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Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Knochenreparatur in Wirbeltieren,
insbesondere bei Säugetieren und beim Menschen. Genauer gesagt betrifft die Erfindung
ein Verfahren zur Knochenreparatur, bei dem ein Implantationsmaterial auf
Kollagenbasis zur Anwendung kommt, um die Reparatur durch Knochenkonduktion zu
erleichtern. Dieses Kollagenmaterial ist hochgradig gereinigt und nichtimmunogen und
kann - falls dies gewünscht wird - xenogen sein. Das Kollagen ist ein wiederhergestelltes
aus Haut oder Knochen stammendes Material oder ein Gemisch daraus.
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Die Menschheit ist schon seit Jahrhunderten mit dem Problem der Durchführung der
Reparatur von Knochenschäden konfrontiert. Bis vor relativ kurzer Zeit bestand die
einzig praktikable Vorgangsweise darin, gebrochene Knochen ruhigzustellen und auf
die Natur zu vertrauen, daß Skelettgewebe wieder in eine Verletzung hineinwächst. Erst
mit dem Aufkommen der Chirurgie wurde es möglich, implantierte
Knochenersatzmaterialien zu verwenden - nicht nur zum Ersatz verletzter oder erkrankter
Knochenstrukturen, sondern auch zur Reparatur angeborener oder degenerativer Defekte in der
Skelettstruktur.
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Seither wurden sehr viele verschiedene Materialien verwendet und komplexe
Konstruktionen als Ersatz ganzer Knochenabschnitte geoffenbart; Beispiele hierfür sind
Hüftgelenke (US-A-3.820.167) und Zähne (US-A-4.186.486). Zu den verwendeten
Materialien zählen Metalle wie z.B. Titan (EP-A-0.071.242, US-A-3.918.100),
Keramikmaterialien wie z.B. Aluminiumoxid (US-A-3.919.723), geformte und
behandelte Knochen (US-A-3.318.774) und verschiedene Knochenpräparate wie z.B. zu
flexiblen Matten verdichteter Knochenstaub (US-A-2.621.145).
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Es ist seit langer Zeit bekannt, daß Skelettstrukturen anorganische und organische
Komponenten aufweisen. Die mineralische Komponente, die vermutlich die Festigkeit
und Steifigkeit der Knochenstruktur bewirkt, ist vor allem eine Form von
Kalziumphosphat, Hydroxyapatit. Die organische Komponente setzt sich hauptsächlich
aus einer einzigen Proteinart, Kollagen, zusammen, das ein bestimmtes Maß an
Elastizität verleiht, wodurch die übermäßige Sprödigkeit der Strukturen verhindert wird.
Da Skelettgewebe eine lebende Substanz ist, müssen natürlich zusätzlich metabolisch
aktive organische Komponenten in der Struktur enthalten sein, und es sind diese
Knochenzellen und ihre aktiven Metaboliten, die für den natürlich einsetzenden
Heilungs- und Aufrechterhaltungsvorgang verantwortlich sind.
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Da die Hauptkomponenten des Knochens jedoch vom quantitativen Standpunkt
Kollagen und Keramikmaterial sind, wurden auch verschiedene rekonstituierte
Implantatpräparate aus Gemischen ähnlicher oder unterschiedlicher Keramikmaterialien
sowie verschiedene Arten von Kollagenpräparaten verwendet. Siehe z.B. US-A-
3.443.261, Hayashi, K., et al., Arc Orthop Traumat Surg (1982) 99: 265 und US-A-
4.314.380.
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Es wurde ermittelt, daß die Reparatur von Knochengewebe durch einen von zwei
Mechanismen oder durch eine Kombination beider Mechanismen eintritt. Bei der
konduktiven Reparatur bewegen sich Zellen, die für ihre Eigenschaft als Knochenzellen
bereits widmungsgebunden sind (Knochenvorläuferzellen), vom angrenzenden
Knochenmaterial in den schadhaften Bereich und bilden direkt Knochensubstanz. Es
sind keine speziellen Faktoren (mit Ausnahme nichtspezifischer Nährstoffe) erforderlich.
Bei der Induktion findet vor diesem Prozeß die Umwandlung von zuvor nicht-
widmungsgebundenen Zellen mit mehrfachem Potential zu Knochenvorläuferzellen
statt, die zuerst Knorpelsubstanz bilden, welche kalzifiziert und degeneriert und durch
Knochensubstanz ersetzt wird. Um die Fähigkeit, dies zu tun, zu erlangen, sind
spezifische Proteinfaktoren erforderlich. Die Beschaffenheit dieser Faktoren ist derzeit
unbekannt. Für die konduktive oder induktive Reparatur ist es notwendig, daß das
lebende Wirtsgewebe die endgültige Skelettstruktur bereitstellt. Somit dient das
Implantat, das als Mittler dieser Prozesse auftritt, nicht als Ersatz für den schadhaften
oder entfernten Knochen, sondern eher als Matrixstütze für den aktiven Ersatz des
fehlenden Gewebes.
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Daher wurden Anstrengungen zur Entwicklung von Implantaten für schadhaftes
Skelettgewebe oder Läsionen in Knochen und Zähnen entwickelt, die genau diesem
Zweck dienen. Diese Implantate versuchen nicht, die Zusammensetzung der fehlenden
Knochensubstanz zu imitieren, sondern sie dienen eher als Strukturstütze und als
Führungsmatrix, um dort Knochenmaterialablagerungen einzubringen, die letztendlich
aus der benachbarten frischen Knochensubstanz stammen. Diese Stützen können nur
Matrixstützfunktionen übernehmen, d.h. als Mittler bei der konduktiven Reparatur
agieren, oder sie können zusätzlich Faktoren enthalten, die die Differenzierung nicht-
widmungsgebundener Zellen zu Knochenvorläuferzellen stimulieren, indem sie
sogenannte "Osteogenesefaktoren" (osteogenesis factors, OF) oder
"knochenmorphogene Proteine" (bone morphogenic proteins, BMP) bereitstellen. Da
Kollagen bereits ein vertrautes Material für die mit dem Knochenwachstum assoziierten
metabolisch lebensfähigen Zellen ist, versuchte man, vor allem aus Kollagen
bestehende Implantate zur induktiven und konduktiven Knochenreparatur zu verwenden.
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In Zusammenhang mit Implantaten zur induktiven Reparatur offenbart US-A-4.294.753
ein Verfahren zur Herstellung eines knochenmorphogenen Proteins. Ein
Reinigungsverfahren für einen OF, der wahrscheinlich nicht dem BMP der obigen
Patentveröffentlichtung entspricht, ist in US-A-4.434.094 geoffenbart. Diese Faktoren
sind natürlich im Knochen vorhanden, und Präparate entmineralisierter
Knochenteilchen, die beim Aufbau von Implantaten verwendet werden, setzen vermutlich diesen
Faktor in operabler Form frei. In verschiedenen Implantaten kamen sowohl gereinigte
als auch ungereinigte Formen dieser Faktoren zum Einsatz.
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Andere Forscher offenbarten die Ergebnisse von Versuchen, Kollagenpräparate alleine
als Matrix für konduktive Knochenreparatur-Aktivitäten zu verwenden, d.h. Präparate,
die keine Faktoren zur Reifung von Vorläuferzellen zu osteogenen Zellen enthalten und
somit als Mittler bei der konduktiven Reparatur fungieren.
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Krekeler, V.G. et al., J Oral Surg (1981) 10: Suppl 1: 151 verglichen die Nützlichkeit
autologer Spongiosa, eines Kollagenpräparats (Collagenfleece , Pentapharm) und
Bindegelatine als Füllungen für peridontale Defekte bei Stöberhunden (Beagles). Die
Präparate wurden einfach in die künstlich geschaffenen Knochenhohlräume gepackt und
der Heilungsprozeß durch mehrfarbige aufeinanderfolgende Markierung verfolgt.
Collagenfleece stellte sich als Heilungsmittler heraus, war jedoch weniger wirkungsvoll
als die Transplantate autologer Spongiosa.
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Das im obigen Präparat verwendete Collagenfleece wird nach einem Verfahren, das in
US-A-4.066.083 geoffenbart ist, aus Schweinehaut gewonnen. Die Haut wird fein
zerteilt, mit einem Detergens entfettet, gewaschen und mit Pepsin gespalten, um eine
viskose Suspension zu ergeben, und das Kollagen wurde durch Zugabe einer gesättigten
Salzlösung gefällt. Der Niederschlag wird in Säure suspendiert, als faseriger weißer
Niederschlag in Salzlösung erneut gefällt, so oft wie nötig gewaschen und durch
Waschen mit Alkohol entsalzt. Das gereinigte Kollagen wird in Säurelösung suspendiert
und gefriergetrocknet. Es wird durch γ-Bestrahlung sterilisiert, die das Präparat abbauen
oder vernetzen kann. Dieses Präparat ist im Handel erhältlich und wurde in zahlreichen
anderen Knochenreparatur-Untersuchungen eingesetzt.
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Joos, U. et al., Biomaterials (1980) 1:23-26, verwendeten Collagenfleece als Implantat
in künstlich beschädigten Hasen-Unterkieferknochen und stellten nach zwei Wochen
fest, daß die schadhaften Bereiche mit schwammigen Knochenteilchen gefüllt waren
und nach vier Wochen eine vollständige Verknöcherung zeigten. Zetzman, D. et al.,
Schweiz Mschr Sabnhelik (1982) 92:119 erzielten eine Knochenreparatur bei der
Gesichtschirurgie durch Verwendung von Collagenfleece als Implantat. Springorum,
H.W. et al., Z Orhop (1977) 115:686 kamen mit Collagenfleece bei einem
Rindenschichtdefekt zu ähnlichen Ergebnissen.
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Jaffee, A. et al., Archs Oral Biol (1978) 23: 415; ebda. (1982) 27: 999 berichteten über
die erfolgreiche Fixierung von Acryl-Zahnimplantaten bei Hunden unter Verwendung
von Kollagenlösungen, die durch Extraktion mit Essigsäure und
Trichloressigsäure/Ethanol-Reinigung aus Hundehaut hergestellt wurden. Die erfolgreiche Fixierung
der Implantate war auch nach einem Jahr noch intakt.
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Cucin, R.L. et al., New York State Journal of Medicine (1979) 1856 verwendeten mit
Gammastrahlen behandeltes Atelopeptidkollagen aus Kalbshaut zur Reparatur von
Hasenrippen und, bei Unterstützung durch Gelatine-Schwammaterial oder mit
autologem Knochenstaub, zur Reparatur von Schädellöchern bei Hunden.
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Ein Kollagenpräparat, das vermutlich noch immer die Telopeptide enthält und durch
Gammabestrahlung vernetzt ist, wurde zum Füllen von Zahnpulpahohlräumen und als
"Knochenersatz"implantat unter der Haut verwendet, wie in EP-A-0.012.443 bzw. EP-A-
0.012.959. Ein weiteres vernetzes Präparat ist in EP-A-0.052.288 (= US-A-4.597.762)
geoffenbart.
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Keines der obigen Reparaturverfahren mit Kollagen war ein voller Erfolg. Entweder
treten Entzündungen auf (insbesondere bei Verwendung von xenogenem Kollagen),
oder die Heilung ist unzufriedenstellend. Die vorliegende Erfindung bietet ein
implantierbares Kollagenpräparat, das das einwachsende Knochen reparaturgewebe von
den widmungsgebundenen Knochenzellen in den Schadensbereich leitet, dessen
Reparatur erwünscht ist. Da xenogenes Kollagen verwendet werden kann, sind große
Mengen verfügbar und die Anwendungsgebiete des Verfahrens vielfältig. Außerdem
bietet die Erfindung Knochenreparatur-Zusammensetzungen, die sehr vielseitig sind, da
sie an eine Vielzahl an Lastaufnahme-Erfordernissen anpassbar sind.
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Die vorliegende Erfindung bietet eine Zusammensetzung zur Reparatur von
Knochendefekten oder zum Wiederaufbau der Skelettmatrix eines Säugetiers, insbesondere eines
Menschen, durch das Implantieren von gereinigtem, nicht-immunogenen Kollagen in
den Schadensbereich, welches Kollagen auf Wunsch aus einer anderen Spezies als der
behandelten stammt. Somit ermöglicht die Erfindung die Vermittlung der natürlichen
Mechanismen des behandelten Organismus zur Reparatur des Knochenschadens, indem
ein allgemein anwendbares und hochgradig gereinigtes Kollagenpräparat verwendet
wird, das erfolgreich eine Matrix für neues Knochenwachstum bietet.
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Frische Knochensubstanz, die lebende Knochenvorläuferzellen enthält und einen
Knochendefekt zeigt, wird mit einem Kollagenpräparat in Kontakt gebracht, das eine aus
Haut stammende Zusammensetzung ist.
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Das aus Haut stammende Kollagen ist hauptsächlich Kollagen vom Typ I, enthält eine
geringe Menge an Typ III und wird typischerweise aus Kalbshaut gewonnen. Diese Art
von Kollagen ist im Handel unter der Markenbezeichnung "Zyderm collagen soft tissue
implant (ZCI)" erhältlich und wird zur Faltenentfernung eingesetzt. Das durch ZCI
verkörperte Kollagenpräparat ist eine rekonstituierte fibrilläre Form von
Atelopeptidkollagen.
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Wie z.B. in US-A-3.949.073 beschrieben, wird aus Haut stammendes Kollagen
typischerweise in einem Verfahren aus Haut gewonnen, worin es in eine solubilisierte
Form disassoziiert, durch Filtration sterilisiert und dann nach der Entfernung der
Atelopeptide zu fibrillärer Form rekonstituiert wird.
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Durch Variieren des BCP-ZCI-Verhältnisses in einem Gemisch dieser Peptide können
die physikalischen Eigenschaften des Reparaturmaterials an die jeweiligen Erfordernisse
des Defektbereichs angepaßt werden.
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In einem Aspekt betrifft die Erfindung somit ein Verfahren zur Herstellung einer
Zusammensetzung für die Reparatur von Knochendefekten, welches Verfahren das
Herstellen einer Suspension von gereinigtem, rekonstituiertem, fibrillärem Hautkollagen,
das im wesentlichen vernetzungsfrei ist, und das Lyophilisieren der Suspension umfaßt.
Das Kollagen stammt vorzugsweise aus Kalbshaut.
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Ein solches lyophilisiertes Präparat (lyophilisiertes Kollagengel oder LCG) besitzt
günstige Handhabungseigenschaften und kann zu Bahnen, die leicht zu Implantaten
verarbeitet werden können, extrudiert, gewalzt oder gegossen werden. Alternativ dazu
kann es zu Matten geformt werden.
Durchführungsarten der Erfindung
A. Definitionen
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"Konduktive" Reparatur von Knochendefekten bezieht sich hierin auf ein Verfahren zum
Ersatz verlorener Knochensubstanz oder zum Wachsen erwünschter neuer
Knochensubstanz, das den Stoffwechsel von zuvor widmungsgebundenen
Knochenvorläuferzellen einbezieht. Diese Zellen können Knorpelsubstanz und/oder Knochensubstanz
ohne Induktion durch Proteinfaktoren, die allgemein als osteogen oder morphogen
bekannt sind, herstellen. Das Verfahren umfaßt Mechanismen, durch die die
Osteogenese direkt durch die widmungsgebundenen Zellen bewirkt wird, doch nicht
jene, worin zusätzliche Proteinfaktoren erforderlich sind, um widmungsgebundene
Zellen zu erzeugen.
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"Im wesentlichen bestehend aus" bedeutet, daß die solcherart definierte
Zusammensetzung alle oder im wesentlichen alle ihre relevanten Eigenschaften aus
dem Ingrediens bzw. den Ingredientien bezieht.
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Man beachte, daß die Umwandlung undifferenzierter Zellen zu Knochenvorläuferzellen
auch noch durch körpereigene Proteine bewirkt werden kann. Die "konduktive"
Knochenreparatur wird jedoch gemäß der hierin angeführten Definition durch eine
externe Zufuhr lediglich der Stützmatrix vermittelt und bietet keine externe Quelle
lebenden Gewebes oder eines nicht-körpereigenen Osteogenesefaktors.
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"Knochendefekt" bezieht sich auf einen Bereich im Skelettsystem, in dem die
Ablagerung von Knochengewebe erwünscht ist, ob der Bereich nun durch Verletzung des
Patienten oder durch eine Mißbildung oder Degeneration seines Skelettsystems
entstand. Solche Defekte können auf einfachen Knochenbruch, Zerfall von
Knochengewebe aufgrund von Krankheit, chirurgischer Entfernung von erkranktem
Knochengewebe oder unerwünschter Mißbildungen oder auf wiederherstellende bzw.
kosmetische Chirurgie zurückzuführen sein.
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"Frische Knochensubstanz" bezieht sich auf Knochensubstanz im Skelettsystem des
Patientenorganismus, die sich in einem gesunden Zustand befindet und behandelt wird,
z.B. durch Schneiden, um lebendes Gewebe freizulegen. Es stellt sich heraus, daß beim
erfindungsgemäßen Verfahren Kontakt mit dem Defektbereich durch die frische
Knochensubstanz erforderlich ist, um in diesem Bereich lebensfähige Zellen zur
Knochenregeneration bereitzustellen.
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"Kollagenpräparat" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die als Hauptkomponente
eine bestimmte Form von Kollagenprotein enthält.
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"Xenogen" bezieht sich auf eine Spezies, die sich von jener des behandelten Patienten
unterscheidet.
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"Frei von Verunreinigungen" oder "gereinigt" bezieht sich auf jene Verunreinigungen,
die normalerweise mit dem Kollagen oder einem anderen Präparat in seinem
natürlichen Zustand assoziiert sind. Somit ist aus Kalbshaut hergestelltes Kollagen frei
von Verunreinigungen, wenn andere Komponenten der Kalbshaut im wesentlichen
entfernt wurden; jenes aus Knochensubstanz, wenn andere Knochenkomponenten
entfernt wurden.
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"Rekonstituiertes" Kollagen bezieht sich auf Kollagen, das in einzelne Dreifach-
Helixmoleküle mit oder ohne ihre Telopeptid-Anhängsel zerlegt, in Lösung gebracht
und dann erneut zu einer "fibrillären" Form gruppiert wurde. In dieser Form bestehen
die Fibrillen aus langen, dünnen Kollagenmolekülen, die um Vielfache von etwa ¼
ihrer Länge relativ zueinander versetzt sind. Dies führt zu einer Verbundstruktur, die
weiter zu Fasern zusammengeführt werden kann.
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"Im wesentlichen vernetzungsfrei" bezieht sich auf Kollagen, dessen Telopeptide
entfernt wurden, um zu einem Präparat ohne die native Fähigkeit der
Vernetzungsbildung zu gelangen. Solche Präparate bleiben im wesentlichen vernetzungsfrei, wenn
sie nicht bewußt vernetzt werden, z.B. durch Behandlung mit Glutaraldehyd oder
mittels einer Behandlung, die für eine unechte Form einer solchen Verbindung sorgt
Verfahren, die oft zu Sterilisationszwecken angewendet werden, z.B. hohe Temperatur
und γ-Bestrahlung, bewirken die Bildung zusätzlicher Vernetzungen zwischen den
Helices. Bei der Herstellung gemäß der Erfindung wird aus der Haut stammendes
Kollagen durch Mikrofiltration sterilisiert, während es sich noch in Lösung befindet, und
danach unter sterilen Bedingungen gehandhabt, wodurch man unerwünschte
Vernetzungsbildung verhindern kann.
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"Knochenkollagenpulver" (BCP) bezieht sich auf ein gereinigtes Atelopeptid-Präparat
von aus entmineralisierter Knochensubstanz stammendem Kollagen. Dieses Präparat
besteht im wesentlichen aus Kollagen an sich und enthält keine metabolisch aktiven
Proteine. Da es aus Knochensubstanz stammt, besteht es auf Kollagen vom Typ I und
imitiert die in Knochen vorgefundene native dreidimensionale Struktur.
B. Ausführliche Beschreibung
B.1. Anwendungen
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Die Knochendefekte, auf die die Erfindung anwendbar ist, umfassen jeden Hohlraum in
Knochengewebe, dessen Füllung erforderlich ist, damit das Skelettsystem wieder intakt
ist. Medizinische oder veterinärmedizinische Verfahren der Reparatur von
Knochendefekten, die sich als "Vehikel" zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
eignen, sind die wiederherstellende Chirurgie, die Entfernung von erkranktem
Knochengewebe und der Ersatz mit Überlagerungen oder Prothesen, das Befestigen von
Zähnen, der Ersatz von Zähnen, die Reparatur traumatischer Verletzungen u.dgl. Das
jeweilige Mittel zur Verwendung der Kollagenpräparate der Erfindung hängt von der Art
des Knochenschadens und des zu seiner Behebung ausgewählten Verfahrens ab, wie
dies für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig ist. Im allgemeinen können jedoch die
Zusammensetzungen der Erfindung zu einer Paste bzw. einem Gel gebildet und in den
kranken Bereich eingebracht werden, indem die Paste chirurgisch in den geschädigten
Bereich gepackt wird. Das Kollagenpräparat kann auch in den geschädigten Bereich
eingespritzt werden, wenn es so vermischt wird, daß es eine dünnere Suspension bildet.
In jedem Fall muß jedoch die zu behandelnde Schädigung zuerst so gereinigt werden,
daß frische Knochenoberfläche freigelegt wird, damit lebende Knochenzellen in Kontakt
mit dem Defekt gebracht werden. Die frische Knochenoberfläche ist notwendig, um
eine Quelle an Knochenvorläuferzellen bereitzustellen, die zur Synthetisierung der
permanenten Knochenstruktur gebraucht werden.
B.2 Kollagenpräparate
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Natives Kollagen besteht größtenteils aus einer Dreifach-Helixstruktur, die
Triplettsequenzen enthält, die sich aus Glycin zusammensetzen, das mit zwei
zusätzlichen Aminosäuren verbunden ist, üblicherweise Prolin und Hydroxyprolin;
somit tritt Glycin in jeder dritten Position in der Kette auf. Außerdem enthalten alle
Kollagenketten an jedem Ende Bereiche, die die Triplett-Glycinsequenz nicht aufweisen
und somit nicht helikal sind. Man ist der Ansicht, daß diese Bereiche für die mit den
meisten Kollagenpräparaten verbundene immunogene Wirkung (Immunogenität)
verantwortlich sind. Die immunogene Wirkung kann zu einem Großteil durch die
Entfernung dieser Bereich zur Herstellung von "Atelopeptid"kollagen abgeschwächt
werden. Dies kann durch die Abspaltung mit proteolytischen Enzymen wie z.B. Trypsin
oder Pepsin erfolgen. Aufgrund unterschiedlicher Spezifitäten dieser Proteasen variiert
das Ausmaß der Vollständigkeit der Entfernung der Telopeptide. Somit sind bestimmte
Proteasen vorzuziehen, die für die vollständigste Entfernung sorgen. Dazu zählt Trypsin,
das zur Entfernung von im wesentlichen allen Telopeptidanteilen führt.
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Die nicht-helikalen Telopeptidbereiche sind auch für die Bildung von Vernetzungen
notwendig, die die Stabilität der fibrillären Struktur verstärken. Diese Bereiche enthalten
Aldehyde, die zur Vernetzung mit Lysinresten fähig sind. Atelopeptidkollagen
muß - falls dies gewünscht wird - künstlich vernetzt werden.
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Es weisen zwar alle Kollagene die obigen Eigenschaften auf, doch sie wurden je nach
ihrer genauen Aminosäuresequenz in den einzelnen Ketten der Dreifachhelix, dem
Kohlehydratanteil und der Gegenwart oder Abwesenheit von Disulfidvernetzung in
etwa zehn Untertypen klassifiziert. Die häufigsten Untertypen sind Typ I, der in Haut-,
Sehnen- und Knochengewebe vorhanden ist und durch Fibroblasten hergestellt wird,
und Typ III, der vor allem in der Haut anzutreffen ist. Andere Typen befinden sich in
spezialisierten Membranen oder Knorpelsubstanz oder auf Zelloberflächen. Die Typen I
und III enthalten ähnliche Anzahlen an Aminosäuren in ihren Helixstrukturen; Typ
III - aber nicht Typ I - enthält jedoch zwei benachbarte Cysteine an den C-terminalen Enden
der Dreifachhelix, die zur Bildung von Vernetzungen zwischen den Ketten fähig sind.
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Kollagen vom Typ I enthält eine α2- (I) und zwei α1- (I) Ketten, von denen jede 1014
Aminosäuren in ihrem Triplettbereich enthält; auf jeder Kette befinden sich mehrere
Kohlehydratgruppen. Kollagen vom Typ III enthält nur α1 (III) (3 Ketten), die 1026
Reste in ihren Triplettbereichen enthalten. Wie oben erwähnt, sorgt die Gegenwart
eines Paars benachbarter Cysteinreste am Carboxyterminal des Triplettbereichs in
Typ III für Vernetzungsstabilität zwischen den Ketten. Beide Kollagene enthalten kurze
Nicht-Triplettenden (Telopeptide). Das in der vorliegenden Erfindung verwendete
rekonstituierte fibrilläre Atelopeptidkollagen enthält die Atelopeptidformen von Typ I
und Typ III; das Knochenkollagenpulver besteht ausschließlich aus der Atelopeptidform
von Typ I.
Aus der Haut stammendes Kollagen
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Die für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeigneten rekonstituierten
fibrillären Haut-Atelopeptidkollagen präparate werden durch die gereinigten, aus
Kalbshaut stammenden, rekonstituierten, fibrillären Atelopeptidkollagen-Suspensionen
repräsentiert, die üblicherweise unter der Handelsmarke ZYDERM Kollagen implantat
(ZCI) verkauft werden.
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Dieses und andere Präparate aus gereinigtem, aus Haut stammendem, rekonstituiertem,
fibrillärem Atelopeptidkollagen sind auf im Fachgebiet allgemein bekannt. ZCI kam in
großem Umfang in Weichgewebe-Anwendungen zum Einsatz, vor allem bei der
Entfernung von Falten und tiefen Narben durch Einspritzen des Präparats unter die Haut.
Solche Präparate wurden jedoch nur in Verbindung mit unterstützenden Materialien zur
Knochenreparatur verwendet, die auch OF enthalten und somit auf die induktive
Knochenreparatur gerichtet sind.
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Da dieses Kollagenpräparat aus Kalbshaut stammt, enthält es vor allem Kollagen vom
Typ I mit etwa 1-5% Kollagen vom Typ III. Das Atelopeptidkollagen wird noch in
Lösung durch geeignete Filtrationsverfahren sterilisiert und wird somit nicht abgebaut
oder vernetzt. Es wird zur fibrillären Form rekonstituiert und unter sterilen Bedingungen
verpackt.
Lyophilisiertes Hautkollagen
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Wenn dieses Kollagenmaterial lyophilisiert wird, um lyophilisiertes Kollagengel (LCG)
zu bilden, weist es die Fähigkeit auf, sich in den implantierten oder gefüllten Hohlraum
festzusetzen und der Mobilisierung von der erwünschten Stelle aufgrund seiner
hervorragenden strukturellen Integrität standzuhalten. Außerdem zeigen LCG-Matrizen die
erwünschte und erforderliche Eigenschaft der Unterstützung der Heilung und des
erneuten Einwachsens von Knochengewebe in den implantierten Bereich. Wie weiter
unten ausführlich geschildert, können die erfindungsgemäßen LCG-Präparate in einem
Bereich physikalischer Eigenschaften hergestellt werden, die durch den pH-Wert, die
Gefrierrate und die Konzentration der Suspension während der Lyophilisierung reguliert
werden. Unabhängig von den jeweils erwünschten Eigenschaften sind die
erfindungsgemäßen LCG-Präparate teilweise dadurch gekennzeichnet, daß sie aus
rekonstituertem, fibrillärem Atelopeptidkollagen bestehen, das im wesentlichen frei von
Verunreinigungen ist. Wenn das Präparat durch Mikrofiltration sterilisiert und danach unter
sterilen Bedingungen verarbeitet wurde, ist es im wesentlichen auch vernetzungsfrei.
Das zusätzliche Lyophilisierungsverfahren führt zu einer Matte, die ausreichende
Kohäsion aufweist, um leichtes Schneiden in die für die klinische Anwendung geeignete
Form nur mit einer Schere oder einer scharfen Klinge zu gestatten. Das Benetzen der
Matte ergibt ein kittartiges Material, das zu jeder gewünschten Form ausgestaltet und in
den geschädigten Bereich eingelegt werden kann.
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Die Anmelder und andere Forscher offenbarten Formen von lyophilisiertem Kollagen für
medizinische Anwendungen. Diese Kollagenpräparate unterscheiden sich jedoch
ebenso wie ihre Verwendungszwecke von jenen der vorliegenden Erfindung. Battista,
US-A-3.471.598 offenbart eine lyophilisierte Form eines Präparats einer
mikrokristallinen Zwischenform von Kollagen, das durch Behandlung von Rinderhaut
mit Salzsäure, um die Kollagenfasern aufzuquellen und zu trennen, erhalten wird. Das
Kollagen wird weder gereinigt noch werden die Atelopeptide entfernt. Das so
hergestellte Material gilt als geeignet für wasserabsorbierende Schwämme; klarerweise
würde der Verunreinigungsgrad und die Immunogenität solcher Präparate bewirken,
daß sie zur direkten medizinischen Verwendung relativ unerwünscht sind. Außerdem
bleibt die zur Herstellung des Zwischenprodukts verwendete Säure im Schwamm.
Kuntz et al., US-A-3.368.911 offenbaren ein alternatives Verfahren zur Herstellung
absorbierender Kollagenschwämme, um frei von Säure zu sein, welches Verfahren
Karbonsäure anstelle der vergleichsweise nichtflüchtigen, von Battista verwendeten
Säuren einsetzt. Während das Präparat laut dieser Veröffentlichung im wesentlichen
reine Kollagenfibrillen vorsieht, wurden die Atelopeptide nicht entfernt. US-A-4.440.750
offenbart eine Kunststoffdispersion aus entmineralisiertem Knochenpulver und
rekonstruiertem Atelopeptidkollagen. Miyata, US-A-4.294-241 offenbart lyophilisierte
Kollagenbahnen für Hautverbände. Diese Bahnen werden aus in Fibrillen
rekonstituiertem Atelopeptidkollagen hergestellt, doch sie unterscheiden sich insoferne vom
erfindungsgemäßen LCG, als sie künstlich vernetzt sind. Ries offenbart in US-A-
4.066.083 ein Verfahren zur Herstellung des im Handel erhältlichen Produkts
Collagenfleece zur Wundbehandlung. Luck und Daniels, US-A-4.233-360 beschreiben
ein lyophilisiertes Präparat, das eher einen Schaum als Matten ergibt, wie dies in der
vorliegenden Erfindung der Fall ist.
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Siehe auch FR-A-2.328.786 (= US-A-4.140.537, GB-A-1.551.163), worin verdrillte,
ineinander verflochtene Fibrillen eines Atelopeptid-Hautkollagens mit einem mittleren
Durchmesser von zumindest 500 µm hergestellt werden, indem eine Kollagenlösung
während der Desolubilisierung hohen Scherkräften ausgesetzt wird. Das Produkt kann
lyophilisiert werden.
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Im allgemeinen wird das erfindungsgemäße LCG aus einem gereinigten,
rekonstituierten, fibrillären Atelopeptidkollagen hergestellt, z.B. Zyderm I Kollagenimplantat oder
Zyderm II Kollagenimplantat, beides Handelsnamen für rekonstituierte
Kollagenpräparate, die aus Rinderhaut hergestellt wurden. Andere Quellen des rekonstituierten
gereinigten Hautkollagens können verwendet werden, wie z.B. die Häute anderer
Säugetiere. In jedem Fall muß jedoch das Ausgangsmaterial durch Verfahren, die zu im
wesentlichen reinen Kollagenfibrillen führen, die aus der solubilisierten Form
rekonstituiert werden, aus diesen Quellen hergestellt werden. Weiters müssen die
Telopeptide durch geeignete Vefahren, z.B. Trypsinspaltung, entfernt worden sein.
Typischerweise stellt man solche gereinigten Präparate her, indem man das
Ausgangsmaterial fein zerteilt, es mit Enzymen und/oder unter geeigneten pH-
Bedingungen behandelt, um Nicht-Kollagenmaterialien zu zerstören oder zu
extrahieren, das Kollagen mit einem spaltenden Enzym wie z.B. Trypsin zur Entfernung
der Telopeptide behandelt, zur Sterilisierung mikrofiltriert und die Kollagenfibrillen
durch geeignetes Einstellen des pH-Werts und der Salzkonzentration, d.h. von sauer zu
neutral, aus der Suspension rekonstituiert. Solche Präparate sind im Fachgebiet bekannt
und die Ergebnisse im Handel erhältlich.
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Die Verwendung von rekonstituiertem Kollagen zur Herstellung der lyophilisierten
Form ist auch vom Standpunkt der nichtabbauenden Sterilisationsverfahren bedeutsam.
Da das Kollagen zu einem Zeitpunkt während seiner Herstellung in solubilisierter Form
vorliegt, kann die Sterilisation durch Mikrofiltration erfolgen - ein völlig neutrales
Verfahren, das keine wesentliche chemische oder physikalische Änderung der Struktur
bewirkt. Wenn weitere Schritte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, sodaß
keine weitere Sterilisation erforderlich ist, ist das resultierende Produkt weder abgebaut
noch vernetzt, wie dies bei schärferen Sterilisationsverfahren, z.B. bei Wärme- oder γ-
Bestrahlung, der Fall wäre.
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In einem Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen LCG wird eine Suspension
eines geeigneten Kollagens auf eine Konzentration von etwa 20-100 mg/ml gebracht
und in Formen gegossen oder zu Bahnen extrudiert. Diese Formen werden dann bei
etwa -10ºC bis -50ºC gefroren und bei etwa 10-100 Millitorr lyophilisiert, wobei die
Kondensatortemperatur etwa -45ºC bis -55ºC und die Fachtemperatur etwa -30ºC
beträgt. Die Lyophilisierung erfolgt 1-7 Tage lang, bevor die Fachtemperatur etwa 24
Stunden lang auf etwa 15-25ºC erhöht wird; danach wird das LCG aus dem
Lyophilisierer entfernt.
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Alternativ dazu kann eine solubilisierte Form gereinigten Kollagens als
Ausgangsmaterial verwendet werden. Eine solche Lösung wird erhalten, indem man
gereinigtes Atelopeptidkollagen in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von etwa 2-3
auflöst, gegebenenfalls durch Mikrofiltration sterilisiert und die rekonstituierte Form
ausfällt, indem der pH-Wert z.B. mit einem Phosphatpuffer ungefähr auf einen neutralen
Wert gebracht wird. Das resultierende gefällte Kollagen wird durch Zentrifugieren
geerntet und das pelletierte Kollagen in neutralem Puffer erneut suspendiert und wie
oben behandelt.
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Ein alternatives Lyophilisierungsverfahren, das bei einigen Anwendungen bessere
Ergebnisse erzielt, ist eine modifizierte Form der obigen Vorgangsweise. Die
Kollagensuspension wird in sterile Kulturschalen gegossen (z.B. 35 mm) und die
resultierenden gegossenen Formen z.B. mit einer Spatel geglättet. Die gegossenen
Formen werden dann gefroren und vor der Lyophilisierung bei einer Temperatur von
etwa -100ºC bis -50ºC, vorzugsweise bei etwa -80ºC, etwa 1 Stunde lang gehalten. Die
Lyophilisierung erfolgt bei etwa 10-100 Millitorr über einen Zeitraum von etwa 24
Stunden bis zur Trockenheit, um poröse, einige Millimeter dicke Matten zu ergeben.
C. Beispiel
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Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, schränken sie aber nicht ein.
C.1 Herstellung von ZCI
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Zyderm Kollagenimplantat (erhältlich bei Collagen Corporation, Palo Alto, CA) wurde
als rekonstituierte fibrilläre Atelopeptidkomponente verwendet. Die rekonstituierten
nativen Kollagenfibrillen wurden bei einer Konzentration von etwa 35 mg/ml
verwendet. Das Präparat war während der Verarbeitung durch Filtration sterilisiert
worden und wurde somit keinen Abbauvorgang wie z.B. Hitze oder Bestrahlung
ausgesetzt.
C.2 Herstellung von LCG
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A. Pepsin-solubilisiertes, durch Mikrofiltration sterilisiertes Rinderhaut-Kollagen in
wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von etwa 2-3 wurde mit Phosphatpuffer auf einen
pH-Wert von 7,4 eingestellt. Das gefällte Kollagen wurde durch Zentrifugieren geerntet
und dann in Phosphatpuffer (pH 7,4) mit einer Konzentration von 35 mg/ml suspendiert.
Die Lösung wurde zu Bahnenform gegossen, die Bahnen wurden bei -25ºC gefroren
und dann bei 25 Millitorr lyophilisiert, wobei die Kondensatortemperatur -50ºC betrug.
Die lyophilisierten Bahnen wurden dann 5 Tage lang bei -30ºC gelagert, bevor die
Temperatur unmittelbar vor der Verwendung 24 Stunden lang auf 20ºC erhöht wurde.
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B. In einem alternativen (und bevorzugten) Verfahren wurden 5 cm³-Abschnitte von
ZYDERM Kollagenimplantat in sterile 35 mm-Gewebekulturschalen gegossen und mit
einer Spatel geglättet. Das Kollagengel wurde gefroren und etwa 1 Stunde lang bei
-80ºC gehalten. Das gefrorene Gel wurde dann etwa 24 Stunden lang bis zur
Trockenheit lyophilisiert, um poröse weiße Scheiben mit einem Durchmesser von
35 mm und einer Dicke von 3 bis 5 mm zu ergeben.
C.3 Behebung von Schädeldefekten mittels LCG
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Etwa 8 Wochen alte Ratten wurden anästhesiert, die Kopfhaut umgeschlagen und die
Knochenhaut entfernt. Beidseitige 3 x 7 mm große Defekte voller Dicke wurden mit
einem Zahnbohrer in die Scheitelbeinknochen des Schädels eingesetzt. Das wie in
C.2.B hergestellte lyophilisierte Kollagen wurde zu Streifen geschnitten, die etwas
größer als die Defekte waren, um eine feste Abdichtung zwischen dem Defekt und dem
Implantat zu schaffen. Einige Streifen wurden trocken in die defekten Stellen eingesetzt,
um dort zu hydratisieren, während andere vor dem Implantieren vorhydratisiert wurden.
Nach dem Implantieren wurde die Kopfhaut wieder positioniert und vernäht. Die
Heilrate innerhalb der defekten Bereiche wurde durch Histologie 2 und 4 Wochen nach
der Implantation bewertet.
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Nach 2 Wochen waren die Implantate gut mit Bindegewebszellen und Blutgefäßen
infiltriert, doch die Knochenneubildung war sehr eingeschränkt. Während
nichtimplantierte Defekte der Art des vorhergehenden Absatzes nicht verheilten und mit
weichem Gewebe gefüllt blieben, zeigten die reparierten defekten Stellen nach 28
Tagen Bereiche von Knochenneubildung im gesamten Implantat. Frühe Beweise einer
Verschmelzung mit zuvor bestehender Knochensubstanz waren an der Schnittstelle der
Schnittkanten der Defekte und des Implantats ersichtlich. Nach 56 Tagen war im
gesamten geschädigten Bereich reife Knochensubstanz mit gut ausgebildeten
Markhohlräumen vorhanden.
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LCG läßt sich leicht schneiden und handhaben, um Einsätze zu bilden, die konduktives
Knochenwachstum unterstützen können. Die erhaltenen lyophilisierten, rekonstituierten
Kollagenfasermatten bieten für diesen Zweck ein gebräuchliches und geeignetes
Material.