DE3586520T2

DE3586520T2 - Herpes simplex-virus als vektor.

Info

Publication number: DE3586520T2
Application number: DE8585303791T
Authority: DE
Inventors: Bernard Roizman
Original assignee: Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA
Current assignee: Arch Development Corp
Priority date: 1984-06-04
Filing date: 1985-05-30
Publication date: 1993-01-07
Anticipated expiration: 2005-05-31
Also published as: JP2664892B2; US5846707A; US5599691A; JPH06181780A; US6071692A; CA1282721C; JP2641688B2; EP0176170A1; ATE79649T1; DE3586520D1; EP0176170B1; JPS611390A

Description

Die Erfindung betrifft Expressionsvektoren und insbesondere die Verwendung eines viralen Genoms als Vektor zur Expression fremder Gene.
Die Infektion empfänglicher Zellen mit bestimmten Viren, wie etwa dem Herpes-Simplex-Virus (HSV), führt typischerweise zur Abschaltung der Synthese der Wirtsproteine. Die Abschaltung erfolgt in zwei Stufen: Die erste Stufe wird sehr wahrscheinlich durch ein Strukturprotein des Virus verursacht, und genetische Studien weisen darauf hin, daß diese Aktivität nicht wesentlich für das Viruswachstum ist. Eine zweite, irreversible Hemmung tritt während des viralen Reproduktionszyklus als Folge der Expression viraler Genprodukte auf. Verfügbare Daten, die auf chemischer Entkernung mit Actinomycin D oder physikalischer Entkernung mit Hilfe von Cytocholasin B beruhen, legen es nahe, daß die Hemmung zumindest zum Teil auf der Ebene der Translation stattfindet.
Obwohl bereits bekannt war, daß Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) einige Wirtsgene induziert, insbesondere fremde Gene wie zum Beispiel Ovalbumin, welches unter die Kontrolle von viralen regulatorischen Regionen gebracht und durch Transfektion in Zellen eingeführt wurde, ist ihre Expression selektiv und vorübergehend. Es wurde früher angenommen, daß der Hemmungsmechanismus des Wildtypvirus keine fortgesetzte Expression eines in das Virusgenom eingeführten fremden Gens zulassen würde.
Erfindungsgemäß wird ein fremdes Gen in ein virales Genom unter der Kontrolle von regulatorischen Promotorregionen des Genoms eingebaut; das virale Genom wird dadurch zu einem Vektor für die Expression des fremden Gens in infizierten Zellen. Diese Expression wird von den regulatorischen Promotorregionen des Genoms reguliert.
So wird ein virales Genom gentechnologisch verändert, um es für die fortlaufende Vermehrung des Gens zusammen mit dem Virusgenom und die fortgesetzte Expression fremder Gene in einem geeigneten Wirt, ungeachtet der Abschaltung der von Wirtschromosomen gesteuerten Proteinsynthese, nutzbar zu machen.
Die Erfindung wird beispielhaft dargestellt durch die Verwendung von HSV-1 als Vektor zur Expression des Hepatitis-B-Oberflächenantigens (HBsAg). Um seine Expression zu ermöglichen und zu regulieren wird das HBsAg-Gen unter die Kontrolle von regulatorischen Promotorregionen des HSV-Gens gestellt. Dieses Konstrukt wird dann in das Thymidin-Kinase(TK)-Gen des viralen Genoms eingefügt. Zusätzlich kann eine Deletion in dem TK-Gen erzeugt werden, um es zu inaktivieren. Das sich daraus ergebende DNA-Konstrukt wird mit der intakten DNA eines geeigneten HSV-1-Stammes cotransfiziert und TK&supmin; -Nachkommen werden selektiert. Diese Nachkommen enthalten Rekombinanten, die sowohl die Deletion als auch die HBsAg-Insertion enthalten. Kulturen dieser Rekombinanten produzieren wirksam HBsAg über längere Zeiträume.
Erfindungsgemäß werden ein DNA-Konstrukt, ein viraler Vektor, der das zur Expression fremder Gene brauchbare DNA-Konstrukt enthält, ein Verfahren zum Herstellen eines solchen Konstruktes und Vektors, ein Verfahren zur Expression unter Verwendung des Vektors, und spezifische Plasmide und rekombinante Viren zur Verfügung gestellt.
Diese Erfindung ermöglicht die gleichzeitige Einführung und synchrone Expression fremder Gene in Zellkulturen in großem Maßstab ohne die vorherige Selektion von ausschließlich transformierten Genen. Sie ermöglicht die Expression von Genen, die normalerweise nur schwach exprimiert werden, und von Genen von Organismen die entweder gefährlich sind oder nicht in Kultur gehalten werden können.
Andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden Fachleuten durch die folgende detaillierte Beschreibung in Verbindung mit den Figuren und den Ansprüchen im Anhang deutlich.
Zu den Abbildungen:
Fig. 1 ist ein Flußdiagramm, das die Konstruktion eines rekombinanten Herpes-Simplex-Virus, welches ein β-TK-Promotor-reguliertes Hepatitis-B-Oberflächenantigen enthält, schematisch darstellt.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Schwebedichte von gereinigtem exprimierten HBsAg in mit dem Virus von Fig. 1 infizierten Zellen in einem Cäsiumchloridgradienten zeigt.
Fig. 3 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von gereinigtem exprimierten HBsAg, das aus mit dem Virus von Fig. 1 infizierten Zellen erhalten wurde.
Fig. 4 ist ein Flußdiagram, das die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids schematisch darstellt, welches ein chimäres αICP4-HBsAg-Gen enthält; und
Fig. 5 ist ein Flußdiagram, das die Cotransfektion des Plasmids von Fig. 4 mit intakter viraler DNA und die Selektion eines rekombinanten Herpes-Simplex-Virus, welches das αICP4-HBsAg-Gen enthält, zeigt.
Um ein Herpes-Simplex-Virus (HSV) in einen erfindungsgemäßen Vektor umzuwandeln, genügt es, in seine DNA ein fremdes Gen zu rekombinieren, welches mit einem geeigneten viralen Promotor verknüpft ist. Das fremde Gen muß sein eigenes Transkriptionsterminations-Polyadenylierungssignal haben, oder ein neues solches Signal muß bereitgestellt werden.
Das fremde Gen sollte eine vollständige kodierende Sequenz enthalten. Wenn das fremde Gen jenseits des Terminationssignals der Transkription endet und wenn stromabwärts vom Terminationssignal der Transkription ein weiterer Promotor existiert, müssen die Struktursequenzen des TK-Gens des HSV modifiziert werden, so daß das TK-Gen nicht von diesem Promotor exprimiert werden kann.
Um das fremde Gen in das Virus hinein zu rekombinieren, ist es nötig, homologe flankierende Sequenzen, durch welche das Gen an der gewünschten Stelle rekombiniert, und ein System zur Selektion der gewünschten Rekombinante zu haben. In diesem Fall bestehen die flankierenden Sequenzen aus Teilen der Domäne des viralen TK-Gens und, da die Selektion auf ein inaktives TK-Gen durchgeführt wird, kann jedes Nukleotidanaloge (z.B. ein Wirkstoff), das ausschließlich oder hauptsächlich vom TK-Gen phosphoryliert wird, zur Selektion des rekombinanten TK&supmin;-Virus verwendet werden.
Im Fall des HSV ist das TK-Gen eine sehr wünschenswerte Stelle zur Insertion eines fremden Gens, weil es die Selektion von Rekombinanten möglich macht, die sehr selten vorkommen. Außerdem kann die Position des TK-Gens innerhalb des HSV-Genoms vor der Insertion des fremden Gens ( durch bekannte Verfahren) verändert werden.
Es ist jedoch nicht nötig, daß die Insertion des fremden Gens im TK-Gen erfolgt. Die Insertion kann an jeder verfügbaren nicht-letalen Stelle erfolgen und durch die Verwendung eines anderen selektierbaren Markers im HSV-Genom selektiert werden.
HSV-Gene bilden drei Hauptgruppen, die als α, β und γ bezeichnet werden, deren Expression in koordinierter Weise reguliert wird und sequenziell in der Art einer Kaskade geordnet ist. Es ist bekannt, daß für die meisten α- und einige β-Gene die Promotor- und regulatorischen Domänen stromaufwärts von der Initiationsstelle der Transkription liegen. Speziell werden chimäre Gene, die durch Fusion von regulatorischen Promotordomänen eines α-Gens (zum Beispiel das Gen, welches die Proteine der infizierten Zelle (ICP) Nr. 0, 4, 27 oder 22 bestimmt) mit den 5'-transkribierten, nicht-kodierenden oder kodierenden Sequenzen anderer Gene konstruiert wurden, wie α- bzw. β-Gene reguliert.
Deshalb wird erfindungsgemäß ein DNA-Konstrukt hergestellt, worin ein fremdes Gen, welches seine vollständige Struktursequenz enthält, die an einem Ende von einer regulatorischen Promotorregion eines viralen Gens und am anderen Ende von einem geeigneten Terminationssignal der Transkription flankiert wird, dauerhaft in ein HSV-Genom integriert wird.
Ein solches Konstrukt wird die Fähigkeit haben, das fremde Gen in dem viralen Genom weiterbestehen zu lassen, und das fremde Gen in Zellen, die mit dem das rekombinierte virale Genom tragenden Virus infiziert sind, zu exprimieren.

Beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung

Gentechnologische Herstellung von HSV-1 Vektoren, die α- und β-regulierte HBsAg tragen.

In beispielhaften Ausführungsformen der Erfindung werden die Struktursequenz und 25 Basenpaare des 5'-transkribierten, nicht-kodierenden Bereichs des HBsAg-spezifizierenden Gens unter die Kontrolle des α-Promotors von ICP4 oder des β-Promotors der viralen Thymidin-Kinase(TK)-Gene eines HSV-1-Genoms gestellt durch die Fusion der 5'-transkribierten nichtkodierenden Region und kodierenden Region des HBsAg-Gens mit den jeweiligen regulatorischen Promotorregionen der HSV-1-Gene. Die chimären Konstrukte werden dann in die 5'-transkribierte nichtkodierende Region des TK-Gens durch homologe Rekombination durch flankierende Sequenzen eingebaut. Mit Rekombinanten, welche die chimären Gene tragen, infizierte Zellen produzieren und scheiden HBsAg in das extrazelluläre Medium mindestens 12 Stunden lang aus.
Die zeitlichen Muster der Expression und die Beobachtung, daß mit der regulatorischen α-Promotorregion verknüpftes HBsAg als α-Gen reguliert wurde, deuten darauf hin, daß in das Virus eingebaute HBsAg-Gen-Chimären als virale Gene reguliert werden.
Die Nukleotidsequenz des TK-Gens von HSV-1 ist veröffentlicht worden. Siehe Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 78, Seiten 1441-1445 (1981) und McKnight, Nucleic Acids Res., Band 8, Seiten 5949-5964 (1980). Die einzige Bgl II-Stelle innerhalb der Domäne des TK-Gens liegt innerhalb des 5'-transkribierten aber nicht translatierten Bereichs des TK-Gens. Eine Deletion an dieser Stelle beeinträchtigt die Promotorfunktion des stromaufwärts gelegenen Bereichs nicht.
Geeignete Verfahren, die zum Einbauen eines fremden Gens in ein HSV-1-Genom und zur Deletion eines Teils des HSV-1 TK-Gens brauchbar sind, werden gemäß der Erfindung von Mocarski et al. Cell, Band 22, Seiten 243-255 (1980); Post et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 77, Nr.7, Seiten 4201-4205 (1980); Post et al., Cell, Band 24, Seiten 555-565 (1981); und Post et al., Cell, Band 25, Seiten 227-232 (1981), wie auch in der Europäischen Patent Veröffentlichung Nr. 74,808 (23. März 1983) beschrieben. Die Offenbarungen der vorgenannten Veröffentlichungen werden hiermit per Bezugnahme eingebaut.
Sowohl das βTK- als auch das αICP4-regulierte HBsAg werden spezifisch in die Bgl II Stelle des TK-Gens eingebaut, wobei sie die 5'-transkribierte nichtkodierende Region dieses Gens unterbrechen. Die chimären Fragmente werden dann mit intakter HSV-DNA cotransfiziert und TK&supmin;-Rekombinante, welche das HBsAg-Gen tragen, die durch homologe Rekombination durch flankierende Sequenzen produziert wurden, werden durch Ausplattieren auf tk&supmin;-Zellen in Gegenwart von BuDR, welches die TK&spplus; viralen Nachkommen inaktiviert, selektiert.
Weil das DNA-Fragment, welches das HBsAg-Gen trägt, offenbar am 3'-Ende zu dem Gen einen Promotor enthält, der den TK-Promotor ersetzt und den TK&spplus;-Phänotyp aufrechterhält, ist es nötig, das TK-Gen in dem chimären Konstrukt durch eine kleine Deletion an der Sac I Stelle innerhalb der kodierenden Sequenzen dieses Gens zu inaktivieren.
Dieses Verfahren ermöglicht die Konstruktion von HSV, das β-Promotor-reguliertes HBsAg enthält, und wird im folgenden genauer beschrieben.
Ferner wurde, um die Expression von α-regulierten HBsAg- von der von β-regulierten HBsAg-rekombinanten Viren zu unterscheiden, eine Konstruktion gemacht, die die Verknüpfung der regulatorischen Promotorregion des α4-Gens von HSV-1 mit einem das HBsAg-Gen enthaltenden DNA-Fragment einbezog. Das chimäre Gen wurde in die Bgl II Stelle des TK-Gens kloniert, und mit intakter viraler DNA durch Cotransfektion rekombiniert, um ein rekombinantes Virus zu erzeugen. Die Einzelheiten und Ergebnisse werden im folgenden genau erläutert.
Mit Bezug auf die Figuren 1-5, werden die Konstruktion von zwei rekombinanten Herpes-Simplex-Viren, welche eine eingebaute kodierende Sequenz für Hepatitis-B-Oberfächenantigen (HBsAg) enthalten, und die Expression dieses Proteins von dem Virus detailliert beschrieben.

Konstruktion und Expression einer HSV-1-Rekombinante, die ein chimäres β-TK-Promotor-reguliertes HBsAg enthält

Das Plasmid pRB 3222 wurde aus dem Plasmid pRB 103 (ATCC Hinterlegungsnummer 39718), welches das Bam HI Q-Fragment des HSV-1 Stammes F [HSV-1(F)] (ATCC Hinterlegungsnummer VR733) trägt, durch Bal 31 Exonuklease-Verdauung zum Entfernen von annähernd 200 Basenpaaren an der einzigen Sac I Stelle, um das TK-Gen zu inaktivieren, erhalten. In dieser Konstruktion ist das Initiationscodon für HBsAg 25 Basenpaare stromabwärts von der Xho I Stelle und nahe bei dem Promotorbereich des TK-Gens gelegen. Deshalb war das β-regulierte Gen ungefähr 80 Basenpaare stromabwärts von der von dem β TK-Gen abgeleiteten Transkriptions-Initiations-Stelle, wogegen das Initiationscodon für HBsAg im α-regulierten Gen (unten) etwa 60 Basenpaare von dem vom αICP4-Gen abgeleiteten Initiationscodon der Transkription entfernt war.
Die DNA des Plasmids pCP 10 (ATCC Hinterlegungsnummer 39717) wurde mit Xho I und Bgl II geschnitten und der sich daraus ergebende Verdau einer Elektrophorese in 5% Polyacrylamid-Gel unterworfen. Das Xho I - Bgl II -Fragment (annähernd 1.7 kb, welches die kodierende Sequenz für HBsAg enthielt) wurde dann vom Polyacrylamidgel gereinigt, und die Enden der DNA-Fragmente wurden mit T4 DNA-Polymerase gefüllt, an Bgl II Linker ligiert, mit Bgl II geschnitten, um kohäsive Enden zu erzeugen, und in die Bgl II Stelle von pRB 3222 kloniert.
Das sich daraus ergebende Plasmid, welches das HBsAg-Gen in der korrekten Transkriptionsorientierung relativ zu der regulatorischen TK-Promotorregion enthält (bestimmt durch ein Bam HI DNA Restriktionsmuster), wird im folgenden als pRB 3223 (ATCC Hinterlegungsnummer 39716) bezeichnet.
Das rekombinante Plasmid pRB 3223 wurde mit Pvu II linearisiert, und 0,1-0,5 µg des Plasmids wurde dann mit 0,5 ug HSV-1 (F) DNA in Kaninchenhautzellen cotransfiziert, und Plaquereinigungsschritte der sich daraus ergebenden rekombinanten Viren wurden ausgeführt, wie von Ruyechan et al., J. Virol, Band 29, Seiten 677-697 (1979) beschrieben. Die sich daraus ergebenden TK&supmin; rekombinanten Viren wurden dann auf der 143 tk&supmin;-Zellinie in Gegenwart eines Mediums, das die Thymin-freie Mischung 199 enthielt, aber mit 3% Kälberserum und 40µg/ml BuDR (Bromuracil-Desoxyribosid) ergänzt war, selektiert.
Wie vorhergesagt enthielten die daraus hervorgehenden TK&supmin;-Nachkommen eine Rekombinante, die nur die Deletion in der Sac I Stelle rekombinierte (als R3222 bezeichnet), und eine andere, die sowohl die Deletion als auch die HBsAg-Gen-Insertion rekombinierte. Diese letztere Rekombinante wird als R3223 (ATCC Hinterlegungsnummer VR2086) bezeichnet.
Das rekombinante Virus R3223 wurde von R3222 durch Verdau der rekombinanten viralen DNA's mit Eco RI Restriktionsendonuklease unterschieden. Die jeweilige DNA-Organisation dieser Viren wurde zudem durch Southern-Blot-Analyse bestätigt.
Tabelle 1, unten, und Fig. 2 zeigen die Expression und Ausscheidung von HBsAg durch das rekombinante Virus R3223. Verozellen in 25 cm³ Kolben wurden R3223 (2 Plaque-bildende Einheiten (pfu) / Zelle) eine Stunde lang ausgesetzt und dann bei 37ºC in einem Medium inkubiert, welches aus mit 1% Kälberserum ergänztem Erhaltungsmedium 199 bestand. Zu den in Tabelle 1 angezeigten Zeiten wurden 5 ml des Erhaltungsmediums aus einem Kolben entfernt, die Zellen dreimal mit je 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (0,15 M NaCl, 8,2 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4; und 2,5 mM KCl) gewaschen, in 1 ml PBS geerntet, dreimal tiefgefroren und wieder aufgetaut und in einer Eppendorf Mikrozentrifuge zentrifugiert.
Die das Zell-Lysat enthaltende überstehende Flüssigkeit wurde dann mit PBS auf 5 ml aufgefüllt. Portionen von 200 µl Medium und infizierten Zellen wurden dann auf die Anwesenheit von HBsAg mit dem Abbott Laboratories ELISA Diagnosesystem, das unter dem Warenzeichen AUSZYME 11 erhältlich ist, nach dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren wie folgt untersucht:
Extrazelluläres Medium und Lysate von mit rekombinanten und Ausgangsviren [HSV-1(F)] infizierten Zellen wurden mit Kügelchen gemischt, die mit Meerschweinchen-Antikörpern gegen HBsAg beschichtet waren. Nach der Inkubation wurden die Kügelchen mit Peroxidase-konjugierten Antikörpern gegen HBsAg zur Reaktion gebracht. Die Anwesenheit von HBsAg wurde spektralphotometrisch bei 492 nm gemessen.
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich wurde HBsAg bereits vier Stunden nach der Infektion im Lysat infizierter Zellen, aber nicht im Medium nachgewiesen. Acht Stunden nach der Infektion wurde HBsAg sowohl in Lysaten infizierter Zellen als auch im extrazellulären Medium nachgewiesen. Zwölf Stunden nach der Infektion wurde die HBsAg-Masse aus dem extrazellulären Medium isoliert. Die Mengen an HBsAg in infizierten Zellen waren jedoch etwa die gleichen wie die zu früheren Zeitpunkten nach der Infektion nachgewiesenen.
Die HBsAg-Mengen die sich in den infizierten Zellen ansammeln erreichten Spitzenwerte, die annähernd 15 mal höher waren als die Hintergrundwerte, die mit Medium und Lysaten von mit HSV-1(F) infizierten Zellen erhalten wurden, 8 Stunden oder eher nach der Infektion und stiegen danach nicht mehr signifikant an. Die HBsAg-Mengen, die im extrazellulären Medium nachgewiesen wurden, stiegen mit der Zeit an, was darauf hinweist, daß HBsAg ausgeschieden und außerhalb der infizierten Zelle angereichert wurde. Das Anreicherungsverhalten von α- und β-reguliertem HBsAg war ähnlich und in Übereinstimmung mit der Beobachtung, daß die Kinetik der Anreicherung von α- und β-regulierten TK-Genen, die von Viren exprimiert werden, welche diese Gene tragen, ebenfalls ähnlich war.
HBsAg wurde nicht in mit dem Wildtyp-Virus [HSV-1(F)) infizierten Zellen oder extrazellulärem Medium nachgewiesen. Daß HBsAg ausgeschieden wird, wurde auch an Zellen beobachtet, die mit einem das HBsAg-Gen tragenden Vaccinia-Virus infiziert waren. Tabelle 1 Expression von α- und β-reguliertem HBsAg in mit rekombinanten und ursprünglichen Viren infizierten Zellen. Stunden nach der Infektion Medium Zell-Lysat * Einheiten der optischen Dichte
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer Studie zur Charakterisierung von ausgeschiedenem HBsAg, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde. Vero-Zellen wurden mit 2 pfu/Zelle R3223 infiziert. 12 Stunden nach der Infektion wurden 9 ml des Erhaltungsmediums geerntet und bei 36000 Umdrehungen/min 20 Stunden bei 4ºC in einem Beckman SW41 Rotor zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde in 0,5 ml des gleichen Mediums suspendiert und 200 µl wurden auf einen 1,1 - 1,5 g/ml isopyknischen CsCl-Dichtegradienten überschichtet und bei 36000 Umdrehungen/min 36 Stunden bei 25ºC in einem Beckman SW 41 Rotor zentrifugiert. 0,5ml-Fraktionen wurden am Boden des Zentrifugenröhrchens abgenommen und mit PBS im Verhältnis 1 :10 verdünnt. Die Fraktionen wurden, wie vorstehend mit Bezug auf Tabelle 1 beschrieben, auf die Anwesenheit von HBsAg untersucht.
Wie aus Fig. 2 ersichtlich lag die HBsAg-Bande bei einer Dichte von 1,17 g/ml. Es ist bekannt, daß HBsAg in Serum kugelförmige Partikel mit Durchmessern zwischen 18 und (25 nm bildet (Dane et al., Lancet, Band 1, Seite 695, 1970). Wie aus Fig. 3 ersichtlich wurden Partikel von ähnlicher Dimension (d.h. 18 - 25 nm) wie Dane 's Partikel durch elektronenmikroskopische Untersuchung der Spitzenwertfraktion die mit 2% Phosphorwolframsäure negativ gefärbt wurde) nachgewiesen, wodurch die Eigenschaft des ausgeschiedenen HBsAg bestätigt wurde.
Die vorhergehende Beschreibung erläutert die Herstellung eines rekombinanten viralen HSV-1 Plasmids, welches die kodierende Sequenz für HBsAg trägt, und den wirkungsvollen Gebrauch des Plasmids als Vektor zum Exprimieren dieses Proteins. In der Konstruktion der Figuren 1-3 wurde das HBsAg-Fragment unter die Kontrolle eines β-Promotor-Bereichs des Virus gestellt.

Konstruktion und Expression einer HSV-1-Rekombinante, die ein αICP4-HBsAg-Cen enthält

Im folgenden wird die Konstruktion eines rekombinanten HSV-1-Plasmids und eines rekombinanten Virus, das die Sequenz und das Gen, welche für HBsAg kodieren, unter der Kontrolle eines α-Promotors trägt, beschrieben.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion eines rekombinanten Herpes-Simplex-Virus , das chimäre αICP4-HBsAg-Gene enthält. Zur Konstruktion gehörte das Ligieren der regulatorischen Promotorregion des α4-Gens von HSV-1 an das DNA-Fragment, welches das vorstehend beschriebene HBsAg-Gen enthält. Das Bam HI Q-Fragment, welches das HSV-1(F) TK-Gen von pRB 103 enthält, wurde in die Xho I Stelle des Plasmids pRB 14 eingebaut, welches aus pBR 322 (ATCC Hinterlegungsnummer 31344) durch Ersetzung des Eco RI-Pvu II-Fragments durch Xho I Linker, der von New England Biolabs, Cambridge, Massachusetts USA erhalten wurde, konstruiert wurde.
Das daraus hervorgehende rekombinierte Plasmid wird hier als pRB 3148 bezeichnet. Das Plasmid pRB 3159 wurde dann dadurch konstruiert, daß das Hind III-Hae III-Fragment (welches den Polylinker enthält) aus pUC 13 in die einzige Bgl II Stelle des HSV-1 (F) Bam HI Q so kloniert wurde, daß die Bam HI Stelle der Struktursequenz des TK-Gens am nächsten gelegen war, wogegen die Sal I Stelle der Initiationsstelle der Transkription dieses Gens am nächsten gelegen war. Plasmid pUC 13 wurde als geeignete Quelle für das den Polylinker enthaltende Fragment ausgewählt, aber andere geeignete Polylinker sind kommerziell verfügbar.
Das Plasmid pRB 3166 wurde aus pRB 3159 durch Verdauung mit Sac I und Religierung zum Entfernen des Sac I-Fragments, welches das Bgl II-Sac I-Fragment von Bam HI Q enthält, konstruiert.
Im letzten Schritt wurden zwei Fragmente in pRB 3166 kloniert, um das Plasmid pRB 3225 zu ergeben. Zuerst wurde das Bam HI-Pvu II-Fragment von pRB 403 (ATCC Hinterlegungsnummer 39719), welches die regulatorische Promotor-Domäne des αICP4-Gens enthält, in die Sal I Stelle der Polylinkersequenz kloniert, so daß die Initiationsstelle der Transkription von αICP4 in dem Bam HI-Pvu II-Fragment nahe der Xba I Stelle lag.
Zuletzt wurde das Bgl II-Fragment, welches das HBsAg-Gen von pRB 3223 enthält, in die Xba I Stelle kloniert, so daß der αICP4-Promotor und die Struktursequenzen des HBsAg-Gens in der gleichen Transkriptionsorientierung waren, was durch Eco RI DNA-Restriktionsendonuklease-Muster bestimmt wurde. So wurde durch das vorhergehende Verfahren das chimäre Gen Pα&sub4;-HBsAg in die Bgl II Stelle des TK-Gens kloniert.
Das daraus hervorgehende rekombinante Plasmid pRB 3225 (ATCC Hinterlegungsnummer 39715) wurde, wie vorstehend mit Bezug auf Fig. 1 beschrieben, mit intakter HSV-1 (F) DNA in 143 tk&supmin;-Zellen cotransfiziert, und das daraus hervorgehende rekombinante Virus R3225 (ATCC Hinterlegungsnummer VR2087), welches ein Pα&sub4;-HBsAg-Fragment im TK-Gen enthält, wurde aus den TK&supmin;-Nachkommen in 143 tk&supmin;-Zellen selektiert und auf HBsAg-Expression getestet, wie im weiteren dargelegt wird. Der Transfektions- und Selektionsschritt wird in Fig. 5 schematisch dargestellt.
Um die Expression von α-reguliertem HBsAg (R3225) von der von β-reguliertem HBsAg (R3223) rekombinanten Viren zu unterscheiden, wurde die Beobachtung, daß α-Gene in Abwesenheit von nach der Infektion stattfindender de-novo-Proteinsynthese transkribiert werden, wogegen β-Gene die Anwesenheit funktionsfähiger α-Gene zu ihrer Expression benötigen, gemäß dem folgenden Verfahren benützt.
Replizierende Hep-2-Zellkulturen in 25 cm²-Kolben wurden 1 Stunde in Erhaltungsmedium vorinkubiert, welches 50 µg/ml Cycloheximid (+cyclo) enthielt, und dann jeweils mit 20pfu pro Zelle Wildtyp [HSV-1(F)], R3222, R3223 oder R3225 Viren infiziert. Fünf Stunden nach der Infektion wurde das Cycloheximid enthaltende Medium entfernt und die Zellen wurden ausgiebig gewaschen und dann in Actinomycin D enthaltendem Medium (10 µg/ml) inkubiert. Die Zellen und das Medium wurden nach 90 min weiterer Inkubation geerntet. Das Medium und Zell-Lysat wurden auf HBsAg mit dem AUSZYME II Diagnosesystem (Abbott Laboratories) untersucht. Die Kontrollexperimente (-cyclo) beinhalteten das gleiche Waschverfahren außer, daß keine Wirkstoffe zugesetzt wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Regulation von durch rekombinierte Viren exprimiertem HBsAg Bedingungen der Infektion getestetes Material -Cycloheximid Medium Zell-Lysat * Einheiten der optischen Dichte
Wie oben in Tabelle 2 gezeigt, wurde HBsAg von mit R3225 aber nicht mit R3223 infizierten Zellen nach dem Entfernen von hemmenden Konzentrationen von Cycloheximid, welches während der Infektion und bis fünf Stunden danach im Medium vorhanden war, produziert.
Eine Eigenschaft von HSV-1 α-Genen ist, daß sie die einzigen viralen Gene sind, die in Zellen transkribiert werden, welche während und nach der Infektion Proteinsynthesehemmern ausgesetzt sind. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde nur das HBsAg-Gen, welches in R3225 enthalten ist, in Zellen exprimiert, die in Anwesenheit von Cycloheximid infiziert und gehalten und dann von der hemmenden Wirkung von Cycloheximid befreit wurden, in Anwesenheit von Actinomycin D, um die Transkription der β-Gene, welche von der Synthese des α-ICP4-Genprodukts abhängt, auszuschließen.

Diskussion der Ergebnisse

Bisher wurde gezeigt, daß das HSV-Genom als Expressionsvektor für fremde Gene, und insbesondere für HBsAg, auftreten kann.
Obwohl HSV den makromolekularen Wirtsstoffwechsel und besonders die Wirtsproteinsynthese abschaltet, beeinträchtigt es nicht die Expression fremder Gene (wie am Beispiel des HBsAg dargestellt), welche in das virale Genom eingebaut und von regulatorischen HSV-Promotorregionen reguliert werden. Die Antigeneigenschaft des Genprodukts, seine Schwebedichte in CsCl-Dichtegradienten und die charakteristische 18-25 nm betragende Partikelgröße, die in den Banden der aufgetrennten Präparationen vorhanden ist, zeigen, daß das Produkt des von HSV getragenen HBsAg-Gens ein authentisches Produkt dieses Gens ist. Die Beobachtung, daß HBsAg aus der infizierten Zelle ausgeschieden wird, legt es nahe, daß das Antigen in der richtigen Weise zur Ausschleusung aus Zellen weiterverarbeitet wird.
Die hier präsentierten Ergebnisse weisen darauf hin, daß sowohl die αICP4- als auch die β-TK-verknüpften HBsAg-Gene das Antigen mindestens 12 Stunden lang exprimierten. Das Syntheseverhalten von HBsAg und die Beobachtung, daß ICP4 verknüpftes wie ein α-Gen reguliert wurde, deuten darauf hin, daß die chimären HBsAg-Gene in dem HSV-1-Vektor als virale Gene reguliert wurden. Die Produktion von HBsAg kann durch den Einbau des Gens unter einer regulatorischen α-Promotorregion in das Genom von ts-Mutanten im ICP4-Gen besonders gesteigert werden, insofern als gezeigt worden ist, daß diese Mutanten α-Gene in Zellen, die bei der nicht-permissiven Temperatur infiziert und gehalten werden, kontiniuierlich exprimieren.
Die Verwendung des HSV-Genoms als Vektor für fremde Gene ist besonders nützlich zur Biosynthese in menschlichen Zellen und Charakterisierung der Produkte von (a) Genen von Viren, deren Wachstum in Zellkultur eingeschränkt ist (z.B. das Hepatitis-B-Virus), (b) Genen von infektiösen Erregern, welche für Menschen besonders gefährlich sind, und (c) zellulären Genen, die in sehr geringem Ausmaß oder gar nicht in kultivierten Zellen exprimiert werden. HSV-1-Expressionsvektoren könnten auch zur Analyse der Genregulation, besonders auf der Ebene der Translation, nützlich sein.
Ein besonderer Vorteil von HSV-Vektoren hängt mit der Tatsache zusammen, daß diese Viren ein sehr breites Wirtsspektrum haben. Die Infektion vieler verschiedener Zelltypen auf einheitliche Weise wird dadurch möglich gemacht. Deshalb können fremde, in einen HSV-1-Vektor eingebaute Gene leicht in Kultur weitervermehrt werden und werden als Teil des viralen Genoms in Viruspartikel verpackt. Der Vektor kann dann verwendet werden, um gleichzeitig Zellkulturen in großem Maßstab zu infizieren, um die fortgesetzte Expression des fremden Gens in allen infizierten Zellen zu erreichen. Dieses Verfahren besitzt einen erheblichen Vorteil gegenüber anderen Verfahren, die sich auf die Transfektion von Zellen mit DNA und die Selektion einer kleinen Minderheit von Zellen, welche das fremde Gen exprimieren, stützen. Dieses Verfahren ist anwendbar auf menschliche diploide Zellstämme, die zur Produktion menschlicher Impfstoffe zugelassen sind (z.B. MRC-5 oder W138), welche nicht durch DNA-Fragmente zur Expression fremder Gene transformiert werden können.
In der hier angegebenen beispielhaften Veranschaulichung wurde das HBsAg in Wildtypgenome eingebaut, die an der Insertionsstelle des HBsAg-Gens modifiziert sind. Obwohl bis zu 7 Kbp DNA bereits eingebaut worden sind (Knipe et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Band 75, Seiten 3896-3900, 1978), könnte die Fähigkeit der Wildtyp-HSV-DNA, zusätzliche Genprodukte zu tragen, begrenzt sein.
Die Konstruktion der HSV-1(F)I358-Mutante, bei der annahernd 14 Kbp DNA, welche in den internen wiederholten Sequenzen enthalten waren, durch eine 2 Kbp Insertion ersetzt worden sind, war bereits bekanntgegeben worden (Poffenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Band 80, Seiten 2690-2694, 1983). Durch die Entfernung der Insertion und die Ausdehnung des Genoms auf sein bekanntes maximales Fassungsvermögen könnte die I358-Mutante bis zu 23 Kbp fremder DNA tragen. HSV-1(F)I358 hat deshalb die Fähigkeit, als Vektor mehrerer Gene zu dienen, die Antigene zur Immunoprophylaxe von einer Vielzahl menschlicher infektiöser Erreger spezifizieren.
Die DNA des Herpes-Simplex-Virus Typ 2 (HSV-2) hat im wesentlichen die gleiche Struktur wie die von HSV-1 und unterscheidet sich nur in der Nukleotidpaarung von Basenpaaren. Deshalb sind erfindungsgemäß DNA-Konstrukte möglich, die mit den hier unter Verwendung des HSV-1-Genoms beschriebenen identisch sind.
Herpes-Simplex-Virus 1 ist öffentlich leicht zugänglich. Es ist zum Beispiel bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, unter der ATCC Hinterlegungsnummer VR733 hinterlegt. Ebenso ist das Plasmid pBR322 öffentlich leicht zugänglich; es ist ebenfalls bei der ATCC unter der ATCC Accession Nummer 31344 hinterlegt. Die ATCC ist ersucht worden, diese Kulturen, neben anderen, in Übereinstimmung mit den Anforderungen der Ausführungsbestimmungen des Europäischen Patentabkommens aufrechtzuerhalten, ebenso wie die übrigen in dieser Schrift durch ATCC Hinterlegungsnummern identifizierten Kulturen, welche hinterlegt worden sind.
Die übrigen Materialien, welche in dieser Schrift identifiziert worden sind, sind öffentlich zugänglich. Die Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase, Polynukleotid-Kinase, T4-DNA-Polymerase, Exonuklease Bal 31 und Restriktionsenzymlinker wurden zum Beispiel von New England Biolabs, Cambridge, Massachusetts USA gekauft und nach den Angaben der Hersteller verwendet. DNA-Proben zum Durchsuchen der E. coli -Kolonien nach gewünschten rekombinanten Plasmiden wurden durch Nick-Translation mit [γ-P³²]-ATP markiert, welches von New England Nuclear, Cambridge, Massachusetts USA bezogen wurde.
Der F - Stamm von HSV-1 [HSV-1(F)] und alle hier davon abgeleiteten Rekombinanten wurden auf Vero oder HEp-2 Zellinien kultiviert und eingestellt, die von der American Type Culture Collection bezogen wurden. Die zur Transfektion mit viraler DNA verwendeten Kaninchenhautzellen und ebenso die menschliche tk&supmin; -Zellinie, die zur Selektion der TK&supmin;-Rekombinanten verwendet wurde, sind öffentlich zugänglich.
Die vorstehende detaillierte Beschreibung wird nur zum besseren Verständnis gegeben und es sollten daraus keine unnötigen Beschränkungen abgeleitet werden, da Abwandlungen im Rahmen der Erfindung für Fachleute offensichtlich sind.

Claims

1. Ein rekombinantes virales Genom eines Herpes-Simplex-Virus (HSV) , welches ein an einer spezifischen nicht-letalen Stelle dieses Genoms dauerhaft integriertes rekombinantes Konstrukt enthält, gekennzeichnet dadurch, daß dieses Konstrukt das gesamte oder einen Teil eines nicht-HSV-Gens umfaßt, welches exprimiert werden kann, wobei dieses nicht-HSV-Gen eine vollständige strukturkodierende Sequenz enthält, welche an den jeweiligen Enden von einer regulatorischen Promotorregion eines Gens des Herpes-Simplex-Virus und von einem geeigneten Terminationssignal der Transkription flankiert wird.

2. Ein rekombinantes virales Genom nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Herpes-Simplex-Virus HSV-1 ist.

3. Ein rekombinantes virales Genom nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertion des nicht-HSV-Gens an der spezifischen nicht-letalen Stelle durch die Verwendung eines selektierbaren Markers in dem Genom selektiert wird, vorzugsweise durch die Verwendung eines Thymidin-Kinase(TK) -Gens des Genoms.

4. Ein rekombinantes virales Genom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Promotorregion einen Alpha-Promotor, vorzugsweise von einem Protein einer infizierten Zelle, umfaßt.

5. Ein rekombinantes virales Genom nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Promotorregion einen Alpha-Promotor des Proteins Nummer 4 der infizierten Zelle umfaßt.

6. Ein rekombinantes virales Genom nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Promotorregion einen Beta-Promotor, vorzugsweise einen Beta-Promotor des Thymidin-Kinase-Gens, umfaßt.

7. Ein rekombinantes virales Genom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-HSV-Gen die strukturkodierende Sequenz für das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) umfaßt.

8. Ein rekombinantes virales Genom nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Herpes-Simplex-Virus HSV-2 ist.

9. Ein Plasmidvektor, der ein rekombinantes virales Genom nach einem der vorhergehenden Ansprüche enthält.

10. Ein Plasmidvektor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor das Plasmid pRB 3223 (ATCC Hinterlegungsnummer 39716) umfaßt.

11. Ein Plasmidvektor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor das Plasmid pRB 3225 (ATCC Hinterlegungsnummer 39715) umfaßt.

12. Ein rekombinantes Virus, das ein Produkt der Cotransfektion des Plasmidvektors nach Anspruch 9 mit intakter Herpes-Simplex-Virus-DNA in einen geeigneten Wirt und des Absuchens der daraus hervorgehenden Nachkommen nach solchen Nachkommen, welche das nicht-HSV-Gen enthalten, umfaßt.

13. Ein rekombinantes Virus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es das rekombinante Virus R3223 (ATCC Hinterlegungsnummer VR2086) umfaßt.

14. Ein rekombinantes Virus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es das rekombinante Virus R3225 (ATCC Hinterlegungsnummer VR2087) umfaßt.

15. Ein rekombinantes Virus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertion des nicht-HSV-Gens an der spezifischen nicht-letalen Stelle durch die Verwendung eines selektierbaren Markers in diesem Genom selektiert wird, und die Nachkommen abgesucht werden durch Selektion auf die Anwesenheit oder Abwesenheit dieses Markers.

16. Ein Verfahren zum Erhalten eines gewünschten Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte umfaßt:

(a) Herstellen eines Plasmidvektors nach einem der Ansprüche 9 bis 11, und worin das nicht-HSV-Gen für die Expression des Proteins kodiert;

(b) Cotransfizieren des Plasmidvektors mit intakter Herpes-Simplex-Virus-DNA, um virale Nachkommen zu erzeugen;

(c) Absuchen und Isolieren von Nachkommen, die das nicht-HSV-Gen enthalten, um ein rekombinantes Virus zu erhalten; und

(d) Infizieren eines geeigneten Wirtes mit dem rekombinanten Virus und Kultivieren dieser infizierten Zellen, wobei das Protein produziert wird.

17. Ein Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es die weiteren Schritte des Isolierens und des Reinigens des Proteins umfaßt.

18. Ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten viralen Genoms eines Herpes-Simplex-Virus (HSV), dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellen eines viralen Genoms des Herpes-Simplex-Virus;

(b) dauerhaftes Integrieren eines rekombinanten Konstruktes, welches das gesamte oder einen Teil eines nicht-HSV-Gens, welches exprimiert werden kann, umfaßt, an einer spezifischen nicht-letalen Stelle des Genoms, wobei das nicht-HSV-Gen, wenn es in das Genom integriert ist, eine vollständige strukturkodierende Sequenz enthält, die an ihren jeweiligen Enden von einer regulatorischen Promotorregion eines Gens des Herpes-Simplex-Virus und einem geeigneten Terminationssignal der Transkription flankiert wird.

19. Ein Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Herpes-Simplex-Virus HSV-1 ist.

20. Ein Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertion des nicht-HSV-Gens an der nicht-letalen Stelle durch die Verwendung eines selektierbaren Markers, vorzugsweise des Thymidin-Kinase(TK)-Gens des Genoms, selektiert wird.

21. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Promotorregion einen Alpha-Promotor umfaßt, vorzugsweise von einem Protein einer infizierten Zelle, wie dem Protein Nummer 4 der infizierten Zelle.

22. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Promotorregion einen Beta-Promotor umfaßt, vorzugsweise einen Beta-Promotor des Thymidin-Kinase-Gens.

23. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-HSV-Gen die strukturkodierende Sequenz für das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) umfaßt.

24. Ein Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Herpes-Simplex-Virus HSV-2 ist.

25. Ein Verfahren zum Erhalten eines rekombinanten Virus, welches die Schritte umfaßt:

(a) Cotransfizieren eines Plasmidvektors nach einem der Ansprüche 9 bis 11 mit intakter Herpes-Simplex-Virus-DNA in einen geeigneten Wirt; und

(b) Absuchen der daraus hervorgehenden Nachkommen nach einem rekombinanten Virus, welches das nicht-HSV-Gen enthält.