DE3687523T2

DE3687523T2 - Gaerverfahren zur herstellung von hepatitisimpfstoff.

Info

Publication number: DE3687523T2
Application number: DE8686905524T
Authority: DE
Inventors: C Fieschko
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1985-08-15
Filing date: 1986-08-15
Publication date: 1993-05-13
Anticipated expiration: 2006-08-16
Also published as: EP0233937A1; JPH07106141B2; JPS63500494A; DE3687523D1; WO1987001129A1; EP0233937A4; ATE84568T1; CA1288075C; EP0233937B1

Description

Hintergrund

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren und Medien für das Wachstum von Hefestämmen, die Hepatitis-B- Oberflächen-Antigen (HBsAg) exprimieren, insbesondere Verfahren und Medien für das Wachstum von Hefestämmen, die HBsAg unter aeroben, im Hinblick auf Glucose beschränkten Bedingungen, relativ niedrigen Temperaturen und relativ hohen Gehalten von freien Aminosäuren exprimieren.
Der Hepatitis-B-Virus verursacht eine Erkrankung, die heutzutage als Hepatitis B bekannt ist, früher aber als "Serum-Hepatitis" bekannt war. Es ist geschätzt worden, daß es mehr als 200.000.000 Menschen gibt, die dauerhaft Hepatitis-B-Virus in ihrem Blut haben. Infektion mit dem Virus ist ein Hauptursache von akuter Lebererkrankung. Träger von Hepatitis-B-Virus haben ein hohes Schrumpfzirhose- und Leberzellkarzinom-Risiko.
Der menschliche Hepatitis-B-Virus ist mit dem Dane-Partikel identifiziert worden, das im Serum von Trägern gefunden wird und das der verursachende Stoff klinischer Hepatitis-B-Infektion ist. Das Dane-Partikel ist eine 42 Nanometer große Membranstruktur, die Lipide, DNA und wenigstens vier Proteine: Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen (HBsAg), Hepatitis- B-Kern-Antigen (HBcAg), Hepatitis-B-e-Antigen (HBeAg) und eine DNA-Polymerase, einschließt. In ihrem Serum besitzen Träger auch 22 Nanometer große Lipid-Partikel, die HBsAg, aber nicht DNA, HBcAg, HBeAg oder DNA-Polymerase enthalten. Gegenwärtig in Gebrauch befindliche Hepatitis-B-Vakzine verwenden 22 Nanometer große Partikel, erhalten aus Human- Plasma.
Human-Plasma, das bei der Herstellung von Hepatitis-B-Vakzin verwendet wird, hat eine Antigen-Konzentration von etwa 400 Mikrogramm pro Milliliter. Weil die Gesamtserumkonzentration etwa 60 Millimeter pro Liter beträgt, ist nur eine 150fache Reinigung erforderlich. Wampler et al., in "Modern Approaches to Vaccines", Chanock et al., Hrg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, S. 251-256 (1984). Da jedoch das Ausgangsmaterial Human-Plasma ist, sind aus Plasma gewonnene Hepatitis-B-Vakzine in Hinblick auf die Verfügbarkeit beschränkt, und es muß extreme Vorsicht angewandt werden, um sicherzustellen, daß sie frei von allem schädlichen kontaminierenden Material sind, einschließlich infektiösen Viren.
Ein anderer Ansatz, Hepatitis-B-Vakzin zu erhalten, umfaßt das Infizieren von kultivierten maglignen Zellen, insbesondere Hepatomzellen, mit Hepatitis-B-Virus. HBsAg wird aus Zubereitungen lysierter Hepatomzellen geerntet. Knowles et al., PCT-Anmeldung Nr. PCT/US81/00778. Obgleich dieser Ansatz das Bedürfnis nach Human-Plasma eliminiert, begrenzen die Unerwünschtheit der Verwendung von Krebszellprodukten in Vakzinen, die Notwendigkeit extremer Vorsicht, um Infektiosität zu vermeiden, die in Säugetier-Zellkultur inhärenten Schwierigkeiten in Säugetier-Zellkultur alle die Brauchbarkeit dieses Ansatzes.
Es ist berichtet worden, daß Affennierenzellen, die mit rekombinenten Plasmiden transfiziert wurden, die das Gen für HBsAg enthielten, HBsAg durch Lyse oder durch Sekretion freisetzen. Levinson et al., EPO-Anmeldung Nr. 73,656. Nichtsdestoweniger teilt die Herstellung von Hepatitis-B- Vakzin aus Affennieren-Fibroplasten, mit der Ausnahme der Eliminierung von Besorgnissen im Hinblick auf die Verwendung von Produkten von Krebszellen, die der Herstellung von Hepatitis-B-Vakzin aus Hepatomzellen innewohnenden Nachteile.
Im Licht der Probleme mit konventioneller Vakzin-Herstellung ist es erwünschenswert, Verfahren zur Herstellung von HBsAg in Isolation von anderen Komponenten des Hepatitis-B-Virus zu besitzen. Produktion von HBsAg in Mikroorganismen durch die Verwendung rekombinanter Technologie erlaubt solch isolierte Produktion.
In einem Ansatz, rekombinante Technologie auf HBsAg-Produktion anzuwenden, kann das Gen, das für HBsAg kodiert, in ein bakterielles Plasmid inseriert und in verschiedenen Escherichia coli-Wirtsorganismen amplifiziert und exprimiert werden. Rutter et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 020,251. Es ist jedoch berichtet worden, daß diese Technik zu niedrigen Ausbeuten führt, weil HBsAg in E. coli leicht abgebaut wird, und daß das Wachstum von E. coli durch HBsAg gehemmt wird. Miyanohara et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 105,049. Es ist auch berichtet worden, daß bestimmte bakterielle Zellkomponenten, z. B. Lipopolysaccharide, für Menschen hoch toxisch sind und Reinigungsprobleme stellen, und es ist berichtet worden, daß Bakterien, die Prokaryonten sind (d. h. Mitglieder der Gruppe von Organismen, denen der Zellkern fehlt) ineffiziente Translation der Gene von Eukaryonten (d. h. Mitgliedern der Gruppe von Organismen, die einen Zellkern besitzen) bereitstellen können, insofern als: Bakterien gewisse Prozesse nicht ausführen können, wie etwa Ausspleißen von Introns oder proteolytische Spaltung von Vorläuferproteinen; Bakterien-Proteine nicht glykosylieren, phosphorylieren oder methylieren, was alles Modifikationen nach der Translation sind, die für die Immunogenität von Proteinen wichtig sein können; Bakterien das sogenannte Signalpeptid nicht erkennen, das für die Sekretion von Genprodukten in Eukaryonten wichtig ist; und Codon-Präferenz (d. h. die Möglichkeit, mit der eine bestimme Sequenz von Nukleinsäuren, die für einen Aminosäurebestandteil des Proteins kodiert, exprimiert wird) in prokaryontischen und eukaryontischen Organismen verschieden sein kann. Hofschneider et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 105,141.
Ein anderer Ansatz zur Expression von HBsAg in Mikroorganismen, und einer, der nahezu alle Einwände gegen die Verwendung von E. coli als Wirt überwindet, verwendet ein Hefe-Expressionssystem. Solche Expressionssysteme haben im allgemeinen die Verwendung von Bakterien-Hefe-Pendelvektoren umfaßt, die Plasmide mit Sequenzen sind, die die Replikation sowohl in Bakterien als auch in Hefe ermöglichen. Rutter et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 072,318; Hitzemann et al., Europäische Patenanmeldung Nr. 073,657; Cabezon et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 106,828; und Bitter et al., Gene, 263-274 (1984). Hefe bietet mehrere Vorteile für die Produktion von eukaryontischen Genprodukten: Hefe sind GRAS-Organismen, die im allgemeinen als sicher anerkannt sind; Hefe wird in Kulturen leicht in großen Mengen gezüchtet; die Hefekultur-Technologie im großen Maßstab ist gut verstanden; weil Hefezellen eukaryontisch sind, enthalten sie Verarbeitungsorganismen für Glykosylierung, Phosphorylierung und Methylierung; und Hefezellen tolerieren das HBsAg-Protein besser. Rutter et al., aaO; Hitzeman et al., aaO. Darüber hinaus haben aus Hefe gewonnene Partikel, trotz Bedenken, daß in Hefe produziertes HBsAg ein niedrigeres immunogenes Potenzial haben könnte als die in Säugetierzellen produzierte Form (Hofschneider et al.; aaO), einen ED&sub5;&sub0; (ein Maß für die notwendige effektive Dosis, um eine Immunantwort hervorzurufen) von 112 mg, der nur geringfügig höher ist als der ED&sub5;&sub0; von 98 mg für aus Säugetierzellen gewonnene Partikel. Burnette et al., in "Modern Approaches to Vaccines", Chanock et al., Hrg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 245-250 (1984).
Ein wichtiger kommerzieller Aspekt der Produktion von HBsAg- Polypeptiden in Hefe sind die Kosten pro Gramm. Diese Kosten werden gesenkt durch: (1) Erhöhen des Wachstums von Hefe; (2) Erhöhen der Produktion von oder Verhindern der Zerstörung von einmal produzierten HBsAg-Polypeptiden.
Bei einem Ansatz für das Wachstum von Hefe wird die Kultur unter Glucose-Beschränkung gezüchtet, wodurch die Glucose bei einer relativ niedrigen Konzentration gehalten wird, verhindert wird, daß die Wachstumsrate einen vorgegebenen Wert übersteigt, und Sauerstoff bei einer relativ hohen Konzentration gehalten wird. Unter Verwendung dieser Techniken wird die Bildung von Ethanol minimiert. Fiechter et al., Advances in Microbial Physiology, 22, 123-183 (1981); in Yeast Technology, Reed et al., AVI Publishing Co., Inc., Westport, Connecticut (1973) S. 53-81. Zum Beispiel kann eine computergesteuerte Produktion von Bäckerhefe in einem mit einem Computer gekoppelten Bioreaktor den Respirationsquotienten RQ (Mol produziertes CO&sub2;/Mol verbrauchtes O&sub2;) und die Ethanolkonzentration als Feedback-Parameter bei einer automatischen Steuerung der Additionsrate von Glucose in einem batchweise beschickten Medium verwenden. Woehrer et al., Biotechnol. Bioeng., 23, 567-581 (1981).
Ein Hefetyp, der bei der Expression von rekombinanten Genprodukten verwendet wird, ist Saccharaomyces cerevisiae. Siehe z. B. Bitter et al., Gene, 23, 263-274 (1984).
Komponenten von Medien für die Kultur von rekombinante Gen- Produkte exprimierender Hefe schließen ein: 0,2 % w/v Glucose im Minimalmedium von Spizizen (Beggs, Nature, 275, 104-109 (1978; YEPD mit 2 % (w/v) Pepton und 2 % Glucose oder 6,7 g/l Hefe-Stickstoffbasis, 5 g/l Casaminosäuren und 20 g/l Glucose für HBsAg-Expression [Rutter et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 72,318]; YHB-Leucin bei 30ºC für HBsAg-Expression [Hitzeman et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 73,657]; 0,67 % Hefe-Stickstoffbasis, 0,5 % tryptophanfreie Casaminosäuren und 2 % Glucose für Expression von HBsAg [Valenzuela et al., Nature, 298, 347-350 (1982)); 2 % Glucose, 0,7 % Hefe-Stickstoffbasis-Aminosäure und 2 % YPD (2 % Polypepton, 1 % Hefeextrakt und 2 % Glucose) oder YPD allein oder BurkHolder-Minimalmedium bei 30ºC für Expression von HBsAg [Miyanohara et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 105,149]; 8,5 g/l Hefeextrakt bei Umgebungstemperatur (etwa 24ºC) für die Produktion von Ethanol aus Xylulose [Gong et al., U.S. Patent Nr. 4,490,468]; 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton und 2 % Glucose für HBsAg-Expression [Valenzuela et al., Biotechnology, 3, 317-320 (1985)]; und Hefe-Minimalsalzmedium plus 2 % Glucose oder 10 % hydrolysierte Maisstärke (mit einer mittleren Polymergröße von 13 bis 17 Glucosemolekülen) oder eine kontinuierliche Glucosezufuhr für Glucoamylase-Expression [Innis et al., Science, 228, 21-26 (1985)]. Solche Medien werden für die Batch-Zucht von Hefe verwendet und werden typischerweise zu sowohl niedrigen Zellkonzentrationen als auch höchstwahrscheinlich niedrigen Expressionniveaus von HBsAg führen. Zum Beispiel ergeben in YMS-Medium in Rüttelkolben gezüchtete Zellen typischerweise Ausbeuten von nur 50-200 ng/OD ml HBsAg.
Man glaubt, daß ein bevorzugtes Medium und ein bevorzugter Satz von Kulturbedingungen für das Exprimieren fremder Polypeptide in Hefe noch zu definieren bleibt.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Medium für die Kultivierung von Hefe zur Verfügung gestellt, die in der Lage ist, ein fremdes Gen-Produkt zu exprimieren, welches umfaßt:
ausgewogene freie Aminosäuren in einer Konzentration zwischen etwa 20 g/l und etwa 160 g/l.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Medium zur Kultivierung von Hefe, die in der Lage ist, ein fremdes Gen- Produkt zu exprimieren.
Es ist ein Medium offenbart, das ausgewogene freie Aminosäuren in einer Konzentration zwischen etwa 20 g/l und etwa 160 g/l umfaßt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein Verfahren zur Fermentation von Hefe zur Verfügung gestellt, die in der Lage ist, ein exogenes Gen-Produkt zu exprimieren, welches die Schritte umfaßt:
Einbringen der Hefe in ein Kulturmedium, das ausgewogene freie Aminosäuren in einer Konzentration zwischen etwa 20 g/l und etwa 160 g/l umfaßt; und
Kultivieren der Hefe bei einer Temperatur von etwa 25ºC.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Züchten von Hefe zur Verfügung, die in der Lage ist, ein fremdes Gen-Produkt zu exprimieren.
Es wird ein Verfahren offenbart, bei dem die Hefe in ein ausgewogenes Medium eingebracht wird, das freie Aminosäuren in einer Konzentration zwischen etwa 20 g/l und etwa 160 g/l einschließt. Die Hefe wird bei einer Temperatur von etwa 25ºC kultiviert.
Ein anderes Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Fermentation von Hefe zur Verfügung, die in der Lage ist, ein exogene Gen-Produkt zu exprimieren, welches die Schritte umfaßt:
Kultivieren der Hefe in einem Medium, mit Konzentration der Kohlenstoffquelle, die oberhalb, aber so nah wie möglich bei 0 gehalten wird, und einer Ethanolkonzentration, die so nahe wie möglich bei 0 gehalten wird; und
Aufrechterhalten der Temperatur des Mediums bei etwa 25ºC. Die Hefe wird bei einer Temperatur von 25ºC kultiviert und mit einer Nährstofflösung derart beschickt, daß die Kohlenstoffquelle bei einer Konzentration oberhalb, aber so nahe wie möglich an 0 gehalten wird und Ethanol sich nicht ansammelt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht einen Standard-Fermentationsdurchlauf für die Fermentation von Hefe, die HBsAg exprimiert;
Fig. 2 zeigt Darstellungen von Ethanolkonzentration, Glucosekonzentration und OD&sub6;&sub0;&sub0; für den Durchlauf von Fig. 1;
Fig. 3 stellt Wachstumsausbeutedaten für den Durchlauf von Fig. 1 dar;
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung von OD&sub6;&sub0;&sub0; für Zellen, die in Minimal- und Vollmedien gezüchtet worden sind;
Fig. 5 ist eine Darstellung von Zell- und Ethanolkonzentration gegen Zeit;
Fig. 6 veranschaulicht das Wachstum eines Hefestammes auf Ethanol mit und ohne Casaminosäuren;
Fig. 7 ist eine Vergleichsdarstellung von Zellkonzentration gegen Zeit bei verschiedenen Konzentrationen an Casaminosäuren;
Fig. 8 stellt Wachstumsprofile für einen Durchlauf auf einem Medium dar, das mit Casaminosäuren ergänzt ist;
Fig. 9 veranschaulicht Wachstumsprofile für einen Durchlauf auf einem Medium, das mit Casaminosäuren ergänzt ist;
Fig. 10 veranschaulicht Wachstumsprofile für einen Durchlauf auf einem Medium gemaß der vorliegenden Erfindung;
Fig. 11 veranschaulicht Wachstumsprofile für einen Durchlauf bei verringerter Temperatur gemäß der vorliegenden Erfindung;
Fig. 12 veranschaulicht einen Durchlauf auf einem Minimalmedium und bei einer verringerten Temperatur gemäß der vorliegenden Erfindung; und
Fig. 13 stellt einen Durchlauf auf einem Medium gemäß der vorliegenden Erfindung und bei einer verringerten Temperatur gemäß der vorliegenden Erfindung dar.

Detaillierte Beschreibung

Effizientes Wachstum von L. cerevisiae zu hohen Zellkonzentrationen auf Glucose ist in der Vergangenheit auf zwei fundamentale Probleme gestoßen: (1) die Wachstumsausbeute des Organismus (g Hefetrockengewicht/g Glucose) ist niedrig und (2) die erreichte maximale Zellkonzentration ist typischerweise niedriger als Werte von 30-80 g/l Hefetrockengewicht, die häufig in der Literatur berichtet werden.
Eine Untersuchung wurde vorgenommen, um den gesamten Kohlenstoff aufzulisten, der dem Fermenter in Form von Glucose während eines Standardfermentationsdurchlaufes zugesetzt wird, um zu versuchen, ein Kohlenstoffgleichgewicht zwischen Substrat-Glucose und Zellprodukten und Kohlendioxid zu bestimmen.

Beispiel 1

Ein "Standard"-Durchlauf von der Art, wie er normalerweise für die Produktion von Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen- Fermentation von S. cerevisiae verwendet wird, wurde durchgeführt. In solch einem Durchlauf werden die Zellen anfänglich batchweise in einem Vollmedium gezüchtet, das 5 g/l Glucose enthält. Hach acht Stunden Wachstum wird eine kontinuierliche Zufuhr, die konzentrierte Glucose, Casaminosäuren, Hefe-Stickstoffbasis und Vitamine und Mineralien enthält, gestartet. Die Zufuhrrate wird dann in achtstündigen Intervallen sukzessiv erhöht.
In einem Standarddurchlauf (bezeichnet als 176-3) enthielt ein Batch-Medium: 6 g/l Glucose; 2 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 2 g/l (NH&sub4;)&sub2;PO&sub4;; 2 g/l Casaminosäuren; 2 g/l Hefe-Stickstoffbasis; 2 g/l MgSO&sub4;; 0,3 ml Thiamin (1 %ige Lösung) pro Liter; 1 ml Spurenmetallösung A (27 g/l FeCl&sub3;·6H&sub2;O; 2,0 g/l ZnCl&sub2;·4H&sub2;O; 2,0 g/l CaCl&sub2;·6H&sub2;O; 20 g/l NaMoO&sub4;·2H&sub2;O; 1,0 g/l CaCl&sub2;·2H&sub2;O; 1,9 g/l CaSO&sub4;·5H&sub2;O; 0,5 g/l H&sub3;BO&sub3;; und 100 ml/l konzentrierte HCl) pro Liter; und 1 ml Vitaminlösung A [0,42 g/l Riboflavin; 5,4 g/l Pantothensäure; 6,1 g/l Niacin; 1,4 g/l Pyridoxin; 0,06 g/l Biotin; und 0,04 g/l Polsäure] pro Liter. Ein Zufuhrmedium für ein Standarddurchlauf enthielt: 400 g/l Glucose; 5 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 5 g/l (NH&sub4;)&sub2;PO&sub4;; 100 g/l Casaminosäuren; 12 g/l Hefe- Stickstoffbasis; 5 g/l MgSO&sub4;; 0,3 ml Thiamin (1 %ige Lösung) pro Liter; 1 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 1 ml Vitaminlösung A pro Liter.
Während Durchlauf 176-3 wurde das Abgas aus dem Fermenter auf CO&sub2; und O&sub2; unter Verwendung eines Massenspektrometers überwacht, und diese Werte wurden alle vier Stunden aufgezeichnet. Diese Daten sind im Fig. 1 graphisch dargestellt. Zusätzlich wurden Proben gesammelt und alle vier Stunden zentrifugiert und der Kulturüberstand für spätere Analyse eingefroren.
Glucoseanalyse der Kulturbrühe zeigte, daß während der Fermentation Glucose beschränkend war, d. h. die Konzentration betrug weniger als 100 mg/Liter. Daher wurde eine Kohlenstoffbilanz zwischen Glucose und CO&sub2; plus Zellen durchgeführt, um zu bestimmen, ob alle Glucose zugerechnet werden konnte. Eine Bilanz über den gesamten Zeitverlauf der Fermentation wurde durchgeführt, indem die CO&sub2;-Daten in Fig. 1 graphisch integriert wurden. Diese Integration zeigte, daß 11,15 Mol CO&sub2; während des Verlaufs der Fermentation produziert wurden. Am Ende der Fermentation waren insgesamt 1.630 g Glucose verbraucht worden und 177 g Hefe waren produziert worden. Angenommen, daß die Hefe zu 50 % Kohlenstoff ist, errechnet sich die Bilanz wie folgt:
1.630 g Glucose → 491 g CO&sub2; + 177 g Hefe oder auf einer Kohlenstoffbasis: 652 g C → 134g C + 88,5 g C
Mit anderen Worten können 652 - (134 + 88,5) = 429 g Kohlenstoff oder 66 % der Glucose nicht zugerechnet werden. Extrazelluläres sekretiertes Protein wurde als Sitz des Kohlenstoffdefizits eliminiert, weil Biuret-Proteintests nur Spurenmengen von Protein im Kulturüberstand zeigten.
Glucose kann durch Hefe auf einem von zwei Wegen metabolisiert werden. Vollständige Oxidation von Glucose über den oxidativen Weg produziert große Mengen von Energie (16-28 Mol ATP/Mol Glucose) während der Reaktion
(1) C&sub6;H&sub1;&sub2;O&sub6; → 6CO&sub2;+ 6H&sub2;O + Zellen
und ist durch einen RQ [Respirationsquotient = Mol produziertes CO&sub2;/Mol verbrauchtes O&sub2;] von 1,0-1,2 gekennzeichnet. Andererseits produziert partiale Oxidation über den fermentativen Weg niedrige Energieausbeuten (2 Mol ATP/Mol Glucose) gemäß der Reaktion
(2) C&sub6;H&sub1;&sub2;O&sub6; → 2C&sub2;H&sub5;OH + 2CO&sub2; + Zellen mit einem RQ»1,0.
Untersuchung der RQ-Daten in Fig. 1 zeigt, daß der Wert für RQ konsistent oberhalb 3,0 liegt. Daher trat beträchtlicher fermentativer Stoffwechsel auf. Dies wurde durch Messen der Ethanolkonzentration in der Brühe verifiziert. Die Profile von Ethanol, Glucose, CO&sub2; und OD&sub6;&sub0;&sub0; für Durchlauf 176.3 sind Fig. 2 aufgetragen. Am Ende der Fermentation hatten sich 73 g/l Ethanol im Medium angesammelt und waren für insgesamt 381 g Kohlenstoff verantwortlich. Einschluß dieses Wertes in die Kohlenstoffbilanz:
(3) Glucose → CO&sub2;+ Hefe + Ethanol 652 g C → 134 g C + 88,5 g C + 381 g C
ergibt eine Kohlenstoffrückgewinnung von 92 %. Das verbleibende Kohlenstoffdefizit beruht wahrscheinlich auf dem Verlust von Ethanol im Abgas oder auf Meßfehlern.
Die Wirkung dieses Übergangs von oxidativen zu fermentativen Wegen kann auch an den Wachstumsausbeutedaten (g Hefetrockengewicht/g Glucose) für Durchlauf 176-3 gesehen werden, wie in Tabelle I und Fig. 3 angegeben, wobei der OD&sub6;&sub0;&sub0; (optische Dichte bei 600 nm) mit A bezeichnet ist, der prozentuale Anteil von CO&sub2; B bezeichnet ist, die Konzentration von Glucose (in g/l) mit C bezeichnet ist und die Konzentration von Ethanol (in g/l) mit D bezeichnet ist. Tabelle I Stunden Respirations-Quotient Ethanol Glucose
Ein Abfall in der Wachstumsausbeute über die Zeit wird erwartet, weil, während oxidativer Metabolismus von Glucose 16 bis 28 Mol ATP/Mol Glucose zur Verfügung stellt, der fermentative Metabolismus, der in der Fermentation vorherrscht, nur etwa ein Zehntel soviel Energie oder 2 Mol ATP/Mol Glucose zur Verfügung stellt.
Die Untersuchung der Daten für den Respirationsquotienten, die Wachstumsausbeute und die Ethanolkonzentration zeigen somit beträchtlichen fermentativen Metabolismus von Glucose zu Ethanol während des Feed-Batch-Wachstums von S. cerevisiae. Dieser Metabolismustyp führt zu niedriger Energieausbeute aus Glucose und damit niedriger Ausbeute an Hefezellen. Das produzierte Ethanol seinerseits führt zu einem abgesenkten maximalen spezifischen Wachstumrate. Ethanol ist ein bekannter nicht-kompetitiver Wachstumsinhibitor von Hefe und gehorcht der Gleichung:
(4) umi = um(Ki)/(i+Ki)
in der umi die verringerte maximale spezifische Wachstumsrate ist, die auftritt, wenn der Wachstumsinhibitor in einer Konzentration von i mit einer Hemmungskonstante von Ki vorhanden ist. Es ist berichtet worden, daß der Wert von Ki von Ethanol der das Wachstum von S. cerevisiae beeinflußt, bei etwa 25 g Ethanol/Liter liegt. Daher wird die maximale spezifische Wachstumsrate, wenn mehr und mehr Ethanol produziert wird, weiter und weiter gesenkt trotz der Zugabe von Glucose mit ansteigenden Raten. Der einzige Aktionsweg, der der Hefezelle offensteht, ist die Produktion von mehr Ethanol, weil ihre maximale spezifische Wachstumsrate niedriger als die Additionsrate von Glucose ist.
Partiale Oxidation von Glucose zu Ethanol durch Hefen tritt unter einer der drei Bedingungen (1) bei niedrigen gelösten Sauerstoffkonzentrationen, (2) unter Bedingungen von Glucoseüberschuß oder (3) bei einer zu hohen spezifischen Wachstumsrate auf. In Beispiel 1 gab es (1) genügend Sauerstoff und (2) wurde die Glucosekonzentration nahe 0 gehalten; jedoch wurde (3) die Wachstumsrate der Zelle bei ihrem Maximum gehalten, weil Glucose mit einer Rate zugegeben wurde, die weit oberhalb der maximalen spezifischen Wachstumsrate der Zellen lag. In diesem Licht beschreibt Beispiel 2 Experimente, in denen die spezifische Wachstumsrate der Kultur auf einem niedrigeren Niveau gehalten wird, um (1) eine viel höhere Wachstumsausbeute von Zellen aus Glucose und (2) eine viel höhere endgültige Zellkonzentration bereitzustellen, weil hemmende Konzentrationen von Ethanol nicht gebildet wurden.

Beispiel 2

In einer Studie über Mediumzusammensetzung und Zufuhrrate wurden HBsAg exprimierende Zellen eines Stammes SC RH 218/pGPD-1 [dessen Konstruktion bei Bitter et al., Gene, 32, 263-274 (1984) beschrieben ist] bei 30ºC, pH 4,5 in einem Durchlauf (bezeichnet als 193-2) auf Minimalmedium und ,in einem Durchlauf (bezeichnet als 176-3 und beschrieben in Beispiel 1) auf einem Vollmedium, ergänzt mit säurehydrolysierten Casaminosäuren, gezüchtet. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 veranschaulicht, wobei eine graphische Darstellung von OD&sub6;&sub0;&sub0; für Zellen, die auf den Minimalmedium gewachsen sind, mit M bezeichnet ist und eine graphische Darstellung von OD&sub6;&sub0;&sub0; für Zellen, die auf dem Vollmedium (wie für Durchlauf 176-3 beschrieben) gewachsen sind, mit R bezeichnet wird.
In einem Minimal-Batch-Medium waren die folgenden Bestandteile eingeschlossen: 5 g/l Glucose; 5 g/l K&sub2;HPO&sub4;; 2 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 1 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 0,2 ml 1 %ige Thiaminlösung pro Liter; 1 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 1 ml Vitaminlösung A pro Liter; 0,02 g/l Inosit; und 0,17 g/l DOW ® P2000 (Polypropylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 2000). In einem Minimal-Feed-Medium wurden die folgenden Bestandteile eingeschlossen: 400 g/l Glucose; 25 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 64 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 15 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 0,5 ml 1 %ige Thiaminlösung pro Liter; 0,5 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 0,5 ml Vitaminlösung A pro Liter; und 0,05 g/l Inosit.
Wachstum auf Minimal-Medium produziert eine Zellkonzentration mit einem OD = 24 (26 g Zelltrockengewicht/Liter). Bei 24 Stunden wurde die Zugabe von Glucose zum Fermenter gestoppt. Von 24 bis 32 Stunden nahm die Ethanolkonzentration von 14 auf 9 g/Liter ab, aber die Zellkonzentration stieg nicht an. Somit nutzen die Zellen, die aus dem Minimal-Medium gewachsen sind, angesammeltes Ethanol im Medium nicht effektiv für Zell-Biosynthese, wie aus Fig. 5 abgeleitet werden kann.
Weil dieser Stamm ein diauxisches, d. h. ein zweiphasiges Wachstum auf Glucose und Ethanol im YMS zeigt, wurden Rüttelkolben-Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Zellen durch Züchten auf dem produzierten Ethanol in einem Medium, das leicht mit säurehydrolysierten Casaminosäuren ergänzt ist, zu höherer Zellkonzentration wachsen wurden. YMS-Medium besteht aus: 6,7 g/l Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren (Difco, Detroit, Michigan 48232), 5 g/l Casaminosäuren (BBL, BBL Microbiology Systems, Becton Dickinson and Co., Cockeysville, MD 21030) und 20 g/l Glucose. Die Ergebnisse dieses Experiments, durchgeführt mit Duplikatkolben mit einem Minimalmedium [100 mM (PO&sub4;)&supmin;²; 1 g/l NH&sub4; Cl; 0,5 g/l NaCl; 0,002 M MgSO&sub4;; 0,0002 M CaCl&sub2;; und 5 g/l Glucose] plus 3 g/l Casaminosäuren erscheint in Fig. 6. Wie in Fig. 6 veranschaulicht wird viel schnelleres Wachstum auf Ethanol erreicht, wenn Casaminosäuren im Medium enthalten sind.
Die Variation von Zellkonzentration mit der Zeit für Wachstum bei 30ºC und bei pH 4,5 in Gegenwart von Konzentrationen von 5 und 10 g/l Casaminosäuren, enthalten im Batch-Wachstumsmedium, ist in Fig. 7 veranschaulicht. Die Resultate eines Durchlaufs (bezeichnet als 211-6) mit 10 g/l Casaminosäuren im Batch-Medium und 20 g/l Casaminosäuren im Feed-Medium ist mit H bezeichnet und eine graphische Darstellung der Ergebnisse des Durchlaufs (bezeichnet als 211-5) mit 5 g/l Casaminosäuren im Batch-Medium und 10 g/l Casaminosäuren in Feed-Medium ist in Fig. 7 mit L bezeichnet. Die Ethanolkonzentration in den Durchläufen 211-5 und 211-6 stiegen nie über 2 g Ethanol/Liter, während die Ethanolkonzentration für Durchlauf 176-3 im Vollmedium auf über 70 g Ethanol/Liter am Ende der Fermentation anstieg. Ein Auftrag der Zellkonzentration über die Zeit für Durchlauf 176-3 ist in Fig. 5 als die mit N bezeichnete Linie enthalten.
Ein Batch-Medium für Durchlauf 211-5 enthielt: 2 g/l Glucose; 5 g/l Casaminosäuren; 5 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 2 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 1 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 0,2 ml 1 % Thiamin pro Liter; 1 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 1 ml Vitaminlösung A pro Liter; und 0,117 ml DOW ® P2000 pro Liter. Ein Feed-Medium für Durchlauf 211-5 enthielt 275 g/l Glucose, 10 g/l Casaminosäuren; 25 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 50 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 15 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 1 ml 1 % Thiamin pro Liter; 2,5 ml Spurenmetallösung A pro Liter; und 2,5 ml Vitaminlösung A pro Liter. Ein Batch-Medium für Durchlauf 211-6 enthielt: 2 g/l Glucose; 10 g/l Casaminosäuren; 5 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 2 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 1 ml 1M MgSO&sub4;; 1 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 0,2 ml 1 % Thiamin pro Liter; 1 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 1 ml Vitaminlösung A pro Liter; und 0,17 ml DOW ® P2000 pro Liter. Ein Feed- Medium für Durchlauf 211-6 enthielt: 275 g/l Glucose; 20 g/l Casaminosäuren; 25 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 50 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 15 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 1 ml 1 % Thiamin pro Liter; 2,5 ml Spurenmetallösung A pro Liter; und 2,5 ml Vitaminlösung A pro Liter.
Die spezifische Wachstumsrate des Organismus muß unter einem bestimmten Niveau gehalten werden, um die toxische Ansammlung von Ethanol zu vermeiden. Wie oben angegeben, sammelte sich Ethanol in Durchlauf 176-3 zu mehr als 70 g/l an, wodurch (1) die Wachstumsausbeute beträchtlich verringert (auf 0,12 g Zelltrockengewicht/g Glucose) und (2) die Wachstumsrate und endgültige Zellkonzentration gehemmt wurde (auf 16 g Zelltrockengewicht/Liter). In Durchlauf 211-6 wurde die Wachstumsrate jedoch sorgfältig durch die Additionsrate von Glucose gesteuert und kein Ethanol sammelte sich im Medium an, was zu (1) einer erhöhten Wachstumsausbeute von 0,34 g Zelltrockengewicht/g Glucose und (2) zu einer erhöhten Zellkonzentration führte (auf 68,2 g Zelltrockengewicht/Liter).
Um Ethanolansammlung in den Durchläufen 211-6 und 211-5 zu vermeiden, wurde Glucose sehr langsam in dem Fermenter zugeführt. Es ist bevorzugt, daß die Zufuhrrate bis zu einem Punkt gerade unterhalb des Punktes erhöht wird, wo Ethanol beginnt, sich zu akkumulieren, um eine bessere Fermenterproduktivität zu ermöglichen. Dies kann empirisch durch Überwachung von Ethanol und Respirationsquotient (RQ) erreicht werden. Als Alternative kann die mit einem Computer gekoppelte Steuerung der Glukoseadditionsrate zum RQ verwendet werden, wie offenbart bei Woehrer et al., Biotechnol. Bioeng., 23, 567-581 (1981).
Beispiel 3 beschreibt das Wachstum des S. cerevisiae(PH 218)- Stamms SC RH 218/pGPD-1, der eine Plasmid pGPD-1 enthält, wie beschrieben bei Bitter et al., Gene, 32, 263-274 (1984), auf Zellkonzentrationen von über 200 g Trockengewicht/Liter (äquivalent zu einem OD&sub6;&sub0;&sub0; von 190 und 460, gemessen auf einem Spectronic 20 [Bausche & Lombe, Rochester, New York] bzw. auf einem Beckman Spektrophotometer) und bei Expressionsniveau bis zu 1,8 mg HBsAg/g Trockengewicht Zellen (äquivalent zu 600 ng HBsAg/OD-ml) in Gegenwart von hohen Gehalten an Casaminosäuren.

Beispiel 3

In beiden Durchläufen auf Casaminosäuren in Beispiel 2 gab es bei t=40 Stunden und bei t=50 Stunden einen "Totpunkt", an den die Kultur unabsichtlich an Magnesium hungerte und nicht wuchs. Die Kultur wuchs nicht, bis zusätzliches MgSO&sub4; dazu gegeben wurde. Der Magnesiummangel trat auf, weil das Medium für viel weniger effiziente Verwendung von Glucose konzipiert war, d. h. eine Wachstumsausbeute von 0,15 g Zelltrockengewicht/g Glucose. Als das Medium ausgeglichen war und die tatsächliche Wachstumsausbeute viel größer war, d. h. 0,34 g Zelltrockengewicht/g Glucose, wurden andere Nährstoffe beschränkend. Ein neues Medium, das so konzipiert ist, daß es die neue Wachstumsausbeute berücksichtigt, vermeidet die unabsichtliche Nährstoffverarmung. Eine Batch- Mediumzusammensetzung ist in Tabelle II aufgelistet.

Tabelle II

Gereinigtes Wasser 7 l
Säurehydrolysierte Casaminosäuren 202 g
KH&sub2;PO&sub4; 108 g
(NH)2SO 30 g
Glucose 16 g
Inosit 0,16 g
MgSO&sub4;(1M) 32 ml
Spurenmetallsg. A 24 ml
DOW ® P2000 Antischonmittel 1 ml
Thiaminlsg. (1 %) 3,2 ml
Vitaminlsg. A 24 ml
NH&sub4;OH (30 % w/w als NH&sub3;) und H&sub3;PO&sub4;(85 % w/w) wurden bei Bedarf zugegeben, um den pH bei 4,5 zu halten.
Die Glucose, Inosit und MgSO&sub4; wurden in gereinigten Wasser zusammengebracht aufgefüllt auf 200 ml und für etwa 30 Minuten bei 121º C autoklaviert. Spurenmetallösung A, die 1 %ige Thiamin-Lösung und Vitaminlösung A werden aseptisch zugegeben, um Lösung Ia zu bilden. Zu etwa 7,0 Liter gereinigtem Wasser in einem Fermenter werden die Casaminosäuren, KH&sub2;PO&sub4;, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; und Antischaummittel zugegeben. Der Fermenter wird zunächst sterilisiert und danach auf etwa 30º C abgekühlt. Als nächstes wird die Lösung Ia zum Fermenter dazugegeben.
Die Feed-Mediumzusammensetzung ist in Tabelle III gezeigt.

Tabelle III

Gereinigtes Wasser bis zu 6 l
Glucose 3200 g
Casaminosäuren 656 g
KH&sub2;PO&sub4; 17,1 g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 30 g
MgSO&sub4;7H&sub2;O (1M) 90 ml
Thiaminlsg. (1 %) 8,6 ml
Spurenmetalllsg. A 40,5 ml
Vitaminlsg. A 40,5 ,ml
Inosit 0,2 g
Die Glucose, Inosit und MgSO&sub4; werden im gereinigten Wasser bis zu 4 Litern zusammengebracht, um Lösung Ib zu bilden, und bei etwa 121º C für etwa 30 Minuten autoklaviert. Die Casaminosäuren, KH&sub2;PO&sub4; und (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; werden im gereinigten Wasser bis zu 2 Litern zusammengebracht, um Lösung IIb zu bilden, die bei etwa 121º C für etwa 30 Minuten autoklaviert wird. Die Lösungen Ib und IIb werden auf Raumtemperatur abgekühlt und dann aseptisch kombiniert. Die Thiaminlösung, die Spurenmetall-Lösung A und die Vitaminlösung A werden bei der Mischung der Lösungen Ib und IIb zugegeben.
Die neuen Medien wurden verwendet, um SC RH 218/pGPD-1 auf hohe Zellkonzentration unter den Glucose-Zufuhrbedingungen von Beispiel 2 zu züchten. Die Implementation dieses Mediums in einem Durchlauf, bezeichnet als 226-4, ein abgestuftes Zufuhrschema und Manupulation von Bewegen, Belüften und Rückdruck (um genügend Sauerstofftransfer in die Fermentationsbrühe zu ermöglichen) führte zu Zellkonzentrationen von mehr als 190, gemessen auf einem Spectronic20Spektrophotometer bei 600 nm. Fig. 8 stellt Profile für Durchlauf 226-4 (bei 30ºC, pH 4,5) von Zellkonzentration, bezeichnet mit A (OD&sub6;&sub0;&sub0;), HBsAg-Konzentration in mg/l Brühe (X10), bezeichnet als B, und der spezifischen HBsAg-Konzentration (RIA Ausria von Abbott Labs in ng/OD-ml, wobei 600 ng HBsAg/OD-ml = 1,8 mg HBsAg/g Trockengewichts Zellen) bezeichnet mit C, dar.
Ein Batch-Medium für Durchlauf 226-4 enthält: 2 g/l Glucose; 5 g/l Gasaminosäuren; 13,2 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 10 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 8 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 0,4 ml 1 % Thiamin pro Liter; 3 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 3 ml Vitaminlösung A pro Liter; und 0,02 g/l Inosit. Ein Feed-Medium für Durchlauf 226-4 enthält: 528,5 g/l Glucose; 2,86 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 0,50 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 15 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 1,43 ml 1 % Thiamin pro Liter; 7,14 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 7,14 ml Vitaminlösung A pro Liter; und 0,03 g/l Inosit.
In Fig. 8 hat die Konzentration von HBsAg einen Peak bei 33 mg HBsAg/Liter etwa 70 Stunden in die Fermentation hinein (bei einer OD von 120). Nach diesem Punkt fällt die HBsAg- Konzentration schnell und kontinuierlich bis zum Ende der Fermentation, trotz des weiteren Anstiegs in der Zellkonzentration auf eine OD von etwa 190.
Western-Blots bestätigten eine Abnahme in der spezifischen Menge von Antigen-Protein während dieses Zeitintervalls, und somit kann die Abnahme in RIA-HBsAg-Partikelkonzentration wenigstens teilweise der Abnahme in der proteinhaltigen Komponente zugerechnet werden. Es ist jedoch nicht klar, ob das Antigen-Protein eine Proteolyse durchläuft und/oder einfach nicht von der Zelle synthesisiert und die früh in der Fermentation produzierte Menge durch das Wachstum von Zellen mit wenig oder gar keinem Antigen-Protein verdünnt wird.
Proteolyse ist normalerweise am größten in Zellen, die langsam wachsen oder in stationärer Phase sind oder die in Minimal-Medium gezüchtet werden oder die bei superoptimalen Temperaturen gezüchtet werden. Weil die Zellen in Durchlauf 226-4 in Minimal-Medium gezüchtet wurden, das nur leicht mit Casaminosäuren ergänzt war, war der anfängliche vorgenommene Ansatz, das Wachstumsmedium mit Casaminosäuren anzureichern. In Durchlauf 211-5 von Beispiel 2 waren das Batch- und das Feed-Medium ähnlich zu dem in Durchlauf 226-4 verwendeten, mit der Ausnahme, daß Zugaben vom Casaminosäuren von 5 g/l und 10 g/l stoßweise bei etwa 38 und 54 Stunden vorgenommen wurden.
Wie in Fig. 9 gezeigt, in der OD&sub6;&sub0;&sub0; mit A bezeichnet ist, half die Zugabe von Gasaminosäuren in einem mit 216-6 bezeichneten Durchlauf nicht nur, HBsAg zu "stabilisieren" [siehe das Plateau in (mg HBsAg/Liter) X 10, bezeichnet als B] von 55 bis 75 Stunden, sondern bewirkte auch, daß die spezifische Menge an Antigen (in ng/OD-ml) [bezeichnet als C] bei 38 und 55 Stunden dramatisch sprang. Ob die Gasaminosäuren den proteolytischen Verlust von HBsAg verringerten oder eine Stimulierung in HBsAg bewirkten, das Nettoergebnis war ein Anstieg in den Mengen an HBsAg.
Ein Batch-Medium für Durchlauf 216-6 enthielt: 2 g/l Glucose, 5 g/l Gasaminosäuren; 13,2 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 10 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 4 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 0,4 ml 1 % Thiamin pro Liter; 1 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 1 ml Vitaminlösung A pro Liter; 0,04 g/l filter-sterilisiertes Inosit; und 0,2 ml DOW® P2000 pro Liter. Ein Feed-Medium für Durchlauf 216-6 enthielt: 528,57 g/l Glucose; 1,86 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 50 g/l (NH&sub4;)SO&sub4;; 15 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 1,43 ml 1 % Thiamin pro Liter; 2,86 ml Spurenmetallösung A pro Liter; und 2,86 ml Vitaminlösung A pro Liter.
Eine weitere Möglichkeit für die HBsAg-Abnahme beruhte auf Plasmid-Veriust und/oder Mutation der Kultur, während sie sich in Fermenter befand. Um diese Hypothese zu testen, wurden alle 4-8 Stunden während der Fermentation Proben gezogen und auf nicht-selektives YPG-Medium plattiert (10 g/l Hefeextrakt (erhältlich von BBL, Gockeysville, Maryland), 20 g/l Bacto-Trypton (erhältlich von BBL, Cockeysville, Maryland) und 20 g/l Glucose) und dann auf selektives YMS-Medium replikaplattiert. Für alle Probennahme-Zeitpunkte der Fermentation war die Plasmidstabilität größer als 90 %. 20 Kolonien wurden dann zufällig von einem späten Zeitpunkt in der Fermentation an, zu dem das HBsAg abnahm, genommen. Diese Kolonien wurden dann verwendet, um 20 Kolben mit YMS-Medium zu beimpfen und für 48 Stunden auf einem Durchrüttler zu züchten. Die Kulturen in jedem Kolben produzierten HBsAg mit Expressionsniveau von 100-200 ng HBsAg/OD-ml. Daher wurde Kulturinstabilität als Grund für die Abnahme in HBsAg ausgeschlossen.
Wegen der angestiegenen Gehalte an HBsAg, die durch die stoßweise Zugabe von Gasaminosäuren bewirkt worden waren, umfaßte die nächste Fermentation, bezeichnet als Durchlauf 248-4, erhöhte Gehalte an Gasaminosäuren sowohl im Batch-Medium (20 g/l gegenüber 5 g/l in Durchlauf 211-6 und im Durchlauf 176-3) und in Feed (110 g/l gegenüber 0 g/l in Durchlauf 211-6 und 176-3). Die Profile (bei 30ºC , pH 4,5) von OD&sub6;&sub0;&sub0; in einer mit A bezeichneten Kurve, mg HBsAg/Liter, in einer mit B bezeichneten Kurve, und ng HBsAg/OD-ml, in einer mit C bezeichneten Kurve, für Durchlauf 248-4 sind in Fig. 10 gezeigt. Man sieht, daß das Expressionsniveau von HBsAg während des Verlaufes der Fermentation bei etwa 200 ng HBsAg/OD-ml konstant bleibt. Die erhöhte Stabilität der HBsAg-Produktion im Durchlauf 248-4 war erwünscht. Das Expressionsniveau von 200 ng HBsAg/OD-ml war jedoch 2-3mal niedriger als in Durchlauf 211-6.
Ein Batch-Medium für Durchlauf 248-4 enthielt: 2 g/l Glucose; 25,25 g/l Gasaminosäuren; 13,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 3,75 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 4 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 0,4 ml 1 % Thiamin pro Liter; 3 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 3 ml Vitaminlösung A pro Liter; 0,02 g/l Inosit; und 0,13 ml DOW ® P2000 pro Liter. Ein Feed-Medium für Durchlauf 248-4 enthielt: 532,5 g/l Glucose; 209,25 g/l Gasaminosäuren; 2,85 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 5 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 15 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 6,75 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 6,75 ml Vitaminlösung A pro Liter; 0,02 g/l Inosit; und 0,13 ml DOW ® P2000 pro Liter.
In Beispiel 3 half die Zugabe von Casaminosäuren sowohl bei der stoßweisen als auch bei einer kontinuierlichen Zufuhr, die Bildung der HBsAg-Partikel zu stabilisieren, obgleich diese Stabilisierung bei der kontinuierlichen Zufuhr deutlich zu Lasten verringerten Expressionsniveaus ging. Um die Wirkung proteolytischer Enzyme zu minimieren, wird in Beispiel 4 Wachstum bei verringerten Temperaturen angewendet.

Beispiel 4

In einem Durchlauf, bezeichnet als 262-4, wurde der Stamm SC RH 218/pGPD-1 in einem mit Gasaminosäuren angereicherten Medium (etwa 25 g/Liter) gezüchtet und mit einem Medium gefüttert, das ebenfalls mit den Batch-Casaminosäuren angereichert war (etwa 110 g/Liter). (Die Batch- und die Feed-Medien waren ansonsten identisch mit denjenigen von Durchlauf 248-4.). Die Temperatur in diesem Durchlauf wurde von den 30º C (pH 4,5), die normalerweise verwendet wurden, auf 25º C bei 28 Stunden in die Fermentation hinein abgesenkt. Die Ergebnisse dieses Durchlaufes sind in Tabelle IV tabelliert und in Fig. 11 graphisch dargestellt, wobei eine OD&sub6;&sub0;&sub0;-Kurve mit A bezeichnet ist, eine (mg/l)X10-Kurve mit B bezeichnet ist und eine ng/OD-ml-Kurve mit G bezeichnet ist.
Das Expressionsniveau hatte einen Peak bei 489 ng/OD-ml bei t = 70 Stunden oder mit 96 OD-Einheiten ergibt dies 46,9 mg HBsAg/Liter. Bei etwa t = 63 Stunden war das Feed-Medium verarmt. Sowohl das Expressionsniveau als auch die Gesamtmenge an HBsAg stieg jedoch nach diesem Punkt weiter an bis zu 70 Stunden, als die Menge an HBsAg scharf abnahm, vermutlich wegen der Wirkung von Proteasen, die nach Wachstumsende induziert wurden. Tabelle IV Zeit
Das in einem mit 262-5 bezeichneten Durchlauf verwendete Medium war ein Beinahe-Minimal-Medium mit 5 g/l CAA, das dem anfänglichen Batch-Medium zugesetzt wurde. Ammoniumsulfat diente als einzige Stickstoffquelle im Feed.
Ein Batch-Medium für Durchlauf 262-5 enthielt: 2 g/l Glucose; 5 g/l Gasaminosäuren; 13,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 10 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 4 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 0,4 ml 1 % Thiamin pro Liter; 3 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 3 ml Vitaminlösung A pro Liter; 0,02 g/l Inosit; und 0,13 ml DOW ® P2000 pro Liter. Ein Feed-Medium für Durchlauf 262-5 enthielt: 532,5 g/l Glucose; 2,85 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 50 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 15 ml 1M MgSO&sub4; pro Liter; 1,43 ml 1 % Thiamin pro Liter; 6,75 ml Spurenmetallösung A pro Liter; 6,75 ml Vitaminlösung A pro Liter; und 0,04 g/l Inosit.
Wie in Durchlauf 262-4 wurde die Temperatur von 30 auf 25ºC bei t = 28 Stunden abgesenkt.
Die Ergebnisse von Durchlauf 262-5 (bei pH 4,5) erscheinen in Tabelle U und in Fig. 12, wobei eine OD&sub6;&sub0;&sub0;-Kurve mit A bezeichnet ist, eine (mg/l)X10-Kurve mit B bezeichnet ist, eine ng/OD-ml mit G bezeichnet ist und eine (g/l Ethanol)X10-Kurve mit D bezeichnet ist. Nach Absenken der Temperatur auf 25º C von 30ºC stieg das Expressionsniveau und setzte den Anstieg bis zur Beendigung der Fermentation fort. Die Gesamtmenge an HBsAg stieg auch bis zum Ende der Fermentation, wobei ein Maximum von 61,7 mg HBsAg/Liter erreicht wurde. Tabelle V Zeit
In einem Durchlauf, bezeichnet als 260-4 (bei pH 4,5) wurde etwa dasselbe angereicherte Medium und Feed verwendet, das in Durchlauf 248-4 verwendet wurde, aber eine verringerte Temperatur von 25º C wurde vom Zeitpunkt 0 an verwendet. Die Ergebnisse von Durchgang 260-4 erscheinen in Tabelle VI und sind in Fig. 13 veranschaulicht, wobei eine OD&sub6;&sub0;&sub0;-Kurve mit A bezeichnet ist, eine (mg/l)X10-Kurve mit B bezeichnet ist und eine ng/OD-ml mit G bezeichnet ist. Tabelle VI Zeit
Zeit, wie gesehen in Fig. 11 und 12. Jedoch trat eine leichte, ungeklärte Abnahme in HBsAg von 54,7 mg/Liter bei 68,5 Stunden auf 53,8 mg/Liter bei 72,5 Stunden auf.
Somit scheint verringerte Temperatur von 25º C die HBsAg-Produktion zu stabilisieren, möglicherweise durch Verringern der Konzentration und/oder Aktivität proteolytischer Enzyme. HBsAg-Gehalte von über 60 mg/Liter sind durch Verringern der Temperatur sowohl in mit Gasaminosäuren angereicherten Medien (61,7 mg/Liter) als auch in nicht-angereicherten (63,6 mg/Liter) erhalten worden. Bei 20 ug HBsAg/Dosis Vakzin repräsentieren diese Zahlen 3.000 Dosen/Liter Fermentationsbrühe.
Obgleich die vorliegende Erfindung im Hinblick auf die bevorzugte Ausführungsform beschrieben worden ist, ist zu verstehen, daß Modifikationen und Verbesserungen den Fachleuten auf diesem Gebiet einfallen werden. Folglich ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung alle solche Variationen einschließt, die in den Schutzumfang der Erfindung, wie er beansprucht ist, fallen.

Claims

1. Medium zum Kultivieren von Hefe, die in der Lage ist, ein fremdes Gen-Produkt zu exprimieren, welches umfaßt:

ausgewogene freie Aminosäuren mit einer kombinierten Gesamtkonzentration zwischen etwa 25 g/l und etwa 160 g/l.

2. Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ausgewogenen freien Aminosäuren Casaminosäuren sind.

3. Medium nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die kombinierte Gesamtkonzentration ausgewogener freier Aminosäuren etwa 110 g/l beträgt.

4. Verfahren zur Fermentation von Hefe, die in der Lage ist, ein exogenes Gen-Produkt zu exprimieren, welches die Schritte umfaßt:

Einbringen der Hefe in ein Kulturmedium, das ausgewogene freie Aminosäuren mit einer kombinierten Gesamtkonzentration zwischen etwa 25 g/l und etwa 160 g/l umfaßt; und

Kultivieren der Hefe bei einer Temperatur von etwa 25ºC.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Einbringschritt den Schritt umfaßt, daß die Konzentration der von Kohlehydrat abgeleiteten Kohlenstoffquelle im Kulturmedium bei im wesentlichen 0 gehalten wird, so daß die Ethanolproduktion durch die Hefe minimiert ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, weiter gekennzeichnet durch den Schritt, daß das Kulturmedium mit Sauerstoff zu wenigstens 30 % von Luftsättigung gesättigt wird.

7. Verfahren zur Fermentation von Hefe, die in der Lage ist, ein exogenes Gen-Produkt zu exprimieren, welches die Schritte umfaßt:

Kultivieren der Hefe in einem Medium, wobei die Konzentration einer von Kohlehydrat abgeleiteten Kohlenstoffquelle bei im wesentlichen 0 gehalten ist, so daß Ethanolproduktion durch die Hefe minimiert wird, Bereitstellen ausgewogener freier Aminosäuren mit einer Konzentration zwischen etwa 20 g/l und etwa 160 g/l im Medium; und

Halten der Temperatur des Mediums bei etwa 25ºC.