DE3590080C2

DE3590080C2 -

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Publication number: DE3590080C2
Application number: DE3590080A
Authority: DE
Inventors: Hector F. Deluca; Heinrich K. Madison Wis. Us Schnoes; Rafal R. Warschau/Warszawa Pl Sicinski; Yoko Delmar N.Y. Us Tanaka
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1984-03-05
Filing date: 1985-01-22
Publication date: 1992-08-06
Anticipated expiration: 2005-01-23
Also published as: IE850520L; BE901879A; AU584071B2; DE3590080T; IE57951B1; WO1985003939A1; IL74168A; IL74168A0; FR2560597B1; GB2155478A; FR2560597A1; DK506985A; JPS61501447A; DK153145C; GB2155478B; NL8520021A; DK153145B; DK506985D0; GB8505486D0; AU3889585A

Description

Die Erfindung betrifft neue 1α-Hydroxyvitamin D₂- Analogverbindungen, welche unerwartete biologische Eigenschaften aufweisen, sowie solche Verbindungen entaltende Arzneimittel.

Aufgrund der allgemein bekannten und anerkannten Wirksamkeit von 1α-Hydroxyvitamin D-Verbindungen bei der Calcium- und Phosphathomöostase bei Tieren oder Menschen bestand ein Interesse an der Herstellung der natürlichen Metaboliten und an der Auffindung von Analogverbindungen mit geeigneten biologischen Eigenschaften. Dies hat zur Herstellung einer Vielzahl von Verbindungen geführt, die biologische Aktivität aufweisen (vgl. z. B. DeLuca et al., Topics in Current Chem., Band 83, Seite 1 (1979); Ann. Rev. Biochem. 52, 411 (1983); Yakhimovich, Russian Chem. Rev. 49, 371 [1980]). Das Interesse an derartigen Verbindungen besteht weiterhin, insbesondere deswegen, weil erkannt wurde, daß zusätzlich zu ihrer klassischen Funktion als Regulatoren der Calcium-Homöostase bestimmte Vitamin D-Derivate, insbesondere 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ und 1α-Hydroxyvitamin D₃ auch Zell-Differenzierungsprozesse beeinflussen und in der Lage sind, das Wachstum und die Verbreitung bestimmter Leukämiezellen zu inhibieren (Suda et al., US-PS 43 91 802; Suda et al., Proc. Natl. Acad. USA 80, 201 [1983]; Reitsma et al., Nature, 306, 492- 494 [1983]).

Die meisten der bekannten Vitamin D-Metaboliten und -Analogverbindungen sind Derivate der Vitamin D₃-Serie, d. h. sie besitzen gesättigte Steroid-Seitenketten. In der Seitenkette ungesättigte Vitamin D-Verbindungen sind jedoch ebenfalls bekannt, nämlich bestimmte Hydroxyderivate von Vitamin D₂, wie 25- Hydroxyvitamin D₂ (US-Patentschrift 35 85 221), 1α,25- Dihydroxyvitamin D₂ (US-Patentschrift 38 80 894), die 24-Hydroxy- und 24,25-Dihydroxyvitamin D₂-Metaboliten (Jones et al., Arch. Biochem. Biophys. 202, 450 [1980]), 1α-Hydroxyvitamin D₂ (US- Patentschrift 39 07 843), wie auch bestimmte verwandte 22-trans- Dehydro-Verbindungen, welche der 24-Methylsubstituent fehlt, und wie sie beschrieben sind in der US-Patentschrift 37 86 062 und von Bogoslovskii et al. (J. Gen. Chem. USSR 48 (4), 828 (1978); Chem. Abstr. 89, 163848j, 89, 209016s).

Bei den erfindungsgemäß vorgeschlagenen neuen Vitamin D- Analogverbindungen handelt es sich um 1α,3β(9,10-Secocholesta-5Z,7E,-10(19))22E-tetraen-1,3-diol- Derivate der allgemeinen Formel

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe darstellt. Die erfindungsgemäße Verbindung, worin R ein Wasserstoffatom darstellt, kann als eine Zwischenverbindung bei der Herstellung der Verbindung erhalten werden, in der R eine Hydroxylgruppe ist.

Strukturmäßig sind die erfindungsgemäßen Verbindungen Analogverbindungen der Hydroxyvitamin D₂-Verbindungen, denen der 24-Methylsubstituent fehlt, d. h. die Verbindungen können als 1α-Hydroxy-28-norvitamin D₂ bzw. 1α-25-Dihydroxy-28- norvitamin D₂ aufgefaßt werden.

Die beiden erfindungsgemäßen Verbindungen weisen eine starke biologische Aktivität auf und sind durch ein unerwartetes und neues Aktivitätsspektrum charakterisiert, wie es näher weiter unten beschrieben wird.

Eine Methode zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist in dem Verfahrensschema I dargestellt. In der folgenden Beschreibung dieses Schemas und in den Beispielen und Tabellen beziehen sich die durch arabische Zahlen angegebenen Verbindungsbezeichnungen (z.B. (1), (2), (3), . . . (10), (11), (12)) auf die so numerierten Strukturformeln in dem Verfahrensschema.

Das Ausgangsmaterial ist der Dien-geschützte Aldehyd der Struktur (1) (vgl. Verfahrensschema I), der aus dem Ergosterolacetat nach dem Verfahren von Barton et al. (J. Chem. Soc. (C) 1968 (1971)) hergestellt worden ist. Die Umsetzung des Aldehyds (1) mit 3-Methyl-1-butylphenylsulfon der nachstehend angegebenen Formel

(CH₃)₂CHCH₂CH₂-SO₂Ph

in einem organischen Lösungsmittel und in Gegenwart einer starken organischen Base ergibt die Hydroxysulfon-Zwischenverbindung der Struktur (2), wie sie in dem Verfahrensschema I dargestellt ist. Die Behandlung der Zwischenverbindung (2) mit Natriumamalgam in gepufferter Alkohollösung liefert dann das 22,23-trans-Olefin (22E-Olefin) der Struktur (3).

Die Umsetzung des 22E-Olefins (3) mit einem starken Hydrid- Reduktionsmittel (z. B. LiAlH₄) in einem Ether-Lösungsmittel ergibt die 5,7-Dien-Zwischenverbindung (4). Diese Zwischenverbindung wird sodann mit ultraviolettem Licht in einem organischen Lösungsmittel bestrahlt, um das entsprechende Provitamin D-Derivat zu erhalten, welches isoliert wird und in einem organischen Lösungsmittel auf eine Temperatur erhitzt wird, die sich im Bereich von Raumtemperatur bis zur Rückflußtemperatur bewegt, um das Provitamin D- Chromophor zu dem Vitamin D-Chromophor zu isomerisieren, wodurch die 22E-Dehydrovitamin D₃-Verbindung der Struktur (5) erhalten wird. Verbindung (5) ist eine bekannte Vitamin D-Analogverbindung, die zuvor nach einem weniger bequemen Verfahren hergestellt wurde (Bogoslovskii et al., an oben angegebener Stelle).

Die Zwischenverbindung (1) wird sodann am Kohlenstoffatom 1 hydroxyliert nach dem allgemeinen Verfahren von DeLuca et al. (US-Patentschriften 41 95 027 und 42 60 549). Diese Reaktionsschritte umfassen die Reaktion der Verbindung (5) mit Toluolsulfonylchlorid in herkömmlicher Weise, um das entsprechende 3β-Tosylatderivat zu erhalten, welches direkt in gepuffertem Methanol solvolysiert wird, um die 3,5-Cyclovitamin D-Zwischenverbindung zu erhalten, welche durch die Struktur (6) im Verfahrensschema I angegeben ist. Durch Behandlung der letzteren Verbindung mit Selendioxid und tert.-Butylhydroperoxid wird nach chromatographischer Reinigung das entsprechende 1-hydroxylierte Produkt erhalten, welches überwiegend die 1α-Hydroxycyclovitamin D-Verbindung der Struktur (7) enthält. Eine kleine Menge des entsprechenden 1β-Hydroxy-Epimers kann ebenfalls in dem Produkt erhalten sein, jedoch ist die Trennung der Epimeren, obwohl diese mittels Chromatographie möglich ist, in dieser Stufe nicht erforderlich. Das Erhitzen dieser 1-Hydroxycyclovitamin D-Zwischenverbindung in Eisessig bei 40 bis 60°C liefert sodann ein Gemisch der 3-acetylierten Solvolyseprodukte, woraus durch Chromatographie die 5,6-cis- bzw. 5,6-trans-Verbindungen der Strukturen (8) und (9) isoliert werden. Wenn das 1-Hydroxycyclovitamin D-Produkt, welches der Solvolyse unterworfen wird, einen Anteil 1β-Hydroxy-Epimer enthielt, so enthält das Solvolysegemisch ebenfalls die 1β-Hydroxy-Epimeren entsprechend zu den Verbindungen (8) oder (9) und, sofern dies gewünscht wird, können diese Verbindungen durch Chromatographie isoliert werden.

Die herkömmliche Basenhydrolyse der Acetatfunktion in der Verbindung (8) ergibt das Diolprodukt der Struktur (10).

Dieses Diol (10) wird sodann einer enzymatischen Hydroxylierung am Kohlenstoffatom 25 in vitro unterworfen, wobei ein Leberhomogenisat verwendet wird, welches von Ratten mit Vitamin D-Mangel hergestellt wurde (gemäß der Beschreibung in der US-Patentschrift 43 07 025), um nach chromatographischer Trennung des Produktgemisches das gewünschte 1α,25-dihydroxylierte Produkt in reiner Form zu erhalten, welches durch die Struktur (12) angegeben ist.

In der folgenden detaillierten Beschreibung des Syntheseverfahrens, welches oben in Grundzügen dargestellt wurde, wurden die physikochemischen Daten erhalten unter Verwendung der unten angegebenen Verfahren und Vorrichtungen. Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde mittels der Vorrichtung der Firma Waters Associates Model ALC/GPC 204 unter Verwendung einer Säule aus Zorbax-Sil (DuPont) (6,2 mm × 25 cm Abmessungen der Säule, Fließgeschwindigkeit 4 ml/min, 1500 psi) durchgeführt. Die Säulenchromatographie wurde durchgeführt über Silikagel 60, 70-230 mesh ASTM (Merck). Die präparative Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde durchgeführt über Silika 60 PF-254 (20×20 cm- Platten, 1 mm Silikagel). Die Bestrahlungen wurden durchgeführt unter Verwendung einer Quecksilberdampflampe Hanovia 608A36, die mit einem Vycor-Filter ausgerüstet war. Alle Reaktionen werden vorzugsweise unter einer Inertgasatmosphäre durchgeführt (z. B. Argon).

3-Methyl-1-butylphenylsulfon (Isopentylphenylsulfon)

PhSO₂Na (1,97 g, 12 mMol) wurde zu einer gerührten Lösung von 3-Methyl-1-brombutan (1,51 g, 1,2 ml, 10 mMol) in DMF (20 ml) bei 75°C gegeben. Das Gemisch wurde 5 Stunden auf 75°C erhitzt, sodann abgekühlt, in Wasser eingegossen und mit Benzol extrahiert. Die organische Schicht wurde mit 5% HCl, 5% NaHCO₃ und Wasser gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und eingedampft. Das ölige Sulfonprodukt (1,69 g, 80%) war im wesentlichen rein und wurde ohne jegliche Reinigung verwendet; NMR δ 0,88 (6H, d, J = 6,5 Hz, 2×CH₃), 1,61 (3H, m, -CH₂-CH), 3,08 (2H, m, SO₂-CH₂-), 7,50-7,95 (5H, m, Ar-H); IR: 1300 (br), 1147, 1088, 745, 692, 564, 539 cm^-1; Massenspektrum m/e 212 (M⁺, 3), 143 (92), 77 (57), 71 (73), 70 (73), 55 (42), 43 (100), 41 (47).

(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-1,2-urazol)-cholesta-6,22-dien-3β- ol (3)

n-Butyllithium (1,7 M-Lösung in Hexan, 4,12 ml, 7 mMol) wurde einer gerührten Lösung von Diisopropylamin (707 mg, 1 ml, 7 mMol) in wasserfreiem THF (14 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Sulfon gemäß der Herstellung in Beispiel 1 (1,50 g, 7,07 mMol) in wasserfreiem THF (11 ml) wurde innerhalb von 10 Minuten tropfenweise zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur gerührt für weitere 15 Minuten, sodann abgekühlt auf 0°C und der Aldehyd (1) (545 mg, 1 mMol) in wasserfreiem THF (7 ml) wurde zugesetzt. Das Rühren wurde 2 Stunden bei 0°C fortgesetzt und die Lösung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt (30 Minuten). Das Gemisch (welches das Hydroxysulfonprodukt (2) enthielt) wurde in gesättigte Lösung von Na₂HPO₄ in Methanol (200 ml) eingegossen, Natriumamalgam (5,65%, 10 g) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde für 17 Stunden bei 4°C gerührt. Ausgefallenes Quecksilber wurde abfiltriert und nach der Einengung des Reaktionsgemisches auf etwa 5 ml wurde es mit Wasser verdünnt und mit Methylenchlorid extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), unter vermindertem Druck eingeengt und der ölige Rückstand wurde über eine Silikagelsäule chromatographiert. Überschüssiges Sulfonreagens wurde mit Benzol-Ether (7 : 3)-Gemisch eluiert. Die Eluation mit Benzol-Ether (6 : 4) lieferte das reine Produkt (3) (375 mg, 67%) als einen Schaum: NMR δ 0,81 (3H, s, 18-H₃), 0,86 (6H, d, J = 6,7 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,97 (3H, s, 19-H₃), 1,03 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H₃), 3,16 (1H, dd, J₁ = 4,4 Hz, J₂ = 14 Hz, 9-H), 4,44 (1H, m, 3-H), 5,25 (2H, br m, 22-H und 23-H), 6,22 und 6,39 (2H, AB q, J = 8,5 Hz, 6-H und 7-H), 7,40 (5H, br m, Ar-H); IR: 3444, 1754, 1701, 1599, 1402, 969, 757 cm^-1; Massenspektrum, m/e 557 (M⁺, 1%), 382 (70), 349 (51), 253 (28), 251 (45), 119 (PhNCO, 83), 55 (100).

(22E)-Cholesta-5,7,22-trien-3β-ol (4)

Das Addukt (3) (330 mg, 0,6 mMol) und Lithiumaluminiumhydrid (700 mg) in wasserfreiem THF (40 ml) wurden unter Rückfluß für 18 Stunden erhitzt. Das überschüssige Reagens wurde mit einigen Tropfen Wasser zersetzt. Wasserfreies Na₂SO₄ wurde zugesetzt und die organische Phase wurde dekantiert und eingeengt, um einen kristallinen Rückstand zu ergeben, der über einer Silikagelsäule gereinigt wurde. Die Eluation mit Benzol-Ether (94 : 6)-Gemisch ergab reines Dien (4) (180 mg, 80%), welches aus Methanol umkristallisiert wurde: Schmelzpunkt 119,5-122,5°C; [α] = -118° (c = 1,2, CHCl₃); NMR δ 0,63 (3H, s, 18-H₃), 0,87 (6H, d, J = 6,7 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,95 (3H, s, 19-H₃), 1,03 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H₃), 3,64 (1H, m, 3-H), 5,25 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,38 und 5,57 (2H, AB q, J = 6 Hz, 7-H und 6-H); UV λ_max 281 nm; IR: 3436, 1461, 1382, 1366, 1062, 1036, 968 cm^-1; Massenspektrum, m/e 382 (M⁺, 100), 349 (M⁺-H₂O-Me, 71), 323 (34), 271 (M⁺-Seitenkette, 16), 253 (M⁺-Seitenkette-H₂O, 32).

(5Z,7E,22E)-9,10-Secocholesta-5,7,10(19),22-tetraen-3β-ol (5)

Eine Lösung der Verbindung (4) (100 mg, 0,26 mMol) in Ether (120 ml)-Benzol (30 ml)-Gemisch wurde mit Argon für 40 Minuten entgast. Die Lösung wurde bei 0°C für 13 Minuten bestrahlt in einer Quarztauchquelle, die mit einer UV-Lampe und einem Filter ausgerüstet war. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand durch HPLC getrennt, wobei 1% 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel verwendet wurde, um das reine Provitamin D-Derivat zu erhalten (40,4 mg, 40%), welches bei 24 ml gesammelt wurde; NMR δ 0,72 (3H, s, 18-H₃), 0,87 (6H, d, J = 6,7 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 1,04 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H₃), 1,65 (3H, s, 19-H₃), 3,91 (1H, m, 3-H), 5,28 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,50 (1H, m, 11-H), 5,69 und 5,96 (2H, AB q, J = 12,5 Hz, 7-H und 6-H); UV λ_max 260,5 nm; λ_min 234 nm.

Das Provitamin (40 mg, 0,1 mMol) in Ethanol (100 ml) wurde unter Rückfluß für 3 Stunden erhitzt. Nach dem Abzug des Lösungsmittels wurde das Produktgemisch durch HPLC getrennt (Eluation mit 1% 2-Propanol in Hexan). Die Ausbeute des Vitamins (5) (gesammelt bei 34 ml) betrug 30,8 mg (77%); Schmelzpunkt (Hexan) 99-101°C; NMR δ 0,56 (3H, s, 18-H₃), 0,88 (6H, d, J = 6,7 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 102 (3H, d, J = 6,6 Hz, 21-H₃), 3,96 (1H, m, 3-H), 4,82 und 5,05 (2H, jeweils enges m, 19-H₂), 5,27 (2H, br m, 22-H und 23-H), 6,03 und 6,24 (2H, AB q, J = 11,4 Hz, 7-H und 6-H); UV λ_max 265 nm, λ_min 228 nm; IR: 3420, 1458, 1441, 1378, 1366, 1050, 970, 943, 891, 862 cm^-1; Massenspektrum, m/e (M⁺, 22), 349 (M⁺-H₂O-Me, 4), 271 (M⁺-Seitenkette, 8), 253 (M⁺-Seitenketten-H₂O, 13), 136 (100), 118 (80).

(5Z,7E,22E)-3β-Acetoxy-9,10-secocholesta-5,7,10(19),22- tetraen-1α-ol (8)

Ein frisch umkristallisiertes p-Toluolsulfonylchlorid (50 mg, 0,26 mMol) wurde einer Lösung des Vitamins (5) (30 mg, 0,08 mMol) in wasserfreiem Pyridin (300 µl) zugesetzt. Nach 30 Stunden bei 4°C wurde das Reaktionsgemisch in Eis/gesättigte NaHCO₃ unter Rühren eingegossen. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und mit Benzol extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit gesättigter NaHCO₃, gesättigtem Kupfersulfat und Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt, um das ölige 3β-Tosylderivat zu erhalten. Das rohe Tosylat wurde mit NaHCO₃ (150 mg) in wasserfreiem Methanol (10 ml) behandelt und das Gemisch wurde 8,5 Stunden bei 55°C gerührt. Nach dem Abkühlen und Einengen auf etwa 2 ml wurde das Gemisch mit Benzol (80 ml) verdünnt, mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt.

Die erhaltene ölige 3,5-Cyclovitamin D-Analogverbindung (6) war hinreichend rein, um für die folgende Oxidationsstufe ohne jegliche Reinigung eingesetzt zu werden. Einer heftig gerührten Suspension von SeO₂ (4 mg, 0,036 mMol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (5 ml) wurde tert.-Butylhydroperoxid (13,2 µl, 0,094 mMol) zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde wasserfreies Pyridin (40 µl) zugesetzt und das Gemisch wurde weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit CH₂Cl₂ (3 ml) verdünnt und auf 0°C abgekühlt. Das rohe 3,5-Cyclovitaminprodukt (6) in CH₂Cl₂ (4,5 ml) wurde sodann zugegeben und die Reaktion wurde bei 0°C für 15 Minuten fortschreiten gelassen. Das Gemisch wurde sodann langsam (30 Minuten) auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Gemisch wurde in einen Trenntrichter überführt und mit 30 ml 10%iger NaOH geschüttelt. Ether (150 ml) wurde zugesetzt und die abgetrennte organische Phase wurde mit 10% NaOH, Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Einengung zur Trockne unter vermindertem Druck ergab einen gelben öligen Rückstand, der über Silikagel-TLC- Platten gereinigt wurde, welche entwickelt wurden in einem 7 : 3-Gemisch von Hexan-Ethylacetat (R_f 0,35), wodurch das 1-Hydroxycyclovitaminprodukt erhalten wurde (14,4 mg, 45%): NMR δ 0,55 (3H, s, 18-H₃), 0,64 (1H, m, 3-H), 0,88 (6H, d, J = 6,9 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 1,03 (3H, d, J = 6,9 Hz, 21-H₃), 3,26 (3H, s, -OCH₃), 4,2 (2H, m, 1-H und 6-H), 4,95 (1H, d, J = 9,3 Hz, 7-H), 5,1-5,4 (4H, br m, 19-H₂, 22-H und 23-H); Massenspektrum, m/e 412 (M⁺, 27), 380 (M⁺-MeOH, 46), 339 (22), (M⁺-Seitenketten-MeOH), 29), 245 (18), 135 (100). Das oben angegebene Produkt enthielt überwiegend die 1α-Hydroxycyclovitamin D-Analogverbindung der Struktur (7) und eine kleine Menge des entsprechenden 1β-Epimers. Eine Lösung dieses 1-Hydroxycyclovitamin D- Produkts (12 mg) in Eisessig (0,5 ml) wurde für 15 Minuten auf 55°C erhitzt. Das Gemisch wurde sorgfältig in Eis/gesättigte NaHCO₃ eingegossen und mit Benzol und Ether extrahiert. Die vereinten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und eingeengt. Das erhaltene Produktgemisch wurde der HPLC unterworfen (1,5% 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel), um 4,9 mg der Verbindung (8) zu erhalten (Eluation bei 42 ml) und 3,1 mg der Verbindung (9) (Eluation bei 50 ml).

Verbindung (8): NMR δ 0,56 (3H, s, 18-H₃), 0,88 (6H, d, J = 7,0 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 1,02 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H₃), 2,04 (3H, s, -OCOCH₃), 4,41 (1H, m, 1-H), 5,02 (1H, enges m, 19-H), 5,1-5,4 (4H, br m, 3-, 19-, 22- und 23-H), 6,03 und 6,35 (2H, AB q, J = 11,4 Hz, 7-H und 6-H); UV λ_max 264 nm, λ_min 227,5 nm; Massenspektrum, m/e 440 (M⁺, 15), 380 (M⁺-HOAc, 84), 362 (M⁺-HOAc-H₂O, 9), 269 (M⁺-Seitenketten- HOAc, 40), 251 (15), 135 (100), 134 (94).

Verbindung (9): NMR δ 0,57 (3H, s, 18-H₃), 0,89 (6H, d, J = 7,0 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 1,03 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H₃), 2,04 (3H, s, -OCOCH₃), 4,49 (1H, m, 1-H), 5,00 und 5,14 (2H, jeweils enges m, 19-H₂), 5,25 (3H, br m, 3-, 22- und 23-H), 5,81 und 6,58 (2H, AB q, J = 12,0 Hz, 7-H und 6-H); UV λ_max 269,5 nm, λ_min 228 nm; Massenspektrum, m/e 440 (M⁺, 6), 380 (47), 269 (15), 135 (100), 134 (62).

Ebenfalls wurde aus dem Solvolyse-Produktgemisch eine geringe Menge (0,87 mg) des 1β-Hydroxy-Epimers entsprechend der Verbindung (8) erhalten, welches durch die folgenden Daten charakterisiert ist: NMR δ 0,55 (3H, s, 18-H₃), 0,87 (6H, d, J = 6,9 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 1,01 (3H, d, J = 6,9 Hz, 21-H₃), 2,06 (3H, s, -OCOCH₃), 4,17 (1H, m, 1-H), 4,99 (2H, m, 3-H und 19-H), 5,1-5,4 (3H, br m, 19-, 22- und 23-H), 6,00 und 6,38 (2H, AB q, J = 11,3 Hz, 7-H und 6-H); UV λ_max 262,5 nm, λ_min 227 nm; Massenspektrum, m/e 440 (M⁺, 27), 380 (78), 362 (12), 269 (28), 251 (20), 135 (100), 134 (78).

Hydrolyse der 3β-Acetoxygruppe in den Verbindungen (8) und (9)

Eine Lösung des 3β-Acetoxyvitamin-Derivats (8) (0,7-6 mg) in Ethanol (0,1 ml) wurde mit 10% KOH in Methanol (0,8 ml) behandelt und das Gemisch wurde für 1 Stunde auf 50°C erhitzt. Nach der üblichen Aufarbeitung und abschließenden HPLC-Reinigung (8% 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel) wurde das 1α-3β-Diol der Struktur (10) in 84%iger Ausbeute erhalten: NMR δ 0,56 (3H, s, 18-H₃), 0,87) 6H, d, J = 7,0 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 1,02 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H₃), 4,22 (1H, m, 3-H), 4,42 (1H, m, 1-H), 5,00 (1H, enges m, 19-H), 5,1-5,4 (3H, br m, 19-, 22- und 23-H), 6,01 und 6,38 (2H, AB q, J = 11,4 Hz, 7-H und 6-H); UV λ_max 264,5 nm, λ_min 227,5 nm; Massenspektrum, m/e 398 (M⁺, 21), 380 (M⁺-N₂O, 9), 2,87 (M⁺-Seitenkette, 6), 269 (M⁺-Seitenketten-H₂O, 8), 251 (5), 152 (38), 134 (100). Die Verbindung (10) eluiert bei 40 ml in dem obigen HPLC- System.

Die analoge Behandlung des Acetoxyderivats (9) ergab nach HPLC-Reinigung das 5,6-trans-1α,3β-Diol der Struktur (11) in 72%iger Ausbeute: NMR δ 0,58 (3H, s, 18-H₃), 0,87 (6H, d, J = 7,0 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 1,03 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H₃), 4,24 (1H, m, 3-H), 4,49 (1H, m, 1-H), 4,97 und 5,13 (2H, jeweils enges m, 19-H₂), 5,25 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,88 und 6,58 (2H, AB q, J = 11,5 Hz, 7-H und 6-H); UV λ_max 273 nm, λ_min 229,5 nm; Massenspektrum, m/e 398 (M⁺, 21) 380 (5), 287 (6), 269 (5), 251 (4), 152 (33), 134 (100). Die Verbindung (11) eluiert bei 38 ml.

25-Hydroxylierung der Verbindung (10)

Das 5,6-cis-1α,3β-Diol der Struktur (10) gemäß obiger Darstellung wurde sodann 25-hydroxyliert nach dem folgenden Verfahren: Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Diät mit geringem Calcium-Vitamin-D-Mangel nach der Beschreibung von Suda et al., J. Nutr. 100, 1049 (1970) für 2 Wochen behandelt. Sie wurden durch Enthauptung getötet und ihre Lebern wurden entfernt. Ein 20%iges (w/v) Homogenisat wurde hergestellt in eisgekühlter 0,25 M Sucrose. Die Inkubation wurde in 10 ml Inkubationsmedium in einem 125 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben durchgeführt, der eine aliquote Menge an Leberhomogenisat enthielt, die 1 g Gewebe, 0,125 M Sucrose, 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), 22,4 mM Glucose-6-phosphat, 20 mM ATP, 160 mM Nicotinsäureamid, 25 mM Succinat, 0,4 mM NADP, 5 mM MgCl₂, 0,1 M KCl und 0,5 Einheiten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase enthielt. Die Reaktion wurde initiiert durch Zugabe von 400 µg der Verbindung (10), die in 100 µl 95%igem Ethanol gelöst war. Das Gemisch wurde bei 37°C inkubiert unter Schütteln mit 80 Auslenkungen/min für 3 Stunden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 ml Methanol und 10 ml Dichlormethan gestoppt. Nach weiterer Zugabe von 10 ml Dichlormethan wurde die organische Phase gesammelt, während die wäßrige Phase mit 10 ml Dichlormethan erneut extrahiert wurde. Die organischen Phasen von insgesamt drei Extraktionen wurden vereint und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand, der das gewünschte Produkt enthielt, wurde in 1 ml CHCl₃ : Hexan (65 : 35)-Gemisch gelöst und auf eine Sephadex-LH-20-Säule (0,7 cm × 14 cm) gepackt, äquilibriert und mit demselben Lösungsmittel eluiert. Die ersten 10 ml wurden verworfen, während die nächsten 40 ml gesammelt und eingedampft wurden. Der Rückstand wurde sodann in 8% 2-Propanol in Hexan gelöst und der Hochleistungs-Flüssigchromatographie unterworfen (Modell LC/GPC 204 HPLC, Waters Associates, Medford, MA) unter Verwendung einer Zorbax-Sil-Säule (4,6 mm × 25 cm, DuPont, Inc., Wilmington, DE), welche unter einem Druck von 1000 psi mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min arbeitete. Das gewünschte 25-hydroxylierte Produkt wurde bei 42 ml eluiert. Das Produkt wurde ferner durch Hochleistungs- Flüssigchromatographie gereinigt, wobei eine Umkehrphasen-Säule verwendet wurde (Richrosorb Rp-18, 4,6 mm × 25 cm), die unter einem Druck von 1200 psi und einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min betrieben wurde. Die Säule wurde mit 22% H₂O in Methanol eluiert und das Produkt wurde bei 50 ml eluiert. Das Produkt wurde ferner durch HPLC unter Verwendung von Zorbax-Sil gereinigt und die Bedingungen entsprachen der obigen Beschreibung. Das erhaltene Produkt wurde durch die folgenden Daten charakterisiert: UV-Absorption (95% Ethanol) λ_max 265 nm, λ_min 228 nm; Massenspektrum, m/z 414 (Molekül-Ion M⁺), 396 (M⁺-H₂O), 378 (M⁺-2 × H₂O), 287 (M⁺-Seitenkette), 269 (M⁺-Seitenketten- H₂O), 251 (M⁺-Seitenketten-2 × H₂O), 152 (Ring A, C 7/8 Bindungsspaltung), 134 (152-H₂O) und 59 ((CH₃)₂C=OH)⁺ erhalten aus der C24/25-Bindungsspaltung).

Die obigen Daten, insbesondere die charakteristische Ultraviolett-Absorption und die hervortretenden und diagnostischen Peaks bei m/z 152, 134 und 59 in dem Massenspektrum zeigen, daß es sich bei dem Produkt um die gewünschte 25-hydroxylierte Verbindung handelt, die durch die Struktur (12) (Verfahrensschema I) angegeben wird.

Wenn es gewünscht wird, können die erfindungsgemäßen Verbindungen leicht in kristalliner Form erhalten werden durch Umkristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln, z. B. Hexan, Ethern, Alkoholen oder Gemischen davon, wie den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist.

Biologische Aktivität der Seitenketten-Dehydrovitamin D- Verbindungen

Die biologische Wirksamkeit der oben beschriebenen Dehydrovitamin D-Analogverbindungen wurde durch Versuche in vivo an Ratten und im Vergleich mit 1α-Hydroxyvitamin D-Verbindungen bekannter Wirksamkeit nachgewiesen. Beide Produkte, (12) und die Schlüssel-Zwischenverbindung, Verbindung (10), wurden getestet und als hoch aktiv befunden.

Biologische Aktivität der Verbindung (10)

Der Versuch wurde folgendermaßen durchgeführt: Männliche Weanling-Ratten wurden von der Firma Holtzman Co., Madison, WI, gekauft und ad libtum mit Wasser und einer Diät mit geringem Calciumgehalt, adäquatem Phosphor und Vitamin D-Mangel gemäß der Beschreibung von Suda et al. (J. Nutr. 100, 1049 [1970]) für drei Wochen gefüttert. Die Ratten wurden sodann in Gruppen von jeweils 6 Ratten eingeteilt und sie erhielten 650 pMol der Verbindung (10) oder von 1α-Hydroxyvitamin D₃ (1α-OH-D₃) gelöst in 0,05 ml 95%igem Ethanol intrajugular 18 Stunden vor ihrer Tötung. Die Ratten in der Kontrollgruppe bekamen den Ethanolträger in der gleichen Weise. Die Ratten wurden sodann durch Enthauptung getötet und das Blut wurde gesammelt. Das durch Zentrifugieren erhaltene Serum des Blutes wurde mit 0,1% Lanthanchloridlösung (1 : 20) verdünnt und die Serum-Calcium-Konzentration wurde mit einem Atomabsorptionsspektrophotometer gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben:

Tabelle I

Anstieg der Serum-Calcium-Konzentration als Reaktion auf eine Einzeldosis von 650 pMol der Verbindung (10) oder der Verbindung 1α-OH-D₃, verabreicht 18 Stunden vor der Tötung

Biologische Aktivität der Verbindung (12)

Die Untersuchung wurde gemäß folgender Beschreibung durchgeführt:
Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Diät mit geringem Calciumgehalt und Vitamin D-Mangel für 3 Wochen gemäß obiger Beschreibung behandelt. Sie wurden sodann in Gruppen von jeweils 5 Ratten unterteilt. Ratten in einer Kontrollgruppe erhielten 0,05 ml 95%iges Ethanol intrajugular, während Ratten in den Testgruppen 325 pMol der Verbindung (12) oder von 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ (1α,25-(OH)₂D₃) gelöst in 0,05 ml 95%igem Ethanol erhielten. 18 Stunden später wurden sie durch Enthauptung getötet und das Blut wurde gesammelt. Die Serum-Calcium- Konzentration wurde mit einem Atomabsorptionsspektrophotometer gemäß obiger Beschreibung ermittelt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II angegeben:

Tabelle II

Anstieg der Serum-Calcium-Konzentration als Reaktion auf eine Einzeldosis von 325 pMol der Verbindung (12) oder der Verbindung 1α,25-(OH)₂D₃, verabreicht 18 Stunden vor der Tötung

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß beide Verbindungen (10) und das Endprodukt (12) gemäß der Erfindung hoch aktiv sind bezüglich der Förderung eines Anstiegs der Serum- Calcium-Niveaus von Ratten mit Vitamin D-Mangel. Sie sind tatsächlich äquivalent bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit im Vergleich zu entsprechenden bekannten, in der Seitenkette gesättigten Verbindungen, 1α-OH-D₃ und 1α,25-(OH)₂D₃, deren hohe Wirksamkeit und pharmazeutische Verwendbarkeit durch viele Berichte allgemein und in der Patentliteratur (z. B. vergleiche Patentschrift 42 25 596) dokumentiert ist.

Besonders bemerkenswert und unerwartet ist die überlegene Aktivität von Verbindung (10) bei der Mineralisierung der Knochen von Tieren (Küken), die sich gegenüber der physiologischen Verwendung von Vitamin D₂-Verbindungen unterscheidet. Dies ist eine Verstärkung, welche durch die folgenden Daten erläutert wird.

Verfahren

1 Tag alte weiße männliche Leghorn-Küken wurden von der Firma Northern Hatcheries (Beaver Dam, WI) erhalten. Sie wurden mit der Sojaproteindiat mit Vitamin D-Mangel gemäß der Beschreibung in Omdahl et al. (Biochemistry 10, 2935, 2940, 1971) für 3 Wochen gefüttert, wonach sie einen Vitamin D-Mangel aufwiesen. Sie wurden sodann in Gruppen von jeweils 6 Küken eingeteilt. Eine Gruppe erhielt Wesson-Öl- Träger oral verabfolgt; die anderen Gruppen erhielten die angegebene Verbindung (vgl. Tabelle III) gelöst in derselben Menge von Wesson-Öl jeden Tag für eine Zeit von 7 Tagen. 24 Stunden nach der letzten Verabfolgung wurden alle Küken durch Umdrehen des Halses getötet. Ihre Tibiae (Schienbeine) wurden entfernt und von anhaftendem weichem und Verbundgewebe befreit und für 24 Stunden in Alkohol extrahiert, woran sich 24 Stunden in Diethylether unter Verwendung eines Soxhlet-Extraktors angeschlossen. Die Knochen wurden sodann bei 100°F auf ein konstantes Gewicht getrocknet und gewogen. Sie wurden sodann bei 650°C für 24 Stunden in einem Muffelofen verascht. Die Asche wurde gewogen und der prozentuale Aschegehalt in jedem der Tibiae wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III nachfolgend aufgeführt.

Tabelle III

Mineralisierung von rachitischen Kükenknochen

Die Ergebnisse zeigen, daß 130 pMol von 1,25-(OH)₂D₃ oder 1α-OH-D₃ oder von der neuen Verbindung (10) gemäß der Erfindung in gleichem Maß wirksam sind bezüglich der Steigerung des Mineralgehaltes der rachitischen Tibia. Um jedoch das gleiche Maß an Effektivität zu erreichen, waren 1300 pMol 1α-OH-D₂ erforderlich. Dies stimmt mit den vorangehenden Ergebnissen überein, worin gezeigt wurde, daß eine 10fach größere Dosis von 1α-OH-D₂ als von 1α-OH-D₃ erforderlich ist, um die gleiche Mineralisierung der Tibia von rachitischen Küken zu erzeugen. Diese Ergebnisse zeigen überraschenderweise, daß die Verbindung (10), obwohl sie eine Analogverbindung von 1α-OH-D₂ ist, eine unerwartete und überlegene Wirksamkeit bezüglich der Mineralisierung der Knochen von Tieren bietet, als sie bekannt ist zur Unterscheidung gegen die Vitamin D₂-Verbindungen in physiologischer Verwendung. Dies ist ein unerwartetes Merkmal dieser neuen Analogverbindung und zu deren Anwendung. Da diese unerwartete Aktivität in vivo der Verbindung (10) unzweifelhaft nach der Hydroxylierung zur entsprechenden 1α,25-Dihydroxyverbindung (Verbindung (12)) in vivo auftritt, sollte die Verbindung, d. h. Verbindung (12), welche die 24-Desmethyl-Analogverbindung von der bekannten Verbindung 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ ist, wirksam sein, um eine Knochenmineralisation bei Küken zu schaffen, die äquivalent zu derjenigen ist, die durch 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ gezeigt wird; somit würde diese neue Vitamin D₂-Analogverbindung in Küken voll wirksam sein. Diese hohe Wirksamkeit der Verbindungen (10) und (12) in einem Tier, welche sie gegenüber Derivaten vom Vitamin D₂-Typ unterscheidet ist neu und ein unterscheidendes Merkmal dieser Substanzen.

Aufgrund der ausgeprägten biologischen Aktivität werden die erfindungsgemäßen Verbindungen leicht Anwendung finden als Ersatz für verschiedene der bekannten Vitamine D-Metaboliten in der Therapie oder Prophylaxe von Unregelmäßigkeiten des Calcium-Metabolismus, wie Rachitis, Hypoparathyroidismus, Osteodystrophie, Knochenerweichung oder Osteoporose bei Menschen oder verwandten Calcium- Mangel-Erkrankungen (z. B. Milchfieber) bei Tieren. Entsprechend können diese Verbindungen bei der Behandlung von bestimmten bösartigen Erkrankungen, z. B. bei menschlicher Leukämie, eingesetzt werden. Unter Berücksichtigung der ausgeprägten und unerwarteten Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen (Verbindungen (10) und (12)) bei der Förderung der Mineralisierung von Knochen bei Vögeln (vgl. Tabelle III) können diese Verbindungen eine spezielle Verwendung haben bei der Abwendung oder der Behandlung von Zuständen, die durch Calcium-Ungleichgewicht erzeugt werden (z. B. Dünne der Eischale, Schwäche von Geflügelbeinen) bei Geflügel, wobei alle die bekannten Vitamin D₂-Derivate eine sehr schlechte Wirksamkeit aufweisen.

Zu therapeutischen Zwecken können die erfindungsgemäßen Verbindungen auf jede herkömmliche Weise und in jeder Form, die für die ausgewählte Verabreichungsart geeignet ist, angewandt werden. Die Verbindungen können mit jedem verträglichen und unschädlichen pharmazeutischen Träger formuliert werden in Form von Pillen, Tabletten, Gelatinekapseln oder Suppositorien oder als Lösungen, Emulsionen, Dispersionen oder Suspensionen in unschädlichen Lösungsmitteln oder Ölen. Eine derartige Formulierung kann andere therapeutisch wirksame und vorteilhafte Bestandteile enthalten, wie sie für die speziellen Anwendungen zweckmäßig sein können. Für die Verabreichung an Menschen werden die Verbindungen vorteilhafterweise in Mengen von 0,5 bis 10 µg pro Tag angewandt, wobei die spezielle Dosis eingestellt wird unter Berücksichtigung der im Einzelfall verabreichten Verbindung, der zu behandelnden Krankheit und dem Zustand sowie der Ansprache des Patienten.

Verfahrensschema I

Claims

1. 1α,3β(9,10-Secocholesta-5Z,7E,10(19))-22E-tetraen-1,3-diol- Derivate der allgemeinen Formel I worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe darstellt.

2. Arzneimittel, enthaltend eine der Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Exzipienten.