DE3689084T2

DE3689084T2 - Verfahren zur in vitro-Diagnose von bösartigen Zellen aus dem Verdauungstrakt.

Info

Publication number: DE3689084T2
Application number: DE86400957T
Authority: DE
Inventors: Monique Arpin; Brigitte Dudouet; Alphonse Garcia; Daniel Louvard; Eric Pringault; Sylvie Robine
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Pasteur
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Pasteur
Priority date: 1985-05-02
Filing date: 1986-04-30
Publication date: 1994-04-28
Anticipated expiration: 2006-05-01
Also published as: DE3689084D1; ATE156136T1; EP0206849A3; EP0206849A2; JP2698326B2; EP0206849B1; EP0502553B1; JPH07188300A; JPH08208699A; JPH11123091A; WO1986006494A3; EP0502553A3; EP0502553A2; DE3650641T2; WO1986006494A2; DE3650641D1; JPH1066574A; JP2698337B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel zur in vitro-Diagnose des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins beim Menschen von vermehrten bösartigen Zellen ausgehend von Tumorzellen des Verdauungstrakts und insbesondere von solchen des Adenokarzinom-Typs. Diese Mittel betreffen sowohl in vitro- Diagnoseverfahren als auch Materialien, die bei diesen Verfahren eingesetzt werden können, insbesondere DNA-Fragmente, die als Sonden verwendet werden können, oder auch vorzugsweise monoklonale Antikörper, die gegen Human-Villin gerichtet sind.
Die Erfindung erstreckt sich weiterhin auch auf die verschiedenartigen Anwendungen dieser monoklonalen Antikörper, beispielsweise bei der Reinigung von Human-Villin, ausgehend von es enthaltenden Zellextrakten. Diesbezüglich betrifft die vorliegende Erfindung auch das gereinigte Human-Villin selbst.
Es wurde bereits vorgeschlagen, beim Nachweis als spezifische Marker Strukturproteine zur Identifizierung bestimmter Typen von höheren eukariotischen Zellen und zur Untersuchung des Ablaufs der verschiedenen Stufen ihrer Entwicklung, insbesondere bei ihrer Differenzierung, zu verwenden. Als Beispiel für bekannte Marker kann man Fadenproteine erwähnen, beispielsweise Vimentin, Keratine oder Neuro-Fadenproteine, welche die Identifizierung bestimmter Zelltypen, die Untersuchung ihrer Entwicklung ausgehend von dem Embryogenese-Stadium bis zum endgültigen Stadium der Zelldifferenzierung, sowie ihr Verhalten gegenüber Umgebungsmedien ermöglicht haben (E. LAZA- RIDES, Nature, 283, 249 (1980) und R. MOLL et al., Cell, 31, 11 (1982).
Die Keratine werden häufig als besonders wirksame Marker betrachtet, welche die Unterscheidung von Epithelzellen und Nicht-Epithelzellen ermöglichen. Aufgrund dieser Tatsache hat sich gezeigt, daß diese Unterscheidung es nicht immer ermöglicht, zweifelsfrei die Herkunft der fraglichen Epithelzellen festzustellen.
Die Notwendigkeit, sicher die Herkunft bestimmter Zelltypen festzustellen, erlangt eine besonders große Bedeutung bei einer großen Zahl von Fällen, beispielsweise wenn es sich darum handelt, bei der Untersuchung einer biologischen Probe, welche eine Vermehrung von Tumorzellen belegt, die primären Tumorzellen zu identifizieren, von denen diese Vermehrung ausgeht, oder die Anwesenheit von Metastasen festzustellen, deren Ursprung ein Krebs im Verdauungstrakt ist, oder die Wirksamkeit einer chemotherapeutischen Behandlung oder anderer Behandlung gegen Krebsmetastasen festzustellen. Es ist gut bekannt, daß die Wirksamkeit einer Antikrebs-Behandlung mit einer genauen Identifizierung der Tumorzellen verknüpft ist, die der primäre Grund der Krankheit sind.
Diese Beobachtungen sind besonders wichtig beim Nachweis, vorzugsweise beim frühzeitigen Nachweis der Vermehrung von Tumorzellen aus dem Verdauungstrakt (die für einen erheblichen Anteil der klinisch beobachteten Krebse verantwortlich sind) oder aus dem Nierenbereich, oder von Zellen, die von den eben genannten Zellen abgeleitet sind, insbesondere bei der Identifizierung von Markern, die für diese Zellen charakteristisch sind.
Die Erfindung interessiert sich somit insbesondere für den Nachweis von Tumorzellen, die bestimmte essentielle Phenotypen von Epithelzellen beibehalten haben, die normalerweise in den Schleimhäuten des Verdauungsapparats vorhanden sind, insbesondere in den Darmschleimhäuten, und deren hauptdifferenzierte Typen durch absorbierende Zellen oder Enterozyten gebildet sind.
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf spezifische Marker, die nachgewiesen werden können, ob sie nun von Tumorzellen getragen werden oder nicht.
Die Erfindung zielt insbesondere darauf ab, den Nachweis dieser Marker zu ermöglichen, selbst wenn diese von den genannten Tumorzellen abgelöst sind, insbesondere im Rahmen der Nekrose dieser Zellen, und beispielsweise in dem Blutkreislauf freigesetzt sind.
Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Marker ist das gesamte oder ein Teil von Villin. Es handelt sich um ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 95.000 Dalton, welches normalerweise in den Zotten der Verdauungsschleimhäute, insbesondere Darmschleimhäute, vorhanden ist. Das Villin ist in der Lage, sich in Gegenwart von Calciumionen an Aktin zu binden.
In einem 1984 veröffentlichten Artikel (J. Submicrosc. Cytol. 16 (1): 159-160) haben Coudrier et al. ausgehend von der Beobachtung einer Karzinom-Zellinie die Anwesenheit von Villin in differenzierten Zellen und in undifferenzierten Zellen beschrieben. Villin wurde mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern in dieser Zellinie nachgewiesen.
Von einer Spezies zur anderen kann die Aminosäuresequenz des Villins leicht variieren, wobei jedoch die funktionellen Charakteristika beibehalten bleiben. Die bislang bekannten Reinigungsmethoden ermöglichen die Gewinnung von Hühner- und Schweine-Villin in praktisch reinem Zustand. Andererseits führen diese Methoden jedoch nicht zur Gewinnung von gereinigtem Human-Villin.
Eines der besser bekannten Villine ist das von Hühnern. Es wird aus einer Sequenz von 854 Aminosäuren gebildet. Es kann durch schonende Proteolyse mit Trypsin und Protease V-8 an bestimmten Stellen zerschnitten werden zur Bildung der Fragmente 44 Kd, 51 Kd und 10 Kd, deren relative Positionen in der Karte von Villin nach Paul MADSUDAIRA, MRC, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, U.K. und John GLENNEY et al., J.B.C., 1981, 256, 8156-8161, sich wie folgt darstellt: Fragmente der schonenen Proteolyse Ort der Bindung an Aktin, unabhängig von der Anwesenheit von Calcium Ort der Bindung an Aktin, in Abhängigkeit von der Anwesenheit von Calcium Ti: Teilung durch Trysin V8: Teilung mit der Protease V8 Bereich, der bezüglich der Aminosäuresequenz bekannt ist
Die Aminosäuresequenz des COOH-terminalen Bereichs (779-854) oder des "Kopfbereichs" (Head Piece oder "Peptide HP") des Hühner-Villins ist die folgende:
Ganz allgemein ist Villin insbesondere in den Bürstensäumen vorhanden, die man auf der Oberfläche von Enterozyten beobachtet, insbesondere wenn diese das Endstadium der Differenzierung erreicht haben, im Bereich der Wandungen der Darmöffnung. Die Mikro-Darmzotten sind Organellen, die in der Endstufe der Differenzierung der Enterozyten gebildet werden. Das Villin ist insbesondere in den Bündeln der axialen Mikrofilamente dieser Mikro-Darmzotten lokalisiert. Es trägt zum Aufbau ihres Zellskeletts bei. Durch Immunofluoreszenz-Untersuchung von Gefrierschnitten hat sich gezeigt, daß das Villin im apikalen Pol der länglichen Zellen vorhanden ist, welche die Säulen bilden, welche die Darminnenwand bedecken, und auch in der Nähe der proximalen Tubuluszellen der Nieren vorhanden ist. In diesen beiden Fällen handelt es sich um Bereiche, die mit dem Bürstensaum der betreffenden Zellen übereinstimmen. Villin wurde jedoch nicht im Bereich verschiedener anderer Typen von Darmzotten verschiedener anderer Epithelien festgestellt, wenn diese frei sind von einem stark organisierten Bürstensaum (A. BRETSCHER et al., Exp. Cell. Res., 135, 213 (1981) oder auch der Artikel von H. REGGIO et al., veröffentlicht in dem Werk "Membranes in Growth and Development" (Membranen im Zuge des Wachstums und der Entwicklung) von A. LISS, New York (1982), Seiten 89-105).
Es hat sich weiterhin gezeigt, daß Villin in einem frühen Stadium der Entwicklung der Enterozyten vorhanden ist, lange bevor der Bürstensaum gebildet wird.
Die vorliegende Erfindung ergibt sich durch eine doppelte Erkenntnis. Villin bleibt in praktisch systematischer Weise im Verlauf der Tumorgenese der Gewebe des Verdauungstrakts nachweisbar und insbesondere bei Krebsen des Kolons, einer der verbreitesten Formen des Krebses, und auch bei bestimmten Typen von Nierenkrebsen, während Villin niemals bei primären Tumorzellen nachgewiesen werden konnte, die sich aus der anfänglichen Krebsbildung von Geweben, die in anderen Organen vorliegen (Leber, Eierstöcke, Lungen etc.) ergeben.
Darüber hinaus ist Villin in vivo in allen Bereichen der Entwicklung von Tumorzellen des Verdauungstrakts nachweisbar sowohl in dem Stadium, daß der Tumorgenese vorausgeht als in späteren Stadien, unabhängig von dem Entwicklungsstadium der fraglichen Zellen.
Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren, das darauf abzielt, in vitro Tumorzellen, die ursprünglich im Verdauungstrakt gebildet worden sind, und/oder Derivate davon in einer biologischen Probe nachzuweisen, ist dadurch gekennzeichnet, daß man diese biologische Probe mit Reagenzien in Kontakt bringt, die eine spezifische Affinität für Villin besitzen oder das dieses Protein codierende Gen erkennen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf jede biologische Probe anwendbar, in der Tumorzellen aus dem Verdauungstrakt oder Tumorzellen, die gegebenenfalls in anderen Bereichen des Organismus unter dem Einfluß von primären Zellen aus dem Verdauungstrakt oder Nierenbereich gebildet worden sind, enthalten sind, oder auch auf sämtliche biologischen Proben, die im Rahmen der Nekrose dieser Zellen gebildete Abbauprodukte dieser verschiedenen Tumorzellen enthalten, einschließlich den Villin-Marker. Diese biologische Probe kann aus sämtlichen Probenformen bestehen: Gewebefragmente oder feste Tumore, die man beispielsweise durch Biopsie erhalten hat, oder auch Proben von biologischen Flüssigkeiten, insbesondere Gesamtblut oder Blutserum, welche bösartige Zellen oder originäre Fragmente dieser Zellen fördern können.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung besteht das bei dem Diagnoseverfahren eingesetzte Reagens aus einer DNA, deren Sequenz einen Bereich aufweist, der für eine Aminosäuresequenz des Human-Villins codiert, insbesondere den COOH-terminalen Bereich.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden bei den Methoden zur Durchführung des Diagnoseverfahrens immunologische Techniken angewandt, wobei das für Villin eine spezifische Affinität aufweisende Reagens durch Antikörper gebildet wird, die Villin zu erkennen vermögen.
Diese Antikörper sind ihrerseits in irgend einer an sich bekannten Weise markiert oder sind ihrerseits dann, wenn sie an Villin oder dieses tragende Gewebe gebunden sind, durch markierte Immunoglobuline oder andere markierte Proteine (beispielsweise Protein A von Staphylococcus aureus) erkennbar.
Die besonders geeigneten Methoden sind jene, die bei den Versuchen angewandt worden sind, die weiter unten beschrieben werden und die zu den oben angegebenen Feststellungen geführt haben.
Die Erfindung betrifft weiterhin spezifische neue Mittel zum Nachweis des Villins im Bereich der Mikrodarmzotten der Enterozyten oder von analogen Zellen (wobei es sich versteht, daß die Anwendung dieser neuen Mittel nicht notwendigerweise auf den Einsatz des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens beschränkt ist).
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind diese Mittel durch DNA, die der vollständigen mRNA von Human-Villin entsprechen, oder ein DNA- Fragment, dessen Nucleotidsequenz einen Bereich aufweist, der für eine Aminosäuresequenz von Human-Villin codiert, welches in der Lage ist, sich spezifisch mit einer für Villin codierenden Nucleotidsequenz zu hybridisieren, gebildet.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Anwendung bei dem oben beschriebenen Verfahren einer DNA, die der vollständigen mRNA von Human-Villin oder einem cDNA-Fragment entspricht, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es mindestens einen Teil der Nucleotidsequenz enthält, die für die Aminosäuren des COOH-Endes von Human-Villin codiert. Diese Nucleotidsequenz und die entsprechende codierte Aminosäuresequenz sind im folgenden angegeben:
Die eingesetzte Nucleotidsequenz wird als Sonde zum Nachweis von mRNA oder von DNA, die für Human-Villin codieren, verwendet.
Eine für diese Art von Nachweis geeignete Sonde wird mit Vorteil durch ein radioaktives Element oder irgendeine andere Gruppe markiert, die seine Erkennung im hybridisierten Zustand mit dem Präparat ermöglicht, welche die zu untersuchende mRNA oder DNA enthält.
Entsprechend klassischer Verfahrensweisen werden diese Sonden mit einer biologischen Probe, welche die zu untersuchenden Zellen enthält, oder direkt mit deren Nucleinsäuren unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine eventuelle Hybridisierung der Nucleotidsequenz der Sonde mit einer komplementären Sequenz ermöglicht, die gegebenenfalls in der untersuchten Probe enthalten ist.
Die Reproduzierbarkeit des Nachweises wurde unter Verwendung einer Sonde geprüft, die eine Einfügung von 200 Basenpaaren enthält.
Diese Nucleotidsonden, welche neue erfindungsgemäße Produkte darstellen, werden ihrerseits gemäß einer weiteren Ausführungsform dazu verwendet, die Expression der mRNA des Villins in jedem der Differenzierungszustände der Enterozyten und/oder den Zellen, die Villin exprimieren und in verschiedenen Stadien der Reifung der Zellen aus dem Nieren- oder Darmbereich verwendet.
Die erhaltenen Sonden ermöglichen weiterhin die Bestimmung der Zahl, der Organisation und der Struktur des oder der Gene des Villins, die aus einer Human-Genombank isoliert worden sind.
Erfindungsgemäß isoliert man die für das Ende des Human-Villins codierende Nucleotidsequenz mit Hilfe der folgenden Schritte:
- Man bereitet mit Hilfe an sich bekannter Verfahrensweisen ausgehend von einer Zellinie, die Villin exprimiert, die gesamte mRNA (Messenger-RNA);
- man bildet eine cDNA-Datenbank (komplementäre DNA);
- man fügt die cDNA in einen Vektor ein, der dazu geeignet ist, das durch die Einfügung codierte Protein zu exprimieren;
- man transformiert einen Bakterienstamm mit den erhaltenen rekombinanten Vektoren und schafft dann Bedingungen, die die Expression des gewünschten Proteins in dem Bakterium ermöglichen;
- man selektioniert rekombinante Klone, die den spezifischen Klon des Villins enthalten, mit Hilfe von villinerkennenden Antikörpern.
Die Stufe der Bildung der cDNA-Bank erfolgt mit Hilfe eines Vektors, der dazu geeignet ist, das durch das eingefügte cDNA codierte Protein zu exprimieren.
Die besonders vorteilhaften Klonierungsvektoren, insbesondere im Hinblick auf ihre erhöhte Exprimierungsausbeute, werden durch Plasmide des Typs pEX gebildet. Solche Plasmide sind von Stanley und Luzio in EMBO Journal, 1984, 3, 1429-1434 beschrieben. Sie sind von Plasmiden abgeleitet, die das cro-lacZ-Fusionsgen enthalten, dessen Expression unter der Kontrolle des Promotors PR des Bakteriophagen Lambda erfolgt. Diese Expression kann durch die Temperatur induziert werden.
Ein Polynucleotid, welches mehrere einzigartige Restriktionsstellen enthält, wird in jede der Lesephasen eingefügt, sowie Signale der Beendigung der Transkription und der Übersetzung. Die im Bereich der einzigartigen Restriktionsstellen eingefügten cDNA werden mit großem Wirkungsgrad in Form des entsprechenden cro-βgal-Peptidhybridproteins exprimiert. Dieses Hybridprotein ist wenig löslich, was in vorteilhafter Weise die Gefahr einer Proteolyse in dem Bakterium verringert und den immunologischen Nachweis durch spezifische Antikörper erleichtert.
Zur Bewirkung der Einfügung von cDNA in guter Orientierung in bezug auf das Gen cro-lacZ, zur Erzielung der Expression des entsprechenden Polypeptids in dem Bakterium, verwendet man eine Methode der sequentiellen Anfügung von verschiedenen Linkern an beiden Enden der cDNA nach der Methode von Helfmann et al. (P.N.A.S. USA, 1983, 80, 31-35). Die verwendeten Linker entsprechen den Schnittstellen von BamHI und SalI.
Diese rekombinanten Plasmide werden mit Hilfe an sich bekannter Verfahrensweisen dazu verwendet, den zur Expression des Proteins durch die untersuchte Sequenz verwendeten Bakterienstamm zu transformieren.
Bakterienstämme von E. coli sind besonders bevorzugt und insbesondere der Stamm E. coli pop 2135, welcher das Allel cIts857 des Repressors cro enthält.
Man erhält in dieser Weise in dem Bakterienstamm eine cDNA-Bank, die der mRNA von Zellen entspricht, die Villin in hohem Grad exprimieren und die etwa 30.000 rekombinante Klone enthalten.
Die Expression des Hybridproteins kann durch die Temperatur induziert werden. Man arbeitet daher bei einer Temperatur, bei der der Repressor des Gens cro nicht mehr aktiv ist. Hierzu ist es ausreichend, die Stämme während etwa 2 Stunden bei einer Temperatur oberhalb der Raumtemperatur, insbesondere im Bereich von 40 bis 42ºC, zu inkubieren.
Die nach der Lyse der Bakterien und der Renaturierung der Proteine mit Hilfe an sich bekannter Verfahrensweisen gewonnenen Klone werden durch immunologisches Screening selektioniert.
Vorzugsweise bewirkt man zunächst ein Screening der cDNA-Bank mit Hilfe eines Typs von polyklonalen Anti-Villin-Antikörpern. Die spezifisch mit dem oder den polyklonalen Antikörper(n) reagierenden Klone werden mit Hilfe mindestens eines monoklonalen Antikörpers, der gegen die COOH-terminalen Epitope gerichtet ist, ausgesiebt.
Ein zufriedenstellend es Aussortieren erfolgt mit Hilfe eines polyklonalen Anti-Villin-Antikörpers, wie eines polyklonalen Antikörpers, der gegen intaktes Schweine-Villin gerichtet ist, sowie einem oder mehreren monoklonalen Antikörper(n), welche die im COOH-terminalen Bereich des Moleküls vorliegende Epitope erkennen.
Die Auswahl mit Hilfe des polyklonalen Antikörpers wird mit Vorteil ergänzt durch eine anschließende sekundäre Aussiebung mit Hilfe eines anderen polyklonalen Antikörpers, insbesondere eines polyklonalen Antikörpers, der gegen das COOH-terminale Fragment des Hühner-Villins gerichtet ist.
Die Erfindung betrifft insbesondere einen Klon, der eine dem Human-Villin entsprechende cDNA trägt und der dadurch gekennzeichnet ist, daß er spezifisch mit dem gegen intaktes Villin gerichteten polyklonalen Antikörper dem gegen das COOH-terminale Peptid des Hühner-Villins gerichteten polyklonalen Antikörper und mit den beiden gegen die COOH-terminalen Epitope gerichteten monoklonalen Antikörper reagiert.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Klon, der eine dem Villin entsprechende cDNA trägt, die eine Einfügung mit einer polyA-Sequenz und einer Poly- Adenylierungsstelle umfaßt.
Gemäß einem weiteren Gegenstand der Erfindung sind die zum Nachweis des Villins verwendeten Mittel durch monoklonale Antikörper gebildet.
Dieser Gegenstand der Erfindung stützt sich auf die Tatsache, daß die Villine, die aus unterschiedlichen Spezies herrühren, gemeinsame Epitope enthalten, die für monoklonale Antikörper zugänglich sind, die in spezifischer Weise nicht nur das besondere Villin, das zur Immunisierung des Tieres verwendet worden ist, dessen Milzzellen mit den Myelomzellen fusioniert worden sind zur Bildung von Hybridoma, die die genannten monoklonalen Antikörper ausscheiden, erkennen, sondern auch in spezifischer Weise Villine erkennen, die von anderen Spezies stammen, einschließlich der menschlichen Spezies.
Ein erfindungsgemäß bevorzugter monoklonaler Antikörper ist daher durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet:
- Er erkennt das gereinigte Schweine-Villin (Western Blotting).
- Er erkennt Hühner-Villin (Western Blotting).
- Er erkennt das Villin des Zellextrakts der Zellinie, die von einem Adenokarzinom des menschlichen Kolons abgeleitet ist: HT29 (Western Blotting).
- Er erkennt Ratten-Villin in der Immunozytochemie (mit Formaldehyd fixierte Gefrierschnitte (Cryostat) von Ratten-Darmschleimhaut).
Ein von den monoklonalen Antikörpern, die der obigen Definition entsprechen, bevorzugter Antikörper erkennt ebenfalls ein in dem "Peptid HP" des Hühner-Villins enthaltenes Epitop, wobei die Erkennung sowohl im Hinblick auf das zuvor isolierte Peptid HP als auch im Hinblick auf das Peptid 51Kd, das noch das Peptid HP enthält, möglich ist, wobei dieser Antikörper weder das Peptid 44Kd noch das Peptid 44Kd des Hühner-Villins erkennt.
Der bevorzugte erfindungsgemäße Antikörper erkennt weiterhin das Protein HP sowohl in denaturiertem Zustand, insbesondere nach der Behandlung mit Natriumdodecylsulfat (SDS), als auch auf Villin tragenden Epithelzellen. Dieses Ergebnis zeigt, daß das von dem Peptid HP getragene Epitop nicht durch andere Proteine in dem Zellmedium maskiert wird.
Die Erfindung betrifft natürlich auch Hybridoma, die diese monoklonalen Antikörper ausscheiden. Eine vorteilhafte Methode zur Bildung dieser Hybridoma, insbesondere durch Fusion von Milzzellen von Mäusen, die gegen gereinigtes Schweine-Villin immunisiert worden sind, einerseits mit geeigneten Myelomzellen, andererseits wird weiter unten noch erläutert. Das in dieser Weise erhaltene bevorzugte Hybridom (Stamm BD-D 2C3) wurde bei der Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) des Institut Pasteur, Paris, am 29. April 1985 unter der Hinterlegungsnummer I-440 hinterlegt.
Gemäß einer vorteilhaften Variante der Erfindung kann das zur Bildung der Antikörper verwendete immunogene Mittel in großen Mengen in dem Bakterium exprimiert werden. Dieses immunogene Mittel entspricht dem Peptid, das durch die oben definierte Nucleotidsequenz codiert wird, die der DNA von Human-Villin oder einem Fragment entspricht.
Unter Anwendung klassischer Methoden injiziert man das Peptid an Tiere, gewinnt die Antisera und dann gegebenenfalls die Antikörper aus den Antisera, beispielsweise durch Affinitätschromatographie. Die Bildung der Antikörper nach dieser Ausführungsform besitzt ein um so größeres Interesse, als der durch das oben definierte cDNA-Fragment codierte Bereich HP zugleich der am stärksten immunogene Bereich und der spezifischste Bereich des Villins ist.
Es ist festzuhalten, daß das durch die Nucleotidsequenz der von Villin komplementären DNA oder eines Fragments dieser DNA codierte Protein auch eine Quelle für Antigene darstellt, die es ermöglicht, kompetitive Radioimmunoassays durchzuführen (entweder durch die direkte ELISA-Methode oder durch eine kompetitive ELISA-Methode).
Es versteht sich von selbst, daß man auchjedes beliebige andere immunogene Mittel, welches die gleiche immunogene Sequenz enthält, verwenden kann, beispielsweise das Peptid HP als solches, das gegebenenfalls zuvor auf ein Trägermolekül aufgepfropft worden ist, wie Rinderserumalbumin, um in dieser Weise seine immunogenen Eigenschaften zu steigern.
Es ist weiterhin für den Fachmann klar, daß er dann, wenn er den bevorzugten erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in Händen hält, er auch in der Lage ist, den charakteristischen Epitopbereich des Peptids HP zu definieren. Um ihn genauer zu identifizieren, kann man insbesondere ein Verfahren anwenden, welches die folgenden Stufen umfaßt:
- Synthese einer Polynucleotidsequenz, die für das Peptid HP codiert (oder für einen Teil des Peptids HP, von dem vernünftigerweise angenommen werden kann, daß er das gewünschte Epitop enthält),
- Linearisieren des oben definierten Plasmids, welches die Nucleotidsequenz enthält, die für das COOH-terminale Ende des Villins codiert, und dies in einem Bereich einer Restriktionsstelle außerhalb der genannten Sequenz,
- gesteuertes Ausschneiden des linearisierten Plasmids mit einem exonucleolytischen Enzym, wie dem Enzym Bal31,
- Rezirkularisierung des Plasmids mit Hilfe einer DNA-Ligase,
- Transformation eines geeigneten Mikroorganismus, der seinerseits durch das entsprechende Plasmid transformiert werden kann und in der Lage ist, die in diesem enthaltene Einfügung zu exprimieren,
- Inkontaktbringen der Expressionsprodukte dieses Mikroorganismus mit dem betrachteten Antikörper,
wobei der oben beschriebene Verfahrenszyklus so lange wiederholt wird, bis der Nachweis des immunogenen Produkts unter den Expressionsprodukte des mit dem zuletzt erwähnten rezirkularisierten Plasmid transformierten Mikroorganismus verschwindet.
Es ist möglich, am Ende eines jeden Zyklus des oben definierten Verfahrens insbesondere durch Sequenzieren der Endbereiche des Plasmids vor und nach der letzten Schneidmaßnahme, die zu einem Verlust der Fähigkeit des Erkennens des rezirkularisierten Zwischen-Plasmids führt, das Epitop im Bereich des Peptids zu lokalisieren, welches durch die im Verlaufe dieser letzteren Schnittmaßnahme eliminierten Nucleotidsequenz codiert wird. Man kann sagen, daß die Tatsache, daß der Fachmann über den oben angesprochenen monoklonalen Antikörper verfügt, dies damit äquivalent ist, ihm die chemisch definierte und dieses Epitop enthaltende Peptidsequenz zur Verfügung zu stellen.
Die Erfindung betrifft weiterhin praktisch biologisch reines Human-Villin, welches mit dem oben definierten bevorzugten monoklonalen Antikörper reagiert und bei der Untersuchung der elektrophoretischen Wanderung auf Polyacrylamidgel, insbesondere SDS-PAGE, lediglich eine einzige Bande ergibt.
In der Tat kann Human-Villin aus einem Lysat von menschlichen Enterozyten extrahiert werden, das man insbesondere durch Behandlung dieser letzteren mit einer wäßrigen Lösung, die ein geeignetes Detergens enthält, erhält und mit Hilfe des oben genannten monoklonalen Antikörpers gereinigt hat. Ein Reinigungsverfahren dieser Art benützt den monoklonalen Antikörper, der mit Vorteil auf einem festen Träger immobilisiert ist, der vorzugsweise an Maßnahmen der Affinitätschromatographie angepaßt ist. Beispielsweise ist der monoklonale Antikörper an ein dreidimensional vernetztes Agarosenetzwerk fixiert, das im Handel unter der Bezeichnung SEPHAROSE von der Firma PHARMACIA AG vertrieben wird, beispielsweise durch Fixierung nach der Cyanogenbromid- Methode.
Die Erfindung betrifft daher insbesondere ein Verfahren zur Abtrennung von Human-Villin, das gekennzeichnet ist durch Maßnahmen, die darin bestehen, eine Villin enthaltende Lösung durch eine Affinitätssäule zu führen, die den monoklonalen Antikörper trägt, um in dieser Weise das Human-Villin selektiv zu fixieren, um dieses dann durch Dissoziation des Antigen-Antikörper- Komplexes entweder mit einem sauren Puffer mit einem pH-Wert von 2 bis 4 auf der Grundlage von Glycin oder einem basischen Puffer auf der Grundlage von Methylamin mit einem pH-Wert von 11 zu gewinnen und dann gegen einen Ammoniumacetat-Puffer zu dialysieren.
Es versteht sich von selbst, daß die Erfindung auch Polypeptide mit niedrigerem Molekulargewicht umfaßt, die aus Fragmenten des Human-Villins bestehen. Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß die Fragmente dadurch erhalten werden können, daß man Human-Villin mit Enzymen zur Spaltung von Polypeptiden an spezifischen Stellen schneidet. Als Beispiele für solche Proteine kann man insbesondere Trypsin oder Protease von Staphylococcus aureus V8, α-Chymotrypsin, die "Protease der Drüse unterhalb des Mäuse-Oberkiefers" (mouse submaxillary gland protease), die von der Firma BOEHRINGER vertrieben wird, Collagenase von Vibrio laginolyticus chemovar iophagus, die die genannten Peptide Gly-Pro und Gly-Ala spezifisch erkennen, etc. nennen.
Es versteht sich weiterhin von selbst, daß Gegenstand der Erfindung weiterhin die Hybridoma und die monoklonalen Antikörper sind, die speziesspezifisch oder nicht sind und die ausgehend von Human-Villin oder seinen Fragmenten hergestellt werden können.
Weitere Charakteristika und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der weiteren Beschreibung der besonderen Bedingungen, die zur Verdeutlichung des Nachwelses von Human-Villin, der Herstellung und der Verwendung von Hybridoma und monoklonalen Antikörpern bei den Untersuchungen erläutert werden.
Erläutert wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Klons, der einen Teil der cDNA von Human-Villin trägt.

Beispiel 1: Nachweis von Human-Villin

Die Expression des Villins kann in unterschiedlichen Stadien der Vermehrung von Tumorzellen oder Nicht-Tumorzellen, die aus dem Verdauungsbereich oder dem Nierenbereich einerseits und anderen Bereichen des Organismus stammen können, untersucht werden. Ausgehend von den betreffenden Geweben werden diese gefroren, fixiert und unter Bedingungen präpariert, welche die Erzeugung von Schnitten ermöglichen (Gefrierschnitte nach der Methode von BROWN und FARQUHAR, Cell. 36, 295 (1984).
Man bildet Schnitte mit einer Dicke von 5 um bei -25ºC und legt sie auf mit Polylysin bedeckten Glasplättchen ab. Nach dem Eintauchen in eine Pufferlösung aus einer Phosphatsalzlösung, die 0,2% Gelatine enthält (PBS-Gelatine) werden die Schnitte behandelt, um Villin mit Hilfe einer Lösung nachzuweisen, die 50 ul Antivillin-Kaninchen-Antiserum enthält, 1/800º verdünnt in PBS-Gelatine, und werden dann während 25 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert.
Die Schnitte werden anschließend dreimal während 10 Minuten in PBS- Gelatine gewaschen.
Dann werden mit Rhodamin markierte Anti-IgG vom Kaninchen (hergestellt von der niederländischen Firma Nordic Immunological Laboratories) zugegeben und die Schnitte werden in Gegenwart dieser Anti-IgG bei Raumtemperatur während 25 Minuten inkubiert. Die Schnitte werden anschließend vollständig in PBS-Gelatine gewaschen und dann zur Untersuchung unter einem Fluoreszenz-Mikroskop (Photomikroskop ZEISS) montiert, welches mit einer Immersionslinse in einem Öl Plan Neofluar ausgerüstet ist und mit einem geeigneten Filtersatz versehen ist.
Die Kontrollgewebe oder die Tumorgewebe anderen Ursprungs werden in gleicher Weise behandelt.
Es konnten die folgenden Beobachtungen gemacht werden:
Wenn von Adenokarzinomen des Kolons stammende Gewebe beobachtet werden, erweisen sich 11 von 12 Beobachtungen als positiv bezüglich der Expression von Villin. Menschliche Tumore anderen Ursprungs, wie Lymphome, insbesondere mesenteriale Knotenlymphome und verschiedene Typen von Karzinomen anderen Ursprungs, die gegebenenfalls zu Metastasen im Bereich des Pankreas oder des Ösophagus führen, exprimieren das Protein nicht.
Ganz allgemein haben die Untersuchungen eine enge Korrelation zwischen dem primären Darmursprung der behandelten Tumoren und der Expression von Villin gezeigt. Eine Vielzahl von Untersuchungen, die an Tumoren bestimmten Ursprungs durchgeführt worden sind, haben praktisch in allen Fällen negative Ergebnisse im Bereich der Expression des Proteins gezeigt.
Es ist festzuhalten, daß bei Geweben aus dem Darmbereich das Villin stets beobachtet werden konnte, unabhängig von dem Ausmaß der Vermehrung der genannten Zellen.
Die oben angesprochenen Untersuchungen wurden mit polyklonalen Antikörpern durchgeführt. Man kann jedoch noch wesentlich genauere Ergebnisse mit dem polyklonalen Antikörper erzielen, der beim C.N.C.M. hinterlegt worden ist.
Die Bedingungen, bei denen die Hybridoma, welche die monoklonalen Antikörper ausscheiden, isoliert worden sind, werden nachfolgend als Beispiele erläutert. Es wird auch eine bevorzugte Ausführungsform der Bedingungen angegeben, bei denen das Diagnostikum der Anwesenheit oder Nichtanwesenheit des Villins bei den immunologischen Untersuchungen des Typs ELISA nachgewiesen werden kann.

Beispiel 2: Herstellung von gegen Villin gerichteten monoklonalen Antikörpern

A) Immunisierungsprogramm

- Mäuse Balb/C mit einem Alter von 6 bis 8 Wochen.
- Antigen: gereinigtes Schweine-Villin (10 mg/ml) (homogene Bande nach der Proteinelektrophorese über Polyacrylamidgel (10%) in Gegenwart von SDS mit einem Molekulargewicht von 95Kd):
-10 mM Imidazol
-75 mM HCl
-1 mM EGTA
-0,1 M DTT
-50% Glycerin
- Programm:
-Tag 0: Intraperitoneale Injektion von 50 ug reinem Villin in einer 50/50- Emulsion (PBS-vollständiges Freund'sches Adjuvans).
-Tag 14: Wiederholung der Intraperitonealen Injektion von 50 ug Villin (Emulsion PBS-unvollständiges Freund'sches Adjuvans).
-Tag 21: Wiederholung der Intraperitonealen Injektion von 50 ug Villin (Emulsion PBS-unvollständiges Freund'sches Adjuvans).
-Tag 28: Intramuskuläre Injektion von 20 ug reinem Villin in Lösung in PBS.
-Tag 29: Intravenöse Injektion von 10 ug reinem Villin in Lösung in PBS.
-Tag 32: Fusion.

B) Fusion

I) Parenterale Zellen

a) Myleomzellen:
-Linie Sp2/0-Ag 14 (8-Azaguanin-resistent).
-Sterile Kultur im DMEM-Medium 10% FCS.
b) Milzzellen:
Ursprung: Milz von Mäusen o Balb/C, die gegen Schweine-Villin hyperimmunisiert sind.

II) Zellfusionsverfahrengemäß G. Kühler und C. Milstein (kontinuierliche Kultur von verschmolzenen Zellen, die Antikörper einer vordefinierten Spezifität ausscheiden (Nature 1975, 256, 495).

- Fusion in einem DMEM-Medium ohne Serum unter sterilen Bedingungen in Gegenwart einer 50%igen Polyethylenglykol-Lösung (PEG 1000-Merck 9729) in dem DMEM-Medium ohne Serum. Nach der Zählung der beiden parenteralen Zelltypen wird die Suspension der Myelomzellen in dem Kulturmedium mit der Suspension der Milzzellen in einem Verhältnis von 1 zu 5 vermischt.
- Kontaktzeit 2 Stunden 30 Minuten.
- Unterbrechung der Wirkung durch PEG durch Verdünnen des vollständigen DMEM-Mediums.
- Endverdünnung der Zellsuspension (2·10&sup5; Zellen/ml) in dem selektiven Medium DMEM-HAT.
- Verteilung in Näpfchen einer COSTAR-24-Näpfchenschale mit 1 ml pro Näpfchen (COSTAR Tissue Culture Cluster 24, Kat. Nr. 3524, COSTAR 205 Groadway, Cambridge, Ma., USA).

III) Selektion der Klone

Die Klone werden im Hinblick auf ihre Fähigkeit identifiziert, Antikörper auszuscheiden, die gegen gereinigtes Schweine-Villin gerichtet sind.

C) Selektionsmethode

I) ELISA-Test: Dieser Test ermöglicht den Nachweis von monoklonalen Anti-Villin-Antikörpern in der überstehenden Kulturflüssigkeit nach der Fusion.

- Fixierung des Antigens an dem Träger (ELISA-Platte)
Konzentration: 5 ug/ml in einem Kaliumphosphat-Puffer 50 mM, pH = 8, eine Nacht bei 4ºC.
- Sättigung mit PBS-Tween 20-BSA
- Inkubierung I mit der unverdünnten überstehenden Flüssigkeit von Hybridom, 3 Stunden bei 4ºC.
- Inkubierung II mit Anti-IgG von Mäusen, die mit β-Galactosidase markiert sind, 2 Stunden bei 4ºC.
Sämtliche Waschungen zwischen jeder Stufe erfolgen mit PBS-Tween 20 0,1%.
- Substrat O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranisid (Sigma N11-27) in einem 0,1M Phosphatpuffer, pH = 7,0, 10&supmin;³M MgSO&sub4;, 2·10&supmin;³M Mn SO&sub4;, 2·10&supmin;³M dehydratisiertes Magnesium-Tritriplex (Merck 8409).
Messung: optische Dichte 414 nm.
Die selektionierten Klone sind jene, bei denen die überstehenden Flüssigkeiten der Hybridoma einen optische Dichte-Wert ergeben, der um den Faktor 10 größer ist als das optische Dichte-Grundrauschen.

II) Western Blotting gemäß Burnette (Anal. Biochem. 1981, 112, 195-203)

Dieser Test ermöglicht die Selektionierung von Klonen, welche monoklonale Anti-Schweine-Villin-Antikörper sekretieren und ebenfalls Human-Villin und Hühner-Villin erkennen, unter Klonen, die bei dem ELISA-Test positiv sind.

Verschiedene Stufen des Tests:

a) Elektrophorese eines Zellextrakts der Darmschleimhaut von Hühnern und eines Zellextrakts der Zellinie HT29 (Adenokarzinom von Human-Kolon), die Villin exprimieren, auf Polyacrylamidgel.
b) Elektrotransfer der auf dem Polyacrylamidgel getrennten Proteine auf Nitrocellulose-Papier.
c) Inkubierung des Nitrocellulose-Papiers, auf welches die Zellproteine übertragen worden sind, mit den überstehenden Flüssigkeiten von Hybridomen, die zuvor mit ELISA selektioniert worden sind, über Nacht bei 4ºC.
d) Inkubieren während einer Stunde bei Raumtemperatur mit Anti-IgG von Mäusen, die mit Peroxidase markiert worden sind.
e) Substrat:
- 10 mg Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
- 20 ml 0,1M Tris HCl, pH = 7,6
- 0,2 ml 1%ige H&sub2;O&sub2;.
Sämtliche Waschvorgänge zwischen einer jeden Stufe erfolgen mit frisch gewonnenem Kälberserum - PBS-Triton X100.
f) Positive Reaktion: Schnelles Auftreten einer kastanienfarbigen Bande (Molekulargewicht 95Kd), wenn die Reaktion Antigen - monoklonale Antikörper erfolgt.

D) Klonierung der selektrionierten Hybriden

- Methode der begrenzten Verdünnungen:
Man verdünnt die positiven Klone in dem selektiven Mediumin der Weise, daß nur eine Zelle pro Näpfchen (Platte mit 96 Näpfchen) auf die Makrophagen (Ursprung: Mäuse Balb/C, 4 Wochen), die am Boden der Näpfchen fixiert sind, verteilt werden.
Zugabe des konditionierten selektiven Mediums.
- Selektion der positiven Klone nach den oben beschriebenen Methoden.
- Erforderlichenfalls Reklonierung.

E) Herstellung von Asziten

- Die selektionierten Klone werden an Mäuse injiziert (denen 4 bis 5 Tage zuvor eine "PRISTANE"-Injektion (Aldrich, 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) verabreicht worden ist).
- Man injiziert 1 bis 2·10&sup6; Zellen pro Maus.
- Nach 10 bis 15 Tagen Rückgewinnung der Aszitesflüssigkeit, welche vermehrte Zellen des Klons enthält. Diese Aszitesflüssigkeit besitzt einen Gehalt an monoklonalen Anti-Villin-Antikörpern von mehr als 1 mg/ml.
- Einfrieren der selektionierten Klone in dem Medium DMEM 10% FCS-5% DMSO.
Aufbewahrung in flüssigem Stickstoff bei -176ºC.

DIREKTES ELISA-VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON VILLIN

- Adsorption von gereinigten IgG ausgehend von dem Aszites BD-D2C3 in konstanter Konzentration auf ELISA-Platten.
- Der Antikörper wurde durch Ionenaustauschchromatographie (DEAE- Trisacryl) und einer Hydroxyapatit-Säule gereinigt.
-Einstellung der Konzentration.
- Inkubierung während 2 Stunden bei 37ºC, dann über Nacht bei 4ºC.
- Waschen in PBS/Tween 20, 0,1%.
- Sättigung der Platten
Man inkubiert während 30 Minuten in Gegenwart von PBS/Tween 20 0,1%/BSA 0,4%.
- Zugabe des Antigens
- Abnehmender Konzentrationsbereich von gereinigtem Villin von 5 ug/ml auf 1 oder 0, 1 ng/ml in Gegenwart von BSA 0,4%.
- Inkubierung während 3 Stunden bei 4ºC.
- Waschen in PBS/Twenn 20 0,1%.
- Zugabe von gereinigtem IgG ausgehend von einem gegen Villin gerichteten und mit β-Galactosidase gekuppeltem polyklonalem Kaninchenserum.
- Inkubierung während 2 Stunden bei 4ºC.
- Waschen in PBS/Tween 20 0,1%.
- Nachweis der β-Galactosidase
- Zugabe von 20 mg p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid ausgehend von einer Lösung von 4 mg/ml in 20 ml des 0,1M Phosphatpuffers pH = 7, 10&supmin;³M MgSO&sub4;, 2·10&supmin;&sup4;M MnSO&sub4;, 2·10&supmin;³M EDTA (Merck 8409).
- Inkubierung während x Stunden bei 37ºC.
- Bestimmung der optischen Dichte bei 414 nm.

Beispiel 3: Klinische Beobachtungen am Menschen

Unter Anwendung eines ELISA-Tests, der nachfolgend beschrieben wird und dessen Empfindlichkeit es ermöglicht, sehr geringe Villin-Gehalte in einem Zellextrakt (0,5 ng Villin pro mg Gesamtproteine) festzustellen, wurden Messungen durchgeführt, um die Menge des Villins zu ermitteln, die in dem Serum bestimmt werden kann. Da das Villin ein intrazelluläres Protein ist, das von normalen und tumoralen Zellen des Verdauungstrakts exprimiert wird, haben die Erfinder in der Tat feststellen können, daß unter bestimmten physiopathologischen Bedingungen die Nekrose der Zellen, die Villin enthalten, zu seiner Freisetzung in den Blutkreislauf führen kann.
Die Untersuchung einer Population von Blutspendern (n = 190) zeigt, daß Villin in der großen Vielzahl der Seren (n = 168) nicht festgestellt werden kann; dennoch zeigt eine kleine Anzahl von Individuen (n = 15) einen nachweisbaren Villinspiegel (5 bis 10 ng/ml). Dieser Wert ist als Villinspiegel zu betrachten, der keine pathologische Signifikanz besitzt. Schließlich zeigen einige Individuen (n = 7) einen Villinspiegel oberhalb des Grundwerts (50 bis 100 ng/ml). Diese Individuen, die als "normal" bezeichnet werden (3,6%) wurden keiner ergänzenden klinischen Untersuchung ihres Verdauungstrakts unterzogen (Fibroskopie, Kolonoskopie).
Die ersten Ergebnisse, die bei verschiedenen gastro-intestinalen pathologischen Zuständen erhalten worden sind, sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Nachweis von meßbaren Villinmengen (Werte zwischen 10 und 10.000 ng/ml) in den Seren von Kranken, die folgende Krankheitszustände aufweisen:
*Bösartige pathologische Zustände des Verdauungstrakts:
- Kolorektale Krebse.
- Magenkrebse.
*Gutartige pathologische Zustände des Verdauungstrakts:
- Villustumoren.
- Crohn-Krankheit.
- Blut ende Rekto-Kolonentzündung.
- Zwölffingerdarm-, Magen- und Ösaphagusgeschwüre.
Es ist wesentlich festzuhalten, daß die Verdauungspolyadenome ("Polypen") nicht zu einer Freisetzung dieses Proteins im Blut führen.
Bestimmte ergänzende Punkte konnten von dieser Untersuchung abgeleitet werden:
1) Es scheint keine Korrelation zwischen der zirkulierenden Villin-Menge und der Größe oder dem Entwicklungszustand des Tumors zu existieren.
2) Bei der postoperativen Überwachung zeigt die Bestimmung dieses Proteins einen Abfall seines Serumspiegels nach seiner vollständigen operativen Beseitigung. Andererseits beobachtet man im Fall des Verbleibens von Tumorgewebe (unvollständige operative Entfernung, Rezidive, Metastasen) entweder eine Aufrechterhaltung des Villin-Spiegels oder seine Steigerung.
Diese Untersuchung zeigt, daß Villin üblicherweise nicht in dem Serum von normalen Patienten feststellbar ist, während man es im Serum von Kranken nachweisen kann, die von bösartigen pathologischen Zuständen (Darm- oder Rektumkrebsen) befallen sind, oder die gutartige Geschwüre (Crohn-Krankheit, blutende Rekto-Kolonentzündung, Geschwüre) des Verdauungstrakts aufweisen, bei denen Entzündungszustände und nekrotische Zustände der Verdauungsschleimhäute auftreten.
Die Bestimmung des Villins im Blut erweist sich auch bei der Überwachung von gutartigen Krankheiten (Geschwüre und Entzündungskrankheiten der Verdauungswege) von großen Interesse. Andererseits ist es für die Erforschung des zirkulierenden Villins möglich, in Kombination mit den erfindungsgemäßen Antikörpern andere Tumor-Marker zu verwenden, wie ACE (embryonales karzinogenes Antigen), welches derzeit zur Überwachung der Entwicklung von Krebsen verwendet wird, jedoch die folgenden Nachteile besitzt:
1) daß es bezüglich des befallenen Organs wenig spezifisch ist; und 2) auch bei verschiedenartigen gutartigen pathologischen Zuständen zu beobachten ist.

Beispiel 4: Herstellung der dem Human-Villin entsprechenden cDNA Herstellung von mRNA

Man bereitet mRNA ausgehend von der Zellinie HT29, die von einem menschlichen Kolon-Adenokarzinom abgeleitet ist. Die RNA werden mit der von Ullrich et al. In Science, 1977, 196, 1313-1319 beschriebenen Guanidiumchlorid-Methode extrahiert. Die Reinigung der polyA&spplus; mRNA erfolgt durch Säulenchromatographie über Oligo-dT-Cellulose nach der von Aviv und Leder in Proc. Natl. Scl., USA, 1972, 69, 1408-1412 beschriebenen Methode.

Herstellung der cDNA

Man bereitet den ersten und zweiten Strang der cDNA nach der von Fiddes und Goodman in Nature, 1979, 281, 351-356 beschriebenen Methode. Die sequentielle Addition von SalI-Linkern am 3'-Ende und BamH1-Linkern am 5'-Ende erfolgt nach der Methode von Helfmann et al., die in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1983, 80, 31-35 beschrieben worden ist.
Man erhält eine cDNA-Bank, die etwa 30.000 rekombinante Klone enthält.

Vektor

Man verwendet die Plasmide pEX1-3 (siehe Stanley und Luzio, EMBO Journal, 1984, 3, 1429-1430, 1984). Diese Vektoren ergeben Plasmide, die das Fusionsgen cro-LacZ enthalten, dessen Expression unter der Kontrolle des Promotors PR des Bakteriophagen Lambda gesteuert wird. Ein Polynucleotid, welches mehrere einzigartige Restriktionsstellen enthält, wurde am 3'-Ende des Gens LacZ eingefügt. Die Signale der Beendigung der Transkription und der Übersetzung werden ebenfalls in die drei Lesephasen eingefügt.
Die cDNA wurden in jedes der Plasmide pEX, die mit den Restriktionsenzymen BamH1 und SalI digeriert worden sind, eingefügt. Sie finden sich darin somit in der gleichen Orientierung in bezug auf das Gen CroLacZ.

Transformation

Man verwendet als Bakterienstamm den Stamm E. coli pop 2135, der nach O. Raibaud, wie in Nucleic Acid Research beschrieben, wie folgt gebildet worden ist:
Man klont an der Stelle BamHI einen Polylinker des Fragments Bg1II von 2,3 Kilobasen des Phagen λ, der das Allel C1857 und den Promotor PR enthält, in dem man gemäß dem folgenden Schema vorgeht:
Das in dieser Weise erhaltene Fragment EcoRI wird dann in die Stelle ECORI von pOM41 geklont und in das Chromosom des Stammes C600 überführt (siehe Gene, 29, 231-241).
Durch Cotransduktion von P1' mit einem proximalen Marker arnB führt man diese Struktur in das Chromosom von MM294 ein (F&supmin; endA thi hsdR). Man erhält E. coli pop 2135: Orientierung malT, CI857, PR maIPO.
Die Transformation des Bakterienstammes E. coli pop 2135 durch rekombinante Plasmide wird nach der Rubidium verwendenden Methode durchgeführt, die von Hanahan et al. beschrieben worden ist, J. Mol. Biol., 1983, 166, 557-580. Dieser Stamm enthält das Allel cIts857 des Repressors von cro.
Die Zahl der erhaltenen Rekombinanten liegt im Bereich von 103 bis 104 ng cDNA.

Selektion der Klone durch immunologischen Nachweis

Die erhaltenen rekombinanten Klone werden auf Nitrocellulosefiltern ausgebreitet. Die Synthese des Hybridproteins wird nach zweistündiger Inkubierung bei 42ºC induziert. Nach der Lyse der Bakterien mit SDS und Renaturierung der Proteine in Abwesenheit von Methanol werden die Klone durch immunologisches Screening analysiert. Die Renaturlerung der Proteine erfolgt nach der Technik von Burnett, die in Anal. Biochem. 1981, 112, 195-203 berichtet worden ist.
In einem ersten Durchgang wird die Bank mit einem polyklonalen Antikörper gescreent, der gegen das intakte Schweine-Villin gerichtet ist. Man bewirkt anschließend ein zweites Screening unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers, der gegen ein COOH-terminales Fragment von Hühner-Villin gerichtet ist, und zwei monoklonalen Antikörpern (BDD&sub2;C&sub3; und IID&sub3;H&sub9;), welche die in dem COOH-terminalen Bereich des Moleküls vorhandenen Epitope erkennen.
Der Klon pEXZ-V19 enthält eine Einfügung von 510 Basenpaaren. Der codierende Bereich umfaßt 330 Basenpaare. Er wird von einem nichtcodierenden Bereich mit 200 Basenpaaren gefolgt.
Die klonierte cDNA codiert für die 95 COOH-terminalen Aminosäuren des Human-Villins und repräsentiert etwa 1/10 des gesamten Proteins (Molekulargewicht: 95 Kd).
LITERATURSTELLEN:
(1) Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, J., Pictet, R., Tischer, E., Rutter, W.J. und Goodman, H.M.: Rat Insulin Genes: Construction of plasmids containing the coding sequences. Science, 1977, 196, 1313-1319.
(2) Aviv, H. und Leder, P.: Purification of biologically active globin mRNA by chromatography on oligothymidylic acid cellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972, 69, 1408-1412.
(3) Fiddes, J.C. und Goodman, H.M.: Isolation, cloning and sequence analysis of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 1979, 281, 351-355.
(4) Helfman, D.M., Feramisco, J.R., Fiddes J.C., Thomas, G.P. und Hughes, S.H.: Identification of clones that encode chicken tropomyosin by direct immunological screening of a cDNA expression library. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1983, 80, 31-35.
(5) Stanley, K.K. und Luzio, J.P.: Construction of a new family of high efficiency bacterial expression vectors: Identification of cDNA clones coding for human liver. EMBO Journal, 1984, 3, 1429-1434.
(6) Stanley, K.K.: Solubilization and immune-detection of beta-galactosidase hybrid proteins carrying foreign antigenic determinants. Nucleic Acids Res., 1983, 11, 4077-4092.
(7) Hanahan, D.: Studies on transformation of E. coli with plasmids. J. Mol. Biol., 1983, 166, 557-580.
(8) Burnett, W.N.: "Western Blotting": Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem., 1981, 112, 195-203.

Claims

1. Diagnoseverfahren zum in vitro-Nachweis von Tumorzellen, die ursprünglich im Verdauungstrakt gebildet worden sind, und/oder Derivaten davon in einer biologischen Probe, von der angenommen wird, daß sie Tumorcharakter besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß man diese biologische Probe mit einem für Villin oder sein Gen spezifischen Reagens in Kontakt bringt, welches aus Antivillin-Antikörpern, diese Antikörper, die Human-Villin erkennen, oder aus einem DNA-Fragment, welches für Human-Villin codiert, gebildet ist.

2. Gegen Villin gerichteter monoklonaler Antikörper, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

- er erkennt gereinigtes intaktes Schweine-Villin (Western Blotting),

- er erkennt das Villin des Zellextrakts der Zellinie, die von einem Adenokarzinom des menschlichen Colons abgeleitet ist (Western Blotting),

- er erkennt Ratten-Villin in der Immunocytochemie (mit Formaldehyd fixierte Gefrierschnitte (Kryostat) von Ratten-Darmschleimhaut),

- er wird durch das am 29. April 1985 unter der Hinterlegungsnummer I-440 beim C.N.C.M. hinterlegte Hybridom produziert.

3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er eine antigene Stelle in der C-terminalen Sequenz (779-854) oder dem "Kopfteil" des Hühner-Villins der Formel erkennt:

wobei dieser monoklonale Antikörper in der Lage ist, diesen "Kopfteil" zu erkennen, ob dieser isoliert oder im Inneren des im Hühner-Villin vorliegenden Peptids mit 51 kd vorhanden ist.

4. Hybridom zur Bildung des monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 2, hinterlegt am 29. April 1985 unter der Hinterlegungsnummer I-440 am C.N.C.M.

5. Biologisch reines Human-Villin, welches bei der Untersuchung der elektrophoretischen Wanderung auf Polyacrylamidgel im wesentlichen nur eine Bande des Molekulargewichts 95 kD ergibt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens, welches das Human-Villin codierende Gen erkennt, aus einer DNA gebildet ist, deren Sequenz einen Bereich aufweist, der für eine Aminosäuresequenz des Human-Villins codiert, insbesondere den COOH-terminalen Bereich.

7. Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie der vollständigen mRNA des Human-Villins oder einem DNA-Fragment entspricht, dessen Nucleotidsequenz einen Bereich aufweist, der für eine Aminosäuresequenz des Human-Villins codiert, der dazu in der Lage ist, sich spezifisch mit einer für Villin codierenden Nucleotidsequenz zu hybridisieren.

8. cDNA-Fragment, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen Teil der Nucleotidsequenz enthält, die für Aminosäuren des COOH-Endes des Human-Villins codiert, wobei die Nucleotidkette und die Kette der entsprechenden Aminosäuren die folgenden Sequenzen aufweisen:

9. Sonde zum Nachweis von mRNA oder DNA, die für Human-Villin codieren, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einen Teil der C-terminalen Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 7 umfaßt, wobei diese Sequenz gegebenenfalls durch ein radioaktives Element oder irgendeine andere Gruppe, die ihre Erkennung in hybridisiertem Zustand mit dem Präparat, das die zu untersuchende mRNA oder DNA enthält, ermöglicht.

10. Verfahren zur Herstellung der für das C-terminale Ende des Human-Villins codierenden Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß man

- mit Hilfe an sich bekannter Verfahrensweisen ausgehend von einer Zellinie, die Villin exprimiert, vollständige mRNA (Messenger-RNA) herstellt;

- eine cDNA-Bank bildet (komplementäre DNA);

- die cDNA in einen Vektor einfügt, der in der Lage ist, das durch die Einfügung codierte Protein zu exprimieren;

- mit Hilfe der erhaltenen rekombinanten Vektoren einen Bakterienstamm transformiert und dann Bedingungen einstellt, die die Expression des gewünschten Proteins in dem Bakterium ermöglichen;

- mit Hilfe von Villin erkennenden Antikörpern die rekombinanten Klone selektioniert, welche den für Villin spezifischen Klon enthalten.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufbau der cDNA-Bank mit Hilfe eines Klonierungsvektors bewirkt wird, der dazu geeignet ist, das durch die eingefügte cDNA codierte Protein zu exprimieren, insbesondere mit Hilfe von Plasmiden des Typs pEX.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bakterienstamm des Typs E. coli, insbesondere E. coll pop 2135, mit Hilfe von rekombinanten Vektoren, welche eine für das C-terminale Ende des Human-Villins codierende Nucleotidsequenz enthalten, transformiert.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Screening der cDNA-Bank mit Hilfe eines polyklonalen Anti- Villin-Antikörpers, wie eines gegen intaktes Schweine-Villin gerichteten polyklonalen Antikörpers, und dann mit einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern, die in dem COOH-terminalen Bereich vorliegende Epitope erkennen, bewirkt, wobei das Screening mit Hilfe der polyklonalen Antikörper mit Vorteil von einem sekundären Screening mit Hilfe eines weiteren polyklonalen Antikörpers gefolgt wird, insbesondere mit Hilfe eines gegen das COOH-terminale Fragment des Hühner-Villins gerichteten polyklonalen Antikörpers.

14. Klon, der eine dem Human-Villin entsprechende cDNAträgt, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch mit dem gegen das Intakte Villin gerichteten polyklonalen Antikörper, mit dem gegen das COOH-terminale Peptid des Hühner-Villins gerichteten polyklonalen Antikörper und mit den beiden, gegen die COOH-terminalen Epitope gerichteten monoklonalen Antikörper reagiert.