DE3539775A1 - Neues lymphokin, gegen dieses lymphokin spezifische antikoerper, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents
Neues lymphokin, gegen dieses lymphokin spezifische antikoerper, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendungInfo
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Description
Anmelderin: Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku
Kenkyujo, Japan
Neues Lymphokin, gegen dieses Lymphokin spezifische Antikörper,
Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
Die Erfindung betrifft ein neues Lymphokin, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung sowie einen
gegenüber diesem Lymphokin spezifischen monoklonalen Antikörper und seine Herstellung.
Lymphotoxin (LT) und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) sind bekannte
Lymphokine, die Tumorzellen schädigen. So wurde Lymphotoxin beispielsweise beschrieben von Aoki, Ryuichi
et al. in "Lymphokine", Shin-Menekigaku Sosho, Bd. 6, Seiten 87 bis 105, Igaku-Shoin, Tokio, 1979; B.R. Bloom & P.R.
Glade in "In Vitro Method in Cell-Mediated Immunity", Academic Press, Inc. 19-71; und in "Cellular Immunology", Bd.
38, Seiten 388 bis 402 (1978); der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) wurde beispielsweise beschrieben in E.A. Carswell
et al. "Proceedings of the National Academy of Sciences
of the U.S.A." Bd. 72, Nr. 9, Seiten 3666 bis 3670 (1975)
und in E. Pick "Lymphokines", Bd. 2, Seiten 235 bis 272 "Tumor Necrosis Factor", Academic Press, Inc. (1981).
Kürzlich wurde in der JA-A-146 293/83 ein Anti-Tumoi—Lymphokin-Glycoprotein
beschrieben.
In "Scientific American", Bd. 243, Nr. 4, Seiten 56 bis 64 (1980) beschreibt C. Milstein monoklonale Antikörper.
Als Chemotherapeutika werden im allgemeinen mindestens
ein Alkylierungsmittel, metaboiische Antagonisten, Antitumorantibiotika
und Pflanzenalkaloide verwendet. Chemotherapeutika haben jedoch die Nachteile, daß bei ihrer Verwendung
bei den Patienten Nebenwirkungen auftreten können, daß ihr Tumorspektrum relativ eng und ungenügend ist und daß
sie zu medikament-resistenten Tumoren führen können.
Als Ergebnis jahrelanger Untersuchungen über Lymphokine wurde nun ein neues Lymphokin entdeckt, dessen physikochemische
Eigenschaften und zytotoxische Aktivität auf bösartige Tumorzellen völlig von denen bekannter Lymphokine verschieden
sind. Dieses neue Lymphokin kann nun hergestellt und verwendet werden, außerdem wurde ein gegenüber diesem
Lymphokin spezifischer monoklonaler Antikörper gefunden und auch hergestellt.
Die Erfindung betrifft somit ein neues Lymphokin mit den
folgenden physikochemischen Eigenschaften:
1) Molekulargewicht: 20.000 - 2.000 Dalton
2) Isoelektrischer Punkt: pi = 6,2 - 0,3
3) Elektrophoretisch^ Beweglichkeit: auf Scheiben-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE):
Rf = 0,29 - 0,02
4) UV-Absorptionsspektrum:
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm
5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
unlöslich in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer, kaum löslich oder unlöslich in Ethylether, Ethylacetat
oder Chloroform
6) Farbreaktion:
proteinpositiv gemäß Lowry- oder nach der Mikrobiuret-
Methode,
saccharidpositiv mit Phenol-Schwefelsäure oder Anthron-
Schwefelsäure
7) Biologische Eigenschaften: gegen L 929-Zellen zytotoxisch,
gegen K3-Zellen zytostatisch, Draktisch frei von Interferonaktivität
8) Stabilität in wässerigen Lösungen:
bis zu 60 0C stabil bei 30-min. Inkubation bei pH 7,2
stabil im oH-Bereich von 4,0 bis 11,0 bei 16-stünd. Inkubation bei 4 C und
9) Stabilität bei Kryokonservierung bzw. Kältelagerung: bei -10 C über einen Monat und länger stabil.
Die Erfindung betrifft auch die Herstellung und die Verwendung des erfindunqsgemäßen Lymphokine sowie den gegenüber
diesem Lymphokin spezifischen monoklonalen Antikörper und
seine Herstellung.
-X-
Im folgenden wird das neue erfindungsgemäße Lymphokin einfach
mit "LK 2" abgekürzt.
LK 2 wird hergestellt durch Inberührungsbringen von LK 2
produzierenden Humanzellen, beispielsweise Humanleukozyten, Humanlymphozyten und daraus etablierten Zellinien, mit
einem LK 2-Induktor. Humanleukozyten und —lymphozyten können
aus frischem Humanblut isoliert werden; die etablierten Humanzellinien können in herkömmlicher Weise in vitro vermehrt
werden.
Für eine wirkungsvollere Ausnutzung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist es zweckmäßig, eine in vivo Zellvermehrung anzuwenden, in der die Humanzellinie direkt in einen nichthumanen Warmblütler transplantiert wird oder in herkömmliche
Diffusionskammern inokuliert wird, in denen die Nährflüssigkeit des nichthumanen Warmblütlers der Zellinie zugeführt
wird.
Im Gegensatz zur in vitro Zellvermehrung benötigt das in
vivo Verfahren kein oder viel weniger teures Serum enthaltendes Nährmedium und weniger Pflege während der Zellvermehrung;
die vermehrten Humanzellen liefern eine viel höhere LK 2-Aktivität.
Außerdem kann bei dem in vivo Verfahren die Humanzellinie leicht vermehrt werden durch Verwendung der von dem nichthumanen Warmblütler zur Verfügung gestellten Nährkörper—
flüssigkeit, wenn man die Humanzellinie einem nichthumanen Warmblütler transplantiert oder die Zellinie in eine herkömmliche
Diffusionskammer einbringt, die die Körperflüssigkeit
aufnimmt und diese Kammer in das Tier einbettet oder auf das Tier aufbringt. In beiden Fällen werden die Tiere
in herkömmlicher Weise gefüttert.
4Z:
Das in vivo Verfahren ist außerdem dadurch gekennzeichnet, daß eine stabilere und schnellere Zellvermehrung, eine
höhere Zellproduktion und eine viel höhere LK 2-Produktion je Zelle als mit dem in vitro Verfahren erreicht werden
kann.
Für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren sind
Humanzellinien geeignet, die LK 2 produzieren, in einen nichthumanen Warmblütler transplantiert und in diesem Tier
leicht vermehrt werden können, wie beispielsweise die in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd. 20, Nr. 6, Seiten
616 bis 643 (1975) beschriebenen Humanzellinien. Besonders geeignet sind Human-Lymphoblastoidlinien, wie Namalwa (ATCC
CRL 1432), beschrieben in "Journal of Clinical Microbiology", Bd. 1, Seiten 116 bis 117 (1975); BALL-I, TALL-1
und NALL-1, beschrieben in I. Miyoshi, "Nature", Bd. 267,
Seiten 843 bis 844 (1977); M-7002 und B-7101, beschrieben
in "The Journal of Immunology", Bd. 113, Seiten 1334 bis 1345 (1974); JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT-3 (ATCC CRL 1552)
und EBV-HO, beschrieben in "The Tissue Culture", Bd. 6, Nr. 13, Seiten 527 bis 546 (1980); CCRF-SB (ATCC CCL 120);
CCRF-CEM (ATCC CCL 119); BALM 2; DND-41; und andere etablierte
Zellinien, die durch Transformieren normaler Humanmonozyten oder -granulozyten mit karzinogenen Viren, Mitteln
oder Bestrahlung erhalten worden sind.
Die Vermehrungsgeschwindigkeit und/oder LK 2-Produktivität
je Zelle dieser Zellinien kann verbessert werden durch Zellfusion mit Polyethylenglykol oder Sendai-Virus oder
durch Genrekombination mit beispielsweise Nuklease, Ligase oder DNA-Polymerase. Die hier angegebenen verwendbaren
Humanzellinien sollen jedoch den Umfang der Erfindung nicht beeinträchtigen. Eine oder mehrere dieser Zellinien können
kombiniert in den Stufen bis zur LK 2-Induktion verwendet
werden. Gegebenenfalls können Humanleukozyten oder Lymphozyten,
die aus frischem Humanblut hergestellt werden können,
in Kombination mit jeder dieser Humanzelllinien verwendet werden.
Als nichthumaner Warmblütler können im erfindungsgemäßen
Verfahren alle Tiere verwendet werden, in denen sich Humanzellen vermehren können, beispielsweise Geflügel, wie Hühner
oder Tauben, oder Säugetiere, wie Hunde, Katzen, Affen, Kaninchen, Ziegen, Schweine, Pferde, Rinder, Meerschweinchen,
Ratten, Nacktratten, Hamster, Mäuse oder Nacktmäuse.
Da die Transplantation von Humanzellen in Tiere unerwünschte
Immunoreaktionen hervorruft, werden nichthumane Warmblütler im möglichst jüngsten Stadium verwendet, z.B. als Ei, Embryo
oder Fötus oder als Neugeborene oder jüngste Tiere, um diese Immunreaktion so gering wie möglich zu halten.
Vor der Transplantation können die Tiere mit Röntgen- oder Gamma-Strahlen in einer Dosis von etwa 200 bis 600 rem
bestrahlt werden, oder es wird ihnen ein Antiserum oder ein die Immunreaktion unterdrückendes Mittel injiziert,
um die Immunreaktion auf dem geringstmöglichen Wert zu halten.
Bei Verwendung eines Tieres ohne Immunreaktion, wie einer Nacktmaus oder Nacktratte als Wirt, können die oben beschriebenen
Humanzellen ohne diese Vorbehandlung in die Tiere transplantiert und leichter vermehrt werden, ohne Angst vor
auftretenden unerwünschten Immunreaktionen, da diese Tiere sogar als Erwachsene weniger Immunreaktionen zeigen.
Die Zellvermehrung und/oder die Erhöhung der LK 2-Produktion kann stabilisiert werden durch nacheinanderfolgende Transplantation
in den gleichen oder in verschiedene nichtmensch-
liehe Warmblutle η. Das kann beispielsweise dadurch erreicht
werden, daß eine Zellinie zuerst einem Hamster transplantiert wird und die Humanzellinie in dem Hamster vermehrt
wird, dann die vermehrten Humanzellen in eine Nacktmaus
transplantiert werden. In diesem Fall können die aufeinander folgenden Transplantationen mit einem nichthumanen Warmblütler
der gleichen Klasse oder Ordnung wie auch der gleichen Art oder Gattung durchgeführt werden.
Die Humanzellen können in jede Stelle des Tieres transplantiert werden, vorausgesetzt, die Humanzellen vermehren
sich dort: Beispielsweise in die Allantoishöhle oder intravenös, intraperitoneal oder subkutan.
Die Humanzellen können aber auch vermehrt werden durch Einbringen in eine herkömmliche Diffusionskammer verschiedener
Form oder Größe, die mit geeigneten Vorrichtungen ausgerüstet ist, um eine Verunreinigung der Kammer mit Tierzellen
zu vermeiden, jedoch die Humanzellen mit der Nährkörperflüssigkeit des Tieres versorgt, z.B. mit einem Membranfilter,
einem Ultrafilter oder Hohlfaser mit einer Poren-
—7 —5
größe von etwa 10 bis 10 rn, und Einbetten, beispielsweise
intraperitoneal, der Kammer in das Tier, wobei sich die Humanzellen in der Kammer durch Versorgung mit der
Nährkörperflüssigkeit des Tieres vermehren.
Die Diffusionskammer kann außerdem so ausgelegt und beispielsweise
auf das Tier angebracht werden, daß die Nährflüssigkeit in der Kammer frei zirkulieren kann. Die Kultur
in der Kammer kann während der Zellvermehrung beobachtet werden, und zwar entweder durch mindestens ein an der Kammerwand
angebrachtes durchsichtiges Seitenfenster und/oder durch Ersatz der Kammer selbst gegen eine neue Kammer zu
verschiedenen Zeitpunkten, um die Zellvermehrung ohne Schlachten des Tieres über seine Lebenszeit zu erhalten
IS
und die Zellproduktion je Tier stark zu erhöhen. Da die
Humanzellen mit den Tierzellen in einer solchen Diffusionskammer nicht in direkte 3erührung kommen, werden unerwünschte
Immunreaktionen verhindert; es kann jeder nichthumane Warmblütler ohne Vorbehandlung zur Unterdrückung dieser
Immunreaktion verwendet werden, und die vermehrten lebensfähigen Humanzellen können leicht aus der Diffusionskammer
gewonnen werden.
Die Tiere können in herkömmlicher Weise gefüttert werden,
nach der Transplantation ist keine besondere Vorsicht notwendig. Für eine maximale Zellvermehrung ist im allgemeinen
eine Zeit von 1 bis 10 Wochen notwendig; es werden Zellzah-
7 12
len von etwa 10 bis 10 Humanzellen je Tier oder auch mehr erhalten. Insbesondere vermehren sich die transplantierten Humanzellen im erfindungsgemäßen Verfahren um etwa 10 Dis 10 mal oder mehr, was etwa 10 bis 10 mal mehr ist, als herkömmlicherweise erhältlich durch Inokulieren und Vermehren der Humanzellen auf einem in vitro Nährkulturmedium. Das wirkt sich auch qünstig auf die LK 2-Produktion aus.
len von etwa 10 bis 10 Humanzellen je Tier oder auch mehr erhalten. Insbesondere vermehren sich die transplantierten Humanzellen im erfindungsgemäßen Verfahren um etwa 10 Dis 10 mal oder mehr, was etwa 10 bis 10 mal mehr ist, als herkömmlicherweise erhältlich durch Inokulieren und Vermehren der Humanzellen auf einem in vitro Nährkulturmedium. Das wirkt sich auch qünstig auf die LK 2-Produktion aus.
Erfindungsgemäß ist jedes Verfahren anwendbar, vorausgesetzt
die LK 2-Produktion kann in den vermehrten Humanzellen induziert werden. Die vermehrten Humanzellen werden in
dem als Wirt für die Zellvermehrung verwendeten Tier mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht. So werden beispielsweise
Humanzellen, die in einer Ascitessuspension vermehrt wurden, oder Tumorzellen, die beispielsweise subkutan
gebildet wurden, direkt in vivo mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht, um die LK 2-Produktion zu induzieren;
das angesammelte LK 2 wird aus dem Ascites, dem Serum und/oder Tumor gewonnen und gereinigt. Die vermehrten
Humanzellen können aber auch aus dem Tier gewonnen und dann in vitro mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht
werden. So können vermehrte Humanzellen, die entweder aus
der Ascitessuspension oder durch Aufbrechen und Extrahieren
der beispielsweise subkutan gebildeten Tumormasse(η) gewonnen
wurden, in einem Nährkulturmediunn suspendiert, auf eine Temperatur von etwa 20 bis 40 C zu Erreichung einer
Zelldichte von etwa 10 bis 10 Zellen/ml vorgewärmt und in vitro mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht
werden; das angesammelte LK 2 kann dann aus der Kultur gewonnen werden.
Bei Verwendung einer herkömmlichen Diffusionskammer werden
die vermehrten Humanzellen mit dem LK 2-Induktor in der Kammer oder nach der Gewinnung in Berührung gebracht.
Die so erhaltenen Humanzellen können weitere 1 bis 4 d in vitro vor der LK 2-Induktion kultiviert werden, um die
Fortpflanzungszeit zu regulieren.
Die LK 2-Produktion je Tier kann durch Anwendung mindestens einer der folgenden Verfahren noch gesteigert werden:
1) Die vermehrten Humanzellen werden in dem Tier, das als Wirt für die Zellvermehrung verwendet wurde, mit einem
LK 2-Induktor in Berührung gebracht und dann aus der (den) Stelle(n) des Tieres oder dessen Gesamtkörper
gewonnen und dann in vitro mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht.
2) Die Humanzellen werden wiederholt mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht.
3) Die in das Tier eingebettete oder mit dem Tier verbundene Diffusionskammer wird zu verschiedenen Zeitpunkten durch
eine frische Kammer ersetzt.
- 10 -
Af .
AIs LK 2-Induktoren im erfindunqsgemäßen Verfahren geeignet
sind herkömmliche alpha-Interferon-Induktoren (alpha-IFN-Induktoren),
wie Viren, Nucleinsäuren und Nucleotide, sowie herkömmliche gamma-Interferon-Induktoren (gamma-IFN-Induktoren),
wie Phytohamagglutinin, Concanavalin A, Mytogen aus Phytolacca americana (pokeweed), Lipopolysaccharid,
Endotoxin, Polysaccharid und Bakterien. Antigene wirken auf die sensibilisierten Zellen als LK 2-Induktoren.
Die LK 2-Produktion kann durch eine kombinierte Verwendung von IFN-alpha- und IFN-gamma-Induktoren als LK 2-Induktoren
erhöht werden. Es wurde bestätigt, daß diese Kombination die gleichzeitige Produktion von humanspezifischem Interferon
(HuIFN) induziert. Das ist sehr günstig, da gleichzeitig und wirtschaftlich günstig zwei oder mehr biologisch
aktive Substanzen hergestellt werden können, z.B. LK 2 und HuIFN und die Humanzellen viel wirkungsvoller ausgenützt
werden können.
Das so erhaltene LK 2 kann durch ein oder mehrere Reinigungs- und/oder Trennverfahren gewonnen werden, beispielsweise
durch Aussalzen, Dialyse, Filtrieren, Zentrifugieren,
Einengen und/oder Lyophilisieren. Ist ein sehr viel reineres LK 2-Präparat erwünscht, so kann ein Präparat mit höchster
Reinheit durch Anwendung der oben beschriebenen Verfahren in Kombination mit anderen herkömmlichen Verfahren erhalten
werden, beispielsweise durch Adsorption und Desorption an einem Ionenaustauscher, Gelfiltration, Fraktionierung
am isoelektrischen Punkt, Elektrophorese, Ionenaustauschchromatographie,
Hochleistungsflüssigchromatographie, Säulenchromatographie
und/oder Affinitätschromatographie.
Immobilisierte monoklonale Antikörper, die durch Binden
eines monokonalen Anti-LK 2-Antikörpers (der im folgenden beschrieben wird) auf einen geeigneten wasserunlöslichen
- 11 -
Träger erhalten werden kann, beispielsweise auf BrCN-aktivierte
Sepharose (Pharmacia Fine Chemical AB, Uppsala, Schweden) kann zweckmäBigerweise zur Beschleunigung und
leichteren LK 2-Reinigung verwendet werden.
Es wurde bestätigt, daß das so erhaltene LK 2 die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:
1) Molekulargewicht:
20.000 - 2.000 Dalton
20.000 - 2.000 Dalton
2) Isoelektrischer Punkt: pi = 6,2 - 0,3
3) Elektrophoretische Beweglichkeit:
in der Scheiben-Polyacrylamidgelelektrophorese Rf = 0,29 - 0,02
4) UV-Absorptionsspektrum:
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm
5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
unlöslich in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer,
kaum löslich oder unlöslich in Ethylether, Ethylacetat oder Chloroform
6) Farbreaktion:
proteinpositiv gemäß Lowry oder der Mikrobiuretmethode saccharidpositiv mit Phenol-Schwefelsäure oder Anthron-Schwefelsäure
7) Biologische Aktivität:
bei L 929-Zellen zytotoxisch, bei KB-Zellen zytostatisch,
praktisch frei von Interferonaktivität
- 12 -
8) Stabilität in wässeriger Lösung:
stabil bis zu 60 C bei 30-rnin. Inkubation bei pH 7,2,
stabil im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 bei 16-stünd. Inkubation bei 4 C und
9) Stabilität bei Kryokonservierung:
einen Monat oder langer stabil bei -10 C.
Es wurde auch bestätigt, daß LK 2 normale Humanzellen nicht wesentlich zytolysiert, jedoch eine bemerkenswerte Zytolyse
bei einer Vielzahl von Humantumorzellen sowie bei Mäuse-Fibroblastoidzellen,
L 929, bewirkt und diese Zellen abtötet. So ist LK 2 beispielsweise in Form einer Zusammensetzung
für die Prophylaxe und/oder Therapie von LK 2-empfindlichen Erkrankungen geeignet, beispielsweise bei bösartigen Tumoren
und insbesondere verschiedenen bösartigen Humantumoren, deren Behandlung sehr schwierig ist.
Somit kann erfindungsgemäß die tumorhemmende Wirkung von
Chemotherapeutika mit einem Steigerungsmittel, das LK 2 als Wirkstoff enthält, erhöht werden.
Die Dosis an Chemotherapeutika kann auf etwa 1/2 bis 1/1000 verringert werden, da die tumorhemmende Wirkung der Chemotherapeutika
außerordentlich mit dem Steigerungsmittel erhöht werden kann. Außerdem verbreitert die Verwendung
des Steigerungsmittels das Tumorspektrum der Chemotherapeutika und ermöglicht die Behandlung von medikament-resistenten
Tumoren.
Als Chemotherapeutika können erfindungsgemäß beispielsweise
eines oder mehrere der folgenden Mittel verwendet werden: Alkylierungsmittel, wie Melphalan, Cyclophosphamide, Ifosfamide,
Estramustine, Natriumphosphat, Busulfan, Imorposulfantosilat,
N-Methy1-3,3'-dimesyIoxydipropylamirv-biphenyl-4,4'-disulfonat,
Carboquon, Thio-TEPA, Carmustin,
- 13 -
Nimustinhydrochlorid, Streptozocin, Dacarbazin und Pipobroman;
metabolische Antagonisten, wie Methotrexat, Fluorouracil,
Tegaful, Carmoful, Cytarabin, Ancitabinhydrochlorid, Enocitabin, 6-Mercaptopurin und Th'ioinosin; tumorhemmende
Antibiotika, wie Doxorubicin, Daunorubicin, Aclarubicin,
Bleomycin, Peplomycin, Mitomycin C, Actinomycine D und C, Chromomycin A,,, Mithramycin und Neocarzinostatin; und
Pflanzenalkaloide, wie Vincristinsulfat, Vinblastinsulfat,
Vindesinsulfat und Podophyllotoxin. Bei der Behandlung von
Prostata- oder Brustkrebs kann gegebenenfalls mindestens ein
tumorhemmendes Hormon, wie Prednisolon, Methyltestosteron oder konjugiertes Östrogen, in Kombination mitverwendet
werden.
Die Kombination dieser Chemotherapeutika mit LK 2 soll ten je nach Bedingungen gewählt und nicht beschränkt werden.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann hergestellt
werden durch Immunisierung eines nichthumanen Warmblütlers mit LK 2 als Antigen, Isolierung der Antikörper produzierenden
Zellen aus dem Tierkörper, Fusion der Antikörper produzierenden Zellen mit Myelomazellen, Selektion der entstandenen
Hybridzellen als Klon, der LK 2-spezifische Antiköroer
produzieren kann, Vermehrung dieses Klons und Gewinnung des LK 2-spezifischen monoklonalen Antikörpers aus den
vermehrten Zellen.
Die Immunisierung kann erreicht werden durch Injektion beispiels intravenös, intraperitoneal oder subkutan, einer
wässerigen LK 2-Lösung, -Emulsion oder -Suspension als Antigen in einen geeigneten nichthumanen Warmblütler, wie
Huhn, Taube, Hund, Katze, Affe, Ziege, Schwein, Rind, Pferd,
Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Hamster oder Maus, und Füttern des Tieres während 3 oder mehr Tage zur Induktion
der Antikörperproduktion. Als Antigen kann auch ein
- 14 -
Konjugat von LK 2 mit einem Saccharic! gemäß JA-A-23 847/83
verwendet werden.
Das Antigen kann als Einzeldosis o'cTer wenn notwendig in
zwei oder mehr Dosen zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf
von etwa 3 bis 30 d injiziert werden.
Die Milzzellen des immunisierten Tieres, in dem die Antikörper-Produktion
induziert worden ist, werden mit Myelomazellen
der gleichen oder einer anderen Art in geeigneter Weise fusioniert, z.B. gemäß G. Kohler et al. in "Nature", Bd.
256, Seiten 495 bis 497 (1975) oder "European Journal of Immunology", Bd. 6, Seiten 511 bis 519 (1976). Die so erhaltenen
Hybridzellen werden selektioniert und geklont, der (die) Klon(e) wird (werden) in vitro oder in vivo kultiviert
und der angesammelte hochspezifische monoklonale Antikörper wird dann aus der entstandenen Kultur gewonnen. Dabei wird
das in vivo Verfahren dem in vitro Verfahren vorgezogen, da bei in vivo Kultivierung eine viel höhere Vermehrung
des Klons und eine viel höhere Produktion des monoklonalen Antikörpers ohne Verwendung eines teuren Serums erreicht
werden kann.
Beim in vivo Verfahren wird der Klon dadurch vermehrt, daß die Nährkörperflüssigkeit eines nichthumanen Warmblütlers
ausgenützt wird, wobei dieser der gleichen oder einer anderen Art als bei der Immunisierung angehören kann; dabei
wird der Klon in einen solchen nichthumanen Warmblütler transplantiert oder der Klon wird in eine herkömmliche
Diffusionskammer inokuliert, die die Nährkörperflüssigkeit
eines solchen Tieres aufnehmen kann; der angesammelte monoklonale Antikörper wird aus den Körperflussigkeiten, wie
Ascites und Serum, gewonnen. Nach der Vermehrung in vivo kann der Klon aber auch in einem serumfreien Kulturmedium
15 -
weitere 1 bis 5 d kultiviert werden; der angesammelte monoklonale
Antikörper kann aus der entstandenen Kultur gewonnen werden.
Der so erhaltene monoklonale Antikörper kann leicht durch
ein oder mehrere Trenn- und/oder Reinigungsverfahren gewonnen werden, beispielsweise durch Aussalzen, Dialyse, Filtrie
ren, Zentrifugieren, Einengen und/oder Lyophilisieren.
Ist eine sehr viel höhere Reinigung erwünscht, so kann ein Präparat mit höchster Reinheit durch Kombinieren der
oben beschriebenen Verfahren mit anderen herkömmlichen Verfahren erreicht werden, beispielsweise durch Adsorption
und Desorption an einem Ionenaustauscher, Gelfiltration, Fraktionierung am isoelektrischen Punkt, Elektrophorese,
Ionenaustauschchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie,
Säulenchromatographie und/oder Affinitätschromatographie. Die Ausbeute an monoklonalem Antikörper kann zweckmäßigerweise
noch verbessert werden durch Verwendung eines immobilisierten LK 2-Gels, das durch Binden von hochreinem
LK 2 auf einem wasserunlöslichen Träger, wie BrCN-aktivierte Sepharose, erhalten werden kann.
Der erfindungsgemäß erhältliche monoklonale Antikörper
ist als Ligand für die Affinitätschromatographie bei der LK 2- Produktion sowie für die Diagnose verschiedener Humanerkrankungen
wegen seiner Spezifität für LK 2, das bösartige Tumoren schädigt, geeignet.
Die LK 2-Titer werden entweder durch Verwendung von KB-ZeI-en
oder L 929-Zellen als Zielzellen bestimmt: Bei Verwendung von KB-Zellen wird die zytostatische Aktivität gemäß "Cancer
Chemotherapy Report", Teil 3, Bd. 3, Nr. 2, September (1972) bestimmt. Bei Verwendung von L 929-Zellen wird die zytotoxische
Aktivität in Gegenwart von Aktinomycin D gemäß E. Pick,
- 16 -
"Lymphokines", Bd. 2, Seiten 245 bis 249, "Tumor-Nekrose-Faktor",
Academic Press, Inc. (1981) bestimmt. Im folgenden wird die Bestimmung mit L 929-Zellen verwendet, wenn nichts
anderes angegeben ist.
Die HuIFN-Titer werden mit der herkömmlichen Plaque-Reduktionsmethode
unter Verwendung von FL-Zellen aus Humanamnionflüssigkeit gemäß "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd.
20, Nr. 6, Seiten 616 bis 643 (1975) bestimmt.
Die Hämagglutinationstiter werden gemäß S.E. SaIk "The
Journal of Immunology", Bd. 49, Seiten 87 bis 98 (1944) bestimmt.
Die 3eispiele erläutern die Erfindung.
Herstellung von teilgereinigtem LK 2
Neugeborenen Hamstern wird herkömmliches Antiserum aus
Kaninchen injiziert, um ihre Immunreaktion zu schwächen, und subkutan eine Human-Lymphoblastoidlinie, BALL-1, transplantiert.
Die Tiere werden drei Wochen in herkömmlicher Weise gefüttert. Die subkutan gebildeten Tumormassen werden
extrahiert, zerkleinert und in Salzlösung aufgebrochen.
Die so erhaltene Zellsuspension wird mit RPMI 1640-Medium,
pH 7,2, das mit Serum aufgefüllt wird, gewaschen und in einem frischen Präparat des gleichen Kulturmediums zu einer.
Zelldichte von etwa 2x10 Zellen/ml wieder suspendiert. Diese Zellsuspension wird mit Sendai-Virus (etwa 400 Hämagglutinationstiter/ml)
versetzt und 24 h zur Induktion der der LK 2-Produktion bei 37 0C inkubiert.
- 17 -
Die Kultur wird bei etwa 1000 g und etwa 4 C zentrifugiert,
der entstandene Niederschlag wird entfernt. Der so erhaltene Überstand wird gegen eine Salzlösung, die 0,01 m Phosphatpuffer,
pH 7,2, 20 h dialysiert und durch ein Membranfilter filtriert. Das Filtrat wird durch eine Säule mit
immobilisierten Anti-HuIFN-Antikörper geleitet, die nicht
adsorbierte Fraktion wird gesammelt. Aus dieser Fraktion wird eine aktive Fraktion durch Chromatofokussierung aewonnen,
eingeengt und zu einem pulverförmigen Produkt mit
LK 2-Aktivität lyophilisiert.
Die spezifische Aktivität dieses Produkts beträgt etwa 10 Einheiten/mg Protein. Die LK 2-Ausbeute beträgt etwa
2,0x10 Einheiten/Hamster.
Herstellung von Anti-LK 2-Antikörpern
Ein gemäß Beispiel A-I hergestelltes LK 2-Präparat wird
in einer Salzlösung zu einer Proteinkonzentration von etwa 0,05 % (Gew./Vol.) gelöst; die Lösung wird mit dem gleichen
Volumen an Freunds Volladjuvans versetzt. Mäuse werden immunisiert durch subkutane Injektion von 0,2 ml-Proben
des so erhaltenen Gemisches und 7 d nach der ersten Injektion gefüttert. Nach der Induzierung der Anti-LK 2-Antikörper-Produktion
in den Antikörper produzierenden Zellen der Tiere wird die Milz jedes Tiers extrahiert, zerkleinert,
aufgebrochen und suspendiert und zwar zusammen mit einer Maus-Myeloma-Zellinie (P -X63-Ag8 von Flow Laboratories
Inc., Rockville, Maryland, USA) in serumfreiem Eagle's Minimalnährmedium, pH 7,2, das 50 % (Gew./Vol.) Polyethylenglykol
1000 enthält und auf 37 C vorgewärmt war. Das
4 Gemisch mit einer Zelldichte von 10 Zellen/ml wird 5 min
- 18 -
stehengelassen, dann auf das 20-fache mit einem frischen
Präparat des gleichen Kulturmediums verdünnt; die Hybridomazellen,
die in dem Hypoxanthin, 'Äminopterin und Thymidin
enthaltenden Medium wachsen können, werden gemäß R.L. Davidson und P.S. Gerald in "Somatic Cell Genetics", Bd. 2,
Nr. 2, Seiten 175 bis 176 (1976), gesammelt; der Klon enthält
Hybridomazellen, die Anti-LK 2-Antikörper produzieren
können. Diese geklonten Hybridomazellen werden in einer
Dosis von etwa 10 Zellen/Maus intraperitoneal in Mäuse transplantiert, die 2 Wochen gefüttert und dann geschlachtet
werden. Die Körperflüssigkeiten der Tiere, wie Ascitesflüssigkeit und Blut, werden gesammelt, zentrifugiert und
mit Ammoniumsulfat ausgesalzen; die Fraktionen, die bei 30 bis 50 % Sättigung ausfallen, werden gesammelt. Diese
Fraktionen werden dialysiert und mit einem immobilisierten Anti-LK 2-Antikörpergel der Affinitätschromatographie zugeführt.
Das immobilisierte Anti-LK 2-Antikörpergel wurde erhalten durch Umsetzung einer gemäß Beispiel A-1 erhaltenen
LK 2-Probe mit BrCN-aktivierter Sepharose bei Raumtemperatur,
wobei eine Anti-LK 2-Antikörperfraktion entstand,
die dialysiert, konzentriert und lyophilisiert wurde.
Das entstandene pulverförmige Produkt neutralisiert immunologisch
spezifisch die zytotoxische Aktivität von LK 2.
Die Stabilität des monoklonalen Antikörpers in wässeriger
Lösung wird durch Bestimmung der Restneutralisationsaktivität nach Inkubieren unter bestimmten Bedingungen untersucht:
Nach der 30-min. Inkubation bei pH 7,2 und verschiedenen Temperaturen bleiben 80 % und mehr der Aktivität übrig,
bei 70 0C gehen jedoch 90 % und mehr verloren. Nach der
16-stünd. Inkubation bei 4 0C und verschiedenen pH-Werten
ist die Aktivität in einem pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 stabil, sie geht jedoch bei einem pH-Wert von 2,0 zu 90 %
und mehr verloren.
- 19 -
Bei der Untersuchung der Eigenschaften des monoklonalen
Antikörpers wurde festgestellt, daß der monoklonale Antikörper
gegenüber 2-Mercaptoethanol empfindlich ist und eine
spezifische Antigen-Antikörper-Reaktion mit Anti-Maus-Immunoglobulin-M-Antikörper
zeigt. Deshalb wird der monoklonale Antikörper in die Klasse der Immunoglobulin-M-Antikörper
eingereiht.
Herstellung und physikochemische Eigenschaften des hochreinen
LK 2
Ein gemäß Versuch A-1 erhaltenes teilgereinigtes LK 2-Präparat
wird mit einem gemäß Beispiel A-2 hergestellten immobilisierten monoklonalen Antikörpergel der Affinitätschromatographie
unterworfen; die LK 2-Fraktionen werden gesammelt, dialysiert, eingeengt und lyophilisiert.
Es wird ein hochreines LK 2-Präparat mit einer spezifischen
Aktivität von etwa 10 Einheiten/mg Protein erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften des LK 2 werden an
diesem Präparat untersucht:
1) Molekulargewicht:
Das Molekulargewicht von LK 2 wird durch Elektrophorese mit SDS-Polyacrylamidgel gemäß K. Weber und M. Osborn
in "Journal of Biological Chemistry", Bd. 244, Seite 4406 (1969), bestimmt. Die Säule mit 10 % Acrylamidgel
wird mit etwa 10 .ug-Proben des Präparats in Gegenwart von 0,1 % SDS beladen, die Elektrophorese wird mit 8 mA
je Säule während 4 h durchgeführt. Nach der Extraktion und der folgenden LK 2-Bestimmung der aktiven Fraktion
beträgt das Molekulargewicht von LK 2 20.000 - 2.000 Dalton.
- 20 -
2) Isoelektrischer Punkt:
Bei einer 2-stUnd. 25 W-Elektro-f-okussierung des Präparats
mit einem Gelprodukt für die Elektrofokussierung bei pH 3,5 bis 9,5 ("Ampholine Pagplate" von LKB-Produkter
AS, Stockholm, Schweden) erhält man einen isoelektrischen
Punkt pi = 6,2 - 0,3.
3) Elektrophoretische Beweglichkeit:
Gemäß B-.J. Davis in "Annals of New York Academy of Sciences",
Bd. 121, Seite 404 (1964), werden etwa 10.ug-Proben des Präparats auf Säulen mit 7,5 % Acrylamidgel aufgebracht,
2 h der Elektrophorese bei pH 8,3 und 3 mA je Säule unterworfen, extrahiert und auf LK 2-Aktivität
untersucht. Man erhält eine elektrophoretische Beweglichkeit Rf von 0,29 - 0,02.
4) UV-Absorptionsspektrum:
Durch Analyse des UV-Spektrums des Präparats mit einem UV-250-Spektrometer (Shimadzu Seisakusho K.K., Kyoto,
Japan) wird ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm gefunden.
5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
Das Präparat ist in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer
unlöslich, in Ethylether, Ethylacetat und Chloroform kaum löslich oder unlöslich.
6) Farbreaktion:
Das Präparat ist proteinpositiv gemäß der Lowry- und
der Mikrobiuret-Methode, saccarid-positiv mit Phenol-Schwefelsäure
und Anthron-Schwefelsäure.
- 21 -
7) Biologische Aktivität:
Es wurde eine zytotoxische Aktivität bei L 929-Zellen
und eine zytostatische Aktivität bei KB-Zellen, jedoch
keine wesentliche HuIFN-Aktivität festgestellt.
8) Stabilität in wässeriger Lösung:
i) Hitzestabilität:
5
Präparatproben mit etwa 1x10 Einheiten/ml werden
Präparatproben mit etwa 1x10 Einheiten/ml werden
bei pH 7,2 und verschiedenen Temperaturen 30 min inkubiert; die zytotoxische Restaktivität wird bestimmt;
dabei wird festgestellt, daß LK 2 bis zu °C stabil ist.
ii) pH-Stabilität:
0,1 ml Präparatoroben (1x10 Einheiten/ml) werden mit 1 ml Pufferlösung mit verschiedenen pH-Werten
versetzt, beispielsweise mit Mcllvaine-Puffer bei
pH 2 bis 7, Phosphatpuffer, pH 7,8, Glycin-NaOH-Puffer,
pH 8 bis 11, und 16 h bei 4 0C inkubiert. 0,1 ml des inkubierten Gemisches werden dann mit
0,05 m PhosphatDuffer, pH 7,2, auf pH 7,2 eingestellt,
die Restaktivität wird bestimmt. Es wird festgestellt, daß LK 2 im pH-Bereich von 4,0 bis
11,0 stabil ist.
iii) Stabilität gegenüber Bacillusprotease (Dispase): Etwa 1x10 Einheiten/ml Präparat werden mit einer
Bacillusprotease ("Dispase" von Godo Shusei Co., Ltd., Tokio, Japan) zu einer Enzymaktivität von
100 Einheiten/ml versetzt, das Gemisch wird bei pH 7,2 und 37 °C 2 h inkubiert. Während der Inkubation
werden dem Gemisch kleine Proben entnommen, die mit Kälberserumalbumin zu einer Konzentration
von 1 % (Gew./Vol.) zur Unterbrechung der enzymati-
- 22 -
20,
sehen Reaktion versetzt werden. Bei dieser Bestimmung
der LK 2-Aktivität wurde festgestellt, daß LK 2 gegenüber der Bacillusprotease empfindlich
ist und seine Aktivität bei fortschreitender enzymatischer
Reaktion verliert.
9) Stabilität bei Kryokonservierung bzw. Kältelagerung: Das LK 2-Präparat wurde in wässeriger Lösung bei -10 C
und pH 7,2 einen Monat gelagert, aufgetaut und bestimmt. Es konnte keine Aktivitätsabnahme festgestellt werden.
Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß LK 2 physikochemische Eigenschaften hat, die sich von denen bekannter
Lymphokine, wie LT, TNF oder IFN, unterscheiden. Auch der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper ist neu, da er
die zytotoxische Aktivität des neuen Lymphokine LK 2 immunologisch
spezifisch neutralisiert.
Zytostatische Wirkung auf bösartige Turnorzellen
Die zytostatische Wirkung von LK 2 auf verschiedene Humanzellen
wird mit den gemäß Beispiel A-1 und A-3 erhaltenen LK 2-Präparaten untersucht.
Die in Tabelle 1 angegebenen Humanzellen (10 Zellen) werden in 1 ml herkömmlichen Nährmedium, das Kälberfötusserum
enthält, suspendiert, 1 d kultiviert, mit 0,1 ml einer Salzlösung, die entweder 50 Einheiten oder 500 Einheiten
eines gemäß Beispiel A-1 oder A-3 hergestellten LK 2-Präparats enthält, versetzt und 2 d bei 37 0C inkubiert. Am
Ende der Kultur werden die lebenden Zellen mit Neutralrot (Farbreagens) gemäß der in "Applied Microbiology", Bd.
22, Nr. 4, Seiten 671 bis 677 (1971), beschriebenen Methode
- 23 -
gefärbt; das Farbreagens wird mit einer angesäuerten Ethanollösung
eluiert. Die Anzahl der lebenden Zellen wird durch
Bestimmung der Eluatabsorption bei.einer Wellenlänge von 540 nm gemessen.
Als Kontrolle wird 0,1 ml einer LK 2-freien Salzlösung verwendet.
Die Wachstumshemmung (Prozent) wird gemäß folgender Gleichung berechnet:
Wachstumshemmung (%) =
-M- ApsorP'tion bei Verwendung von LK 2,
( Absorption der Kontrolle x
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
Die Ergebnisse bestätigen, daß LK 2 normale Zellen nicht wesentlich beeinträchtigt, jedoch sehr stark das Wachstum
verschiedener bösartiger Tumorzellen hemmt. Aus Tabelle 1 ist auch ersichtlich, daß ein teilgereinigtes LK 2-Präparat
mit einem hochreinen Präparat gut vergleichbar ist.
- 24 -
Zellinie
LK 2 aus Beispiel A-1
LK 2 aus Beispiel A-3
Quelle der Zellinie
50 Einheiten 500 Einheiten 50 Einheiten 500 Einheiten
| HEp#2* | Epidermoides Larynx- karzinom |
33 | 40 | 46 | 68 |
| PC-8* | Lungenkarzinom | 26 | 37 | 56 | 80 |
| MKN 7* | Magenkrebs | 35 | 41 | 60 | 77 |
| HLE* | Leberkarzinom | 32 | 38; | 55 | 71 |
| HeLa* | Epitheloides Cervix- karzinom |
24 | 35 | 46 | 68 |
| L-132** | Embryonale Lunge | 3 | -2 | 1 | -3 |
| Chang-Leber ** | Leber | 2 | -3 | -4 | -1 |
| Giradi-Herz ** | Herz | -2 | 2 | -1 |
*) Humanzellinien aus bösartigen Tumoren
**) Humanze11inien normalen Ursprungs
**) Humanze11inien normalen Ursprungs
Beispiel B-2
Einer Gruppe von BALB/c-Mäusen wer'cfen Meth-A-Zellen aus
Mäusesarkom transplantiert. Vom 10. Tag nach der Transplantation
an wird den Mäusen intravenös eine Salzlösung, die ein gemäß Beispiel A-3 hergestelltes LK 2-Präparat enthält,
in einer Dosis von 100 oder 1000 Einheiten/kg einmal täglich während 15 d injiziert. Die Mäuse werden dann geschlachtet,
die in den Tieren gebildeten Tumormassen werden bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
„ . .. Tägliche Dosis Tumormasse
Behandlung (Einheiten/kg) (g)
Kontrolle 0 5.7±0.7
100 3.3+0.4*
1,000 2.8±0.4*
*) Statistisch signifikant gegenüber Kontrollen mit einer Signifikanz von 5 %
Einer Gruppe vom BALB/c-Nacktmäusen werden subkutan in den Rücken kleine Fragmente von Humanbrustkrebs-Gewebe
transplantiert.
3 Nachdem die Tumormassen auf etwa 200 mm in den Tierkörpern
- 26 -
gewachsen sind, wird den Tieren eine Salzlösung, die ein
gemäß Beispiel A-1 oder A-3 hergestelltes LK 2-Präparat
enthält, intravenös in einer, Dosis· -von entweder 100 Einheiten/kg
oder 1000 Einheiten/kg einmal täglich während 20 d injiziert. Dann werden die Tiere geschlachtet, die entstandenen
Tumormassen werden bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.
Tägliche Dosis Tumormasse
Behandlung (Einheiten/kg) (g)
Kontrolle 0 10.8+1.0
100 7.310.7*
LK 2 gemäß
1,000 6.8±0.5*
100 6.4+0.5*
LK 2 gemäß
1,000 5.6+0.7*
*) Statistisch signifikant gegenüber Kontrollen mit einer Signifikanz von 5 %
Einer Gruppe von BALB/c-Nacktmäusen werden subkutan in den Rücken kleine Humanbrustkrebs-Gewebefragmente gemäß
Beispiel B-3 transplantiert.
3 Nachdem die Tumormassen auf etwa 200 mm in den Tierkörpern
gewachsen sind, wird den Tieren eine Salzlösung, die ein
- 27 -
gemäß Beispiel Α-3 hergestelltes LK 2-Präparat und/oder
ein alpha-HuIFN-Präparat enthält, intravenös einmal täglich
während 20 d injiziert. Dann werden die Tiere geschlachtet, die entstandenen Tumormassen werden bestimmt.
Als Kontrolle wird eine LK 2- und alpha-HuIFN-freie
Salzlösung verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.
Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß die kombinierte Verwendung von LK 2- und alpha-HuIFN die tumorhemmende Wirkung
von alpha-HuIFN extrem steigert.
| Behandlung | (Einheiten/kg) | Tumormasse Cg) |
| Kontrolle | 0 | 10.8±1.0 |
| LK 2 | 100 | 6.4±0.5* |
| alpha-HuIFN | 1,000 | 6.7±0.5* |
| LK 2 + alpha-HuIFN |
100 1,000 |
*) Statistisch signifikant gegenüber Kontrollen mit einer Signifikanz von 5 %
Ein akuter Toxizitätstest, in dem einer Gruppe von 20 d
alten Mäusen ein gemäß Beispiel A-3 hergestelltes LK 2-Präparat verabreicht wurde, bestätigt, daß die Toxizität des
- 28 -
- aer Präparats nach intraperitonealer Injektion extrem niedrig
ist, d.h. LDC_. = 19 Einheiten oder mehr.
DU
Aus den oben angegebenen Versuchen ist ersichtlich, daß LK 2 eine starke zytostatische Wirkung auf bösartige Tumoren
sowohl in vitro als auch in vivo hat. Außerdem ist die Verabreichung von LK 2 sicher, da eine hohe Dosierung normale
Zellen praktisch nicht beeinträchtigt und eine niedrige Dosierung Tumorzellen deutlich hemmt.
Die wirksame LK 2-Dosis liegt im allgemeinen im Bereich von 5 bis 500.000.000 Einheiten/d bei Erwachsenen: Insbesondere
beträgt sie bei lokaler Verabreichung, beispielsweise in Form einer Lokalinjektion oder eines Augenwassers,
5 bis 10.000.000 Einheiten/d, bei Verabreichung durch die Haut oder die Schleimhäute, beispielsweise in Form einer
Salbe oder eines Zäpfchens, 10 bis 50.000.000 Einheiten/d,
bei systemischer Verabreichung, beispielsweise als intravenöse oder intramuskuläre Injektion, 50 bis 100.000.000
Einheiten/d und bei oraler Verabreichung 500 bis 500.000.000 Einheiten/d; die Dosierung ist jedoch je nach. Anweisungen
und dem Befinden des Patienten frei wählbar.
Obwohl LK 2 in herkömmlicher Weise durch Vermischen mit herkömmlichen Trägern, Grundstoffen und/oder Hilfsmitteln
in ein Medikament verarbeitet werden kann, sollte der LK 2-Gehalt wegen der Toxizität, der wirksamen Dosis und der
Sicherheit mindestens 5 Einheiten/g betragen.
Die Art und die Form der prophylaktischen und/oder therapeutischen
Mittel für LK 2-empfindliche Erkrankungen kann frei gewählt werden: So sind beispielsweise für eine orale
Verabreichung Präparate für den Darm geeignet, wie Kapseln,
- 29 -
Tabletten oder Pulver, für die rektale Verabreichung Zäpfchen;
für die Injektion kann es beispielsweise eine lyophilisierte Injektion sein, die vor der Verwendung mit destilliertem
Wasser zu einer Injektionslösung gelöst wird; auch in Form eines Collunariums, Augenwassers oder einer Salbe
ist das Präparat geeignet.
Bei der Behandlung von Patienten mit einem bösartigen Tumor kann beispielsweise ein dem Patienten entnommenes Tumorgewebefragment
in vitro mit LK 2 behandelt werden, um die Immunogenität des Gewebefragme.nts zu erhöhen, und dem Patienten
wieder verabreicht werden, um so eine wirkungsvollere Behandlung des bösartigen Tumors zu erreichen.
Die kombinierte Verwendung von LK 2 mit tumorhemmenden Mitteln, beispielsweise Lymphokine, wie HuIFN, TNF, LT
und T-Zellwachstumsfaktor (TCGF), tumorhemmenden Polysacchariden,
wie 1,3-ß-Glukan, Arabinomannan, Lipopolysaccharid,
OK-432 (Picibanil), PSK (Krestin) und Lentinan, metabolischen Antagonisten, wie Methotrexat und Fluoruracil, und
tumorhemmenden Antibiotika, wie Doxorubicin und Mitomycin C, ist sehr günstig, da diese kombinierte Verwendung die
tumorhemmende Wirkung von LK 2 extrem erhöht.
Insbesondere wurde festgestellt, daß LK 2 die tumorhemmende
Wirkung von Chemotherapeutika erhöht.
Die steigernde Wirkung von LK 2 auf die Tumorhemmung wird im folgenden erklärt.
Steigerung der tumorhemmenden Wirkung von Chemotherapeutika
mit LK 2
Die Steigerung der tumorhemmenden Wirkung von Chemothera-
- 30 -
- «ae- -
peutika mit LK 2 wird mit bösartigen Tumorzellen untersucht.
Bösartige Humantumorzellen (10 Zellen) werden in 1 ml
herkömmliches Kulturnährmedium, das mit Kälberfötusserum
versetzt ist, eingeimpft und einen Tag kultiviert. Die Kultur wird dann mit 0,1 ml einer Salzlösung, die 100 Einheiten
eines gemäß Beispiel A-3 hergestellten LK 2-Präparats und/oder ein Chemotherapeutikum enthält, versetzt und weitere
zwei Tage bei 37 C kultiviert.
Als Kontrolle wird eine LK 2-. und chemotherapeutikumfreie
Salzlösung verwendet.
Nach beendeter Kultur wird die Anzahl der lebenden Zellen gemäß Beispiel 8-1 gezählt, die Wachstumshemmung (%) wird
bestimmt.
Die Konzentration der untersuchten Chemotherapeutika war
wie folgt: Nimustin-Hydrochlorid (ACNU), 1,0x10~ g/ml
—8 Kultur, Fluoruracil (5-FU): 1,5x10 g/ml Kultur, Doxorubicin
(ADM): 1,0x10~10 g/ml Kultur, Mitomycin C (MMC): 2,5x10~9 g/ml Kultur und Vinkristin-Sulfat (VCR): 1,5x10~10
g/ml Kultur.
Die Ergebnisse sind Tabelle 5 angegegeben.
Aus Tabelle 5 ist ersichtlich, daß LK 2 die tumorhemmende Wirkung von Chemotherapeutika extrem erhöht.
- 31 -
ACNU
MMC
VCR
Zellinie
|
HEp#2
(Epidermoides Larynxkarzinom) |
52 | 4 | 67 | 8 | 80 | 13 | 70 | 10 | 72 | 5 | 66 |
|
PC-8
(Lungenkarzinom) |
62 | 2 | 71 | 10 | 85 | 6 | 71 | 5 | 68 | 8 | 72 |
| MKN 7 (Magenkrebs) |
62 | 4 | 73 | 6 | 77 | 5 | 69 | 3 | 73 | 6 | 70 |
| HLE (Leberkarzinom) |
57 | 5 | 75 | 8 | 81 | 7 | 73 | 12 | t 74 |
10 | 69 |
|
HeLa
(Epitheloides Cervixkarzinom) |
51 | 5 | 71 | 12 | 69 | 7 | 62 | 7 | 61 | 10 | 63 |
+) mit Chemotherapeutikum
-) ohne Chemotherapeutikum; die Werte geben die Wachstumshennmung (%)
bei den Tunorzellen an
cn co co
Beispiel C-2
Einer Gruppe von BALB/c Nacktmäusen werden subkutan in
den Rücken kleine Humanbrustkrebs-Gewebefragmente transplan
tiert.
3 Nach dem die Tumormassen auf etwa 200 mm in den Tierkörpern gewachsen sind, wird eine Salzlösung, die ein gemäß Beispiel
A-3 hergestelltes LK 2-Präparat enthält, intravenös einmal täglich während 20 Tagen injiziert. Die Tiere werden dann
geschlachtet, die entstandenen. Tumormassen werden bestimmt.
Als Kontrolle wird eine LK 2- und chemotherapeutikumfreie
Salzlösung verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben.
| Behandlung | Tägliche Dosis | Tumormasse (g) |
| Kontrolle | 0 | 10.811.0 |
| LK 2 | 100 Einh./kg | 6.410.5* |
| MMC | 1 mg/kg | 5.1+0.4* |
| LK 2 + MMC | 0.1 mg/kg | 4.8+0.4* |
*) Statistisch signifikant gegenüber Kontrollen mit einer Signifikanz von 5 %
Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß LK 2 sogar in vivo sehr stark die tumorhemmende Wirkung von Chemotherapeutika
erhöht.
- 33 -
Die Ergebnisse bestätigen auch, daß eine Kombination eines Chemotherapeutikums mit LK 2 eine hohe tumorhemmende wirkung
hat, sogar dann, wenn das Chemotherapeutikum allein eine niedrige Konzentration und somit eine ungenügende tumorhemmende
Wirkung aufweist.
Die Verwendung von LK 2 als Steigerungsmittel für Chemotherapeutika
verringert sehr die eingesetzte Chemotherapeutikum-Konzentration,
verhindert Nebeneffekte und verbreitert sehr das Tumorspektrum der Chemotherapeutika.
Das erfindungsgemäße, LK 2 enthaltende Steigerungsmittel
weist eine steigernde Wirkung auf die Tumorhemmung auf, wenn es mit Chemotherapeutika verwendet wird.
Das Steigerungsmittel wird mit einem Chemotherapeutikum
vorgemischt, das entstandene Gemisch wird gleichzeitig auf einmal verabreicht. Man kann aber auch zuerst entweder
das Steigerungsmittel oder das Chemotherapeutikum verabreichen und das andere Mittel auf gleiche oder andere Weise
nachreichen.
Die folgenden Beispiele D, E und F erläutern die LK 2-Hei—
Stellung, LK 2 enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen sowie den LK 2-spezifischen monoclonalen Antikörper.
Eine Humanlymphoblastoid Linie, BALL-I, wird in Eagle's
Minimalnährmedium, pH 7,4, das 20 % Kälberfötusserum enthält, eingeimpft und in vitro in Suspension bei 37 0C auf
herkömmliche Weise kultiviert. Die vermehrten Humanzellen werden mit serumfreien Eagle's Minimalnährmedium, pH 7,4,
gewaschen und in einem frischen Präparat des gleichen Kulturmediums wieder suspendiert, und zwar zu einer Zelldichte
- 34 -
- 3-r-
von etwa 1x10 Zellen/ml. Die Zellsuspension wird mit Sendai-Virus in einer Dosierung von etwa 1 000 Hämagglutinationstiter/ml
versetzt und einem Tag bei 38 C zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Nach dem Zentrifugieren
der entstandenen Kultur bei etwa 1 000 g und 4 C wird der überstand gegen eine Salzlösung, die 0,01 m Phosphatpuffer,
pH 7,2, 15 Stunden dialysiert und durch einen Membranfilter filtriert. Das Filtrat wird auf eine Säule
mit Anti-LK 2-Antikörper gemäß Beispiel A-1 aufgegeben; die nicht adsorbierte Fraktion wird gemäß Beispiel A-3
durch Affinitätschromatographie gereinigt, und zwar auf einer Säule mit einem Anti-LK 2-Antikörper gebundenen Gel,
und zu einem Konzentrat mit einer spezifischen LK 2- Akti-
vität von etwa 10 Einheiten/mg Protein eingeengt.
Die Ausbeute beträgt etwa 1,5x10 Einheiten/1 der induzierten Zellsuspension.
Beisoiel D-2
Neugeborenen Hamstern wird ein herkömmliches Antiserum aus Kaninchen zur Schwächung ihrer Immunreaktion injiziert
und subkutan eine Humanlymphoblastoid-Linie, BALL-1, transplan
tiert; die Tiere werden drei Wochen in herkömmlicher
Weise gefüttert. Die in den Tieren subkutan gebildeten Tumomassen von je etwa 15 g werden extrahiert, zerkleinert
und in Salzlösung aufgebrochen. Nach dem Waschen mit serumfreiem RPMI 1640-Medium, pH 7,2, werden die vermehrten
Zellen in einem frischen Präparat des gleichen Kulturmediums
zu einer Zelldichte von etwa 5x10 Zellen/ml wieder suspendiert. Die Zellsuspension wird mit Sendai-Virus und
Endotoxin aus E. coli in einer Dosierung von etwa 1 000 Hämagglutinationstiter/ml und etwa 10 .ug/ml versetzt und
bei 37 C einen Tag zur Induktion der LK 2-Produktion in-
- 35 -
kubiert. Nach dem Zentrifugieren der Kultur bei etwa 1 000 g
und 4 C zur Entfernung des Sediments wird der Überstand
gegen eine Salzlösung, die 0,01 m P-hosphatpuf f er , pH 7,2 enthält, 21 Stunden dialysiert und durch einen Membranfilter
filtriert. Das Filtrat wird mit einer Antikörpersäule gemäß Beispiel D-1 gereinigt; die Eluatlösung wird eingeengt und
zu einem pulverförmigen Produkt mit einer spezifischen LK
9
2-Aktivität von etwa 10 Einheiten/mg Protein lyophilisiert.
2-Aktivität von etwa 10 Einheiten/mg Protein lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt etwa 3,2x10 Einheiten.
Erwachsenen Nacktmäusen wird intraperitoneal eine Humanlymphoblastoid-Linie,
TALL-I, transplantiert; die Tiere werden fünf Wochen in herkömmlicher Weise gefüttert, dann
wird intraperitoneal Newcastle-Virus (etwa 3 000 Hämagglutinationstiter
je Nacktmaus), das vorher durch UV-Bestrahlung praktisch inaktiviert worden ist, injiziert;
die Tiere werden 24 h nach der Injektion geschlachtet, die Ascitesflussigkeit wird gesammelt, gereinigt, eingeengt
und gemäß Beispiel D-2 zu einem pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt etwa 3,5x10 Einheiten je Nacktmaus. Beispiel D-4
Erwachsene Mäuse werden mit Röntgenstrahlen in einer Dosis von etwa 400 rem bestrahlt, um ihre Immunreaktion zu schwächen,
dann wird ihnen eine Humanlymphoblastoidzell-Linie,
Mono-1, subkutan transplantiert; die Tiere werden in herkömmlicher
Weise drei Wochen gefüttert. Die in den Tieren subkutan gebildeten Tumormassen von je etwa 10 g werden
- 36 -
extrahiert und gemäß Beispiel D-2 aufgebrochen. Die so
erhaltenen Humanzellen werden gemäß Beispiel D-2 suspendiert, die entstandene Zellsuspension wird mit Sendai-Virus
und Conkanavalin A in einer Dosis von etwa 500 Hämagglutinationstiter/ml
und 0,8 .ug/ml versetzt und bei 37 0C einen
Tag zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Die Kultur wird dann gereinigt, eingeengt und gemäß Beispiel D-2 zu
einem pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt etwa 2,Ox-IO Einheite je Maus.
Beispiel D-5
Neugeborenen Hamstern wird eine Humanlymphoblastoid-Linie,
Namalwa (ATCC CRL 1432) gemäß Beispiel D-2 transplantiert;
die Tiere werden in herkömmlicher Weise vier Wochen gefüttert. Die in den Tieren subkutan gebildeten Tumormassen
von je etwa 20 g werden extrahiert und zu einer Zellsuspension mit einer Zelldichte von etwa 3x10 Zellen/ml aufgebrochen.
Die Zellsuspension wird mit Sendai-Virus in einer Dosis von etwa 1 000 Hämagglutinationstiter je ml versetzt
und bei 36 C zwei Tage zur Induktion der LK 2- Produktion inkubiert. Die Kultur wird gereinigt und gemäß Beispiel D-1
zu einem Konzentrat mit LK 2-Aktivität eingeengt.
Die Ausbeute beträgt etwa 2,2x10 Einheiten je Hamster.
Eine Humanlymphoblastoid-Linie, NALL-1, wird in Salzlösung
suspendiert und in eine etwa 10 ml fassende zylindrische Kunststoff-Diffusionskammer eingebracht, die mit einem
Membranfilter mit einer Porengröße von etwa 0,5 .um ausge-
- 37 -
rüstet ist. Die Kammer wird intraperitoneal in eine erwachsene
Ratte eingebettet, das Tier wird vier Wochen in herkömmlicher. Weise gefüttert. Nach dem E-n-tfernen der Kammer be-
trägt die Zelldichte in der Kammer etwa 5x10 Zellen/ml, was
2
etwa 10 mal oder mehr ist als bei der in vitro-Vermehrung in einem CO_-Inkubator unter Verwendung eines Nährkulturmediums erreichbar ist. Die Humanzellen werden in dem Kulturmedium gemäß Beispiel D-2 suspendiert, mit Newcastle-Virus (etwa 500 Hämagglutinationstiter/ml), das vorher durch UV-Bestrahlung inaktiviert worden ist, und Phytohämagglutinin (etwa 50 .ug/ml) versetzt und bei 37 C einen Tag zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Die Kultur wird gereinigt, eingeengt und gemäß Beispiel D-2 zu einem pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität lyophilisiert.
etwa 10 mal oder mehr ist als bei der in vitro-Vermehrung in einem CO_-Inkubator unter Verwendung eines Nährkulturmediums erreichbar ist. Die Humanzellen werden in dem Kulturmedium gemäß Beispiel D-2 suspendiert, mit Newcastle-Virus (etwa 500 Hämagglutinationstiter/ml), das vorher durch UV-Bestrahlung inaktiviert worden ist, und Phytohämagglutinin (etwa 50 .ug/ml) versetzt und bei 37 C einen Tag zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Die Kultur wird gereinigt, eingeengt und gemäß Beispiel D-2 zu einem pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt etwa 8x10 Einheiten je Ratte.
Eine Humanlymphoblastoid-Linie, CCRF-CEM (ATCC CCL 119)
wird in die Allantoishöhlen von befruchteten Eiern, die bei 37 C 5 d inkubiert worden sind, eingeimpft; die Eier
werden bei dieser Temperatur eine weitere Woche inkubiert. Die vermehrten Humanzellen werden aus den Eiern gewonnen
und gemäß Beispiel D-1 zu einer Zelldichte von 5x10 Zellen/ ml supendiert. Die Zellsuspension wird mit Sendai-Virus
(etwa 500 Hämagglutinationstiter/ml) versetzt und bei 37 °C 1 d zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Die erhaltene
Kultur wird gereinigt und gemäß Beispiel D-2 zu einem pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität eingeengt.
Die Ausbeute beträgt etwa 7,0x10 Einheiten/10 befruchtete Eier.
- 38 -
Beisoiel E-1 Injektion
Ein gemäß Beispiel D-2 herqestelltes LK 2-Präparat mit
einer Aktivität von 500.000 Einheiten wird in 200 ml Salzlösung gelöst und unter sterilen Bedingungen durch ein
Membranfilter filtriert. 2 ml-Proben des Filtrats werden
in sterilisierte Glasamoullen verteilt, lyophilisiert und als pulverförmige Injektion verschlossen.
Die Injektion wird günstigerweise allein oder als Steigerungsmittel
in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie Melphalan, Methotrexat oder Doxorubicin, zur Behandlung
von Brustkrebs, Lungenkarzinom, Leberkarzinom oder Leukämie verwendet.
Injektion
Gemäß Beispiel E-1 wird eine pulverförmige Injektion herge-
stellt mit dem Unterschied, daß 3x10 Einheiten alpha-HuIFN
aus Humanlymphoblastoidzellen in 200 ml Salzlösung zusam-
5 men mit 5x10 Einheiten LK 2 gelöst werden.
Die Injektion wird günstigerweise allein oder als Steigerungsmittel
in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie Tegafur, Mitomycin C oder Vincristin-Sulfat zur Behandlung
von Brustkrebs, Lungenkarzinom, Leberkarzinom oder Leukämie verwendet; ihre therapeutische Wirksamkeit ist
größer als die der Injektion des Beispiels E-1.
- 39 -
Salbe
Ein gemäß Beispiel D-3 hergestelltes LK 2-Präparat wird mit einer Mindestmenge an flüssigem Paraffin bis zur Homogenität
verknetet. Das Gemisch wird in herkömmlicher Weise mit weißer Vaseline zu einer Salbe mit einer LK 2-Aktivität
von 20.000 Einheiten/g versetzt.
Die Salbe wird günstigerweise allein oder als Steigerungsmittel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie Cyclophosphamid,
Fluoruracil oder Vincristinsulfat, zur Behandlung von Hautkarzinom, Brustkrebs oder Lymphom verwendet.
Beispiel E-4 Augenwasser
Ein Gemisch von 800 ml destilliertem Wasser, 5 ml beta-Phenylethylalkohol
und 20.000.000 Einheiten eines gemäß Beispiel D-4 hergestellten LK 2-Präparats werden mit Natriumchlorid
und einer zusätzlichen Menge an destilliertem Wasser zu 1000 ml isotoner Lösung vermischt.
Die Lösung wird günstigerweise allein oder als Steigerungsmittel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie
Cytarabin oder Vincristinsulfat, zur Behandlung von Retinablastom verwendet.
Überzogene enterale Tabletten
Überzogene enterale Tabletten werden in herkömmlicher Weise
- 40 -
hergestellt durch Tablettieren eines Gemisches aus Stärke, Maltose und eines gemäß Beispiel 0-7 hergestellten LK 2-Präoarats
zu einem LK 2-Gehalt von 200.000 Einheiten/Tablette (100 mg) und anschließendes Überziehen der Tabletten
mit Methylcellulose-phthalatester.
Die Tabletten werden günstigerweise allein oder als Steigerungsmittel
in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie Doxorubicin, Fluoruracil oder Mitomycin C, zur Behandlung
von Kolonkarzinom oder Leberkarzinom verwendet.
Mäuse werden gemäß Beispiel A-2 immunisiert mit dem Unterschied, daß ein hochreines LK 2-Präparat, das gemäß Beispiel
A-3 erhalten wurde, als Antigen verwendet wird. Die Milzzellen der Tiere werden zusammen mit einer Mausmyelomalinie
(P3-NS-1/1-Ag4-1 von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan) in einer Salzlösung supendiert, die 140 mM/1
NaCl, 54 mM/1 KCl, 1 mM/1 NaHpP0. und 2 mM/1 CaCl enthält.
4 Die Suspension hat eine Zelldichte von 10 Zellen/ml und wird mit einer frischen Salzlösung der gleichen Zusammensetzung,
die jedoch vorher durch UV-Bestrahlung inaktiviertes Sendai-Virus enthält, unter Eiskühlung versetzt; das
Gemisch wird 5 min stehengelassen, dann mit etwa der 20-fachen Menge 37 0C warmem RPMI 1640-Medium verdünnt. Die
Hybridomazellen, die Anti-LK 2-Antikörper produzieren können,
werden gemäß Beispiel A-2 geklont. Die geklonte Hybridomazellen werden intraperitoneal in 7 d alte Hamster (etwa
10 Zellen/Hamster), deren Immunreaktion in herkömmlicher Weise geschwächt worden ist, transplantiert; der monoklonale
Antikörper wird aus den Tierkörpern gemäß Beispiel A-2 gewonnen.
Wie der monoklonale Antikörper des Beispiels A-2 neutrali-
- 41 -
- 4-r-
siert dieses Produkt auch immunologisch spezifisch die zytotoxische Aktivität von LK 2.
Die Stabilität des rnonoklonalen Antikörpers in wässeriger Lösung wird durch Bestimmung der Restneutralisationsaktivität
nach Inkubieren unter bestimmten Bedingungen gemessen: Nach 30-min. Inkubation bei pH 7,2 und verschiedenen Temperaturen
sind 80 % und mehr der Aktivität bei 60 C noch erhalten, wogegen 90 % oder mehr bei 70 C verlorengehen. Nach
16-stünd. Inkubation bei 4 C und verschiedenen pH-Werten ist die Aktivität in einem pH-Bereich von 2,0 bis 11,0
stabil.
Bei der Untersuchung verschiedener Eigenschaften des monoklonalen
Antikörpers wurde festgestellt, daß der monoklonale Antikörper gegenüber 2-Mercaptoethanol beständig ist und
eine SDezifische Antigen-Antikörperreaktion mit Antimaus-Immunoglobulin-G-Antikörper
aufweist. D.h., der monoklonale Antikörper gehört in die Klasse der Immunoglobulin-G-Antikörper.
Ein monoklonaler Anti-LK 2-Antikörper wird gemäß 3eisoiel
F-1 nergestellt mit dem Unterschied, daß als Mausmyelomalinie
SP2/0-Ag14 (von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan) anstelle von P3-NS-1/1-Ag4-1 verwendet wird.
Die immunologisch spezifische Neutralisation der zytotoxischen Aktivität von LK 2 durch den monoklonalen Antikörper
entspricht der des Beispiels F-1. D.h., der monoklonale Antikörper gehört ebenfalls in die Klasse der Immunoglobulin-G-Antikörper.
Claims (32)
1. Lymphokin (LK 2) mit den folgenden physikochemischen
Eigenschaften:
(1) Molekulargewicht: 20.000 - 2.000 Dalton
(2) Isoelektrischer Punkt: pi = 6,2 - 0,3
(3) Elektrophoretische Beweglichkeit:
auf Scheiben-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE): Rf = 0,29 - 0,02
-2-
η *
(4) UV-Absorptionsspektrum:
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm
(5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
unlöslich in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer, kaum löslich oder unlöslich in Ethylether, Ethylacetat
oder Chloroform
(6) Farbreaktion:
proteinpositiv gemäß Lowry- oder nach der Mikrobiuret-Methode,
saccharidpositiv mit Phenol-Schwefelsäure oder Anthron-Schwefelsäure
(7) Biologische Aktivität:
zytotoxisch bei L 929-Zellen,
zytostatisch bei KB-Zellen,
praktisch frei von Interferonaktivität
zytotoxisch bei L 929-Zellen,
zytostatisch bei KB-Zellen,
praktisch frei von Interferonaktivität
(8) Stabilität in wässeriger Lösung:
bis zu 60 C stabil bei 30-min. Inkubation bei pH 7,2, stabil im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 bei 16-stünd.
Inkubation bei 4 C und
(9) Stabilität bei Kryokonservierung:
stabil bei -10 C über einen Monat und langer.
2. Verfahren zur Herstellung von Lymphokin LK 2, gekennzeichnet durch
- Inberührungbringen von LK 2-produzierenden Humanzellen mit einem LK 2-Induktor und
- Gewinnung des angesammelten LK 2.
-3-
3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch
- Vermehrung von LK 2-produzierenden Humanzellen,
- Inberührungbringen der vermehrten Humanzellen mit einem
LK 2-Induktor unter solchen Bedingungen, daß sich eine wesentliche Menge an LK 2 ansammelt und
- Gewinnung des angesammelten LK 2.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, g e k e η η ζ e i c h
net durch die Vermehrung der LK 2-produzierenden Humanzellen in vitro.
5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, gekennzeich
net durch die Vermehrung der LK 2-produzierenden Humanzellen
in vivo.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch
gekennzeichnet , daß die LK 2-produzierenden Humanzellen erhalten werden durch
- Transplantatieren der Humanzellen in einen nichthumanen Warmblütler,
- Füttern der Tiere, wobei die Humanzellen die Nährflüssigkeit des Tierkörpers zu ihrer Vermehrung nutzen und
- Extrahieren und Aufbrechen des im Tierkörper gebildeten Tumors.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß die LK 2-produzierenden
Humanzellen erhalten werden durch
-4-
- Suspendieren der Humanzellen in einer Diffusionskammer,
in der die Nährflüssigkeit des nichthumanen Warmblütlers
den Humanzellen zugeführt wird,
- Einbetten oder Aufbringen der Kammer in oder auf einen
nichthumanen Warmblütler, so daß die Nährflüssigkeit des Tieres den Humanzellen in der Kammer zugeführt wird,
- Füttern der Tiere, wobei die Humanzellen die Nährflüssigkeit
des Tierkörpers zu ihrer Vermehrung nutzen, und
- Gewinnen der vermehrten Humanzellen aus der Kammer.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß der nichthumane Warmblütler
Geflügel oder ein Säugetier ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß in dem nichthumanen Warmblütler
die Immunreaktion geschwächt oder unterdrückt worden ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Diffusionskamer mit
mindestens einem Membranfilter, Hohlfaser- oder Ultrafilter mit einer m
rüstet ist.
rüstet ist.
-7 -5 mit einer nominellen Porengröße von 10 bis 10 m ausge-
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß die LK 2-produzierenden
Humanzellen Humanleukozyten oder Humanlymphozyten sind.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß die LK 2-produzierenden
Humanzellen Lymphoblastoidzellen sind.
-5-
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß die LK 2-produzierenden
Humanzellen aus der aus Namalwa (ATCC CRL 1432), BALL-1,
TALL-1, NALL-1, M-7002, B-7101, JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EBV-HO,
MOLT-3 (ATCC CRL 1552), CCRF-SB (ATCC CCL 120), CCRF-CEM (ATCC CCL 119), BALM-2, DND-41 und Mono-1 bestehenden Gruppe
ausgewählt werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß die Humanzellen in vitro
mit dem LK 2-Induktor in Berührung gebracht werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß die Humanzellen in vvo
rr.it dem LK 2-Induktor in Berührung gebracht werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß der LK 2-Induktor ein
alpha-Interferon- und/oder gamma-Interferon-Induktor ist.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an
einer wirkungsvollen Menge an Lymphokin LK 2 in Kombination
mit pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen und/oder
Verdünnungsmitteln.
18. Tumorhemmende Zusammensetzung nach Anspruch 17.
19. Zusammensetzung nach Anspruch 17 oder 18 mit einem LK 2-Gehalt von mindestens 5 Einheiten/g.
20. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 in Form einer Injektion, eines Augenwassers, einer Salbe,
eines Zäpfchens oder Collunarium.
21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 mit einem zusätzlichen Gehalt an einem Chemotherapeutikum.
-6-
22. Zusammensetzung gemäß einem den Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet , daß das Chemotherapeutikum
aus der aus Alkylierungsmittel, metabolischem Antagonisten, tumorhemmendem Antibiotikum, Alkaloid und deren
Gemischen bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
23. Für LK 2 spezifischer monoklonaler Antikörper.
24. Verfahren zur Herstellung des für LK 2 spezifischen
monoklonalen Antikörpers, gekennzeichnet durch
- Immunisierung eines nichthumanen Warmblütlers mit LK 2 als Antigen,
- Gewinnung der Antikörper produzierenden Zellen aus dem Tierkörper,
- Fusionierung der Antikörper produzierenden Zellen mit
Myelomazellen,
- Selektionierung eines Anti-LK 2-Antikörper produzierenden Klons aus den entstandenen Hybridomazellen,
- Vermehrung des Klons und
- Kultivierung der vermehrten Zellen zur Herstellung des für LK 2 spezifischen monoklonalen Antikörpers.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet , daß die Antikörper produzierenden Zellen
Milzzellen sind.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet , daß der nichthumane Warmblütler
eine Maus ist.
-7-
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch
gekennzeichnet , daß gemäß einem der Ansprüche
2 bis 16 hergestelltes LK 2 verwendet wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch
gekennzeichnet , daß die Fusionierung durchgeführt wird durch
- Suspendieren der Antikörper produzierenden Zellen mit
den Myelomazellen in einer Salzlösung, die eine wirkungsvolle
Menge eines Zellfusionierungsmittels enthält, und
- Stehenlassen der entstandenen Zellsuspension.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, dadurch
gekennzeichnet , daß als Zellfusionsmittel Sendai-Virus oder Polyethylenglykol verwendet wird.
30. Verfahren zur Reinigung von LK 2, gekennzeichnet durch
- Affinitätschromatographie einer LK 2 und Verunreinigungen
enthaltenden Lösung an einer Säule mit immobilisierten Anti-LK 2-Antikörpern und
- Gewinnung der entstandenen LK 2-aktiven Fraktion(en).
31. Verfahren nach Anspruch 30, gekennzeichnet
durch die Verwendung des gemäß einem der Ansprüche 24 bis 29 hergestellten Anti-LK 2-Antikörpers.
32. Reines LK 2 mit einer spezifischen Aktivität von 10 Einheiten/mg Protein oder darüber.
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