DE3686474T2

DE3686474T2 - Diagnostische probe.

Info

Publication number: DE3686474T2
Application number: DE8686113653T
Authority: DE
Inventors: David E Nevalainen
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1985-10-11
Filing date: 1986-10-03
Publication date: 1993-02-11
Anticipated expiration: 2006-10-04
Also published as: AU6368486A; ATE79679T1; AU610818B2; JPS6288963A; EP0223978A1; CA1284103C; DE3686474D1; EP0223978B1; ES2001447A6

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich generell auf Verfahren für den immunologischen Nachweis antigener Determinanten, und insbesondere betrifft sie Verfahren und Einrichtungen für die Bestimmung von Blutgruppenklassifizierungen aus Blut- oder Serumproben.
Erythrozyten sind durch das Vorliegen einer Vielfalt von immunogenen Markern gekennzeichnet, welche für Bluttransfusionen ebenso wie für Organtransplantationen relevant sind. Es ist eine Vielfalt von Blutgruppensystemen bekannt, von denen ein jedes eine Anzahl von damit in Beziehung stehenden Antigenen umfaßt. Die Hauptsysteme umfassen das ABNull-, D(Rh)-, Lewis-, I-, Kell-, P-, MN-, Lutheran-, Nidd- und Duffy-System. Diese und andere Systeme werden in dem Buch von P.D.Issitt und C.H.Issitt, "Applied Blood Group Serology",S.353-360, (Spectra Biologicals, 1975), erörtert. Die chemischen Determinanten der Blutgruppenantigene weisen entweder eine Polysaccharid- oder eine Proteinzusammensetzung auf. Polysaccherid-Antigene kommen entweder als Glykoproteine oder Glykolipide vor, und ihre bestimmende Struktur besteht gewöhnlich aus mehr als einem Zuckerrest. Die Blutgruppenantigene sind bereits bei der Geburt vorhanden, und sie bleiben während der gesamten Lebensspanne eines Individuums intakt.
Das Blutserum der meisten Individuen enthalt Antikörper gegen die Blutgruppenantigene des ABNull-Systems. Das Serum eines Individuums enthalt keine Antikörper, die mit den Antigenen reaktiv sind, welche für die Blutzellen dieses Individuums charakteristisch sind, doch enthält es häufig Antikörper, welche mit Blutgruppenantigenen reaktiv sind, welche für die Erythrozyten dieses Individuums (seine Blutgruppe) nicht kennzeichnend sind. Solche Antikörper sind bei der Geburt noch nicht vorhanden, doch entwickeln sie sich allmählich während des Lebens als Ergebnis einer Sensibilisierung, welche infolge einer Transfusion oder Schwangerschaft auftritt, sowie durch die Einwirkung von Nicht-Blut-Antigenen, welche in der Natur reichlich vorkommen.
Die Wichtigkeit der Blutgruppenserologie wurde erstmals während Versuchen, Blut von einem Individuum in ein anderes zu transfundieren, erkannt. Die frühen Empfänger von Bluttransfusionen wurden häufig krank und starben gelegentlich. Es wurde entdeckt, daß die in dem Serum von Transfusionsempfängern vorhandenen Antikörper häufig die gespendeten Blutzellen agglutinierten, wenn die Blutgruppen des Spenders und des Empfängers voneinander verschieden waren. Abgrund eines frühen Satzes von Versuchen wurde das Hauptsystem von Blutgruppen, nämlich das ABNull(=ABO)-System, beschrieben. Die ABNull-Blutgruppe umfaßt die Blutgruppen O, A, B und AB sowie verschiedene Subblutgruppen vom Typus A und vom Typus B. Ursprünglich wurde angenommen, daß Individuen, welche Blut der Blutgruppe Null aufweisen, Erythrozyten haben, welche auf ihrer Oberfläche keine spezifischen Blutgruppenantigene aufweisen. Es ist nunmehr bekannt, daß Blutzellen der Blutgruppe Null ein als das H-Antigen bekanntes Antigen aufweisen. Individuen, deren Blut der Blutgruppe Null angehört, weisen in ihrem Serum Anti-A- und Anti-B-Antikörper auf. Individuen, deren Blut der Blutgruppe A angehört, weisen Erythrozyten mit A-Antigen auf deren Oberfläche auf, und sie weisen in ihrem Serum Anti-B-Antikörper auf. Individuen, deren Blut der Blutgruppe B angehört, weisen das B-Antigen auf der Oberfläche ihrer Erythrozyten auf, und sie haben Anti-A-Antikörper in ihrem Serum. Jene, deren Blut der Blutgruppe AB angehört, weisen sowohl das A-Antigen als auch das B-Antigen auf der Oberfläche ihrer Erythrozyten auf, und in ihrem Serum zirkulieren keine Anti-A- oder Anti-B-Antikörper.
Das wichtigste Blutgruppensystem, abgesehen von dem ABNull-System, ist das D-(Rh)-system. Das System wird häufig in Verbindung mit dem ABNull-System mit dem Blutgruppensuffix "positiv" oder "negativ" beschrieben, wie z.B. in "Null-positiv" oder "B-negativ", um das Vorliegen oder Fehlen des D(Rh)-Antigens anzuzeigen. Die Rh-Bezeichnung ist eigentlich eine falsche Bezeichnung, und sie wurde ursprünglich angewendet, weil man mit einem Serum, welches in Kaninchen erzeugt worden war, die ihrerseits mit Rhesusaffen-Erythrozyten immunisiert worden waren, ein ähnliches Antigen wie das D-Antigen nachweisen konnte. Das "Rh-Antigen" ist tatsächlich eine Familie von Antigenen, welche in ihrer Fähigkeit, zu immunisieren, beträchtlich schwanken. Das D-Antigen ist das stärkste davon und ist jenes Antigen, auf das man sich üblicherweise bezieht, wenn man von Rh-positiven oder Rh-negativen Typen spricht. Es ist dies auch das Antigen, welches am häufigsten an einer Sensibilisierung durch Transfusion oder Schwangerschaft beteiligt ist. Es gibt auch noch andere Antigene des D-(Rh)-Systems, doch sind dieselben weniger wirksam und bereiten deshalb auch weniger Schwierigkeiten bei der Transfusion oder bei einer fetomaternalen Unverträglichkeit.
Es hat den Anschein, daß die Expression des D-Antigens in einigen Patienten zwar positiv, aber ganz besonders schwach ist. Dies ist häufig auf das Vorliegen einer Variantenform des D-Antigens, welche als Du bekannt ist, zurückzuführen. Diese Variante ist deshalb von Interesse, weil ihr Vorhandensein ohne Anwendung besonderer Sorgfalt übersehen werden kann. Diese Variante kann befähigt sein, eine Antikörper-Produktion in D-negativen Empfängern zu stimulieren.
Zusätzlich zu den antigenen Determinanten, welche die ABNull- und D-(Rh)-Blutgruppen definieren, gibt es auch noch zahlreiche andere Antigene, welche auf der Oberfläche von Erythrozyten dargeboten werden, und welche Blutgruppen definieren. In einigen Fällen sind die Antigene äußerst selten, während sie in anderen Fällen bei der überiegenden Mehrheit der Bevölkerung anzutreffen sind. In vielen Fällen können jedoch ernstliche Reaktionen auftreten, wie z.B. beim Zustandekommen des Morbus haemolyticus des Neugeborenen. Das Kell- Blutgruppensystem (K-Antigen) ist gelegentlich an Schwierigkeiten, die beim "Cross Matching" auftreten, und beim Zustandekommen des Morbus haemolyticus des Neugeborenen beteiligt. Das Kidd-(JK)-Antigensystem ist ebenfalls gelegentlich für verzögerte Transfusionsreaktionen verantwortlich. Diese Hauptblutgruppen sind auch von Interesse für verschiedene anthropologische Untersuchungen sowie für Tests auf Vaterschaftsaufschlüsse sowie für Arbeiten auf dem Gebiet der Gerichtsmedizin.
Die herkömmlichen Flüssigphasenverfahren für Blutgruppen-Bestimmungen umfassen generell Agglutinationstests und Zellysetests. In Agglutinationstests werden Blutproben mit verschiedenen komplementfreien Testseren vermischt, welche Anti-Blutgruppen-Antikörper, wie z.B. Anti-A, Anti-B und Anti-D, enthalten. Erythrozyten, welche Oberflächenantigene einer besonderen Spezifität aufweisen, werden von Antikörpern gebunden werden, die für dieses Antigen spezifisch sind. Die weitere Reaktion mit zusätzlichen Antikörpern wird zur Brückenbildung zwischen benachbarten Zellen und schließlich und endlich zu einer ineinandergreifenden Masse von Erythrozyten, die miteinander verbunden sind, führen. Eine solche Reaktion ist visuell feststellbar, und die Bewertung kann durch spektrophotometrische Einrichtungen automatisiert werden.
In der für Friedman et al. ausgegebenen US-PS Nr. 3 990 850 sind Testkarten für die Blutgruppen-Bestimmung beschrieben, bei welchen Serum, welches Antikörper enthält, die mit Blutgruppenantigenen spezifisch reaktiv sind, auf ein Substrat, wie z.B. kunststoffüberzogene Nitrozellulose, aufgetrocknet ist, welches Substrat die Eigenschaften, wasserundurchlässig und von Wasser benetzbar zu sein, aufweist. Das Testen auf die Blutgruppen wird mit Hilfe von Flüssigphasen-Agglutinationsprüfungen durchgeführt, wobei das Antiserum durch Zugabe destillierten Wassers reskonstituiert wird, und wobei eine Blutprobe zu dem Antiserum hinzugefügt und mit demselben vermischt wird. Die Agglutination der Blutprobe ist visuell feststellbar.
Antikörper, welche mit besonderen Antigenen reaktiv sind, sind oft nicht befähigt, Erythrozyten zu agglutinieren, und zwar wegen Abstoßungskräften, welche durch das die Erythrozyten umgebende, negative Oberflächenpotential verursacht werden. IgM-Antikörper sind ausreichend groß, um die Lücke zwischen den sich gegenseitig abstoßenden Zellen zu überbrücken, doch die kleineren IgG-Antikörper sind häufig nicht in der Lage, diese Lücke zu überbrücken. In solchen Fällen, wo die IgG-Antikörper nicht spontan eine Agglutination verursachen, muß eine solche Reaktion auf einer Anzähl von Wegen induziert werden, welche umfassen können: (1) ein mildes Zentrifugieren, um die Abstoßungskräfte zu überwinden und um so eine Kreuzimunverknüpfung zu ermöglichen; (2) Suspendieren der Testlösung in einem anisotropen Medium, wie z.B. Albumin (22%ig) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP), oder (3) durch Anwendung der "Coombs-Reaktion", wobei Anti-Human-Antiglobuline zum Miteinanderverbinden der Antikörpermoleküle verwendet werden.
Zellysetests sind nicht auf eine Agglutination angewiesen, sondern es wird dabei vielmehr festgestellt, ob ein spezifisch reaktiver Antikörper, der zu einer roten Blutprobe hinzugefügt worden ist, zusammen mit Serum-Komplement eine Zellyse verursacht. Die Kombination von Serum-Komplement mit einem an eine Zellmembran gebundenen Antikörper führt zu einem Bruch der Zellmembran, zu einem Freisetzen des intrazellulären Inhalts und zum Zelltod.
Sowohl die Agglutinationsverfahren als auch die Zellyseverfahren können sowohl quantitativ als auch qualitativ angewendet werden, und sie lassen sich automatisieren. Beide Verfahren können auch zum "Rückwärtsprüfen" von Blutseren verwendet werden, um die Ergebnisse von Tests zu bestätigen, die mit Erythrozyten durchgeführt worden sind. Eine solche "Rückwärts"-Prüfung ist deshalb möglich, weil Blutseren Antikörper enthalten, welche komplementär zu den Antigenen sind, welche von den dem betreffenden Blutserum zugeordneten Erythrozyten dargeboten werden; nämlich Antikörper, welche spezifisch für Hauptblutgruppenantigene sind, welche auf den dem betreffenden Serum zugeordneten Erythrozten nicht vorhanden sind.
Es bestehen wesentliche Beschränkungen hinsichtlich der Anwendung von herkömmlichen Flüssigphasenmethoden zur Bestimmung von Blutgruppen. Die Bewertung der in einer Agglutination bestehenden Testergebnisse erfordert häufig die subjektive Beurteilung seitens eines erfahrenen Personals, um zwischen einer auf eine Antigen-Antikörper-Reaktion zurückzuführenden Agglutination von Zellen und einer nicht-spezifischen Aggregation zu unterscheiden, bei welcher zu einer Antigen-Antikörper-Reaktion nicht in Beziehung stehende Kräfte ein gewisses Ausmaß von Zusammenballung bewirken. Obgleich eine automatisierte Ausrüstung zur Verfügung steht, welche in höherem Maße quantitative Ergebnisse liefern kann, ist eine solche Ausrüstung teuer (geschätzte Kosten von $ 115.000 bis $ 420.000) und steht daher in zahlreichen klinischen Situationen nicht ohneweiteres zur Verfügung (z.B. in Arztpraxen, Blutbanken, Notfallsräumlichkeiten, bei Militäreinsätzen), wo ein rascher, einfacher und genauer Test erwünscht ist. Außerdem gilt, daß zwar Verfahren, welche auf einer Lyse von Zellen basieren, häufig von Nutzen sind, wenn es um Bewertungen von Gewebetypen geht, daß sie aber oft nur von beschränktem Nutzen sind, wenn sie auf Human-Erythrozyten angewendet werden, und zwar entweder deshalb, weil der Zellmembran-Antigen-Antikörper-Komplex in unwirksamer Weise mit dem Serum-Komplement reagiert, oder weil die Antikörper-Konzentration eingeschränkt werden muß, um eine intensive Agglutination zu verhindern, welche eine über das Komplement vermittelte Lyse mechanisch stören würde.
Beträchtliche Fortschritte sind hinsichtlich serologischer Festphasenverfahrensweisen gemacht worden. In der für Rosenfield et al. ausgegebenen US-PS Nr. 4 275 053 sind Festphasenverfahrensweisen zur Blutgruppen-Bestimmung beschrieben, wobei eine Monolage von Erythrozyten kovalent an die Wände eines Kunststoffröhrchens gebunden wird. Die Monolage wird dann mit einer Serumprobe in Berührung gebracht, und es findet eine Immunadsorption der in der Probe vorhandenen Antikörper durch die gebundenen Erythrozyten statt, wenn die Antikörper mit den von den Zellmembranen dargebotenen Antigenen reaktiv sind. Die durch die Antikörper sensibilisierte Monolage von Blutzellen kann dann in einer Agglutinationsreaktion eine zweite Lage von Blutzellen binden, welche ein komplementäres Antigen tragen. Ist der immunologische Typus von sowohl der Monolage von Zellen als auch von der Antikörperschicht bekannt, dann kann die Bildung oder Nicht-Bildung einer zweiten Zellschicht benützt werden, um auf den immunologischen Typus der die zweite Schicht bildenden Zellen zu prüfen. Ist umgekehrt die immunologische Spezifität der ersten Zellschicht bekannt, dann kann man sich auf die Fähigkeit, eine zweite Monolage aus Zellen mit den gleichen Zellen zu bilden, als ein Mittel zum Feststellen verlassen, ob eine Schicht von Antikörpern, welche durch Antigene auf die erste Zellschicht immunosorbiert worden sind, gebildet worden ist oder nicht. Densitometrische Techniken können angewendet werden, um eine quantitative Bewertung der Ergebnisse zu liefern.
Rosenfield et al beschreiben die Verwendung von Polystyrol- und Polyurethanröhrchen als feste Matrix für das Binden von Erythrozyten. Die Verwendung anderer Polymeren, welche auf ihrer Oberfläche reaktive Gruppen darbieten, die ihrerseits ein direktes kovalentes Binden von Blutzellen an die Matrix ermöglichen, wie z.B. Glutaraldehyd, Bromcyan, Amino- und Carboxylgruppen, wird ebenfalls vorgeschlagen. Die Oberflächen werden mit Fibrinogen- und Polylysinlösungen behandelt, um die Erythrozyten irreversibel an die Substratoberfläche zu binden. Die Verwendung anderer Bindungsmittel, wie z.B. von Phytohämagglutinin, Concanavalin A und Phytolacca-decandra-Mitogen, wird ebenfalls vorgeschlagen, um das Binden von Erythrozyten an die Substratoberfläche zu unterstützen. Die Antikörper werden dann mit der gebundenen Monolage von Erythrozyten inkubiert. Für die Bildung der zweiten Monolage aus Erythrozyten ist das bloße Aufbringen einer Zellsuspension und das Absetzenlassen derselben unter der Einwirkung der Schwerkraft, selbst während 25 min, gewöhnlich unzureichend, um eine Kreuzverknüpfung der Antikörper mit den Antikörpern und der ersten Monolage zu ergeben. Es ist daher notwendig, die Bildung der zweiten Monolage durch Behandlungen unter Verwendung von Mitteln, wie z.B. PVP oder vorzugsweise Protaminsulfat, zusätzlich zu dem Inkubieren des Reaktionsgemisches während bis zu 25 min, zu vermehren.
In der für Barr ausgegebenen US-PS Nr. 4 252 538 sind ähnliche Einrichtungen und Verfahrensweisen wie jene von Rosenfield et al. zum Bestimmen von Blutgruppen beschrieben. Barr beschreibt die Verwendung von Kunststoffsubstratmaterialien (wie z.B. Polycarbonat, Polystyrol, Acrylharzen und anderen), die mit Rinderserumalbumin (BSA) überzogen sind. Das BSA wird dann mit Chromichlorid (CrCl&sub3;) beschichtet, welches dazu dient, die Erythrozyten an das BSA und demzufolge an die Substratoberfläche zu binden.
Die Internationale PCT-Anmeldung WO 86/05591 von Lee et al. (Europäische Patentanmeldung 86 901 901.8), in welcher ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung einer biologischen Probe beschrieben ist, hat ein Prioritätsdatum vom 19. März 1985, und ein Veröffentlichungsdatum vom 25. September 1986, und fällt dadurch unter die Bestimmungen des Art.54(3) des EPÜ. In dieser Anmeldung ist das Binden von einem oder mehreren gereinigten Antikörpern, welche spezifisch für antigene Determinanten von Erythrozyten sind, an einen festen Träger, das Inkubieren einer unbekannten Blutprobe mit dem festen Träger, an welchen die Antikörper gebunden sind, das Spülen des Trägers, um ungebundene Erythrozyten zu entfernen, und das Feststellen der roten Farbe der an den Träger gebundenen Erythrozyten beschrieben. Diese Antikörper können auch in einer bestimmten regelmäßigen Anordnung an den festen Träger gebunden werden. Unter den möglichen festen Trägern ist auch Nitrozellulose angeführt worden.
In der am 28. März 1985 veröffentlichten, internationalen PCT-Anmeldung WO85/01354 von Bayer et al. sind Festphasenverfahren zur Blutgruppen-Bestimmung beschrieben, bei welchen bekannte Antikörper an eine feste Oberfläche gebunden werden, und bei welchen Erythrozytenproben, welche mit einem proteolytischen Enzym aktiviert worden sind, für eine immunologische Reaktion dargeboten werden. [Siehe auch: Plapp,et al., Laboratory Management, (Dezember, 39-47 1984).] An der Oberfläche anhaftende Erythrozyten zeigen das Vorliegen eines besonderen Antigens an. Eine Verfahrensweise vom Typus eines "Ruckwärtsprüfens" wird ebenso beschrieben, wobei synthetische oder gereinigte Antigene direkt an ein festes Substrat gebunden werden. Die Oberfläche wird dann mit einem Blutserum unbekannter Spezifität in Berührung gebracht, um es den darin vorhandenen Antikörpern zu ermöglichen, eine immunologische Reaktion mit den zuvor an das Substrat gebundenen Antigenen einzugehen. Dann wird eine zweite Lösung von Erythrozyten, welche bekannte Antigene darbieten, als Anzeigemittel verwendet, wobei das Binden der zweiten Lage von Erythrozyten die antigene Spezifität der nicht-identifizierten Antikörper anzeigt.
Die von Bayer et al. beschriebenen, festen Substrate umfassen Perlen, Proberöhrchen, Blätter bzw. Bahnen, Streifen und Mikrotiterplatten, die allesamt aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid angefertigt sind. Vorzugsweise werden Polystyrol-Mikrotiterplatten mit U-förmigen Vertiefungen verwendet. Die Antikörperlösungen werden auf den festen Oberflächen durch Langzeit-Inkubation oder durch Wärmebehandlung immobilisiert, wobei darauf zu achten ist, daß eine gleichförmige Verteilung der Antikörper quer über die Oberfläche der Vertiefung ermöglicht wird. Es wird darauf hingewiesen, daß der Anti-D-Antikörper Rh-positive Erythrozyten nicht stark genug bindet, um den während des Testverfahrens angewendeten Zentrifugalkräften zu widerstehen, so daß es für wünschenswert angesehen wird, Anti-D an Anti-Human-Immunglobulin (IgG), welches als erstes auf der Oberfläche immobilisiert wird, immunologisch zu binden.
Das Verfahren von Bayer et al. erfordert ein Aktivieren des zu untersuchenden Blutes bei dem Verfahren vom Vorwärtstypus zur Blutgruppen-Bestimmung durch Behandlung der Erythrozyten mit einem proteolytischen Enyzm, um das Binden der Blutzellen durch die Antikörperschicht zu fördern. Die Ergebnisse werden sowohl für die Tests vom Vorwärtstypus als auch für jene vom Rückwärtstypus dadurch abgelesen, daß man die Blutkomponenten in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte inkubieren läßt. Eine positive Reaktion der Erythrozyten mit der Antikörperschicht wird durch eine gleichförmige Auslöschung der Erythrozyten über die gesamte konkave Bodenoberfläche der Vertiefung beim Zentrifugieren angezeigt. Eine neagtive Reaktion ist dadurch gekennzeichnet, daß sich alle Erythrozyten auf dem Boden der Vertiefung zu einem kleinen "Knopf" in der Mitte absetzen. Alternativ wird vorgeschlagen, daß die festen Oberflächen der Vertiefungen der Mikrotiterplatte, nachdem die Erythrozyten anhaften gelassen worden sind, mit einer Kochsalzlösung gewaschen werden können, um nicht-umgesetzte Erythrozyten zu entfernen. Es wird auch vorgeschlagen, daß die Platte umgedreht und einer milden Zentrifugation unterworfen werden kann, um die "Knöpfe" aus Erythrozyten zu entfernen. Bei diesen alternativen Verfahrensweisen würde eine negative Reaktion durch eine klare, von Erythrozyten freie Vertiefung angezeigt werden. Von Plapp et al. wird vorgeschlagen, daß in dem Festphasentest die Bestimmung des Vorliegens eines "negativen", gefärbten "Knopfes" aus Erythrozyten von einem "positiven" Auslöschen der Erythrozyten über einen breiteren Bereich mit Hilfe von automatisierten Einrichtungen unterschieden werden kann, welche eine Summe Geldes in der Größenordnung von $ 20.000 kosten.
Von Interesse für die Grundlagen der Erfindung ist auch die Offenbarung der EPO-Anmeldung 63810, von Gordon, welche am 3. November 1982 veröffentlicht wurde, und welche sich auf Einrichtungen zur Durchführung immunologischer Mehrfachanalysen anhand einer einzigen Probe und auf Verfahren zu deren Verwendung bezieht. Die Einrichtungen bestehen aus einem porösen, festen Träger, welcher eine im voraus ausgewählte, regelmäßige Anordnung von abgegrenzten Adsorptionsflächenteilen von Antigenen, Antikörpern, oder von beiden, enthält, wobei die verbleibenden Adsorptionsstellen auf dem Substrat mit Protein- Blockierungsmitteln, wie z.B. Rinderserumalbumin, gesättigt sind, welche in keine Kreuzreaktion mit den in dem Test verwendeten Antigenen oder Antikörpern eingehen. Die porösen Träger werden dahingehend beschrieben, daß es sich dabei um Materialien handelt, welche eine ausreichende Oberflächenporosität aufweisen, um den Antikörpern den Zugang zu ermöglichen, und welche auch eine geeignete Oberflächenaffinität aufweisen, um Antigene zu binden. Solche Materialien können sein: (1) natürliche, polymere Kohlenhydate und deren synthetisch modifizierte Derivate, einschließlich der Nitrozellulose; (2) natürliche, stickstoffhältige Polymeren, wie z.B. Gelatine; (3) natürliche Kohlenwasserstoffpolymeren, wie z.B. latex; (4) synthetische Polymeren, darunter Polyethylen, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyester, Polyamide und Polyurethan; (4) anorganische, poröse Materialien, wie z.B. Tone; sowie (5) Gemische oder Copolymeren der obigen Klassen. Hinsichtlich dieser Materialien wird auch angeführt, daß sie in geeigneten Formen, wie z.B. Filmen, Bahnen, Platten und Zylindern, in höchstem Maße bevorzugt aber in 0,1 mm dicken Bahnen mit einer Porengröße zwischen 0,15 und 15 um, verwendet werden sollen.
Die Antigene oder Antikörper werden auf den porösen, festen Träger durch direkten Kontakt aufgebracht, wonach eine Inkubation mit den Blockierungsmitteln vorgenommen wird. Dann werden Tests für den Nachweis unbekannter Antigene oder Antikörper durchgeführt, und zwar unter Verwendung von radioaktiv markierten oder an ein Enzym gebundenen Indikator-Antikörpern, welche auch Anti-Human- oder Anti-Tier-Immunoglobulin-Antikörper sein können. Die Ergebnisse der Mehrfachtests werden dann durch Feststellen von Mehrfach-Indikator-Antikörpern bestimmt.
Trotz der Fortschritte, die auf diesem Fachgebiet gemacht worden sind, besteht nach wie vor ein Bedarf auf diesem Fachgebiet nach raschen, einfachen, genauen und billigen Verfahren und Einrichtungen zur Durchführung von Blutgruppen-Bestimmungstests.
In optimaler Weise sollten die zur Blutgruppen-Bestimmung verwendeten, immunologischen Festphaseneinrichtungen billig in der Herstellung sein, wobei nur minimale Mengen von Antikörpern, Blutgruppensubstanzen oder anderen Reagentien (z.B. Bindungs- und Blockierungsreagentien), Antikörpern, Blutgruppensubstanzen, verwendet werden, und wobei einfache, gleichförmige Mittel für die Verteilung dieser Substanzen zur Verfügung stehen. Die geprüften Blutprobenmaterialien sollten nur einer minimalen oder überhaupt keiner Vorbehandlung unterworfen werden. Die Testverfahrensweisen sollten rasch sein, und sie sollten keine Mehrfachmanipulationen von Proben oder Reagentien oder den Gebrauch von Vorrichtungen (Schüttelvorrichtungen, Zentrifugen und dgl. mehr) zum Entwickeln der gewünschten Reaktionen erfordern. Die Indikatoren der Testergebnisse sollten sich leicht stabilisieren lassen, um ein verzögertes "Ablesen" der Testergebnisse zu ermöglichen. Das tatsächliche Ablesen der Testergebnisse sollte unzweideutig sein und sollte nicht den Gebrauch automatisierter Vorrichtungen erfordern.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG

Durch die vorliegende Erfindung werden eine neue, einfache und billige Einrichtung und Verfahren zu deren Gebrauch zur Bestimmung von Blutgruppen- Klassifizierungen an Hand von Blut- oder Serumproben zur Verfügung gestellt. Für die Einrichtung wird nur eine minimale Menge von Antikörpermaterial benützt, die Einrichtung erfordert keine zusätzlichen Vorrichtungen oder keine zusätzliche Ausstattung mit Instrumenten für ihren Gebrauch, und sie ist besonders gut brauchbar in Arztpraxen, in Blutbanken, in Notfallsräumlichkeiten, bei Militäreinsätzen und in unterentwickelten Gegenden. Die Testeinrichtung umfaßt: (a) ein poröses, festes Substrat mit einer mittleren Porengröße von 0,025 bis 7,0 um; und (b) einen oder mehrere, im wesentlichen reine Antikörper, welche mit antigenen Determinanten von Erythrozyten spezifisch reaktiv sind, wobei diese antigenen Determinanten Blutgruppen kennzeichnen, und wobei die Antikörper an das poröse, feste Substrat in einer regelmäßigen Anordnung von abgegrenzten Adsorptionsflächenteilen von unterschiedlichen Spezifitäten derart gebunden sind, daß sie befähigt sind, jene Erythrozyten, mit welchen sie spezifisch reaktiv sind, so zu binden, daß dadurch innerhalb des abgegrenzten Flächenteiles ein feststellbares Farbsignal erzeugt wird, welches mit denjenigen Flächenteilen auf der Oberfläche des Substrates kontrastiert, auf welchen keine Antikörper gebunden sind.
Die Testeinrichtung kann zur Blutgruppen-Bestimmung einer Probe durch: (a) Inkubieren der Testeinrichtung mit einer Blutprobe, deren Blutgruppe bestimmt werden soll; (b) Entfernen der Testeinrichtung aus der Probe und Spülen der Testeinrichtung; und (c) Feststellen eines Farbsignals aus Erythrozyten, welche an Antikörper gebunden sind, welche selbst an das feste Substrat gebunden sind; verwendet werden. Eine einzelne Testbestimmung kann von Hand aus in weniger als 1 min durchgeführt werden.
Es ist auch eine alternative Testeinrichtung zur Bestimmung von Blutgruppen- Klassifizierungen mit Hilfe von Verfahrensweisen vom Typus der "Rückwärts- Serum-Blutgruppen-Bestimmungen" vorgesehen. Die Testeinrichtung umfaßt: (a) ein poröses, festes Substrat mit einer mittleren Porengröße von 0,025 bis 7,0 um; und (b) eine oder mehrere Blutgruppensubstanzen, welche antigene Determinanten zur Verfügung stellen, welche kennzeichnend für spezifische Blutgruppen sind, wobei die Blutgruppensubstanzen mit dem festen Substrat in einer regelmäßigen Anordnung von abgegrenzten Adsorptionsflächenteilen derart verbunden sind, daß sie befähigt sind, Antikörper aus einer Serumprobe zu binden, welche ihrerseits befähigt sind, Erythrozyten zu binden, mit welchen sie spezifisch reaktiv sind, um feststellbare Farbsignale zu erzeugen. Die alternative Testeinrichtung kann zur Bestimmung von Blutgruppen-Klassifizierungen nach den Verfahren einer "Rückwärts"-Serum-Blutgruppen-Bestimmung verwendet werden, welche Verfahren umfassen: (a) Inkubieren der alternativen Testeinrichtung mit einer Probe von Vollblut oder von aus Vollblut isoliertem Serum; (b) Entfernen der Testeinrichtung aus der Probe und Spülen der Einrichtung; und (c) Inberührungbringen der Testeinrichtung mit einem Erythrozytengemisch, welches Erythrozyten enthält, welche antigene Determinanten darbieten, welche kennzeichnend für verschiedene Blutgruppen sind; und (d) Feststellen eines Farbsignals aus Erythrozyten, welche durch die Serum-Antikörper an die Blutgruppensubstanz gebunden sind, welche mit dem festen Substrat verbunden ist. Mit Hilfe der Rückwärts-Blutgruppen-Bestimmungsverfahren gemäß der Erfindung lassen sich die den Hauptblutgruppen entsprechenden Antikörper, welche im Blutserum vorhanden sind, nachweisen, und als selbstverständliche Folgerung daraus lassen sich damit auch die zu diesen komplementären Blutgruppen feststellen.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG:

Beschreibung des porösen, festen Substrates.

Generell können die im Rahmen der vorliegenden Erfindung brauchbaren, porösen, festen Substrate irgendein Material sein, welches eine ausreichende Oberflächenporosität aufweist, um Immunglobulinen den Zutritt zu gestatten, und welches eine geeignete Oberflächenaffinität aufweist, um ein Binden solcher Antikörper zu ermöglichen, und zwar vorzugsweise ohne Zuhilfenahme von Reagentien und Bedingungen, welche für ein kovalentes Binden erforderlich sind. In gleicher Weise werden geeignete, poröse Substanzen den Zutritt und das Binden von Antigenen ermöglichen, welche in Testeinrichtungen von Rückwärtstypus verwendet werden. Solche Materialien können Fasermaterialien, darunter Webstoffe und Faservliesstoffe, umfassen. Mikroporöse Strukturen werden im allgemeinen bevorzugt, doch können ebensogut auch Materialien mit einer Gelstruktur im hydratisierten Zustand verwendet werden. Hinsichtlich ihrer chemischen Natur können die Materialien sein:
(A) Natürliche, polymere Kohlenhydrate und deren synthetisch modifizierte, vernetzte oder substituierte Derivate, wie z.B. (a) Agar, Agarose; vernetzte Alginsäure; substituierte und vernetzte Guargummen, vernetzte Dextranpolymeren und Stärken; (b) regenerierte Zellulosen; Zelluloseester, insbesondere mit Salpetersäure und Carbonsäuren; gemischte Zelluloseester, Zelluloseether, insbesondere solche mit niedrigen aliphatischen Alkoholen.
(B) Natürliche, stickstoffhältige Polymeren, wie z.B. Proteine und deren Derivate, z.B. vernetzte oder modifizierte Gelatine.
(C) Natürliche Kohlenwasserstoffpolymeren, wie z.B. Latexe und Gummen.
(D) Synthetische Polymeren, welche mit in geeigneter Weise porösen Strukturen hergestellt werden können, wie z.B. (a) Vinylpolymeren, wie z.B. Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat und dessen teilweise hydrolysierten Derivate, Polyacrylate, Polyacrylamide, Polymethacrylate; (b) Copolymeren und Terpolymeren der obigen Vinylmonomeren unter sich und mit anderen Monomeren; (c) Polykondensate, wie z.B. Polyester, Polyamide; (d) Additionspolymeren, wie z.B. Polyurethane oder Polyepoxide.
(E) Anorganische Materialien, welche in einer in geeigneter Weise porösen Form hergestellt werden können, wie z.B. Sulfate oder Carbonate von Erdalkalimetallen und Magnesium, z.B. Bariumsulfat, Calciumsulfat, Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, oder Silicate von Alkali- und Erdalkalimetallen und/oder Aluminium und/oder Magnesium, und Aluminium- oder Siliciumoxide oder -hydrate, wie z.B. Tone, Aluminiumoxid, Talk, Kaolin, Zeolith, Silikagel, Glas. Diese Materialien können als solche oder als Füllstoffe in einem der obigen Polymermaterialien verwendet werden.
(F) Gemische oder Copolymeren der obigen Klassen, wie z.B. Propfcopolymeren, die durch Einleiten der Polymerisation von synthetischen Polymeren auf einem vorher vorhandenen, natürlichen Polymer erhalten worden sind.
Ein poröses, festes Substratmaterial, welches für den Gebrauch im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt wird, ist ein mikroporöser Zelluloseester, z.B. ein Ester von Zellulose mit einer aliphatischen Carbonsäure, wie z.B. einer Alkancarbonsäure mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, z.B. Essigsäure, Propionsäure, oder irgendeiner der Buttersäuren oder Valeriansäuren. Besonders bevorzugt ist ein poröses Substratmaterial, welches aus Nitrozellulose hergestellt ist, unter welchem Ausdruck irgendein Salpetersäureester der Zellulose, gewünschtenfalls im Gemisch mit irgendeinem der genannten Carbonsäurezelluloseester, verstanden werden soll. So können reine Nitrozelluloseester verwendet werden, welche aus einem Zelluloseester bestehen, der etwa 3 Stickstoffgruppen je 6 Kohlenstoffatome aufweist. In höchstem Maße bevorzugt ist ein Nitrozellulosematerial des Handelsnamens "Millipore" (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts), welches eine Porengröße von 0,45 um aufweist.
Alle diese Materialien können als solche in geeigneten Formen, wie z.B. als Filme, Streifen oder Bannen, verwendet werden. Sie können auch auf geeignete inerte Träger, wie z.B.: Papier, Glas, Kunststoff, Metall oder Stoffe, aufgeschichtet, damit verbunden oder auf diese auflaminiert werden. Das poröse, feste Substrat liegt vorzugsweise in der Form von Streifen einer Dicke in einem Bereich von etwa 0,01 mm bis etwa 0,5 mm und in höchstem Maße bevorzugt von etwa 0,1 mm, vor. Selbstverständlich hat die Dicke des porösen Substrates einen Einfluß auf die Menge der Antikörperlösung, welche auf das Substrat aufgebracht werden muß, um einen Flecken einer gegebenen Oberfläche zu erzeugen. Die Porengröße kann innerhalb weiter Grenzen variieren, doch liegt sie vorzugsweise zwischen etwa 0,025 um und etwa 7 um, insbesondere zwischen etwa 0,15 um und etwa 4 um, und in höchstem Maße bevorzugt bei etwa 0,45 um. Bemerkt sei, daß die Erythrozyten Durchmesser von etwa 7 um aufweisen, und daß sie physikalisch (das heißt nicht-immunologisch) innerhalb der Porenstruktur von Substraten eingefangen werden können, deren Porengrößen geringfügig kleiner als diese Größe, oder größer, sind.

BESCHREIBUNG DER ANTIKÖRPER:

Der im Rahmen der vorliegenden Unterlagen unter Bezugnahme auf spezifische, bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung brauchbare Blutgruppen-Antikörper verwendete Ausdruck: "im wesentlichen rein" soll Präparationen von IgM- oder IgG-Antikörpern oder Gemische hievon bezeichnen, welche im wesentlichen frei von einer Kombination mit Antikörpern sind, welche befähigt sind, sich an Erythrozyten in einer immunologischen Reaktion zu binden, welche nicht auf spezifischen Blutgruppen-Antigenen basiert, und welche Präparationen im wesentlichen frei von einer Kombination mit Materialien sind, welche befähigt sind, eine Antigen-Antikörper-Reaktion unter Beteiligung antigener Determinanten, die für die Blutgruppen kennzeichnend sind, zu stören. Der Veranschaulichung halber sei erwähnt, daß der Ausdruck "im wesentlichen rein" angewendet werden kann, um eine im wesentlichen homogene Präparation polyklonaler Anti-A- oder Anti-B- oder Anti-D-Antikörper zu beschreiben, welche aus Serum durch Reinigungstechniken der Affinitätschromatographie unter Verwendung der entsprechenden A-, B- oder D-Antigene als alleinigen Absorptionsmitteln rein dargestellt worden sind. Der Ausdruck ist in entsprechender Weise anwendbar, um im wesentlichen homogene Präparationen monoklonaler Anti-A- oder Anti-B- oder Anti-D-Antikörper zu beschreiben, welche aus Zellkulturmedien oder aus Aszitesflüssigkeit durch Affinitätschromatographie-Reinigung oder durch Chromatographietechniken auf der Basis von z.B. für IgM- oder IgG-Typ-Immunglobuline spezifischen Absorptionsmitteln rein dargestellt worden sind.
Generell können die Immunglobuline, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, jene Immunglobuline sein, welche mit verschiedenen antigenen Determinanten spezifisch reaktiv sind, welche für besondere Blutgruppen kennzeichnend sind. Die Antikörper können IgM-Antikörper, IgG-Antikörper oder Gemische hievon sein. Antikörper, welche spezifisch mit Antigenen reaktiv sind, welche kennzeichnend für die verschiedenen Haupt- und Nebenblutgruppensysteme sind, sind für den Gebrauch im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehen. Solche Hauptblutgruppensysteme umfassen die Systeme ABO, D (Rh, Lewis, I, Kell, P, Mn, Lutheran, Kidd und Duffy. Andere Blutbruppen-Antigene und -Systeme umfassen die Antigene bzw. Systeme Xga, Dombrock, Cartwright, Langereis, Diego, Sc, Colton, Wright, Vel, Gerbich, HD-Pr-Sp, Stoltzfus, Bg Stirling, York, Gursha, Gregory, Holley, Knops-Helgeson, MPD, Vennerra, Dp, El, JMH, T, Cad und Sd.
Die Antikörper können polyklonale oder monoklonale sein, und sie sind im Handel erhältlich, oder sie können aus Mäuse-Aszites, durch Gewebekulturtechniken oder nach anderen, auf dem Fachgebiet bekannten Techniken gewonnen werden. Eine typische Beschreibung einer Hybridomen-Verfahrensweise zur Erzeugung monoklonaler Antikörper findet sich in den Publikationen von Wands, J.R., und V.R.Zurawski, Gastroenterology 80:225 (1981); Marshak-Rothstein, A., et al.; J. Immunol. 122:2491 (1979); Oi, V.T. und L.A.Herzenberg, "Immunoglobulin Producing Hybrid", Mishell, B.B. und S.M.Shiigi (Hsg.), Selected Methods in Cellular Immunology, San Francisco: W.H.Freeman Publishing, 1979; und in der am 7.Mal 1985 für Kung et al. ausgegebenen US-PS Nr. 4 515 893. Es können Gemische monoklonaler Antikörper mit unterschiedlichen, antigenen Spezifitäten, oder von monoklonalen Antikörpern und polyklonalen Antikörpern erwünscht sein. Unabhängig von der besonderen Quelle oder dem Typus der Antikörper sollten dieselben jedoch im oben definierten Sinne im wesentlichen rein sein. Die Antikörper können durch Säulenchromatographie oder mit anderen herkömmlichen Mitteln gereinigt werden, doch werden sie vorzugsweise nach den bekannten Affinitätschromatographie-Reinigungstechniken gereinigt.
Die monoklonalen Antikörper, welche derzeit für den Gebrauch im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, umfassen monoklonales Mäuse-Anti-A- Immunglobulin (bezeichnet mit AH8-39, und erhältlich von der Firma Chem Bio Med, Ltd. (Edmonton, Alberta)); monoklonales Mäuse-Anti-B-Immunglobulin (bezeichnet mit AH8-33, und erhältlich von der Firma Chem Bio Med, Ltd. (Edmonton, Alberta)); und polyklonaler Human-Anti-D-(Rho)-Antikörper, welcher von der Dade Division, American Hospital Supply Corp., oder von der RCA Division, Cooper Biomedical, erhältlich ist. Diese im Handel erhältlichen Antikörper müssen jedoch durch Affinitätschromatographie-Reinigung im wesentlichen rein gemacht werden, falls dies nicht bereits als Teil der technischen Herstellung geschehen ist, bevor sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.

Beschreibung der Blutgruppensubstanzen.

Die Blutgruppensubstanzen, die im Zusammenhang mit der alternativen Testeinrichtung der vorliegenden Erfindung für den Rückwärts-Blutgruppen-Bestimmungs-Test brauchbar sind, umfassen jene - natürlichen oder synthetisierten -Materialien, welche antigene Determinanten aufweisen, welche kennzeichnend für die verschiedenen Blutgruppen sind, wenn sie an das poröse, feste Substrat gebunden sind. Die Substanzen umfassen Blutzellen, welche Blutgruppen-Antigene aufweisen, darunter Erythrozyten, doch können sie auch Zellen anderer Fuktionalitäten umfassen und sind nicht auf Blutzellen beschränkt. Besonders nützlich sind Erythrozyten-"Gespenster", welche Erythrozyten sind, welche lysiert worden sind, und deren Hämoglobin entfernt worden ist. Weiterhin ist vorgesehen, daß Blutgruppen-Oberflächenantigene von den Zellmembranen isoliert werden können, auf welchen sie normalerweise dargeboten werden, und auf anderen Materialien präsentiert werden können. Es ist weiterhin vorgesehen, daß Polypeptid- und Polysaccharid-Antigene chemisch synthetisiert werden können, bei welchen die für die Blutgruppenantigene kennzeichnenden, antigenen Determinanten doppelt vorhanden sind. Die Antigene, die von den Blutgruppensubstanzen dargeboten werden, umfassen jene, welche der Hauptblutgruppe ABNull (=ABO) zugeordnet sind, obgleich im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch andere Antigene vorgesehen sind.

BEISPIEL 1:

In diesem Beispiel wird die Beschreibung einer Verfahrensweise gegeben, welche zur Affinitätschromatographie-Reinigung des polyklonalen Anti-D-Antikörpers nützlich ist.
Ob die im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Antikörper nun monoklonale oder polyklonale sind, ob sie im Handel erworben oder spezifisch für die Erfindung produziert worden sind, stets wird es bevorzugt, daß diese Antikörper gemäß Affinitätsreinigungstechniken wie der folgenden gereinigt werden. Ein ausreichendes Volumen von Vollblut wird zu einer Menge von Anti- D-(Rh)-Immunglobulin zugegeben, um den gesamten Antikörper in einer Stunde bei 37ºC zu binden. Dann werden die gebundenen Erythrozyten durch Zentrifugation geerntet, und zu 1 Volumensteil der Erythrozyten werden 9 Volumensteile von 0,1%igem Digitonin in Kochsalzlösung (0,9%iger NaCl-Lösung) zugegeben. Das Gemisch wird während 1 min kräftig geschüttelt, und die so entstandenen Membranen werden dann geerntet und durch Zentrifugation so lange gewaschen, bis ein weißes Pellet erhalten worden ist.
Dann wird 1 Volumensteil der Zellmembranen mit 1 Volumensteil einer 6%igen Albuminlösung und 2 Volumensteilen Ether vermischt, und das Gemisch wird während 1 min kräftig geschüttelt. Das Gemisch wird dann während 15 min bei 37ºC inkubiert. Aus diesem Gemisch kann die Albuminfraktion, welche das Anti-D-Immunglobulin enthält, durch Zentrifugation isoliert werden. Dann wird eine ausreichende Menge von Protein-A-Sepharose zugesetzt, um das Anti-D-Immunglobulin in 1 h bei Zimmertemperatur zu binden. Das Protein-A-Sepharose/Immunglobulin- Konjugat wird dann in eine Gelfiltrationssäule gegossen und mit PBS gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Das Anti-D-Immunglobulin wird mit PBS (pH 3,0) eluiert. Der End-pH-Wert des Immunglobulins wird dann auf 6,5 bis 7,5 eingestellt, und das Material wird bis zum Gebrauch gelagert.

BEISPIEL 2:

Bei diesem Beispiel wird eine Beschreibung einer Säulenchromatographie-Technik gegeben, welche für die Reinigung der Antikörper geeignet ist, die für die praktische Ausführung der Erfindung brauchbar sind. Es ist bekannt, daß für die praktische Ausführung der Erfindung brauchbare IgG-Antikörper sich stark an das Protein A, ein aus Staph. aureus isoliertes Zellwandprotein, binden, während IgM-Antikörper sich stark mit Protamin verbinden. In diesem Beispiel wird Protamin, welches kovalent an Sepharose gebunden ist, dazu verwendet, die IgM aus Mäuse-Aszitesflüssigkeit selektiv zu adsorbieren. Ähnliche Verfahren können zum Reinigen von IgG-Antikörpern unter Verwendung von mit Protein-A-Material gepackten Säulen angewendet werden.
Das Protamin wird unter Anwendung einer Bromcyan-Behandlung an Sepharose-4B gekuppelt; oder es kann dieses Material im Handel bezogen werden. Dann wird eine Säule mit den Protaminperlen gepackt, und sie wird mit einer Phosphat/- Kochsalzlösung-Pufferlösung (Puffer A) ins Gleichgewicht gebracht, welche eine Lösung umfaßt, welche aus 0,03 M KH&sub2;PO&sub4;, 0,026 M NaCl, und 0,05 % NaN&sub3; angesetzt worden ist, und welche eine Lösung umfäßt, welche aus 0,03 M Na&sub2;HPO&sub4;, 0,026 M NaCl und 0,05 % NaN&sub3; angesetzt worden ist, wobei diese Lösungen in solchen Mengen miteinander vermischt worden sind, daß sie einen pH-Wert von 7,4 aufweisen. Dann werden 5 Säulenvolumensanteile des Puffers A durch die Chromatographiesäule laufen gelassen.
Die zu reinigende Aszitesflüssigkeit wird mit 4 Teilen der Puffer-A-Lösung verdünnt, und sie wird auf die Säule aufgebracht. Die IgM werden durch das gebundene Protamin selektiv auf der Säule adsorbiert, und sie werden nicht zusammen mit der Pufferlösung eluiert. Die selektiv adsorbierten IgM können dann unter Verwendung einer unterschiedlichen Phosphat-/Kochsalzlösung-Pufferlösung (des Puffers B) eluiert werden, welcher letztgenannte eine Lösung umfaßt, welche aus 0,08 M KH&sub2;PO&sub4;, 1,1 M NaCl, und 0,05 % NaN&sub3; angesetzt worden ist, und welcher eine Lösung umfaßt, welche aus 0,08 M Na&sub2;HPO&sub4;, 1,1 M NaCl und 0,05 % NaN&sub3; angesetzt worden ist, wobei diese beiden Lösungen in solchen Mengen miteinander vermischt worden sind, daß sie einen pH-Wert von 7,4 aufweisen. 10 Säulenvolumensanteile des Puffers B werden dann durch die Säule eluiert, um die gewünschten IgM zu extrahieren.
Das Eluat aus der obigen Verfahrensweise enthält die gewünschten IgM. Das den Antikörper enthaltende Eluat wird dann auf Sepharose-400-Sortierungsperlen aufgebracht, und Tris-Glycin-Puffer wird durch die Säule eluiert. Die Fraktionen des Eluates werden dann auf das Vorliegen der gewünschten IgM bewertet, und die gewünschte Fraktion wird isoliert und gelagert.

BEISPIEL 3:

A. Herstellung der Testeinrichtung für eine Blutgruppen-Bestimmung gemäß dem Vorwärtstypus:

Die im wesentlichen reinen Antikörper sollen auf das poröse, feste Substrat in einer regelmäßigen Anordnung von abgegrenzten Adsorptionsflächenteilen derart aufgebracht werden, daß in bezug auf jeden einzelnen Adsorptionsflächenteil getrennte immunologische Tests durchgeführt werden können. Beim Aufbringen der Antikörper auf den porösen, festen Träger kann eine Vielfalt von Mitteln angewendet werden. Das Immunglobulin kann auf das poröse Substrat mit händischen Mitteln, wie z.B. mit Kapillarröhrchen, Pipetten oder Spritzen, oder mit Hilfe eines durch gasförmige oder flüssige Treibmittel unterstützten Sprays, aufgebracht werden. Wird das Immunglobulin mit Hilfe eines Sprays aufgebracht, dann kann - in Verbindung mit bekannten lithographischen Techniken - eine Matrize oder eine Appliziereinrichtung verwendet werden, die nach Verfahrensweisen miniaturisiert worden ist, wie sie auf dem Gebiet der Mikroelektronik bekannt sind.
Der Antikörper kann so aufgebracht werden, daß er irgendeine geeignete Geometrie ergibt, wie z.B. Tüpfelchen, Linien oder Flecken. Es kann eine regelmäßige Anordnung von parallelen Linien in eine Anzahl von Streifen eingeschnitten werden, von denen ein jeder eine Anzahl von Segmenten enthält, von denen wiederum ein jedes einen Antikörper von unterschiedlicher Spezifität enthält. Solche Streifen wären für die Techniken der Massenerzeugung ohneweiteres geeignet. Die regelmäßige Anordnung kann von einem Antikörper bis zu einer großen Anzahl von Antikörpern enthalten, doch werden dieselben wegen ihrer Seltenheit und Kostspieligkeit vorzugsweise in kleinen Volumensanteilen aufgebracht.
Vorzugsweise werden die Antikörperlösungen in kleineren Volumensanteilen als 1 ul aufgebracht, wobei Volumensanteile von etwa 0,5 ul für die Erzeugung von Tupfen mit einem Durchmesser von etwa 1 bis 2 mm besonders bevorzugt sind. Tupfen dieser Größe werden für Einrichtungen bevorzugt, bei denen man auf die visuelle Prüfung von positiven Farbsignalen angewiesen ist. Es können auch kleinere Volumensanteile von Antikörperlösungen verwendet werden, doch können solche Volumensanteile noch kleinere Tupfen ergeben, welche eine Bewertung mit spektrophotometrischen Mitteln erfordern. Ist es vorgesehen, daß die Einrichtungen der vorliegenden Erfindung durch nicht-visuelle Mittel, wie z.B. ein Reflexionsspektrophotometer,bewertet werden sollen, dann werden vorzugsweise kleinere Volumensanteile als 0,5 ul aufgebracht, um die Mengen der Antikörpermaterialien, welche für die Erzeugung der Einrichtungen der Erfindung erforderlich sind, noch weiter zu reduzieren.
Die Konzentrationen der in Lösungen aufgebrachten Antikörper fallen vorzugsweise in einen Bereich von etwa 100 - 150 ug IgM je ml der Lösung, wenn sie auf die Nitrozellulosebahnen der vorliegenden Erfindung aufgebracht werden. In höchstem Maße bevorzugt sind Antikörperkonzentrationen in einem Bereich von etwa 120 - 140 ug IgM je ml der Lösung. Größere Konzentrationen können zwar aufgetragen werden, doch mögen sie einer weiteren Erhöhung der Bindungswirksamkeit der Tupfen nicht dienlich sein. Geringere Konzentrationen können ebenfalls aufgebracht werden, mit der Wirkung, daß die Dichte der positiven Farbsignale verringert sein mag. Obgleich zu erwarten ist, daß geringere Antikörperkonzentrationen die Intensität eines positiven Farbsignals so weitgehend reduzieren können, daß dadurch eine visuelle Bewertung der Testergebnisse vernindert wird, so wird dennoch erwartet, daß eine reduzierte Intensität des Farbsignals die spektrophotometrischen Bewertungen der Einrichtungen der Erfindung nicht ungebührlich behindern würde.
Nachstehend wird eine Beschreibung der Herstellung einer spezifischen Einrichtung für eine schnelle Blutgruppen-Bestimmung hinsichtlich der Systeme ABO und D gegeben.
Nitrozellulosefilterpapierbahnen (Millipore Corporation) einer Dicke von 0,1 mm und eines durchschnittlichen Porendurchmessers von 0,45 um wurden zu Streifen zerschnitten und unter Verwendung eines geeigneten Klebstoffes auf einem starren Kunststoffträger montiert. Auf jeden Streifen wurden die folgenden Materialien aufgetragen: 70,5 ng von durch Affinitätschromatographie gereinigtem monoklonalem Mäuse-Anti-A-IgM-Antikörper, der von der Firma Chem Bio Med, Ltd. (Edmonton, Alberta) erhalten worden war; 60,0 ng von durch Affinitätschromatographie gereinigtem, monoklonalem Mäuse-Anti-B-IgM-Antikörper, der von der Firma Chem Bio Med, Ltd. (Edmonton, Alberta) erhalten worden war; und polyklonaler Human-Anti-D-IgG-Ahtikörper, der mit einem Titer von 1:30.000 als Reagens für Tests auf Objektträgern und in Proberöhrchen von der Firma Dade Division, American Hospital Supply, oder von der BCA Division der Cooper Biomedical erhalten worden war, und der durch Affinitätschromatographie gemäß der Verfahrensweise des Beispiels 1 gereinigt worden war. Der Anti-A-Antikörper wurde in einer PBS-Lösung mit einem Gehalt von 1 % an Saccharose auf einen Titer von 1:4.000 (141 ug/ml) verdünnt, und er wurde auf die Nitrozellulosestreifen in Tupfen eines Durchmessers von 1 bis 2 mm und in einer Menge von 0,5 ul je Tupfen mittels einer automatischen Mikrotiterspritze des Typus "Hamilton" aufgebracht. Der Anti-B-Antikörper wurde in einer PBS-Lösung mit einem Gehalt von 1 % an Saccharose auf einen Titer von 1:4.000 (120 ug/ml) verdünnt, und er wurde auf den Nitrozellulosestreifen in Tupfen eines Durchmessers von 1 bis 2 mm und in einer Menge von 0,5 ul je Tupfen mittels einer automatischen Spritze aufgebracht. Der durch Affinitätschromatographie gereinigte Anti-D-Antikörper wurde auf einen Titer von 1:100.000 verdünnt, und er wurde auf den Nitrozellulosestreifen in Tupfen eines Durchmessers von 1 bis 2 mm und in einer Menge von 0,5 ul je Tupfen mittels einer automatischen Spritze aufgebracht. Die Streifen wurden dann trocknen gelassen und bis zum Gebrauch im Exsikkator gelagert.
Die vorliegende Erfindung ist insofern bemerkenswert, als es bei Verwendung des bevorzugten Nitrozellulosesubstrates nicht notwendig ist, die regelmäßige Anordnung von Antigenen oder Antikörpern mit Protein-Blockierungsmitteln, wie z.B. Rinderserumalbumin, zu inkubieren, wie dies bei Gordon der Fall ist. Eine solche Inkubation kann sich sogar als schädlich für die Einrichtungen der vorliegenden Erfindung erweisen. Daher werden die Testeinrichtungen - nach dem Aufbringen der Antikörper - bei Zimmertemperatur trocknen gelassen und bis zum Gebrauch in einem Exsikkator gelagert.

B. Verfahrensweise bei einer "Vorwärts"-Blutgruppen-Bestimmung:

Die folgende Verfährensweise einer "Vorwärts"-Blutgruppen-Bestimmung wird für eine Blutgruppen-Bestimmung gemäß der Erfindung angewendet. Es wird Blut gesammelt, und zwar in höchstem Maße bevorzugt Vollblut, und dasselbe wird mit einem gerinnungshemmenden Mittel behandelt. Saure Citratdextrose (ACD) ist das gerinnungshemmende Mittel der Wahl, doch können auch andre gerinnungshemmende Mittel, wie z.B. EDTA oder Heparin, verwendet werden. Die Blutzellen aus einem Röhrchen mit einem Blutgerinnsel können für den Gebrauch im Rahmen der vorliegenden Erfindung erneut in Kochsalzlösung suspendiert werden, und es kann auch Blut aus Kapillaren verwendet werden.
Der Test wird durchgeführt, indem man die Testeinrichtung mit einer Probe des zu prüfenden Blutes, vorzugsweise durch Eintauchen, in Berührung bringt, obgleich auch andere Methoden, wie z.B. Auftüpfeln des Blutes auf den Streifen, annehmbar sind. Das Blut wird mit dem Teststreifen während 1 bis 30 s, aber vorzugsweise während nur 2 bis 5 s, in Berühung gebracht. Der Teststreifen wird dann sofort in einer normalen Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) sachte gewaschen, und zwar entweder durch Abspülen, oder vorzugsweise durch Eintauchen und leichtes Rühren während 10 bis 15 s bei Zimmertemperatur.
Der Teststreifen sollte dann innerhalb von zwei min nach der Reaktion abgelesen werden. Alternativ können die Ergebnisse auf der Testeinrichtung durch Eintauchen derselben in eine Lösung von Methylalkohol, Säure, oder in ein anderes, geeignetes Fixiermittel fixiert werden. Eine positive Reaktion wird durch einen roten Tupfen gegen den Hintergrund des porösen Substrates signalisiert. Der rote Tupfen kann visuell oder mit einem Gerät, wie z.B. einem Reflexionsspektrophotometer, festgestellt werden. Der rote Tupfen wird durch das Befestigen von Erythrozyten an dem auf der Membran lokalisierten Antikörper erzeugt. Blutzellen der Blutgruppe A werden an Tupfen kleben, welche den A-Antikörper enthalten, Blutzellen der Blutgruppe B werden an Tupfen kleben, welche den B-Antikörper enthalten, und Blutzellen der Blutgruppe D (Rho) werden an Tupfen kleben, welche den D-(Rh)-Antikörper enthalten. Enthalt eine Testeinrichtung 3 Tupfen, welche jeweils A-, B- bzw. D-(Rh)-Antikörper enthalten, dann können die Ergebnisse hinsichtlich der Blutgruppen nach dem folgenden Protokoll abgelesen und interpretiert werden: TABELLE I: A-Tupfen B-Tupfen D-(Rh)-Tupfen Interpretation A-negativ A-positiv
Die Analyse für die anderen Haupt- und Neben-Blutgruppen und Blutgruppen- Antigene kann in gleicher Weise durchgeführt werden. Solche Einrichtungen können auch Tupfen für den Gebrauch als positive und negative Kontrollen aufweisen. Als positive Kontrolle kann Anti-Human-Erythrozyten-Immunglobulin auf die Testeinrichtung aufgetüpfelt werden, damit dieselbe bei Vorliegen von Human-Erythrozyten ein Farbsignal präsentiert. Eine negative Kontrolle kann durch Auftüpfeln eines nicht-erythrozytenspezifischen Immunglobulins geschaffen werden.

BEISPIEL 4:

In diesem Beispiel wurde das Blut von verschiedenen ABO- bzw. (D)-Blutgruppen mit Hilfe von Teststreifen untersucht, welche nach den im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren angefertigt worden waren und gebraucht werden. Als Bezugsbasis wurden die Proben auch nach Standard-Agglutinationstechniken geprüft. Das erfindungsgemäße Verfahren stimmte mit dem Bezugsverfähren hinsichtlich der ABO-Klassifizierung der Blutproben in 100 % von 171 Fällen überein. Hinsichtlich der D-(Rh)-Klassifizierung stimmte das erfindungsgemäße Verfahren mit den Ergebnissen des Agglutinationsverfahrens in 100 % von 166 Fällen überein. Hinsichtlich des Nachweises der Du-Variantenform konnte das erfindungsgemäße Verfahren jedoch nur 4 Proben als Du-positiv nachweisen, während nach dem Bezugsverfahren 7 Proben als positiv identifiziert wurden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden 3 der Du-positiven Proben als D-negativ identifiziert. TABELLE II: Teststreifen der Erfindung Bezugsverfahren (Agglutination)
Erfindungsgemäß wird auch eine alternative Einrichtung zur Blutgruppen-Bestimmung von Blutserum-Antikörpern geschaffen. Die Einrichtung ist auch befähigt, eine Blutgruppe durch "Rückwärts"-Blutgruppen-Bestimmung festzustellen, und zwar wegen der komplementären Beziehung zwischen der Blutzellen- Blutgruppe und der Serum-Antikörper-Blutgruppe. Die alternative Einrichtung umfaßt das poröse, feste Substrat der Einrichtung zur "Vorwärts"-Blutgruppen- Bestimmung, an welche Blutgruppensubstanzen in einer regelmäßigen Anordnung von abgegrenzten Adsorptionsflächenteilen gebunden sind. Alternativ ist es vorgesehen, daß die Blutgruppensubstanzen an das poröse Substrat mittels einer immunologischen Reaktion mit Antikörpern indirekt gebunden werden können, welche Antikörper selbst an das Substrat kovalent gebunden sind. Solche Antikörper können an das Substrat nach den Verfahren der Einrichtung zur direkten Blutgruppen-Bestimmung gebunden werden.
Gemäß einer Ansführungsform werden Blutgruppensubstanzen, welche Antigene der gleichen antigenen Spezifität wie jene aufweisen, auf welche das Serum durch "Rückwärts"-Blutgruppen-Bestimmung untersucht werden soll, auf ein poröses, festes Substrat gemäß den Verfahren fur den Aufbau einer Einrichtung zur Durchführung einer direkten Blutgruppen-Bestimmung aufgebracht. Die Blutgruppensubstanzen bieten somit eine antigene Stelle dar, gegenüber welcher Serum-Antikörper von besonderen Spezifitäten reaktiv sind.
Beispielsweise kann eine Einrichtung zum Feststellen von Anti-A-Serum-Antikörpern dadurch aufgebaut werden, daß man auf ein poröses, festes Substrat eine Blutgruppensubstanz aufbringt, welche ein A-Antigen darbietet, wie z.B. lysierte, A-negative Erythrozyten. Dann wird ein Tropfen der zu untersuchenden Serumprobe auf die Testeinrichtung unter Bedingungen aufgebracht, welche für eine immunologische Reaktion angemessen sind. Sind Anti-A-Antikörper in der Serumprobe vorhanden, dann werden sie sich an die Blutgruppensubstanzen binden. In der abschließenden Stufe werden nicht-lysierte Erythrozyten der Blutgruppe A, welche noch ihre rote Farbe zeigen, auf die Testeinrichtung unter Bedingungen aufgebracht, welche für eine immunologische Reaktion angemessen sind. Waren Anti-A-Antikörper in dem zu untersuchenden Serum vorhanden, dann werden sie sich auf die Blutgruppensubstanzen in der Testeinrichtung binden. Sie werden auch dazu dienen, die Erythrozyten an die Testeinrichtung zu binden. Nach dem Wegspülen jeglicher ungebundener Erythrozyten nach dem Verfahren des Beispiels 3 zeigt der Nachweis eines Signals von roter Farbe auf dem porösen Substrat an, daß Erythrozyten an die Serum-Antikörper gebunden sind, was eine positive Anzeige hinsichtlich des Vorliegens von Serum-Antikörpern der Blutgruppe A darstellt. Dies zeigt wiederum an, daß die entsprechende Blutgruppe nicht die Blutgruppe A ist. Das rote Farbsignal kann visuell oder mit Geräten, wie z.B. einem Spektrophotometer, festgestellt werden.
Blutgruppensubstanzen, welche mehr als eine einzige antigene Blutgruppen-Determinante darbieten, können eine "Rückwärts"-Blutgruppen-Analyse komplizieren, weil diese Blutgruppensubstanzen befähigt sind, in unklarer Weise mit mehr als einer Spezifität von Serum-Antikörper zu reagieren. Aus diesem Grunde werden Blutgruppensubstanzen, welche einfach Antigene der Blutgruppe A oder Antigene der Blutgruppe B darbieten, gegenüber jenen bevorzugt, welche Mehrfachantigene aufweisen, wie z.B. Erythrozyten-"Gespenster" der Blutgruppe AB. Nichtsdestoweniger können etwaige Unklarheiten in den Analysen durch eine sorgfältige Auswahl der Blutgruppen überwunden werden, welche in den Erythrozyten vorhanden sind, welche aufgetragen werden, um die Serum-Antikörper sichtbar zu machen, sowie dadurch überwunden werden, daß man eine regelmäßige Anordung von Testtupfen mit einer Vielfalt von an das poröse Substrat gebundenen Blutgruppensubstanzen vorsieht, welche Blutgruppensubstanzen gegenüber spezifischen Antikörpern empfindlich sind. Es kann eine Vielfalt von Kombinationen von Blutgruppensubstanzen-Spezifitäten, Spezifitäten der Basis-Antikörper und Spezifitäten der Markierungs-Erythrozyten entworfen werden, um das Vorliegen irgendeiner Kombination von Serum-Antikörpern und somit Blutgruppen nachzuweisen.

Claims

1. Testeinrichtung zur Bestimmung der Blutgruppe einer Blutprobe, welche Testeinrichtung umfaßt:

(a) ein festes Substrat;

(b) einen oder mehrere, im wesentlichen reine Antikörper, welche mit Erythrozyten-Antigendeterminanten, die für eine Blutgruppe kennzeichnend sind, spezifisch reaktiv sind, wobei jeder Antikörper an das Substrat in einer abgegrenzten Adsorptionsfläche gebunden ist und befähigt ist, in der Blutprobe vorhandene Erythrozyten, mit welchen der betreffende Antikörper spezifisch reaktiv ist, immunologisch an die Oberfläche des Substrates zu binden, um innerhalb der abgegrenzten Fläche - im Gegensatz zu Flächenteilen auf der Oberfläche des Substrates, auf welchen keine Blutgruppen-Antikörper gebunden sind - ein feststellbares Farbsignal zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet, daß das feste Substrat porös ist, nämlich eine mittlere Porengröße von 0,025 bis 7,0 um aufweist.

2. Testeinrichtung nach Anspruch 1, wobei das Substrat ein Nitrozelluloseblatt ist.

3. Testeinrichtung nach Anspruch 1, wobei die Antikörper an das Substrat nicht-kovalent gebunden sind.

4. Testeinrichtung nach Anspruch 1, wobei die Antikörper durch Affinitätschromatographie gereinigte Antikörper sind.

5. Testeinrichtung nach Anspruch 1, wobei die Antikörper aus einer Gruppe ausgewählt sind, welche aus Anti-A-, Anti-B- und Anti-D-Antikörpern besteht.

6. Testeinrichtung nach Anspruch 2, wobei die Antikörper ein oder mehrere, im wesentlichen reine Antikörper sind, welche aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus durch Affinitätschromatographie gereinigten monoklonalen Anti-A-Antikörpern, durch Affinitätschromatographie gereinigten monoklonalen Anti-B-Antikörpern und durch Affinitätschromatographie gereinigten monoklonalen Anti-D-Antikörpern besteht, wobei jeder Antikörper nicht-kovalent an das Blatt gebunden ist.

7. Testeinrichtung nach Anspruch 6, wobei das Nitrozelluloseblatt eine Porengröße von etwa 0,45 um aufweist.

8. Verfähren zum Bestimmen der Blutgruppen einer Blutprobe, welches Verfahren umfaßt:

(a) Inkubieren der Testeinrichtung nach Anspruch 1 oder 6 mit einer Blutprobe, deren Gruppe bestimmt werden soll;

(b) Spülen der Testeinrichtung;

(c) Feststellen eines Farbsignals aus Erythrozyten, welche immunologisch an Antikörper gebunden sind, welche letztgenannten an das poröse, feste Substrat gebunden sind.

9. Testeinrichtung zum Bestimmen der Blutgruppe einer Blutprobe, welche Testeinrichtung umfaßt:

(a) ein festes Substrat;

(b) eine Blutgruppensubstanz, welche Antigendeterminanten zur Verfügung stellt, welche kennzeichnend für eine spezifische Blutgruppe sind, wobei diese Blutgruppensubstanz derart an das feste Substrat gebunden ist, daß sie befähigt ist, Serum-Antikörper aus einer Serumprobe zu binden, welche Antikörper selbst befähigt sind, solche Erythrozyten immunologisch zu binden, mit welchen die Antikörper spezifisch reaktiv sind, dadurch gekennzeichnet, daß das feste Substrat porös ist, nämlich eine mittlere Porengröße von 0,025 bis 7,0 um hat, und daß die Blutgruppensubstanz weiterhin Blutgruppensubstanzen von mehr als einer spezifischen Blutgruppe umfassen kann, wobei jede Blutgruppensubstanz einer spezifischen Blutgruppe an das feste Substrat in einer abgegrenzten Adsorptionsfläche gebunden ist, um innerhalb der abgegrenzten Fläche - im Gegensatz zu Flächenteilen auf der Oberfläche des Substrates, auf welchen keine Blutgruppensubstanzen gebunden sind - ein feststellbares Farbsignal zu erzeugen.

10. Testeinrichtung nach Anspruch 9, wobei das poröse, feste Substrat ein Nitrozelluloseblatt ist.

11. Testeinrichtung nach Anspruch 9, wobei die Blutgruppensubstanz aus einer Gruppe ausgewählt ist, welche aus Blutgruppensubstanzen besteht, welche eine Antigendeterminante zur Verfügung stellen, die für die Blutgruppen A oder B kennzeichnend ist.

12. Testeinrichtung nach Anspruch 9, wobei die Blutgruppensubstanz ein Oligosaccharid ist.

13. Testeinrichtung nach Anspruch 9, wobei die Blutgruppensubstanz eine lysierte Erythrozytenmembran mit einer charakteristischen Blutgruppenspezifität ist.

14. Verfahren zum Bestimmen der Blutgruppe einer Blutprobe, welches Verfahren umfaßt:

(a) Inkubieren der Testeinrichtung nach Anspruch 9 mit einer Probe von Vollblut oder von aus Vollblut isoliertem Serum, dessen Gruppe zu bestimmen ist;

(b) Spülen der Testeinrichtung;

(c) Inberührungbringen der Testeinrichtung mit einem Gemisch von Erythrozyten, welches Erythrozyten umfaßt, welche Antigendeterminanten darbieten, welche kennzeichnend fur die Blutgruppen sind, auf welche untersucht werden soll;

(d) Feststellen eines Farbsignals aus Erythrozyten,welche über die Serum- Antikörper an die Blutgruppensubstanz gebunden sind, welche letztgenannte an das feste Substrat gebunden ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Gemisch von Erythrozyten solche der Gruppe A und solche der Gruppe B umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Gemisch von Erythrozyten solche der Gruppe AB umfaßt.