DE3587742T2

DE3587742T2 - Lagern und fördern von nematoden.

Info

Publication number: DE3587742T2
Application number: DE3587742T
Authority: DE
Inventors: Janice Margaret Pitt; Takao Yukawa
Original assignee: ECOGEN BIO Inc
Current assignee: ECOGEN BIO Inc
Priority date: 1984-02-07
Filing date: 1985-02-07
Publication date: 1994-06-09
Anticipated expiration: 2005-02-08
Also published as: DK461085D0; FI853870A7; FI853870L; FI853870A0; EP0177508A4; WO1985003412A1; NO853940L; CA1293186C; EP0177508B1; DE3587742D1; DK461085A; NZ211067A; IT8519430A0; NO170251C; NO170251B; EP0177508A1; IT1183183B; JPS61501392A; JPH06293601A; JPH0725641B2

Description

Die Erfindung befaßt sich mit der Aufbewahrung von insektenpatogenen Nematoden, die besonders zur Bekämpfung von Schadinsekten nützlich sind.
Bei der Suche nach alternativen Insektiziden, die Schadinsekten bei minimaler Umweltbelastung unter Kontrolle halten, richtet sich nun die Aufmerksamkeit auf biologische Bekämpfungsmitteln. Die Familie der insektenpatogene Nematoden, zu denen die Steinernematidae und die Heterorhabditidae gehören, ermöglicht einen solchen Ansatz durch ihre natürlichen insektiziden Eigenschaften.
Man findet insektenpatogenen Nematoden in der Erde im dritten larvalen Entwicklungsstadium, in welchem sie in der Lage sind, Insektenlarven sowie Imagos aufzuspüren und in diese einzudringen. Diese Nematoden tragen die symbiontischen Bakterien Xenorhabdus nematophilus und X. luminescens, welche die Abtötung der Insekten unterstützen. Sobald die Nematoden im Insekt sind und auf dessen Immunsystem störend einwirken, vermehren sich die freigesetzten symbiontischen Bakterien sehr rasch und beginnen nach einer kurzen Repeoduktionsphase das Haemocoel - das Blut der Insekten - aufzuspalten. Die Nematoden fressen nun die Bakterien und das teilweise verdaute Haemocoel, reifen heran und vermehren sich. Gemeinsam töten die Nematoden und Bakterien ein Insekt innerhalb von 24 bis 72 Stunden.
Ausschlaggebend für eine erfolgreiche Bekämpfungsstrategie mit insektenpatogenen Nematoden ist eine Massenzucht der Nematoden und eine effektive Zusammenführung von empfindlichen Schadinsekten mit den entsprechenden Nematoden. Bisher haben Schwierigkeiten bei der Massenproduktion sowie die Unfähigkeit Nematoden zu lagern den Fortschritt beim Einsatz von insektenpatogenen Nematoden als biologisches Bekämpfungsmittel verhindert. In der Vergangenheit war das Züchten von Nematoden nur mit in vivo- Methoden, wie z. B. auf Galleria mellonella möglich. Kürzlich wurden nun gewaltige Fortschritte mit in vitro Züchtungsmethoden gemacht, so daß nun das Ziel insektenpatogene Nematoden als kommerzielles Bioinsektizid einzusetzen, realistischer geworden ist.
Die Lagerung und der Transport von Nematoden kristallisierte sich als Schlüsselproblem heraus, bevor Nematoden als sinnvolle Alternative zu chemischen Insektiziden akzeptiert werden könnten.
Es ist bekannt, daß das dritte Larvenstadium in der Erde sehr lange und unter extremen Bedingungen, wie Trockenheit und Kälte, überleben kann. Sobald die Bedingungen wieder günstiger werden, sind die Nematodenlarven wieder aktiv und infizieren Insekten sobald sie Schlüpfen. Dennoch ist die Zahl derer, die solche Bedingungen überleben nicht groß. Gleichzeitig sind Nematoden aber besonders leicht durch schnelles Austrocknen, hohe Temperaturen und UV-Strahlungsexposition verwundbar.
Im dritten Larvenstadium frißt die Larve nicht mehr, sondern lebt von Reserven. Daraus erklärt sich auch, daß die Überlebenschance einer bestimmten Nematodenart von deren Fähigkeit abhängt, spezielle Energiereserven, wie z. B. Glycogen oder Fette, während der Wachstumsphasen, die dem gewünschten infektiösen Stadium vorangehen, einzulagern und von diesen in einem für das Überleben ausreichendem Maße zu zehren. Übertriebene Energiefreisetzung unter Bedingungen, die für das Infizieren von Zielinsekten durch dieses infektiöse Larvenstadium nicht geeignet sind, bedeutet einen verschwenderischen Energieverbrauch und damit eine Verkürzung der möglichen Überlebensdauer und ein Herabsetzen der anschließenden Infektionschancen. Die Zeitspannen des Überlebens ist zum einen festgelegt durch den Energievorrat, wird aber auch durch andere Faktoren, wie Enzymhemmung oder Umwandlung und Ausscheidung von giftigen Stoffwechselnebenprodukten beeinflußt.
Die zur Zeit in Wirksamkeitstests für bestimmte Insekten verwendeten Nematoden werden bei herabgesetzten Temperaturen zwischen 1ºC bis 10ºC aufbewahrt, bei denen die Stoffwechselraten reduziert sind.
Sauerstoff wird entweder kontinuierlich bzw. periodisch zugesetzt oder ist für eine begrenzte Zahl von Nematoden in einem verschlossenen Behälter vorgesehen. Viele Fachleute betonten die Wichtigkeit der Sauerstoffzufuhr und eine im Verhältnis zum Volumen große Oberfläche für den Sauerstoffaustausch bei der Aufbewahrung von Nematoden (Dutky et al. 1964 Hara et al. 1981). Um die Kontaktflächen zwischen Nematodenlösung und Luft zu vergrößern werden Filterpapier, Pauspapier, Baumwollwatte, Schwämme usw. verwendet.
Zum Beispiel können 500 Millionen Steinernema feltiae und S.bibionis auf 100 g trocknem und sauberem Schwamm in belüfteten Tüten bei 1ºC bis 2ºC bis zu 4 Monaten aufbewahrt werden (Bedding, 1984).
Die oben erwähnten Fachleute diskutieren jedoch auch die Konservierung der Nematoden im Zusammenhang mit einer Bereitstellung der Nematoden für Labor- und Freilandversuche.
Grundsätzlich sind die für Freilandversuche oder den Laborbedarf beschriebenen Aufbewahrungsmethoden für einen großräumig angelegten Vertrieb wegen nachfolgender Unzulänglichkeiten nicht geeignet. Diese sind:
(I) Kühlbedingungen
(II) Voraussetzungen der Sauerstoffversorgung (über Belüftung bzw. großes Luftvolumen)
(III) Begrenzte Nematodendichte (bis zu 150 000/ml) selbst bei den oben aufgeführten Vorkehrungen; und
(IV) die Schwierigkeiten die Nematoden vom Trägermaterial zu extrahieren, wenn ein solches verwendet wird.
Es ist ein Anliegen der vorliegenden Erfindung ein Aufbewahrungs- und Transportverfahren für Nematoden zu schaffen, das für eine kommerzielle Anwendung besser geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zum Aufbewahren von insektenpatogene Nematoden an, bei dem eine Lösung von insektenpatogenen, infektiösen Nematodenlarven mit einem Adsorbens vermischt wird, welches Wassermoleküle an seine Oberfläche anlagert und damit die Wasseraktivität in der Mischung herabsetzt, und bei der diese Mischung unter Bedingungen aufbewahrt wird, die das mikrobielle Wachstum hemmen. Vorzugsweise werden die Nematoden mit einem Adsorbens, wie z. B. Aktivkohle, oder einem synthetischen Harz wie z. B. Amberlite, aufbewahrt. Das Adsorbens liegt vorzugsweise als Puder, als in Gel eingebetteter Puder oder als Pellets vor. Zu diesem Zweck wird gemäß der Erfindung der Nematodenbrei bzw. die Nematodenlösung mit der entsprechenden Menge des Adsorbens, wie z. B. Aktivkohle, vermischt und unter Bedingungen aufbewahrt, die das mikrobielle Wachstum hemmen. Die Nematoden können hierbei unter nahezu anaeroben Bedingungen, unter aeroben Bedingungen oder in einem Vakuum aufbewahrt werden. Vorzugsweise werden die Nemtoden in einem Behälter unter weitgehend anaeroben Bedingungen aufbewahrt. Obwohl es sich bestätigt hat, daß das Fehlen oder Vorhandensein von Sauerstoff keine entscheidenden Folgen hat, könnten anaeroben Bedingungen das unerwünschte mikrobielle Wachstum verringern. Vorzugsweise sollte in der Mischung aus Nematoden und dem Adsorbens das Adsorbens mit einem 10-70%igen Gewichtsanteil vorliegen und dementsprechend sollte der Nematodenbrei 90-30% des Gewichts der Mischung ausmachen. Eine Nematodenkonzentration von 0,2 bis 2·10&sup6; Nematoden pro Gramm Brei wird als besonders günstig angesehen.
Das Adsorbens ist ein Material, das an seine Oberfläche verschiedene chemische Stoffe (möglich sind Gifte oder Wassermoleküle, um die Wasseraktivität herabzusetzen) bindet. Hierin unterscheidet es sich von absorbierendem Material oder auch von relativ inerten Materialien, wie z. B. Holzschnitzel, Schwämmen, Sand, Filterpapier und Holzkohle (inaktiviert).
Ein anderer Vorteil der Erfindung ist zurückzuführen auf die überraschende Feststellung, daß infektiöse Nematoden auch ohne Sauerstoff und bei Temperaturen bis zu 40ºC für einen beträchtlichen Zeitraum lebendig bleiben. Deshalb sieht die Erfindung eine Aufbewahrungsmethode für insektenpatogene Nematoden vor, bei der der Brei der infektiösen, insektenpatogene Nematoden unter weitgehend anaeroben Bedingungen aufbewahrt wird.
Mit dem Ausdruck "weitgehend anaeroben Bedingungen" sind solche Bedingungen gemeint, bei denen den Nematoden der freie Sauerstoff entzogen wird. Es soll aber erwähnt werden, daß der Sauerstoffgehalt in der Aufbewahrungsatmosphäre variieren darf, und daß "anaerob" bei verschiedenen Arten verschiedene O&sub2; Niveaus bedeuten kann. Diesem Vorteil der Erfindung geht die Erkenntnis voraus, daß infektiöse Larven keine Sauerstoffzufuhr/ Belüftung und auch keine großes Oberflächen-Volumen-Verhältnis während der Lagerung benötigen, so daß anfängliche Lagerbedingungen relativ aerob sein dürfen, die dann durch den O&sub2; Verbrauch der Nematodenatmung zu einer anaeroben werden.
Anaerobe Bedingungen können auf verschiedensten Wegen erreicht werden. Zum Beispiel, wie oben erwähnt, dadurch daß die Nematoden selbst den O&sub2; in der Lageratmosphäre verbrauchen. Alternativ kann man die Nematoden unter Vakuum, Stickstoff, Kohlendioxid oder anderen inerten Gasen verpacken.
Ein vorteilhafter Sauerstoffgehalt ist weniger als 0,4% v/v und vorzugsweise 0,25% v/v. Aber wie oben bereits erwähnt, kann es sein, daß die Anaerobiosis für verschiedenen Arten höher ist.
Die oben ausgeführten Bedingungen beziehen sich auf kommerziell genutzte Mengen von Nematoden, also Mengen mit wenigstens 0,2 · 10&sup6; Nematoden pro Gramm Brei. Dies ist um so erstaunlicher, da der Stand der Technik relativ kleine Konzentrationen der Nematoden beschreibt.
Vorzugsweise werden die Nematoden unter Bedingungen aufbewahrt, die das Wachstum von Mikroorganismen hemmen, z. B. durch die Anwesenheit eines antimikrobiellen Agens.
Der Begriff "antimikrobiell" soll hier bedeuten, daß es sich um eine Substanz handelt, die entweder die Mikroorganismen zerstört oder das Wachstum von Bakterien und Pilzen hemmt.
Vorzugsweise dient als antimikrobielle Substanz Formaldehyd oder Natriumhypochlorit, vorzugsweise in einer Lösung von 0,1 bis 1,0% w/w. Alternativ können eine Reihe anderer antimikrobieller Agenzien verwand werden, solange sie für die Nematoden in den zugesetzten Mengen nicht giftig sind.
Eine andere Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, daß die Nematoden vor der Lagerung in einem Behälter mit einem anderen antimikrobiellen Agenz gewaschen werden, das in der Lage ist die Oberfläche zu sterilisieren.
Eine andere Ausgestaltung dieser Erfindung sieht ein Verfahren vor, das sich dadurch auszeichnet, daß die Nematoden in einer hoch osmotischen, für Nematoden ungiftigen Lösung aufbewahrt bzw. transportiert werden. In der bevorzugten Ausführung werden die Nematoden in einer 30-70 w/w %igen Mono- oder Disaccharidlösung, aus Saccharose oder Glukose, suspendiert. Ohne sicher zu sein glaubt man, daß hoch osmotische Konzentrationen das unerwünschte mikrobielle Wachstum reduzieren und möglicherweise die Wasseraktivität des Systems herabsetzen, was die Stabilität der Nematoden direkt erhöht.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden die Nematoden auf einem puderigen oder besonderen Adsorbens gelagert. Im Falle von Aktivkohlepuder können die Nematoden direkt mit der Kohle gemischt werden. In zahlreichen anderen Fällen, bei denen das Adsorbens in Form von Pellets vorliegt oder die Nematoden auf einer Trägermatrix transportiert werden, bedarf es einer Freisetzung aus der Trägersubstanz bevor die Nemtoden am gewünschten Ort eingesetzt werden können. Dieses Freisetzen der Nematoden ist zeitaufwendig, arbeitsintensiv und führt oft zu großen Verlusten, aufgrund von unzureichender Loslösung von der Trägersubstanz. Gleichzeitig können kleine Stücke der Trägermasse in den isolierten Nematoden bei der weiteren Handhabung Probleme aufwerfen, wie zum Beispiel durch das Blockieren der Anwendungsvorrichtung.
Um dieses Problem zu beseitigen, wird zum Lagern und Transportieren ein Behälter vorgesehen, der verschließbar ist und eine erste Kammer für die Nematoden Trägersubstanz sowie eine zweite Kammer hat, die das Herauslösen der Nematoden aus der Trägersubstanz erleichtert. Weiterhin soll der Behälter eine Vorrichtung haben, welche die Trägersubstanz in der ersten Kammer zurückhält aber trotzdem durchlässig für die Nematoden ist. Vorzugsweise besteht die Vorrichtung, um die Trägersubstanz in der ersten Kammer zurückzuhalten, aus einem Netz, wobei die Maschengröße so gewählt sein muß daß die Nematoden durchkommen können. Ferner ist vorgesehen einen nematodendurchlässigen Schwanimfilter oder einen Beutel zu verwenden, der ganz oder teilweise für Nematoden durchlässig ist.
Ungeachtet anderer Formen, die auch unter diese Erfindung fallen, werden nun einige bevorzugte Ausführungsform mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben:
Fig. 1 zeigt schematisch eine erste Ausführungsform zum Aufbewahren und Transportieren von Nematoden.
Fig. 2 zeigt schematisch eine zweite Ausführungsform zum Aufbewahren und Transportieren von Nematoden.
In Fig. 1 ist ein verschlossener Behälter 2, z. B. aus Plastik dargestellt, der den Nematodenbrei vermischt mit dem Adsorbens 3, z. B. Aktivkohle enthält. Der Anteil der Aktivkohle mag einer breiten Schwankung unterliegen, bei einem 30-50%igen Gewichtsanteil wurden jedoch befriedigende Ergebnisse erhalten.
In Fig. 2 wird der Nematodenbrei 5 in einem semi-permeablen Membransack 4 aufbewahrt, z. B. einem Dialyseschlauch. Der Sack 4 ist umgeben von einem Behälter 6, der Aktivkohle oder eine Lösung von Aktivkohle in Wasser oder einer Pufferlösung enthält. Am besten ist es, ein antimikrobielle Agens zu dem Nematodenbrei oder in die Flüssigkeit zu geben, die den Sack 4 im Behälter 6 umgibt. Die Ausführungsform gemäß Fig. 2. ist besonders für Verwendungszwecke geeignet, bei denen die Kohle von dem Nematodenbrei getrennt gehalten werden soll. Die Porengrößen der permeablen Membran sollten kleiner als 10 u im Durchmesser sein. Es ist hervorzuheben, daß mit der Aktivkohle-Rezeptur die Nematoden sehr dicht gepackt werden können, z. B. im Falle von S. felitiae 1 Million pro Gramm. Es gibt keine Einschränkungen bezüglich der Größe des Pakets, und zwar von weniger als 1 Gramm bis zu 1 Kilogramm und größer, je nach dem Gebiet und Umfang der Anwendung.
Jede der oben aufgeführten Verpackungen dieser Erfindung ermöglicht es, die Nematoden unter verschiedenen Stufen der Anaerobiose bzw. der Sauerstoffspannung zu halten. Sie können ebenso unter Vakuum, unter Stickstoff, Distickstoffoxid, Kohlendioxid oder Luft gelagert werden. Des weiteren bedarf es keiner herabgesetzten Temperaturen bei der Lagerung. Denn es konnte gezeigt werden, daß die Nematoden über einen bedeutenden Zeitraum lebendig bleiben, auch wenn die Umgebungstemperatur bis zu 37ºC beträgt.
Die oben aufgeführten Methoden sind gültig für eine breite Auswahl an Nematoden, sowohl als reine Stämme als auch in Mischungen von Arten der Steinernematidae und Heterorhabditidae, eingeschlossen S.bibionis und S. felitiae (früher als Neoplectama carpocapsae bekannt), sowie H.bacteriophora und H.heliothides.
Die für den Transport benutzten Behälter können in allen Größen und aus jedem beliebigem Material sein, wie z. B. vakuumierte Plastikbeutel, injektionsspritzenähnliche Verpackungen, Luft- oder Edelgas gefüllte Flaschen, Einmachgläser (Krüge), Büchsen oder Dialyse Schläuche.
Die Nematoden können direkt aus dem Behälter heraus verwendet werden oder auch, abhängig von der jeweils besonderen Anwendung und der Produktart, mit Wasser oder anderen Lösungen verdünnt werden.
Es sollte erwähnt werden, daß die Art der Lagerung und der Aufbewahrung festzulegen ist im Hinblick auf Infektiösität und Lebensfähigkeit der aufbewahrten Nematoden.
Das übliche Bioassay (biologische Prüfung) für gelagerte Nematoden wird mit Schaf-Schmeißfliegen Larven, Lucilia cuprina, auf Filterpapier durchgeführt. Nach einer 5tägigen Inkubationszeit bei 23ºC im Dunklen, werden die Larven sezerniert, um die Infektionsrate zu bestimmen. Als Kontrolle dienen Daten die mit ungelagerten Nematoden ermittelt wurden.
Nachdem das Prinzip der vorliegenden Erfindung ausführlich erläutert ist, sollen nun einige spezielle Beispiele beschrieben werden.

Beispiel 1

Nematoden, S. glaceri NC513, wurden in einer einwertigen Kultur auf einem künstlichen Medium aus homogenisiertem Hühnerabfall und Polyurethan-Schwammstückchen hochgezogen. Das dritte, infektiöse Larvenstadium wurde vom Medium geerntet und mit Wasser gewaschen. Die gereinigten Nematoden wurden mit einer 0,1%gen Formaldehydlösung vermischt und bei 37ºC in verschlossenen Flaschen gelagert.
Die in Tabelle 1 zusammengestellten Ergebnisse zeigen eine erhöhte Stabilität nach Zugabe eines Biocides, wie Formaldehyd, im Vergleich zur Kontrolle mit Wasser.
In einem identischen Experiment war die Lebensfähigkeit von S.glaceri 90% nach 54 Tagen bei 30ºC. Tabelle 1 Auswirkung eines Biocides auf die Lebensfähigkeit von S.glaceri nach einer Lagerung bei 37ºC. Ansatz Lebensfähigkeit nach Tagen S. glaceri in Wasser S. glaceri in 0,1% Formaldehyd

Beispiel 2

Nematoden,. S. glaceri NC513, wurden gemäß Beispiel 1 vorbereitet, dann wurden die gewaschenen Nematoden mit M9 Pufferlösung versetzt und in verschlossenen Flaschen bei 22ºC, 28ºC, 33ºC und 37ºC für 30 Tage gelagert. Die Kontrolle wurde mit Wasser versetzt und für 19 Tage aufbewahrt.
Die Ergebnisse, die in Tabelle 3 zusammengestellt sind, zeigen, daß die Zugabe von einem physiologischen Puffer, z. B. M9, die Lagerfähigkeit der Nematoden erhöht. Tabelle 3 Lebensfähigkeit von S.glaceri nach einer Lagerung (in M9 Puffer) für 30 Tage bei verschiedenen Temperaturen Ansatz Lebensfähigkeit in % nach 19 Tagen in Wasser und 30 Tagen in M9 S. glaceri in Wasser S. glaceri in 0,1% Formaldehyd

Zusammensetzung des M9-Puffers

Na&sub2;HPO&sub4; 6 g
KH&sub2;PO&sub4; 3 g
NaCL 5 g
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,25 g auf 1 Liter destilliertes Wasser

Beispiel 3

Nematoden, S. feltiae Agriotis, wurden gemäß Beispiel 1 vorbereitet anschließend mit Wasser oder 0,1% Formaldehyd versetzt, gefiltert und dünn mit Aktivkohlepulver bedeckt. Sie wurden dann bei 22ºC für 33 Tage gelagert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben und belegen, daß die Zugabe eines Absorbens, wie z. B. Aktivkohle, die Lagerstabilität der Nematoden deutlich verbessert und daß diese Stabilität durch Zusatz von einem Biocide, wie Formaldehyd, noch weiter erhöht werden kann. Tabelle 2 Auswirkung eines Absorbents und eines Biocides auf die Lebensfähigkeit von S. feltiae nach einer Lagerung bei 22ºC für 33 Tage Ansatz Lebensfähigkeit in % S. feltiae in Wasser S. feltiae in Wasser + Aktivkohle S. feltiae in 0,1% Formaldehyd + Aktivkohle

Beispiel 4

Nematoden, S. feltiae Agriotis. wurden gemäß Beispiel 1 vorbereitet und anschließend in einer hochosmotischen Lösung mit 30% Saccharose versetzt sowie bei 22ºC gelagert. Im Vergleich mit einer Kontrollmenge in Wasser, bei der die Lebensfähigkeit gleich Null war, wurde nach 33 Tagen eine Lebensfähigkeit von 85% festgestellt.

Beispiel 5

Nematoden, S. bibionis Otio, wurden gemäß Beispiel 1 vorbereitet. Die gewaschenen und mit 0,1% Formaldehyd versetzten 4000/ml Nematoden wurden mit Aktivkohlepulver im Verhältnis 1 : 1 vermischt (20%w/v in 0,1% Formaldehyd). Durch ein Filterkissen (Millipore) wurden 10 ml dieser Mixtur gefiltert. Das gut abgetropfte Kissen mit Nematoden und Aktivkohlepulver wurde in einem Plastikbeutel verschlossen. Die Lebensfähigkeit der Nematoden betrug 92% nach 140 Tagen Lagerung bei Raumtemperatur. Die Infektiösität ging durch die Lagerung etwas zurück.

Beispiel 6

Nematoden, S. feltiae Mexican, wurden gemäß Beispiel 1 vorbereitet. 65 · 10&sup6; Nematoden als gewaschener Brei (1.5 · 10&sup6; /ml in 0.1% Formaldehyd) wurden mit trocknem Aktivkohlepulver (feiner als 400 u) im Verhältnis 1 : 1 vermischt und in Plastikbeuteln verschlossen.
Die Infektiösität blieb voll erhalten nach einer Lagerung von 30 Tagen bei 24ºC und ebenso nach 180 Tagen bei 4ºC. Der Inhalt der Beutel wurde in Wasser aufgelöst und über Hochdruckdüsen (2000 kPa) auf Artischocken verteilt. Es konnten keine nachteiligen Auswirkungen durch die Kohle festgestellt werden. Die Wirkung der gelagerten Nematoden gegenüber der Artischocken-Federmotte Platyptilia cazrduidactyla war zufriedenstellend. Ein Beutelinhalt von 90 g ist ausreichend um eine Bodenfläche von 500-5000 m² mit einer Nematodendichte von 10&sup4;-10&sup5; Nematoden/m² zu versehen.

Stand der Technik:

Dutky, S.R., Thompson, J.B. d Cantwell, G.E.
"A technique for the mass propagation of the DD - 136 nematode"
J. Insect Pathol. 6 (1964), 417-422.

Hara, A.H. et al.

"Monoxenic mass production of the entomogenous nematode Neoaplectana carpocapsae Weiser on dog/agar medium"
Advances in Agricultural Technology, Wester Series, No. 16 June (1981)

Bedding R.A.

"Larger Scale production storage and transport of the insect parasitic nematode Neoaplectana spp. and Heterorhabditis spp."
Ann. App. Biol. 104 (1984), 117-120

Claims

1. Verfahren zum Aufbewahren insektenpatogener Nematoden, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

Mischen einer Suspension aus infektiösen insektenpatogenen Nematodenlarven mit einem Adsorbens, das an seiner Oberfläche Wassermoleküle angelagert, um die Wasseraktivität in der Mischung herabzusetzen,

und Aufbewahren der Mischung unter Bedingungen, unter welchen das Wachstum von Mikroorganismen gehemmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Adsorbens entweder Aktivkohle oder ein synthetisches Harz ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2,

bei welchem das Adsorbens Kohle ist, und die Konzentration der Kohle im Bereich zwischen 10 und 70 Gewichtsprozent liegt,

und bei welchem die Suspension aus infektiösen insektenpatogenen Nematodenlarven in einem Bereich von 30 bis 90 Gewichtsprozent liegt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem die Konzentration der Nematoden zwischen 0,2 und 2 · 10&sup6; Nematoden/Gramm der Nematodensuspension liegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem die Nematoden aus Familien der Steinernematidae und der Heterorhabditae sowie einer Mischung der Arten dieser Steinernematidae und Heterorhabditae ausgewählt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem die ausgewählten Arten S.bibionis, S.glaseri, S.feltiae, H. bacteriophora oder H. heliothidis sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welchem die Aufbewahrung in Anwesenheit von antimikrobiellen Agensien erfolgt, um das Wachstum von Mikroorganismen zu hemmen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei welchem die Nematoden vor der Aufbewahrung mit einem antimikrobiellen Agens gewaschen werden, um das Wachstum von Mikroorganismen zu hemmen.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, bei welchem das antimikrobielle Agens eine Formaldehyd- oder Natriumhypochloritlösung ist.

10. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, bei welchem das antimikrobielle Agens eine Lösung mit einem hohen osmotischen Druck ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, bei welchem die Lösung eine Konzentration zwischen 0,1 und 1,0 w/w % hat.

12. Für eine längere Aufbewahrung geeigneter Nematodenansatz bestehend aus einer Suspension aus infektiösen insektenpatogenen Nematodenlarven, vermischt mit einem Adsorbens, welches an seine Oberfläche Wassermoleküle zur Verringerung der Wasseraktivität in dem Ansatz anlagert, und mit einem antimikrobiellen Agens.

13. Nematodenansatz nach Anspruch 12, bei welchem die Konzentration der Nematoden in einem Bereich zwischen 0,2 und 2 · 10&sup6; Nematoden/Gramm der Nematodensuspension liegt.

14. Nematodenansatz nach Anspruch 12 oder 13, bei welchem der Ansatz in einem versiegelten Behälter gespeichert ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei welchem die Nematoden in einer Speicheratmosphäre unter weitgehendst anaeroben Bedingungen aufbewahrt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei welchem die Nematoden in einer Speicheratmosphäre unter weitgehendst anaeroben Bedingungen aufbewahrt werden.

17. Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem die Nematoden in dem versiegelten Behälter Sauerstoff bis zum Ereichen eines anaeroben Zustand verbrauchen.

18. Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem die Nematoden unter Vakuum aufbewahrt werden.

19. Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem die Nematoden in Stickstoff aufbewahrt werden.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17 oder 19, bei welchem die Nematoden bei einem Sauerstoffgehalt von weniger als 0,4% v/v aufbewahrt werden.

21. Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem der Sauerstoffgehalt bei etwa 0,25% v/v liegt.

22. Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem die einen hohen osmotischen Druck aufweisende Lösung Monosaccharide oder Disaccharide enthält.

23. Verfahren nach Anspruch 22, bei welchem das Disaccharid Saccharose und das Monosaccharid Glukose ist.

24. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem das Adsorbens in Pulverform vorliegt, oder aus in ein Gel eingebettetem Pulver oder aus Pulverpellets besteht.

25. Nematodenansatz nach Anspruch 12, bei welchem das Adsorbens in einem Bereich zwischen 10 bis 70% des Gesamtgewichts vorliegt.

26. Nematodenansatz nach Anspruch 12, bei welchem das antimikrobielle Agens eine Formaldehyd- oder Natriumhypochloritlösung ist.

27. Nematodenansatz nach Anspruch 26, bei welchem die Lösungen eine Konzentration zwischen 0,1 und 1,0 w/w % haben.

28. Nematodenansatz nach Anspruch 12, bei welchem das antimikrobielle Agens aus einer Lösung mit einem hohen osmotischen Druck besteht.

29. Nematodenansatz nach Anspruch 26, bei welchem die Lösung aus Monosacchariden oder Disacchariden besteht.

30. Nematodenansatz nach Anspruch 29, bei welchem das Monosaccharid Glukose und das Disaccharid Saccharose ist.

31. Nematodenansatz nach Anspruch 12, bei welchem die Nematoden aus der Familie der Steinernematidae, der Heterorhabditae oder einer Mischung aus Steinernematidae und Heterorhabditae ausgewählt sind.

32. Nematodenansatz nach Anspruch 31, bei welchem die ausgewählten Arten S.bibionis, S.glaseri, S.feltiae, H. bacteriophora oder H. heliothidis sind.