-Glutamin und 5% hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum (FBS) (DME/5). Das Medium wurde alle 2-3 Tage gewechselt und die Zellen wurden nach den Standardmethoden der Trypsinablösung subkultiviert.
Mit 1 · 108 Zellen aus der DME/5-Kultur wurden 1,5 Liter DME/5-Medium in einem Zellkultivator (Vanguard International, Inc., Neptune, NJ) angeimpft. Nachdem die Zellen sich festgesetzt hatten wurden sie bei 37ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre mit einem CO&sub2;-Gehalt der Luft von 7,5% kultiviert bis sie konfluent gewachsen waren. Dann wurde das DME/5-Medium ersetzt durch 1,5 Liter eines serumfreien Erhaltungsmediums, das sich aus DME ohne FBS aber mit 5 mM L-Glutamin zusammensetzte. Das Medium wurde alle 2-3 Tage gewechselt. Alle Medien, die nach dem siebten Tag gesammelt wurden, wurden nach dem unten beschriebenen Verfahren verarbeitet.
Zellreste aus dem serumfreien, konditionierten Medium wurden durch mehrere Filtrationen über Whatman 40-Filterpapier und Whatman 934-AH Glasmikrofaser-Filter entfernt. Dem Filtrat wurde Eisessig zu einer Konzentration von 5% (v/v) zugesetzt. Das angesäuerte, serumfreie, konditionierte Medium wurde mit Pepstatin A (5 mg/L) behandelt, eingefroren und bei -20ºC gelagert. Anschließend wurde es aufgetaut und über Whatman 934-AH Glasmikrofaser-Filter abfiltriert. Das Filtrat wurde dann 200fach konzentriert in einem Gerät des Typs "DC2 hollow fiber dialyzer/concentrator unit", das mit HP2 Hohlfaser-Filter mit einem Molekulargewichtsausschluß von 2.000 (Amicon Corp., Lexington, MA) ausgestattet war. Das Konzentrat wurde gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Das lyophilisierte, angesäuerte, serumfreie, konditionierte Medium wurde in 100 mM Natriumphosphat-Puffer pH 6,6 gelöst und über Nacht gegen diesen Puffer dialysiert. Die Lösung wurde abfiltriert und auf eine CM-Cellulosesäule, wie bei Fett et al. (Biochemistry 24 : 965-975, 1985) beschrieben, aufgetragen. Ein typisches Experiment umfaßte 6,3 mg Ausgangsprotein. 3,2 mg davon befanden sich in der Fraktion CM 1 (ungebundener Durchfluß), 2,3 mg befanden sich in der Fraktion CM 2 (gebunden und eluiert mit 1 M NaCl). Beide Fraktionen wurden ausgiebig gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Die Reinigung des angiogenen Materials aus der CM 2- Fraktion wurde über eine Reversed Phase HPLC an einem "Waters Associates liquid chromatography System" durchgeführt. Dieses System besteht aus einem Absorptionsdetektor (254 nm) des Typs 440, einem LKB 2138-Detektor (206 nm), zwei Systemen des Typs 6.000 für die Lösungsmittel-Zufuhr, einem automatischen Auftragssystem vom Typ WISP 710A und einem Datenmodul mit einer Kontrolleinrichtung für das System. Fraktioniert wurde bei Raumtemperatur mit einer Octadecylsilan-Synchropak RP-P-Säule (10 um Partikelgröße, 250 · 4,1 mm) (Synchrom Inc., Linden, IN) bei einer Flußrate von 1 ml/min. Der Säulenefflux wurde bei 206 nm und 254 nm gemessen. Vor der Fraktionierung wurde die lyophilisierte Präparation (CM 2) mit 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (Lösungsmittel A) (Mahoney and Hermodson, J. Biol. Chem. 255 : 11199-11203, 1980) rekonstituiert und mit der automatischen Probeninjektion aufgetragen. Eluiert wurde 120 min. lang mit einem Lösungsmittelgradienten, der in der Endkonzentration Isopropanol/Acetonitril/Wasser (5 : 5 : 4 v/v/v) und 0,08% TFA (Lösungsmittel C) enthält. Unter diesen Bedingungen eluierte Material mit angiogener Aktivität ca. 80 min nach der Probeninjektion (ca. 30% organische Gesamtkonzentration). Nach dieser ersten Elution wurden zusammengefaßte Fraktionen (Pools) gegen Wasser dialysiert, lyophilisiert und für die biologischen Analysen rekonstituiert. Chemische Analysen wurden direkt mit dem Säuleneluat durchgeführt.
Das Material von Pool C und D (s. Abb. 1), welches bei einer organischen Gesamtkonzentration von 29 bzw. 30% eluierte, wurde elektrophoretisch über ein 15% SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Gel und Elektrophorese waren im wesentlichen wie bei Lämmli (Nature 227 : 680-685, 1970) beschrieben. Jedoch wurde das Sammelgel weggelassen. Die Gele wurden mit einem käuflichen Kit (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) silbergefärbt. Pool D enthielt eine einzige Spezies mit einem augenscheinlichen Molekulargewicht von ca. 14.000. Diese Spezies wurde als Angiogenin bezeichnet. Pool C enthielt eine Hauptprotein-Komponente mit einem Molekulargewicht von ca. 16.000 und geringere Mengen eines Proteins mit einem Molekulargewicht von ca. 14.000. Die Ausbeute an Angiogenin in Pool D betrug ca. 0,5 ug/Liter konditioniertes Medium.
Analoge Dosis-Wirkung-Untersuchungen wurden mit den beiden aktiven Fraktionen im Hühnerembryo-CAM-Test durchgeführt. 5 ug von Pool C und D (plus 20 ug Lysozym als Träger) wurden über ein 15% SDS-Polyacrylamid-Gel (s. o.) aufgetrennt. Als Kontrolle enthielt eine Spur lediglich 20ug Lysozym. Nach der Elektrophorese wurde das Gel zweimal für jeweils 15 min mit 20% v/v Isopropanol in PBS gewaschen, um das SDS zu entfernen (Blank et al., Anal. Biochem. 120 : 267-275, 1982). Es folgten drei Waschschritte für jeweils 10 min mit sterilem Wasser, um das Isopropanol zu entfernen. Gelstückchen (2,5 mm) wurden für 72 Stunden in 200 ul 5 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7,0 mit 0,02% (w/v) BSA inkubiert und der Überstand wurde direkt im CAM-Test auf angiogene Aktivität getestet. Die enzymatisch bestimmte Effizienz dieser Extraktion betrug für Lysozym 20%. Das Angiogenin (Pool D) war reproduzierbar aktiv, 0,01% ≤ p ≤ 5% in Bereichen zwischen 290 ng/Ei und 0,5 ng/Ei (d. h. zwischen 20 pmol und 35 fmol/Ei). Eine größere Änderung in der Wirkung fand unter 1,4 ng/Ei statt.
Pool C zeigte zwar ebenfalls Aktivität, aber weniger als Pool D. So erreichte Pool C das Signifikanz-Niveau von ≤ 5% erst bei Konzentrationen über 40 ng/Ei. Diese Daten lassen darauf schließen, daß die angiogene Wirkung im Pool C auf die Proteinspezies mit dem Molekulargewicht von ca. 14.000 zurückzuführen ist, die in diesem Bereich nachgewiesen wurde.
Angiogenin induzierte ebenfalls das Wachstum von neuen Blutgefäßen, wenn es in eine Tasche der Kaninchenhornhaut implantiert wurde. Ein bemerkenswertes Wachstum von neuen Gefäßen aus dem Limbus in den Bereich des Implantats hinein konnte beobachtet werden. Ein Gefäßwachstum konnte in einem Kontrollexperiment mit äquimolaren Mengen Lysozym nicht festgestellt werden. Eine positive angiogene Wirkung in der Kaninchenhornhaut konnte reproduzierbar bei einer Dosis von ca. 50 ng (3,5 pmol) beobachtet werden.
Nach der Elektrophorese der Angiogenin/Lysozym-Mischung über ein 15% SDS-Acrylamidgel konnte angiogene Aktivität mit einem Signifikanz-Niveau von < 0,2% im CAM-Test aus Gelstückchen eluiert werden, die aus einem Bereich des Geles stammten, der einem Molekulargewicht von ca. 14.000 entspricht. Keine angiogene Aktivität (Signifikanz-Niveau > 50%) konnte aus Gelbereichen der benachbarten Kontrollspur mit Lysozym eluiert werden.
Angiogenin wurde auch auf Ribonuklease-Aktivität getestet. Das gereinigte Material (s. o.) wurde einem weiteren Reinigungsschritt über CM-Cellulose unterworfen, wie er bei Fett et al. (ibd.) beschrieben ist. Das gebundene Material wurde eluiert, lyophilisiert und in Wasser rekonstituiert. Aliguots des rekonstituierten Angiogenins wurden zu RNA aus HT-29 Zellen (isoliert nach der Methode von Chirgwin et al., Biochemistry 18 : 5294, 1979) in 30 mM Tris pH 7,5 und 30 mM NaCl gegeben. Der Ansatz wurde für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von ca. 4 Volumen einer Lösung aus 26 mM MOPS, 6,5 mM Natriumacetat, 1,3 mM EDTA, 65% Formamid und 8% Formaldehyd beendet. Die Proben wurden durch eine elektrophoretische Auftrennung über ein 1,1% Agarose-Gel nach der Methode von Lehrach et al. (Biochemistry 16: 4743, 1977) analysiert. Die RNA wurde durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Kontrollexperimente ohne Angiogenin enthielten zwei Haupt-RNA- Banden, die der 28S und der 18S ribosomalen RNA entsprechen. Bei steigenden Mengen von zugegebenem Angiogenin nahm der Anteil der 28S- und der 18S-Banden ab und der Anteil von RNA mit niedrigerem Molekulargewicht nahm zu. Zumindest eine neue, diskrete Bande wurde mit Angiogenin über einen längeren Zeitraum inkubiert. Diese Ergebnisse zeigen, daß Angiogenin eine Ribonuklease ist, welche die 28S und die 18S ribosomale RNA nicht sehr häufig (wahrscheinlich weniger als fünfmal) schneidet.
Ein Isolat der HT-29 Zellinie wurde bei der "American Type Culture Collection" unter der Nr. ATCC No. CRL8905 hinterlegt.

Beispiel 2: Chemische Charakterisierung des Angiogenins

Das Molekulargewicht von Angiogenin wurde sowohl durch die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese als auch durch die Gelfiltrations-HPLC in Anwesenheit von Guanidinhydrochlorid bestimmt. In beiden Fällen wurde ein Molekulargewicht von ca. 14.000 ermittelt. Für die Bestimmung der Aminosäuren- Zusammensetzung und der -Sequenz wurden die Proteine reduziert mit Tributylphosphin in 0,25 M Natriumbicarbonat in n-Propanol (50% in Wasser) und alkyliert mit 1,3-Propansulton (Sigma Chemical Co.) nach der Methode von Ruegg und Rudinger (Int. J. Pest. Prot. Res. 6 : 447-456, 1974). Die alkylierten Proben wurden entsalzt durch eine Chromatographie über eine I-125 HPLC-Säule (Waters Associates) in 17,9% (v/v) Acetonitril, 17,9% (v/v) Isopropanol, 0,1% (v/v) TFA in Wasser. Die Oxidation mit Perameisensäure wurde nach der Vorschrift von Moore (J. Biol. Chem. 238 : 235-237, 1963) durchgeführt. Die lyophilisierten Proben wurden für 20 Stunden unter vermindertem Druck bei 110ºC mit 6 N HCl und 0,1% Phenol hydrolysiert (Sanger und Thompson, Biochem. Biophys. Acta 71 : 468-471, 1963). Die Hydrolysate wurden unter vermindertem Druck bei 25-35ºC getrocknet und in Citrat-Puffer pH 2,2 gelöst. Die Aminosäurenzusammensetzung wurde mit Ninhydrin an einem "Durrum D-500 amino acid analyzer" bestimmt. Für die Quantifizierung wurde ein "Hewlett Packard 3390A integrator" verwendet.
Ein automatischer Edman-Abbau wurde mit 300-3.000 pmol Protein an einem "Beckman 890C sequencer" durchgeführt, und zwar mit 0,1 M Quadrol-Kopplungspuffer und dem Beckman-Programm 121078 wie es bei Fett et al. (ibd.) beschrieben ist. Die Carboxy-Termini wurden durch die Hydrazinolyse (18 Stunden, 80ºC unter vermindertem Druck) von 200 pmol Protein mit wasserfreiem Hydrazin (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) bestimmt (Akabori et al., Bull. Chem. Soc. Japan 25:214-218, 1952). Es folgte eine direkte Analyse der Hydrolysate nach der "Pico-Tag"-Methode (Waters Associates; Bidlingmeyer et al., J. Chromatographie 336 : 93-104, 1984).
Sechs Zyklen des Edman-Abbaus, durchgeführt entweder am nativen Protein oder am Perameisensäure-oxidierten Protein, ergaben keine freie Endgruppe. Nach der Hydrazinolyse wurde lediglich eine einzige carboxyterminale Aminosäure (Prolin) gefunden. Weiterhin wurden keine Untereinheiten mit niedrigerem Molekulargewicht gefunden, wenn das Angiogenin in einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Anwesenheit von 2-Mercaptoethanol untersucht wurde. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, daß das Angiogenin aus einer einzigen Polypeptidkette besteht. Sein Molekulargewicht - berechnet aus der Aminosäuren-Sequenz - beträgt ca. 14.400.
Die analytische Isoelektrofokussierung (IEF) und die Kationenaustauscher-HPLC zeigten, daß das Angiogenin ein extrem basisches Protein ist. Es wandert bei der IEF an die Front, was auf einen isoelektrischen Punkt von größer als 9,5 hindeutet. Weiterhin eluiert das Angiogenin in der Kationenaustauscher-HPLC nach dem Lysozym (pI = 10,5). Dieses Verhalten stimmt mit seinen Bindungseigenschaften an der CM- Cellulose unter den verwendeten Bedingungen überein. Es läßt vermuten, daß neben einer großen Anzahl von basischen Aminosäuren in der Sequenz des Angiogenins viele Carboxylgruppen der Seitenkette Amidgruppen tragen.

Isolierung von Peptiden aus einer Trypsinspaltung

12-66 ug Angiogenin wurden mit 2-3 Gewichtsprozent an HPLC- gereinigtem Trypsin (Titani et al., Anal. Biochem. 123: 408-412, 1982) in 100 ul 0,1 M N-Ethylmorpholin-Puffer pH 8,5 bei 35ºC für 18-20 Stunden unter Stickstoff gespalten. Die größeren Peptide der Trypsinspaltung wurden durch eine Chromatographie über eine "Altex Ultrapore C3"-Säule (Beckman Instruments, Inc.) isoliert. Der Durchfluß wurde über eine "Altex Ultrasphere IP"-Säule (Beckman Instruments, Inc.) chromatographisch aufgetrennt. Hierzu wurde entweder ein flüchtiger (0,1% TFA) oder ein nicht-flüchtiger (0,1 M Perchlorat-0,1% Phosphat, pH 2,5) Puffer verwendet (Meek, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77 : 1632-1636, 1980). Im letzteren Fall mußten die Peptide vor der Sequenzierung entsalzt werden durch eine Chromatographie über eine "IBM 5-uM C18"-Säule mit 0,1% HFBA und Acetonitril als Lösungsmittel. Peptid NT 1 wurde entsalzt durch Reversed Phase Chromatographie an einer C18 Säule mit 0,1% TFA und Acetonitril als Lösungsmittel. Die Aminosäurenzusammensetzung der Peptide wurde wie oben beschrieben bestimmt.

Sequenzen der Peptide aus der Trypsinspaltung

In der Tab. I sind die aus dem Edman-Abbau bestimmten Sequenzen der einzelnen Peptide dargestellt. Die Peptide wurden nach den oben beschriebenen Verfahren isoliert. Eindeutige Sequenzen wurden für die Peptide NT 3a, NT 4a, NT 4b, NT 5, NT 6, NT 7, NT 8 und NT 12 gefunden. Diese Peptide wurden daher als rein betrachtet. Die Analyse des Peptids NT (1 + 13) ergab die Sequenz Arg-Arg, was in Verbindung mit seiner Zusammensetzung darauf hindeutet, daß NT (1 + 13) eine Mischung ist aus Arg-Arg und dem N-blockierten aminoterminalen Peptid NT 1. Entsalztes NT 1-Peptid wurde durch FAB-Massenspektrometrie untersucht, was einen MH&spplus; von 602 ergab. Dies läßt auf die Anwesenheit von < Glu (Pyroglutaminsäure), Asp, Asn, Ser und Arg schließen. Das Peptid NT 2 ergab im ersten Abbau-Zyklus Arg und nichts danach. Seine Zusammensetzung (Arg und Pro) und die Tatsache, daß die carboxyterminale Aminosäure des Angiogenin Pro ist, identifizieren die Sequenz von NT 2 als Arg-Pro und seine Lokalisierung am Carboxylterminus des Angiogenin. Das Peptid NT 3b ergab im ersten Zyklus Arg und Ile und danach nur noch Ser und Lys. NT 3b besteht daher wahrscheinlich aus dem Tripeptid Ile-Ser-Lys plus freiem Arg. Für NT 9 und NT 10 wurde gefunden, daß beide eine Mischung aus zwei Peptiden darstellen, die als NT 9' plus NT 9'' bzw. als NT 10' plus NT 10'' bezeichnet wurden. Die Peptide werden wahrscheinlich jeweils durch eine Disulfidbrücke zusammengehalten. Auch NT 11 ist eine Mischung. In diesem Fall zeigte der Vergleich seiner Sequenz mit denen von NT 4b und NT 12, daß NT 11 aus diesen zwei Peptiden besteht, die durch eine Disulfidbrücke verbunden sind.
Zusammengenommen machen diese Peptide annähernd die gesamte Aminosäurenzusammensetzung des Angiogenin aus.
Eine Spaltung von 700 pmol reduziertem und S-sulfopropyliertem Angiogenin mit Thermolysin ermöglichte die Isolierung von sechs reinen Polypeptiden, deren Sequenz bestimmt wurde (Tab. II). Drei der Sequenzen enthielten Überlappungsbereiche zu den Peptiden aus der Trypsinspaltung.

Zusammenfügen der Peptide aus der Trypsinspaltung

Der Edman-Abbau ergab, daß der Aminoterminus des Angiogenin blockiert ist. Aus der Massenspektometrie war bekannt, daß NT 1 < Glu enthält und < Glu damit die N-terminale Aminosäure sein muß. Deshalb wurden 140 ug intaktes Angiogenin mit Pyroglutaminase verdaut, um den Aminoterminus für den Edman-Abbau zugänglich zu machen. Das Produkt wurde über eine Reversed Phase-HPLC isoliert und 40 Abbau-Zyklen unterworfen. Wie erwartet, war der Aminoterminus nicht länger blockiert. 35 der ersten 36 Abbau-Zyklen wurden identifiziert und ergaben die Sequenz von NT 1, der sich die Sequenz von NT 7 anschloß. Auf diese Sequenz folgte die der NT 9'-Komponente aus NT 9 und ein Teil der Sequenz der NT 10'-Komponente aus NT 10. Damit war die N-terminale Sequenz des Angiogenin festgelegt. Der Rest der Sequenz von NT 10' stammte aus der Analyse von NT 10. Zusätzlich wurde NT 10' über HPLC nach einer Reduktion und Alkylierung von NT 10 isoliert. NT 10' hatte folgende Zusammensetzung: CySCM 0,46 (1), Glu 0,4, Ser 1,08 (1), Gly 1,39 (1), Arg 0,23, Thr 1,13 (1), Ala 0,23, Pro 1,27 (1), Leu 0,95 (1), Lys 0,80 (1), was mit der festgesetzten Sequenz übereinstimmt. Das Peptid NT 13 und vielleicht auch das freie Arg aus NT 3b würden in die Positionen 32 und 33 in der Gesamtsequenz des Angiogenin passen.
Die aminoterminale Sequenz des Angiogenin zeigte, daß sich das einzige Methionin des Proteins an der Position 30 befindet. Eine Bromcyan-Spaltung des Proteins an dieser Stelle erlaubte die Erweiterung der Sequenz um sieben der nächsten acht Aminosäuren, die sich an das Met-30 anschließen.
Der Überlappungsbereich für die Peptide NT 3a und NT 4b in der Reihenfolge 3a-4b wurde durch das Peptid L 6 (Ile, Lys und Ala) aus der Thermolysinspaltung geliefert. Wegen der Thermolysin-Spezifität (Feder und Schuck, Biochemistry 9: 2784-2791, 1970) muß es die Sequenz Ile-Lys-Ala besitzen. Die Themolysin-Spezifität bestimmt auch, daß das Ala aus L 6 kein Bestandteil von NT 6 sein kann. Diese Lokalisierung von L 6 stimmt auch mit der Sequenz von L 4 überein. Seine Sequenz identifiziert L 4 als die Erweiterung von Phe im Peptid NT 8 über den Lys-Arg- Carboxylterminus zum Ser des Peptids NT 3a. Dies legt die Anordnung der Peptide in der Reihenfolge NT 8-3a-4b fest.
Die Existenz von zwei Asn-Gly-Sequenzen im Angiogenin (in den Peptiden NT 4a bzw. NT 12) bot die Möglichkeit einer chemischen Spaltung der Polypeptidkette an diesen zwei Positionen mit der Hydroxylamin-Methode von Bornstein (1970). Die Reaktionsprodukte der Hydroxylamin-Spaltung wurde über eine Molekulargewichtssieb-HPLC entsalzt und die Proteinfraktion direkt sequenziert. Eine eindeutige Sequenz aus 27 von 33 Aminosäuren wurde erhalten, welche die Anordnung der Peptide in der Reihenfolge NT 4a-5-3b-9''-10'' (Abb. 4c) festlegte und damit einen Block von 35 Aminosäuren in der Sequenz lieferte. Die salzhaltige Fraktion der Hydroxylamin-Spaltung wurde über eine "Reversed Phase"-Chromatographie aufgetrennt. Ein reines Peptid, Hydroxylamin-2, wurde erhalten. Seine Aminosäurenzusammenstzung lautete: Asp 1,17 (1), Glu 1,12 (1), Ser 0,99 (1), Gly 1,10 (1), His 0,84 (1), Arg 2,05 (2), Pro 2,11 (2), Tyr 0,22, Val 0,97 (1), Ile 0,81 (1), Leu 1,77 (2) und Phe 1,02 (1). Diese Aminosäuren lieferten den Überlappungsbereich, der die Anordnung der Peptide in der Reihenfolge NT 12-2 und NT 2 zuließ.
Das Peptid L 5 (Phe, Arg, Asx) könnte sich aus zwei verschiedenen Kombinationen von Peptiden aus der Trypsinspaltung zusammensetzen: aus der aminoterminalen Aminosäure Asx der Peptide NT 8 oder NT 12 und der carboxyterminalen Sequenz Phe-Arg des Peptids NT 6. Die wirkliche Kombination NT 6-12 wurde aus der Homologie zu verschiedenen pankreatischen Ribonukleasen hergeleitet, wie sie ein Sequenzvergleich dieser Region mit Proteinsequenzen der Datenbank der National Biomedical Research Foundation zeigte. Die anderen drei Peptide aus der Thermolysinspaltung (L 1, L 2 und L 3) entsprechen den Sequenzen, wie sie in den Peptiden NT 12, NT 9'' und NT 7 ermittelt wurden.
Die Zuordnung von NT 2 als das carboxyterminale Peptid stimmt mit dem Befund überein, daß Prolin die carboxyterminale Aminosäure des Angiogenin ist.
Die Analyse der Aminosäuresequenz des Angiogenin (gezeigt in der Abb. 2) ergab, daß das Angiogenin ein Molekulargewicht von 14.193 Dalton besitzt.
Obwohl hier spezifische Ausführungen der Erfindung zum Zwecke der Erläuterung beschrieben wurden, sollte aus dem Vorangegangenen deutlich geworden sein, daß verschiedene Modifikationen gemacht werden können, die im Sinne und im Umfang der Erfindung liegen. Dementsprechend ist die Erfindung lediglich durch die angefügten Patentansprüche limitiert. Aminosäuren-Sequenzen aus einem Edman-Microabbau von Peptiden des Angiogenins aus einer Trypsin-Spaltung Peptid Ergebnis aus dem Sequenziergerät a Die etablierte Sequenz ist angegeben. Die Ausbeute einer Aminosäure bei jedem Abbauzyklus ist unter der Aminosäure in pmol angegeben. Die Klammern geben an, daß zwei Aminosäuren nach einem gegebenen Abbauzyklus gefunden wurden. Aminosäurenzusammensetzung einiger Peptide aus der Thermolysin-Spaltung des Angiogenins Peptid a Die Werte für Asp und Glu sind zu niedrig (um 30-50% bzw. um 5-20%), da die Anwesenheit von Salz die PITC-Reaktion beeinträchtigte. Sequenz-Position

Claims

Anspruch für die Vertragsstaaten BE, CH, DE, FR, GB, IT, LU, NL, SE

1. Protein mit angiogener Wirkung und folgender Aminosäurensequenz:

Anspruch für den Vertragsstaat AT

1. Verfahren zur Herstellung eines im wesentlichen reinen Proteins mit angiogener Wirkung und folgender Aminosäuren-Sequenz:

aus einem konditionierten Zellkultur-Medium, das folgende Schritte umfaßt:

Behandlung des Mediums, um Proteine mit hohem Molekulargewicht zu entfernen;

Binden eines Anteils des vorbehandelten Mediums an eine Kationenaustauscher-Matrix;

Elution des gebundenen Anteils aus der Matrix zur Herstellung eines Eluats;

Fraktionieren des Eluats durch "High Performance Liquid Chromatography";

Sammeln der Fraktion, die das Protein enthält.