DE3486030T2

DE3486030T2 - Monoklonale antikoerper, spezifisch von in vivo von fibrinogen abgeleiteten derivatstuecken.

Info

Publication number: DE3486030T2
Application number: DE8484113593T
Authority: DE
Inventors: Bohdan J Kudryk; Michael E Wiebe
Original assignee: New York Blood Center Inc
Current assignee: New York Blood Center Inc
Priority date: 1983-11-14
Filing date: 1984-11-10
Publication date: 1993-05-19
Anticipated expiration: 2004-11-11
Also published as: JPH0616717B2; AU3487284A; EP0151239A3; JPS60185800A; EP0151239B1; AU576788B2; EP0151239A2; CA1248472A; JPH0772200B2; JPH06237786A; US4722903A; DE3486030D1

Description

GRUNDLAGE DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, Hybridome (Hybridzellenlinien) zur Erzeugung solcher monoklonaler Antikörper, Verfahren zur Herstellung derselben, Verfahrensweisen zum Nachweis und zur Bestimmung von Peptidfragmenten und diagnostische Methoden sowie diese Antikörper verwendende Testpackungen.
Fibrinogen ist ein großes, dimeres Molekül (Mr 340 000), das aus 3 nicht-identischen Polypeptidketten zusammengesetzt ist. Beim Übergang von Fibrinogen in Fibrin kommt es zu aufeinanderfolgender Freisetzung von Fibrinpeptiden. Bei diesem zweistufigen, durch Thrombin vermittelten Vorgang ist Fibrin I das zuerst auftretende Produkt und wird nach Freisetzung von FPA [Fibrinpeptid A(Aα 1-16)] gebildet. Fibrin II mit kompakterer Struktur entsteht bei der Freisetzung von FPB [Fibrinpeptid B (Bβ 1-14)] (Blombäck et al., Nature, Lond., 257, 501-505, 1978). Zur Wiederherstellung der Gefäß-Integrität ist es nötig, daß Fibrinablagerungen - sei es aus Fibrin I oder II aufgelöst werden. Dies wird in erster Linie auf dem Weg vermittels des Plasmins erreicht (siehe Kernoff und McNicol, Br.Med.Bull., 33, 239-244, 1977 und Collen, Thromb.Haemostas., 43, 77-89, 1980). Einer der frühen Plasminabbauprodukte von Fibrinogen oder Fibrin leitet sich von dem NH&sub2;-terminalen Teil der Bβ-Kette ab. Die Bindung Bβ 42Arg-43Ala ist besonders empfindlich gegenüber Plasmin (Mosesson et al., J. Biol.Chem., 247, 5210-5219, 1972; Takagi und Doolittle, Biochemistry, 14, 940-946, 1975). Die Natur des durch Plasmin freigesetzten BβKettenpeptids hängt vom verfügbaren Substrat ab. Die Spaltung von Fibrinogen oder Fibrin I führt zu dem das Peptid Bβ 1-42 enthaltenden FPB. Letzteres kann natürlich nicht bei der Plasmin-Proteolyse von Fibrin II erzeugt werden, diese führt zur Freisetzung des Peptids Bβ 15-42.
Die Identifizierung und Quantifizierung von Thrombin- und Plasmin-Abbauprodukten von Fibrinogen und Fibrin kann als wertvolle diagnostische Testmethode dienen. In der letzten Dekade wurde eine Anzahl von Immunassaymethoden für diesen Zweck entwickelt. In den meisten dieser Tests wurden auf dem Wege konventioneller Immunisierung hergestellte Antiseren verwendet. Da solche Antiseren Antikörper von verschiedenem Titer, Affinität und Spezifität enthalten, trat eine Anzahl von Problemen auf. Z.B. lagen Antikörper gegen in bestimmten Fibrinogen- und Fibrinfragmenten gefundene spaltungsbedingte Neoantigene im allgemeinen in extrem geringem Titer vor (Plow und Edgington, J. Clin.Invest., 52, 273-282, 1973; J. Biol. Chem., 250, 3386-3392, 1975). Was eine Kreuzreaktivität betrifft, so reagieren die meisten Antiseren mit intaktem Fibrinogen und deshalb muß man bei Plasmaproben (einen) Verfahrensschritt(e) anwenden, um dieses selektiv zu entfernen. Man hat signifikante Unterschiede in der Immunreaktivität bei sowohl gegen FPA als auch gegen FBP hergestellten Antiseren beobachtet (Canfield et al., Biochemistry,, 15, 1203-1208, 1976; Wilner et al., Biochemistry, 15, 1209-1213, 1976; Bilezikian et al. J.Clin.Invest., 56, 438-445, 1975). Einige dieser Antiseren zeigen begrenzte Querreaktivität mit Peptiden, welche nur wenige Aminosäurereste länger sind als freies FPA oder FPB.
Die Entwicklung der Hybridomtechnik durch Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975 kann die Verfeinerung der meisten mit Fibrinogen- oder Fibrinabbauprodukten befaßten Immunassays ermöglichen.
Die Fusion von Mäusemyelomzellen mit Milzzellen aus immunisierten Mäusen nach Köhler und Milstein zeigte erstmalig, daß es möglich war, eine kontinuierliche Zellinie zu erhalten, welche einen monoklonalen Antikörper erzeugt. In der Folge wurde viel Mühe darauf verwendet, verschiedenartige Hybridzellen (Hybridome) zu erzeugen und den von diesen Hybridomen erzeugten Antikörper zu verwenden. Siehe z. B. F.Melchers, M. Potter, und H. Warner, Herausgeber, Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, - "Lymphocyte Hybridomas", Springer-Verlag, 1978, und die darin enthaltenen Hinweise; C.J. Barnstable, et al., Cell, 14, 9-20, Mai 1978; P. Parham und W.F. Bodmer, Nature, 276, 397-399 November 1978; D.M. Wier, Herausgeber, Handbook of Experimental Immunology, 3. Ausgabe, 2, Blackwell, 1978, Kapitel 25; sowie Chemical and Engineering News, 1. Januar 1979, 15-17. In diesen Stellen werden die Probleme angesprochen, welche beim Versuch zur Erzeugung monoklonaler Antikörper aus Hybridomen auftreten. Während die allgemeine Technik feststeht, gibt es viele Schwierigkeiten und Unterschiede in jedem einzelnen Fall.
Tatsächlich ist man vor dem Versuch zur Herstellung eines gegebenen Hybridoms in keiner Weise sicher, daß das erwünschte Hybridom erhalten wird, daß es in diesem Fall einen Antikörper erzeugt oder daß der so erzeugte Antikörper die erwünschte Spezifität aufweist. Das Ausmaß an Erfolg wird in erster Linie vom verwendeten Antigentyp und von der für die Isolierung des erwünschten Hybridoms angewandten Selektionstechnik beeinflußt.
Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß die Spaltung von Fibrinogen mit CNBr in vitro zur Freisetzung eines größeren NH&sub2;-terminalen Fragments führt, zum sog. N-DSK (Blombäck et al., Nature, 218, 130-134, 1968). Der N-DSK- Anteil von Fibrinogen enthält Bindungs- oder Polymerisationsbereiche, welche als Folge einer Enzymaktivierung offenliegen und welche beim Übergang von Fibrinogen zu Fibrin wirksam sind. (Kudryk et al., J. Biol.Chem., 249, 3322-3325, 1974). Das Enzym Thrombin kann FPA und. FPB von Fibrinogen abspalten, die Freisetzung dieser beiden Peptide führt dann zur Bildung von Fibrin II. Im Gegensatz zu Thrombin kann das Schlangengiftenzym Batroxobin lediglich FPA aus Fibrinogen freisetzen (Laurent & Blombäck, Acta Chem. Scand., 12, 1875-1877, 1958), ein Vorgang, welcher zur Bildung eines Fibrintyps führt, welcher Fibrin I genannt wird. Da die NH&sub2;terminalen Enden von Fibrinogen und N-DSK identisch sind, können aus durch Thrombin und Batroxobin induzierten Fibringelen verschiedenartige N-DSK-Arten erhalten werden.
In der Hoffnung, Neoepitope zu identifizieren, stellten Qureshi et al. Thromb.Res., 6, 357-374, 1975 Kaninchen-Antiseren gegen Human-(T)N-DSK her. Obwohl Seren von hohem Titer erhalten wurden, konnten diese Forscher keinerlei immunchemische Unterschiede zwischen N-DSK und (T)N-DSK aufzeigen.
Im Jahr 1982 entwickelten Kudryk et al., einen Radioimmunassay, welcher zur Messung des Plasmaspiegels der die aus Fibrinogen oder Fibrin hergeleitete Bβ-15-42-Sequenz enthaltenden Peptide verwendet werden konnte. (Kudryk et al., Thromb.Res., 25, 277-291, 1982) Da diese Peptide als Folge eines Plasminaufschlusses in vivo auftreten, wurde vorgeschlagen, daß der Test in klinischen Studien zu Krankheitszuständen, in denen Thrombose drohte oder vorlag, wichtige Hinweise geben könne. Allerdings konnte man mit dem Test nicht zwischen Peptiden unterscheiden, welche Verlängerungen entweder am NH&sub2;- oder am COOH-Terminus von Bβ-15-42 enthielten, womit lediglich die gesamte Bβ-15-42-Immunreaktivität gemessen werden konnte.
Nossel et al., J. Clin. Invest., 64, 1371-1378, 1979 identifizierten Bβ 1-42 in klinischen Blutproben und vermuteten, daß dies aus der Plasminproteolyse des sog. Fibrins I herrührte. Eine zweite Type von Fibrin wird ebenso in vivo gebildet. Gemäß Definition fehlt bei Fibrin II sowohl FPA als auch FPB und deshalb kann dessen Auflösung durch Plasmin nicht zu Bβ 1-42 führen (siehe Abb. 8 hierin). Nossel (Nature, Lond., 291, 165-167, 1981) vermutete, daß Fibrin I das zentrale Substrat bei der Fibrinogen-Proteolyse in vivo darstelle und daß Fibrin II mit größerer Wahrscheinlichkeit zu occlusiver Thrombose führt (siehe Abb. 8 hierin). Da occlusive Thrombose eine Lebensgefahr für einen Patienten darstellt, muß der Beginn einer Thrombose erkannt werden. Der Abbau von Fibrinogen in vivo führt zu Produkten, welche Thrombose verursachen, je nach den vorherrschenden enzymatischen Reaktionen, die sich während der Fibrinogenproteolyse abspielen. Es bestanden Probleme insofern, als es schwierig war, auf irgend verläßliche Weise zu bestimmen, ob das von der Thrombinaktivierung von Fibrinogen herrührende Fibrin-I-Polymer wiederum durch Thrombin oder Plasmin aktiviert wird. Wenn es in erster Linie durch Plasmin aktiviert wird, entstehen Spaltprodukte, u. a. ein Fragment der Bβ-Kette von Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42. Wenn letzteres der überwiegende Reaktionsweg ist, kommt es nicht zu occlusiver Thrombose. Wenn Fibrin-I-Polymer jedoch noch weiter durch Thrombin aktiviert wird, bildet sich Fibrin II und dies ist oft von Thrombose begleitet.
Unter Betrachtung des Genannten bestand ein großer Bedarf danach, zu ermitteln, welchen biologischen Weg das Fibrin-I-Molekül einschlägt. Ein Ansatz dazu besteht darin, die Molekülnatur der Bβ-Kectenpeptide in klinischen Proben zu identifizieren. Z.B. könnte die Bestätigung des Vorwiegens von intaktem Bβ 1-42 im Blutplasma eines Patienten zusammen mit gekoppeltem negativen Anzeichen für Peptidfragmente der Bβ-Kette mit Aminosäureresten 1-14 und 15-42 einen starken Hinweis für eine Plasminproteolyse von Fibrin I darstellen. Andererseits würde der umgekehrte Befund einen Hinweis geben, daß Fibrin I weiter zu Fibrin II abgebaut wurde. Wie vorstehend erwähnt, kann der Plasminabbau von Fibrin II niemals zu Bβ1-42 führen.
Matsueda et al., Science, 222, 1129-1132, 1983 entwickelte an Humanfibrin bindende monoklonale Antikörper aus Hybridomen, welche hergestellt waren über die Fusion von Zellen einer Sp-2/O-Myelomzellinie und Milzzellen aus einer weiblichen BALB/c-Maus, welche mit einem Komplex aus einem synthetischen Heptapeptid des Aminogruppenendes der Bβ-Kette von Humanfibrin mit einem Cysteinrest am Carboxyl-Ende des Heptapeptids, mit MB-KLH (maleinimidobenzoyliertes keyhole-Nacktschnecken-Hämocyanin [keyhole limpet hemocyanin]) immunisiert worden war. Einer der monoklonalen Antikörper zeigte eine Kreuzreaktion mit Fibrin von anderen Lebewesen als dem Menschen, z. B. Kaninchen-Fibrin.
Das synthetische Peptid wurde aufgebaut mit dem Zweck, die Beta-Kette von Fibrin und nicht von Fibrinogen nachzuahmen. Durch Anbindung an einen Träger sollte das Peptid in seiner immunogenen Wirkung verstärkt werden. Die Autoren immunisierten Kaninchen, um polyklonale Antikörper zu erhalten, und nur dann kam es zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern in Mäusen.
Die Unterscheidung zwischen den bekannten Antigenen auf Basis synthetischer Peptide und den erfindungsgemäßen Antigenen natürlicher Herkunft ist sehr wichtig, weil synthetische Peptide nicht notwendigerweise dieselbe Sekundär- und Tertiärstruktur natürlicher Peptide aufweisen, auch wenn sie dieselbe Aminosäuresequenz haben.
Kennel et al., offenbaren in Thrombosis Research, Band 22, Nr.3, 1981, Seiten 309-320, monoklonale Antikörper, welche sich gegen das Fragment D von Humanfibrinogen richten und welche zwischen Fibrin und Fibrinogen unterscheiden können. Allerdings sind die monoklonalen Antikörper von denen der vorliegenden Erfindung verschieden. Der monoklonale Antikörper von Kennel et al. richtet sich gegen einen andersartigen Teil von Fibrinogen und kann das Muttermolekül nicht vom Fragment unterscheiden.

DEFINITIONEN

FPA:

Fibrinpeptid A (Aα1-16)

FPB:

Fibrinpeptid B (Bβ 1-14)

Fibrin I:

Fibrin ohne FPA, hergestellt durch Gerinnung von Fibrinogen mit Hilfe des Schlangengift-Enzyms Batroxobin.

Fibrin II:

Das vollständig gebildete Fibrin (ohne FPA und FPB) aus dem Thrombinaufschluß von Fibrinogen.

HPLC:

(high-performance liquid chromatography) Hochleistungs-Flüssigchromatographie

Hybridom ATCC HB 8418:

Mäuse-Lymphocytenhybridom mit der Kennzeichnung HB 8418 seitens der amerikanischen Kulturtypensammlung, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, im folgenden "ATCC", hinterlegt 9. November 1983 (Hinterlegungsreferenz: 1-8C6)

Hybridom ATCC HB 8426:

Mäuselymphocyten-Hybridom mit der Kennzeichnung HB 8426 seitens ATCC, hinterlegt am 16. November 1983, Hinterlegungsreferenz: T2G1s)

Monospezifischer Antikörper:

Ein Antikörper, welcher mit einem einzigen Antigen kombiniert. Ein monospezifischer Antikörper, welcher Inbezug auf eine einzelne Antigendeterminante monospezifisch ist, kombiniert lediglich mit dieser Antigendeterminante (Epitop).

Hetero-molekularer Antikörper:

Ein Antikörper, welcher multiple verschiedene Molekularformen desselben Antikörpers enthält.

Homo-molekularer Antikörper:

Ein Antikörper, welcher für eine einzige Molekularform aufweist, d. h. jedes Antikörpermolekül ist jedem anderen Antikörpermolekül gleich.

Monoklonaler Antikörper:

Ein Antikörper, herrührend von einer einzigen Zellinie, welche genetisch identisch ist und einen homo-molekularen Antikörper erzeugt.

MAb/1-8C6:

Monoklonaler Antikörper 1-8C6, die IgG-Fraktion aus verbrauchtem Massenkulturmedium des Hybridom-Klons, gekennzeichnet als ATCC HB 8418.

MAb/T2G1s:

Monoklonaler Antikörper T2G1s, die IgG-Fraktion aus verbrauchten Massenkulturmedium des Hybridom-Klons, gekennzeichnet als ATCC HB 8426.

N-DSK:

NH&sub2;z-terminaler Anteil von Humanfibrinogen, erhalten durch Spaltung mit CNBr, mit der Molekularformel (Aα 1-51, Bβ 1-118, γ 1-78)&sub2; Molekulargewicht 58000 (Molekulargewicht bestimmt durch Gelelektrophorese)

(B)N-DSK:

CNBr-Fragment, erhalten aus Human-Fibrin, welches durch Gerinnung von Fibrinogen mit Hilfe des Schlangengift- Enzyms Batroxobin hergestellt worden war. (B)N-DSK unterscheidet sich von N-DSK insofern, als es kein FPA hat und deshalb ist seine Molekularformel (Aα 17-51, Bβ 1-118, γ 1-78)&sub2;, Molekulargewicht 55000 (Molekulargewicht bestimmt durch Gelelektrophorese)

(T)N-DSK:

CNBr-Fragment, erhalten aus Humanfibrin, welches durch Gerinnung von Fibrinogen mittels Human-Thrombin oder durch Aktivierung von N-DSK mit demselben Enzym hergestellt wurde. (T)N-DSK hat weder FPA noch FPB und hat die Molekularformel (Aα 17-51, Bβ 15-118, γ 1-78)&sub2;, Molekulargewicht 52000 (Molekulargewicht bestimmt durch Gelelektrophorese)

SDS:

(sodium dodecyl sulfate) : Natriumdodecylsulfat

TPBS:

(phosphate-saline buffer additionally containing 0,05% Tween 20): Phosphat-Salz-Puffer mit Zusatz mit 0,05% Tween 20

ELISA:

(enzyme linked immunosorbent assay): Enzym-gekoppelter Immunabsorptionsassay

RIA:

(Radioimmunoassay): Radioimmunassay

A&sub4;&sub9;&sub0;:

Extinction (absorbance) bei der Wellenlänge 490 nm

Sac-Cel:

Esel-Anti-Maus-Cellulose-Suspension (donkey anti mouse cellulose suspension)

Animal:

Wenn nicht anders angegeben, bedeutet der hier verwendete Ausdruck "Tier" jedes vom Menschen verschiedene Warmblüterlebewesen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft durch Hybridome erzeugte monoklonale Antikörper, wie in/jedem der Ansprüche 1 bis 18 beansprucht; Hybridome zur Erzeugung solcher monoklonaler Antikörper, wie in jedem der Ansprüche 19 bis 29 beansprucht; ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, wie in jedem der Ansprüche 30 bis 37 beansprucht; Verfahren zur Herstellung von Hybridomen, wie in jedem der Ansprüche 38 bis 45 beansprucht; ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Fragments der β-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, wie in jedem der Ansprüche 46 bis 49 beansprucht; ein Verfahren zur Bestimmung der Menge eines in einer Plasmaprobe vorliegenden Peptidfragments der β-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, wie in den Ansprüchen 50 oder 51 beansprucht; ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Fragments der β-Kette von Human-Fibrin II, wie in jedem der Ansprüche 52 bis 57 beansprucht; ein Verfahren zum Nachweis der Möglichkeit des Beginns von occlusiver Thrombose, wie in den Ansprüchen 58 oder 59 beansprucht; sowie eine Testpackung zur Ermittlung, ob das in einer Testprobe enthaltene Plasma bestimmte Aminosäuresequenzen enthält, wie in jedem der Ansprüche 60 bis 65 beansprucht.
Das Verfahren zur Erzeugung der Hybridome und damit der monoklonalen Antikörper schließt die Fusion einer tierischen Zelle, z. B. einer Mäusemyelomzelle aus beispielsweise einer Maus vom Typ P3X63Ag8.653, mit einer Milzzelle aus einem Tier, z. B. einer Maus, beispielsweise einer BALB/cJ-Maus ein.
Im Fall von MAb/1-8C6 wird eine Maus mit einem NH&sub2;-terminalen Fragment von Human-Fibrinogen oder Fibrin I immunisiert und damit ein neues Hybridom, d. h. 1-8C6 erzeugt. Im Fall von MAb/T2G1s wird eine Maus mit einem NH&sub2;-terminalen Fragment von Human-Fibrin II immunisiert und damit ein neues Hybridom, d. h. T2G1s, erhalten. Die erhaltenen Hybridome werden getrennt und solche Hybridome ausgewählt, welche den monospezifischen Antikörper - im Fall von MAb/1-8C6 - gegen ein NH&sub2;-terminales Fragment von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, und - im Fall von MAb/T2G1s - gegen ein NH&sub2;-terminales Fragment von Human-Fibrin II erzeugen.
Das Fragment aus Human-Fibrinogen oder Fibrin I kann gebildet werden durch Spaltung eines solchen Human-Fibrinogens oder Fibrins I durch CNBr. Ein Fragment von Human-Fibrinogen aus solcher CNBr-Spaltung ist N-DSK. Andere Fragmente aus Human-Fibrinogen oder Fibrin I, welche ebenso verwendet werden können, sind Bβ 1-118 und Bβ 1-42. Ein erfindungsgemäß anwendbares Fragment aus Fibrin I ist (B)N-DSK.
Das Fragment aus Human-Fibrin II kann durch Spaltung von Fibrin II durch CNBr gebildet werden. Ein Fragment aus Human-Fibrin II ist (T)N-DSK. Andere ebenso verwendbare Fragmente aus Human-Fibrin II sind Bβ 15-118 und Bβ 15-42.
Die Hybridom-Zellinie ATCC HB 8418 exprimiert einen monospezifischen Antikörper, MAb/1-8C6, welcher mit dem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42, reagiert, jedoch mit Peptidfragmenten der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-14 oder 15-42, nicht reagiert. Als solches erkennt MAb/1-8C6 ein Epitop (antigene Determinante) in der oder um die Bindung Bβ14Arg-15Gly herum und unterscheidet damit zwischen NH&sub2;-terminalen Peptiden aus der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I und von Fibrin II.
Die Hybridom-Zellinie ATCC HB 8426 exprimiert einen monospezifischen Antikörper, MAb/T2G1s, welcher mit dem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II, enthaltend die Aminosäurereste 15-42, reagiert, jedoch mit Peptidfragmenten von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42 oder 1-14, nicht reagiert. Als solches erkennt MAb/T2G1s ein Epitop auf der Bβ-Kette von Fibrin II, jedoch nicht von Fibrinogen oder Fibrin I.
MAb/1-8C6 ist für eine einzelne Determinante auf der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen, Fibrin I, oder daraus hergeleiteten Peptiden, welche die Aminosäurereste 1-42 enthalten, monospezifisch. MAb/1-8C6 enthält keine anderen Antikörper gegen Human-Fibrinogen. Dies steht im Gegensatz zu bekannten Antiseren, welche von Natur aus verunreinigt sind, und im Gegensatz zu bekannten monoklonalen Antikörpern, welche nicht für ein Epitop auf der oder um die Bindung Bβ14Arg-15Gly herum spezifisch sind.
MAb/T2G1s ist für eine einzelne Determinante auf dem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II, enthaltend die Aminosäurereste 15-42, monospezifisch. MAb/T2G1s enthält im wesentlichen kein anderes anti-Human-Immunglobulin, was im Gegensatz zu bekannten Antiseren steht, welche von Natur aus verunreinigt sind und auch im Gegensatz zu bekannten monoklonalen Antikörpern, welche nicht für ein Epitop aus der Bβ-Kette von Fibrin II spezifisch sind.
MAb/T2G1s ist ebenso gegenüber Human-Peptidfragmenten von Fibrin II, enthaltend die Aminosäurereste 15-42, spezifisch, d. h., MAb/T2G1s reagiert mit Produkten, die beim Thrombinaufschluß von Human-Fibrinogen erzeugt werden, reagiert aber nicht mit den Produkten, welche aus dem Thrombinaufschluß bestimmter tierischer Fibrinogene hervorgehen, z. B. Kaninchenfibrinogen.
Die neuen erfindungsgemäßen Hybridome können für die Erzeugung von Antikörper kultiviert werden, ohne daß es nötig ist, Tiere zu immunisieren und zu töten und ohne die folgenden langwierigen Adsorptions- und Reinigungsschritte, welche nötig sind, um sogar die bekannten unreinen Antiseren zu erhalten.
Alle Immunglobulin-Moleküle bestehen aus zwei identischen, leichten Ketten (MW 25.000) und zwei identischen schweren Ketten (MW 50.000), welche durch Disulfidbindungen als Tetramer zusammen gehalten werden. Jede Kette kann der Vorstellung nach in spezifische Bereiche oder Regionen aufgeteilt werden, welche strukturelle und funktionelle Bedeutung haben. Die Hälfte der leichten Kette gegen das Carboxylende hin wird als die konstante Region bezeichnet, während die Hälfte mit dem Aminogruppenende die variable Region der Kette darstellt. Annähernd ein Viertel der schweren Kette am Aminoende wird als deren variable Region bezeichnet, die anderen drei Viertel der schweren Kette bezeichnet man als die konstanten Regionen dieser schweren Kette.
Vier Klassen von schweren Ketten wurden bei Mäusen gefunden, und diese Klassen können über chemische Unterschiede von einander abgegrenzt werden. Der Typ "schwere Kette" bestimmt die Klasse von Immunglobulin und damit dessen Effektorenfunktion. Es gibt fünf Immunglobulinklassen: IgG, IgA, IgM, IgD und IgE. Die vier Klassen von Mäuse-IgG werden als IgG&sub1;, IgG2a, IgG2b und IgG&sub3; bezeichnet.
MAb/1-8C6 gehört zur Klasse IgG und zur Unterklasse IgG2a. MAb/T2G1s gehört zur Klasse IgG und zur Unterklasse IgGj.
Entsprechend werden erfindungsgemäß in Erfüllung der vorgenannten Vorteile zwei Hybridome bereitgestellt: Eines, welches Antikörper gegen das Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42 erzeugt und eines, welches Antikörper gegen das Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 erzeugt. Diese Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung dieser Hybridome bereit.
Weiterhin wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Ermittlung der Natur des Ablaufs der Fibrinogenproteolyse in vivo bereitgestellt.
Erfindungsgemäß werden auch Methoden zur Diagnose von Krankheiten bereitgestellt, in welchen die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper verwendet werden.
Im allgemeinen werden die die monoklonalen Antikörper exprimierenden Hybridome erfindungsgemäß nach der Methode von Köhler und Milstein hergestellt. Nach der Immunisierung von Mäusen mit einer Lösung von N-DSK für den Fall der Erzeugung von MAb/1-8C6 oder von (T)N-DSK im Falle der Erzeugung von MAb/T2G1s werden die Milzzellen der immunisierten Mäuse mit Zellen aus einer Mäusemyelomlinie fusioniert. Die Klonierungs-Kulturflüssigkeiten aus den erhaltenen Hybridomen werden auf solche gesichtet, welche Überstände mit Antikörper enthalten, die eine selektive Bindungsfähigkeit an das Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42 (im Falle der Erzeugung von MAb/1-8C6) oder an das Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 (im Fall der Erzeugung von MAb/T2G1s) aufweisen.
Es wird darauf hingewiesen, daß die unvorhersehbare Natur der Hybridzellenzubereitung es nicht zuläßt, von einem Antigen oder einem Zellsystem auf ein anderes zu schließen.
Die von den erfindungsgemäß erzeugten Hybridomen hergeleiteten monoklonalen Antikörper eignen sich als diagnostische Reagenzien in klinischen Studien zur Bestimmung der Natur des Fibrinmoleküls, welches im Blut irgendeines Patienten mit drohender oder bestehender Thrombose erzeugt wird. Thrombose geht einher mit einer Anzahl von Krankheitszuständen, kann aber auch vor, während oder nach einem operativen Eingriff und auch in anderen traumatischen Zuständen eintreten. Die Wirksamkeit der Heparintherapie bei Hämodialysepatienten kann ebenso über die Messung der Plasmakonzentration an Fibrinogen oder Fibrinspaltprodukten mit Hilfe des erfindungsgemäßen diagnostischen Reagens untersucht werden. Die Wirksamkeit einer thrombolytischen Therapie unter Verwendung von entweder Streptokinase- oder Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator kann ebenso unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper untersucht werden.

Kurze Erläuterung der Zeichnungen

Abb. 1 veranschaulicht die Elektrophoresemuster von N-DSK (1), (B)N-DSK (2) und (T)N-DSK (3) auf 7%-igen Polyacrylamid-Gelen in SDS. Die Beweglichkeit jeder N-DSK-Art wird aufgezeigt. (B)N-DSK wurde aus Batroxobin-induziertem Fibrin isoliert, (T)N-DSK wurde aus N-DSK durch Abbau mit Humanthrombin hergestellt.
Abb. 2a und Abb. 2b sind Graphiken zur Veranschaulichung der Fraktionierung von mit Thrombin gespaltenen Peptiden aus N-DSK (Abb. 2a) und aus (B)N-DSK (Abb. 2b) auf dem Wege der Hochleistungs-Flüssigchromatographie. Die Elutionsmuster wurden durch Messung der Extinction bei 206 nm erhalten. Die Bedingungen für die Säule und die Chromatographie waren denen von Koehn und Canfield, Analyt.Biochem., 116, 349-356, 1981, ähnlich.
Abb. 3 veranschaulicht eine Ouchterlony-Analyse von MAb/1-8C6 unter Verwendung klassenspezifischer Antiseren. Die Antigene bestanden aus normalem Mäuseplasma (A) und MAb/1-8C6 (B) die klassenspezifischen Antiseren waren: Anti-IgG&sub1; (1) anti-IgG2a (2) anti-IgG2b (3); anti-IgG&sub3; (4)
Abb. 4 ist eine Graphik zur Veranschaulichung der Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;J-markiertem Bβ1-118-Liganden durch verschiedene "kalten" Konkurrenzstoffe. Eine 1/40- Verdünnung von MAb/1-8C6 wurde verwendet > und diese band etwa 40% des Liganden in Abwesenheit jeglicher Konkurrenz. Die nicht-spezifische Bindung betrug weniger als 5%. Mittelwerte von mindestens fünf verschiedenen Experimenten werden gezeigt. Keine Hemmung wurde beobachtet mit den anderen zwei Ketten von N-DSK (d. h. Aα 1-51 und γ1-78) im hier gezeigten Konzentrationsbereich. Fibrinogen, N-DSK und (B)N-DSK sind Dimere mit 2 Molen Bβ-Kette (bei Fibfinogen) oder Bβ 1-118 (beide N-DSK-Arten). Deshalb betrug das in den Berechnungen verwendete Arbeits-Molekulargewicht die Hälfte des tatsächlichen Molekulargewichts von allen.
Abb. 5 veranschaulicht Elektrophoresemuster von Bβ 1-118 vor (Gel 1 und 3) und nach (Gel 2 und 4) Abbau mit Thrombin. Die Gele 1 und 2 waren 10%-iges Acrylamid, während die Gele 3 und 4 aus 7%-igem Acrylamid in SDS bestanden. Die Beweglichkeit der Bβ-Kette in jeder Gelprobe wird angegeben.
Abb. 6 ist eine Graphik zur Veranschaulichung der Hemmung der Bindung von ¹²³J-markiertem Bβ 1-118-Liganden durch Standardmengen von "kaltem" Bβ 1-118 vor und nach Thrombinaufschluß. Die Antikörperverdünnung, die spezifische und nicht-spezifische Bindung war wie in Abb. 4 beschrieeben. Der Mittelwert von acht (8) aufeinanderfolgenden Versuchen wird gezeigt, die Standardabweichung ist mit senkrechten Balken angegeben.
Abb. 7a, Abb. 7b und Abb. 7c sind Graphiken zur Veranschaulichung der Immunreaktivitätsprofile an Fraktionen, welche aus einem Hochleistungschromatographie-Versuch unter Verwendung eines Extraktes aus angesammeltem (5,7 ml) Patienten-Plasma erhalten wurden. Die Bedingungen für die Säule waren ähnlich denen in Abb. 2. Nach der Chromatographie wurde das Acetonitril durch Abdampfen entfernt und jede Fraktion in 1,0 ml 0,2-molarem NH&sub4;HCO&sub3; gelöst und für den Immunassay verwendet. Lediglich die Fraktionen 5-8 wurden vor und nach dem Thrombinaufschluß analysiert. FPA wurde in den Proben lediglich vor dem Thrombinaufschluß gemessen. Oberes Bildfeld: Immunreaktivität unter Verwendung der handelsüblichen Bβ 15-42-Radioimmunassaypackung [IMCO Corporation, Ltd, Stockholm, Schweden]; mittleres Feld: mit MAb/1-8C6 gemessene Immunreaktivität; unteres Feld: FPB- Immunrektivität von Fraktionen 5-8, lediglich nach Thrombinaufschluß. Das FPB wurde in den Fraktionen 5-8 und 17-19 gefunden.
Abb. 8 veranschaulicht ein Schema der Fibrinogenproteolyse durch Thrombin und Plasmin in vivo, wie aufgestellt von Nossel und Mitarbeitern (angepaßt von Nossel et al, J. Clin. Invest., 64, 1371-1378, 1979)
Abb. 9 besteht aus Graphiken zur Veranschaulichung der HPLC-Elutionsmuster des Bβ 1-42-Peptids vor (a) und nach (b) Aufschluß mit Humanthrombin. Die Immunreaktivitätsprofile (schattierte Flächen) der Fraktionen wurden auf dem Wege eines Radioimmunassays unter Verwendung von ¹²³J-markiertem Bβ 15-42-Liganden und Kaninchen-Antiserum gegen Bβ 15-42 (Kudryk et al., siehe oben, 1982) erhalten. Die Menge von auf die Säule aufgebrachtem mit Thrombin aufgeschlossenem Peptid war bei (b) etwa 3· so groß wie bei (a). Untersuchungen haben gezeigt, daß das Antigen in einer Ausbeute von mehr als 70% aus den genannten Fraktionen gewonnen werden kann.
Abb. 10 ist eine Graphik zur Veranschaulichung von kompetitivem ELISA unter Verwendung einer mit (T)N-DSK beschichteten Platte (0,8 ug/ml) und MAb/T2G1s. Die Inhibitoren bestanden aus Bβ 1-42 vor und nach Aufschluß mit Thrombin. Die A&sub4;&sub9;&sub0;/5-Minutenwerte in pufferhaltigen Vergleichsvertiefungen (ohne zugegebenen Inhibitor) lagen bei etwa 0,8.
Abb. 11 ist eine Graphik zur Veranschaulichung der Hemmung der Bindung von, ¹²&sup5;J-markiertem Bβ 15-42-Liganden an MAb/T2G1s durch die genannten "kalten" Konkurrenzstoffe.
(T)N-DSK ergab eine Hemmkurve, welche identisch war mit der bezüglich Bβ15-42 oder mit Thrombin aufgeschlossenem Bβl42 gezeigten Kurve. Intaktes Bβ 1-42, Bβ 1-118, N-DSK und (B)N-DSK ergaben keine Kreuzreaktion im gezeigten Konzentrationsbereich. Eine leichte Konkurrenz wurde beobachtet unter Verwendung von normalem Humanplasma, jedoch nur bei Zugabe in sehr geringer Verdünnung.
Abb. 12 ist eine Graphik zur Veranschaulichung der Reaktivität zweier verschiedener monoklonaler Antikörper auf mit Fibrinogen beschichteten ELISA-Platten mit anschließendem Throminaufschluß. Der Versuch wurde auf einer einzelnen Platte (96 Vertiefungen) durchgeführt, welcher Thrombin zugegeben wurde. Der Aufschluß wurde - nach der angegebenen Zeit - durch Zugabe des Thrombin-Inhibitors D-Phe-Pro-Arg- CH&sub2;Cl beendnet. Der A&sub4;&sub9;&sub0;/5-Minutenwert für MAb/1-8C6 auf Vergleichsplatten mit Fibrinogenbeschichtung (nicht aufgeschlossen) betrug etwa 1,7. Auf identischen Platten ergab MAb/T2G1s allein lediglich eine Hintergrundfarbe.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN

Erfindungsgemäß können die Verfahren zur Herstellung der Hybridome und der durch solche Hybridome exprimierten Antikörper durch Fusion einer transformierten tierischen Zelle, wie einer Myelomzelle, mit einer tierischen Milzzelle durchgeführt werden. Vorzugsweise werden jedoch Mäusemyelomzellen und Mäusemilzzellen verwendet und deshalb wird die Erfindung im folgenden über die Verwendung von Mäusemyelomzellen und Mäusemilzzellen beschrieben.
Erfindungsgemäß umfaßt das Verfahren zur Herstellung der Hybridome, welche entweder MAb/1-8C6 (das mit einem Peptidfragment der BβKette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42, reagiert, jedoch nicht mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I enthaltend die Aminosäurereste 1-14 oder 15-42 reagiert) oder MAb/T2G1s (das mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II, enthaltend die Aminosäurereste 15-42, reagiert, jedoch nicht mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-14 oder 1-42, reagiert), exprimieren, im allgemeinen folgende Schritte:
A. Mäuse werden mit entweder N-DSK, Bβ 1-118, Bβ 1-42 oder (B)N-DSK immunisiert, um MAb/1-8C6 zu erzeugen, oder mit (T)N-DSK, Bβ 15-118 oder Bβ 15-42, um MAb/T2G1s zu erzeugen. N-DSK wird aus Fibrinogen und (T)N-DSK durch Thrombinaufschluß von N-DSK hergestellt. Während Mäuse vom Typ BALB/cJ bevorzugt werden, können auch andere Mäusestämme verwendet werden. Der Immunisierungsplan und die Immunogenkonzentration wird so eingestellt, daß geeignete Mengen geeignetermaßen exprimierter Splenocyten erzeugt werden. Um MAb/1-8C6 zu erzeugen, werden Mäuse intraperitoneal (i.p.) mit 0,1 ml einer Emulsion von N-DSK-Lösung (4 mg/ml) mit einem gleichen Volumen von vollständigem Freund- Adjuvans immunisiert, anschließend wird viermal ein Booster in derselben Dosierung unter Verwendung von unvollständigem Freund-Adjuvans in wöchentlichen Abständen injiziert und anschließend ein intravenöser (i.v.) Boost unter Verwendung von 0,1 mg N-DSK in Tris-Salzlösung 10 Wochen später. Um Mab/T2G1s zu erzeugen, werden Mäuse i.p. mit 100 ug (T)N-DSK, vermischt mit vollständigen Freund-Adjuvans immunisiert, anschließend folgen vier i.v. Injektionen eines Boosters derselben Dosierung unter Verwendung von unvollständigem Freund-Adjuvans und anschließend einer i.v. Booster-Injektion von 100 ug (T)N-DSK in Tris-Salzlösung.
B. Die Milz wird aus jeder immunisierten Maus herausgenommen und von jeder Milz eine Zellsuspension in einem geeignetem Medium, z. B. RPMI 1640, zubereitet.
C. Die suspendierten Milzzellen werden mit Mäusemyelomzellen aus einer geeigneten Zellinie, z. B. unter Verwendung eines geeigneten Fusionspromotors, z. B. PEG 1000, fusioniert. Das bevorzugte Verhältnis liegt bei etwa vier Milzzellen pro Myelomzelle im Falle der Erzeugung von MAb/1-8C6 und sieben Milzzellen pro Myelomzelle im Falle von MAb/T2G1s. Für etwa 100 Splenocyten ist ein Gesamtvolumen von etwa 0,5-1,0 ml Fusionsmedium geeignet. Es sind viele Mäusemyelomzellinien bekannt und verfügbar, im allgemeinen seitens der Mitglieder der Akademischen Gemeinschaft oder verschiedener Hinterlegungsbanken, wie des Salk Institute Gell Distribution Center, La Jolla, CA. Die vorzugsweise verwendete Zellinie ist der sog. chemikalienresistente (drug resistant) Typ, so daß nicht-fusionierte Myelomzellen in einem selektiven Medium nicht überleben, während Hybride überleben. Die gängigste Klasse sind gegenüber 8-Azaguanin resistente Zellinien, welche nicht über das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase verfügen und daher nicht durch HAT-(Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) -Medium gefördert werden. Im allgemeinen werden auch Myelomzellinien des sogenannten "nicht sezernierenden Typs" bevorzugt verwendet, da diese selbst keinerlei Antikörper erzeugen, obwohl auch sezernierende Typen verwendet werden können. In bestimmten Fällen können aber auch sezernierende Myelomlinien bevorzugt werden.
Während der bevorzugte Fusionspromotor Polyethylenglycol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 4000 ist (im Handel verfügbar als PEG 1000, usw.), können auch andere bekannte Fusionspromotoren verwendet werden.
D. In getrennten Behältnissen, z. B. getrennten Vertiefungen auf einer Mikrotiterplatte, wird das Gemisch aus nicht-fusionierten Milzzellen, nicht-fusionierten Myelomzellen und fusionierten Zellen in einem Selektivmedium verdünnt, welches die nicht-fusionierten Myelomzellen nicht fördert, und eine für das Absterben der nicht-fusionierten Zellen ausreichende Zeit lang (etwa 14-16 Tage) kultiviert. Man kann die Art einer Begrenzungsverdünnung wählen, bei welcher das Volumen an Verdünner statistisch berechnet wird, um eine bestimmte Anzahl von Zellen (z. B. 1-4) in jedem getrennten Behältnis (z. B. in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte) zu isolieren. Das Medium (z. B. HAT-Medium) ist so beschaffen, daß es die chemikalienresistente (z. B. 8-Azaguaninresistente) nicht-fusionierte Myelomzellinie nicht fördert. Daher werden diese Myelomzellen absterben. Da die nicht-fusionierten Milzzellen nicht bösartig sind, überleben sie nur eine begrenzte Anzahl von Generationen. So können sich diese nicht-fusionierten Milzzellen nach einer bestimmten Zeitdauer (etwa 14-16 Tage) nicht mehr fortpflanzen. Die fusionierten Zellen fahren andererseits fort, sich zu reproduzieren, weil sie die Eigenschaft der Bösartigkeit der sie erzeugenden Myelome und damit die Überlebensfähigkeit im Selektivmedium aufweisen.
E. Der Überstand in jedem Behältnis (Vertiefung) mit einem Hybridom für das Vorliegen von Antikörper (1) gegen N-DSK und verwandte Strukturen [Fibrinogen, N-DSK oder deren Fragmente, z. B. (B)N-DSK (Batroxobin-Abbauprodukt von N-DSK) und Bβ 1-118], jedoch nicht für die Aα 1-51- oder γ1-78-Ketten von N-DSK, Thrombin-aufgeschlossenes Bβ 1-118, (T)N-DSK, freies Bβ 1-14 (FPB) oder Bβ 15-42 - dies für den Fall der Erzeugung von MAb/1-8C6 - und (2) gegen (T)N-DSK und verwandte Strukturen (Fibrin II, (T)N-DSK, Thrombinaufgeschlossenes Bβ 1-42 und Bβ 15-42) und nicht gegenüber intaktem Fibrinogen-N-DSK oder (B)N-DSK oder Bβ 1-42 - dies für den Fall der Erzeugung von MAb/T2G1s -, wird ausgewertet.
F. Ein Hybridom oder Hybridome für die Erzeugung des gewünschten Antikörpers werden selektiert (z. B. durch begrenzende Verdünnung) und geklont, z. B. betreffend einen Antikörper, welcher mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42 regiert, jedoch nicht mit einem beliebigen Peptidfragment der genannten Bβ-Kette, enthaltend lediglich Aminosäurereste 1-14 oder 15-42, reagiert - dies für den Fall von MAb/1-8C6 - oder betreffend einen Antikörper, welcher mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 reagiert, jedoch nicht reagiert mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-14 oder 1-42 - dies für den Fall von MAb/T2G1s.
Wenn einmal das erwünschte Hybridom selektiert und geklont wurde, kann der daraus hervorgehende Antikörper auf eine von zwei Weisen hergestellt werden. Der reinste monoklonale Antikörper wird hergestellt, indem man das erwünschte Hybridom in einem geeignetem Medium eine geeignete Zeit lang in vitro kultiviert und anschließend den gewünschten Antikörper aus dem Überstand der Klone gewinnt. Das geeignete Medium und die geeignete Kultivierungszeit sind bekannt oder können auf leichte Weise bestimmt werden. Bei dieser in vitro-Technik wird der monoklonale Antikörper frei von anderem anti-Human-Immunglobulin erzeugt. Es kommt zum Auftreten einer geringen Menge von anderem Immunglobulin, da das Medium ein xenogenes Serum (z. B. fötales Kälberserum) enthält. Allerdings kann es sein, daß bei dieser in vitro-Methode die erzeugte Menge oder Konzentration an Antikörper für manche Zwecke nicht ausreichend ist, da die Konzentration des monoklonalen Antikörpers lediglich etwa 50 ug/ml beträgt.
Um eine viel höhere Konzentration eines geringfügig weniger reinen monoklonalen Antikörpers zu erzeugen, können die gewünschten Hybridome übertragen werden, d. h. sie werden intraperitonal auf Mäuse, vorzugsweise syngene oder semisyngene Mäuse, injiziert. Das Hybridom bildet nach einer geeigneten Inkubationszeit Antikörper erzeugende Tumore, was zu einer hohen Konzentration des erwünschten Antikörpers
(etwa 5-20 ug/ml) im Blutstrom und im peritonealen Exudat (Ascites) der Wirtsmaus führt. Obwohl diese Wirtsmäuse ebenso normale Antikörper in ihrem Blut und Ascites haben, beträgt die Konzentration dieser normalen/Antikörper lediglich etwa 5% der Konzentration an monoklonalem Antikörper. Da überdies diese normalen Antikörper in ihrer Spezifität nicht anti-human sind, ist der aus dem gewonnenen bösartigen Ascites, oder aus dem Serum gewonnene monoklonale Antikörper im wesentlichen frei von jeglichem verunreinigenden anti- Human-Immunoglobulin. Dieser monoklonale Antikörper weist einen hohen Titer und ein hohes Verhältnis von spezifischem zu nicht-spezifischem Immunglobulin auf.
Folgendermaßen sieht ein Verfahren aus, nach welchem ein Techniker eine Plasmaprobe untersuchen kann, um eine vorliegende Menge an Antigenen (z. B. die Menge eines Peptidfragments der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42 im Fall von MAb/1-8C6, oder die Menge eines Peptidfragments der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 im Fall von MAb/T2G1s), für welche die monoklonalen Antikörper der Erfindung monospezifisch sind, zu bestimmen:
In gewählten Zeitabschnitten wird Blut von einem Patienten sowie das davon herrührende Plasma gesammelt. Die Plasmaprobe wird auf schnellem Wege "aufgearbeitet", d. h. sie wird mit eisgekühltem Ethanol [Endkonzentration 50] behandelt, um Fibrinogen/Fibrin-Peptide aus der Bβ-Kette zu isolieren. Der Ethanolüberstand wird im allgemeinen gefriergetrocknet, um einerseits den Extrakt zu konzentrieren und andererseits das Lösungsmittel zu entfernen. Die "aufgearbeitete" Plasmaprobe kann in zwei Fraktionen aufgeteilt werden, wovon eine zum Nachweis von Bβ 1-42 verwendet wird und die andere zum Nachweis von Bβ 15-42. Die Menge an im Ethanolextrakt vorliegenden Peptiden kann entweder durch Radioimmunassay (RIA) oder durch enzymgekoppelten Immunabsorptionsassay (ELISA) bestimmt werden. Z.B. werden verschiedene Verdünnungen des Ethanolextrakts mit festgelegten Mengen an tierischem monoklonalem Antikörper, z. B. MAb/1-8C6, und mit kompetitivem radiomarkiertem Antigen aus beispielsweise einem radioaktiv markierten Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42, z. B. ¹²³J-markiertem Bβ 1-42-Liganden, vermischt, wobei dieses kompetitive radiomarkierte Antigen sich an den tierischen monoklonalen Antikörper, z. B. MAb/1-8C6, binden kann. Verschiedene Verdünnungen des Ethanolextrakts werden ebenso mit festgelegten Mengen eines tierischen monoklonalen Antikörpers, z. B. MAb/T2G1s, und mit dem kompetitiven radiomarkierten Antigen aus radioaktiv markiertem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 vermischt, wobei dieses kompetitive radiomarkierte Antigen, z. B. ¹²&sup5;J-markierter Bβ 15-42-Ligand, sich an den tierischen monoklonalen Antikörper, z. B. MAb/T2G1s, binden kann. In beiden Fällen wird nach einer geeigneten Inkubationszeit ein zweiter gegen tierischen monoklonalen Antikörper (z. B. MAb/1-8C6 oder MAb/2G1s, wie der Fall liegen mag) spezifischer Antikörper (z. B. Anti-Maus-Gesamt-Antikörper von Kaninchen, oder Sac- Cel) zugegeben. Nach einer zweiten Inkubationsperiode wird am Antikörper gebundenes radiomarkiertes Antigen (Ligand) abgetrennt und quantifiziert, d. h. die Radioaktivität des gebundenen radiomarkierten Antigens wird durch Zählung gemessen. Je mehr "kaltes" Bβ 1-42- (oder -15-42-)-Peptid in der Probe vorliegt, um so weniger gebundener Ligand wird in der betreffenden Probe beobachtet. Die genaue Menge (d. h. die Konzentration an Bβ 1-42 oder -15-42-Peptid) in der unbekannten Probe kann bestimmt werden, indem man den Inhibitionswert der unbekannten Probe mit dem unter Verwendung eines Bβ 1-42- bzw. -15-42-Standards erhaltenen Wert vergleicht, d. h. indem man die Ergebnisse des RIA-Tests unter Verwendung der Plasmaprobe mit den unter Verwendung einer Standardmenge von bekanntem Antigen, z. B. einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42 oder mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 erhaltenen Wert vergleicht.
Auf anderen Wege kann das Vorliegen derselben Antigene (d. h. Bβ 1-42 oder -15-42) durch ELISA nachgewiesen werden. Mit diesem Verfahren wird ein Feststoffträger, z. B. Mikrotiterplatten, über Nacht mit kompetitivem Antigen aus beispielsweise einem Peptidfragment der B -Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend z. B. entweder Bβ 1-42, N-DSK oder intaktes Fibrinogen, beschichtet. Nach Abwaschen und einer "Blockierungs"-Prozedur (zum Geringhalten nicht-spezifischer Bindung) wird eine geeignete Verdünnung von MAb/1-8C6 und einem nicht bekannten Peptidantigen in einer Plasmaprobe (oder Bβ1-42-Standard) in die geeigneten Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Wenn in solch einer Probe das Bβ 1-42-Peptid in großem Überschuß vorliegt, reagiert das MAb/1-8C6 mit dem Peptid und nur wenig, wenn überhaupt, Antikörper ist verfügbar für die Bindung an dasselbe oder an das verwandte Antigen, welches anfangs als Überzug auf die Oberfläche der Mikrotiterplatte (siehe oben) angebracht worden war. Die Menge an Antikörper, z. B. MAb/1-8C6, die (wenn überhaupt) an die mit Antigen beschichtete Platte gebunden wurde, wird durch Bestimmung der Menge des an die Platte gebundenen enzymgekoppelten Antikörpers nachgewiesen, wobei dieser Antikörper sich an das Mäuse-Immunglobulin, z. B. an MAb/1-8C6, bindet, d. h. hierfür spezifisch ist. Diese Methodik ist schon beschrieben (Engvall, E., in Methods in Enzymology, 70, Teil A, 419-439. 1980). Die Menge von beispielsweise Bβ 1-42 in der unbekannten Probe wird bestimmt durch Vergleich des Hemmwerts der unbekannten Probe mit dem unter Verwendung von beispielsweise Bβ1-42-Standard erhaltenen Wert (d. h. die Ergebnisse des ELISA-Tests unter Verwendung der Plasmaprobe werden mit denen verglichen, welche unter Verwendung einer Standardmenge von bekanntem Antigen, d. h. einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42, erhalten werden). Dieselbe ELISA-Verfahrensweise wird angewandt, um das Vorliegen von Bβ15-42 in einer Plasmaprobe nachzuweisen. Z.B. werden die Mikrotiterplatten mit kompetitivem Antigen aus einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42, z. B. Bβ 15-42, beschichtet. MAb/T2G1s und das unbekannte Peptidantigen in einer Plasmaprobe, (oder Bβ15-42-Standard) werden in die Vertiefungen der Platte gegeben. Die Menge des an die mit Antigen beschichtete Platte gebundenen MAb/T2G1s wird nachgewiesen durch Bestimmung der Menge des an die Platte gebundenen enzymgekoppelten Antikörpers, wobei dieser Antikörper sich an das Mäuse-Immunglobulin, z. B. an MAb/T2G1s, bindet, d. h. hierfür spezifisch ist. Die Menge an Bβ 15-42 in der unbekannten Probe wird bestimmt durch Vergleich des Inhibitionswerts der unbekannten Probe mit dem unter Verwendung eines Bβ 15-42-Standards (d. h. die Ergebnisse des ELISA-Tests unter Verwendung der Plasmaprobe werden verglichen mit den Ergebnissen unter Verwendung eines Standard-Peptidfragments der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42).
Ein Verfahren, nach welchem ein Techniker die Möglichkeit für den Beginn occlusiver Thrombose an einem Patienten nachweisen kann, erfordert die Aufteilung der Plasmaprobe in zwei Fraktionen und Bestimmung (1) der Menge eines Peptidfragments der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42 in einer Fraktion, und (2) der Menge des Peptidfragments aus der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 in der anderen Fraktion. Der Techniker kann sich entweder des ELISA- oder des RIA-Tests, wie vorstehend beschrieben, bedienen. Die relativen Mengen an Peptidfragmenten im Plasma eines Patienten können dann verglichen werden. Wenn Bβ 1-42 gegenüber Bβ 15-42 vorwiegt, bedeutet dies, daß die Plasminproteolyse von Fibrinogen oder Fibrin-I-Polymer stattfindet. Wenn Bβ 15-42 gegenüber des Peptidfragments Bβ1-42 überwiegt, bedeutet dies, daß Fibrin II gebildet wurde, d. h. es besteht eine Möglichkeit für den Beginn occlusiver Thrombose beim Patienten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Testpackungen zur Bestimmung der Natur von in vivo erzeugten Peptiden aus Fibrinogen und/oder Fibrin. Eine solche Testpackung, d. h. eine Packung zum Nachweis eines einzelnen Peptids, dient beispielsweise zum Nachweis für das Vorliegen des Peptidfragments aus der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42. Ein Anteil (z. B. 0,5 mg) von lyophilisiertem tierischem monoklonalem Antikörper, z. B. MAb/1-8C6, wird bereitgestellt. Ebenso wird ein Anteil (z. B. 2-4 mg) an Fibrinogen bereitgestellt, welchen der Techniker verwendet, um damit die im ELISA-Test verwendete Mikrotiterplatte zu beschichten. Ein Anteil (z. B. 20 ug) des Peptidfragments der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42 wird ebenso bereitgestellt. Dieser wird vom Techniker dazu verwendet, eine Standardkurve aufzustellen, gemäß welcher die Menge MAb/1-8C6, welche sich an die mit Fibrinogen beschichtete ELISA-Platte bindet, erkennbar an der Farbintensität (Erklärung siehe unten) abnimmt in dem Maße, wie das konkurrierende Antigen, (Bβ 1-42) in der Testprobelösung zunimmt. Der Techniker bereitet Verdünnungen des bereitgestellten Bβ1-42, um bekannte Mengen des als Lösung im kompetitiven ELISA-Test zu verwendenden Antigens zu erhalten, wobei diese Technik bekannt ist. Ein enzymgekoppeltes (z. B. mit Peroxidase konjugiertes) Immunglobulin (z. B. vom Kaninchen) gegen tierisches, beispielsweise Mäuse-Immunglobulin wird ebenso bereitgestellt, um die Bindung des tierischen Immunglobulins, beispielsweise des MAb/1-8C6, an die mit Fibrinogen beschichtete Platte nachzuweisen. Die Bindung des enzymgekoppelten IgG wird nachgewiesen unter Verwendung einer Lösung von H&sub2;O&sub2; und O-Dianisidin. Die Farbintensität kann automatisch unter Verwendung beispielsweise eines MR 580-Microelisa-Autoreader (Dynatech, Alexandria, VA) gemessen werden.
Wenn die Standardkurve aufgestellt ist, kann der ELISA-Test erfolgen unter Verwendung der Plasmaprobe, welche zur Entfernung von Fibrinogen bearbeitet wird (beispielsweise wie unten in Beispiel 7 beschrieben), wobei diese Plasmaprobe eine unbekannte Menge an Bβ 1-42 enthalten kann. Die Farbintensität wird gemessen und die Menge an Bβ 1-42 in der Plasmaprobe kann aus der Standardkurve "abgelesen" werden.
Eine andere erfindungsgemäße Testpackung, d. h. eine Packung zum Nachweis eines einzelnen Peptids, funktioniert wie oben dargelegt, dient jedoch zur Messung der in einer Plasmaprobe vorliegenden Menge an Bβ 15-42. Ein Aliquot von lyophilisiertem tierischem monoklonalem Antikörper, beispielsweise MAb/T2G1s (z. B. 0,5 mg) wird bereitgestellt. Ein Aliquot (z. B. 2-4 mg) Fibrin wird ebenso bereitgestellt und zur Beschichtung der Mikrotiterplatte verwendet. Ein Aliquot (z. B. 20 ug) des Peptidfragments der Bβ-Kette von Human- Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 wird ebenso bereitgestellt, ebenso ein enzymgekoppeltes Immunglobulin (z. B. vom Kaninchen) gegen tierisches, z. B. Mäuse-Immunglobulin.
Eine dritte erfindungsgemäße Testpackung d. h. eine Peptidnachweis-Testpackung zum Nachweis zweier verschiedener Peptide, welche die bevorzugte erfindungsgemäße Testpackung ist, kann zur Bestimmung von sowohl Bβ1-42 als auch Bβ15-42 in einer Plasmaprobe verwendet werden. Die Plasmaprobe wird in zwei Fraktionen aufgeteilt, von welcher eine zur Untersuchung auf das Vorliegen von Bβ 1-42 und die andere zur Untersuchung auf das Vorliegen von Bβ 15-42 verwendet wird. Tierische monoklonale Antikörper, beispielsweise MAb/1-8C6, MAb/T2G1s, Fibrinogen und Fibrin (zur Beschichtung der Platten), Bβ 1-42 und Bβ 15-42 (zur Aufstellung von Standardkurven) sowie enzymgekoppelte Immunglobuline, z. B. von Kaninchen gegen tierisches, z. B. Mäuse-Immunglobulin werden bereitgestellt. Der Techniker folgt den oben beschriebenen Verfahrensanweisungen für jede Packung zum Nachweis der Einzelpeptide. Auf diese Weise können die Mengen an Bβ 1-42 und Bβ 15-42 in jeder Plasmaprobe gemessen und verglichen werden.
Die Anwendung von ELISA gemäß vorstehender Beschreibung wird bevorzugt. Der Techniker kann aber auch anstelle dessen die Bestandteile der Packung zur Durchführung von RIA verwenden und damit die Mengen an Peptidfragmenten bestimmen.
Wie vorstehend beschrieben, stellt die Erfindung ein Mittel für die Schnellanalyse der Natur des in vivo erzeugten Fibrinmoleküls bereit. Wenn das Bβ1-42-Antigen gegenüber dem Bβ 15-42 Antigen in der Plasmatestprobe überwiegt, ist dies ein Hinweis dafür, daß eine Plasminproteolyse von Fibrinogen oder Fibrin-I-Polymer stattfindet. Andererseits ist das Vorwiegen des Bβ 15-42-Antigens gegenüber dem Bβ 1-42-Antigen ein Anzeichen für den Kliniker dafür, daß sich Fibrin II im Kreislauf befindet oder sich auf den Gefäßwänden niederschlägt, was ein zu occlusiver Thrombose führender Vorgang sein kann.
Wenn auch erfindungsgemäß bevorzugt Milzzellen aus immunisierten Mäusen und Mäusemyelomzellen verwendet werden, so kann auch die Verwendung von Zellen aus anderen Tieren, beispielsweise Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen in Erwägung gezogen werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahrensweisen können ebenso zur Erzeugung von Antikörpern gegen Fibrinogen oder Fibrin-I-Fragmenten aus von Menschen verschiedenen Lebewesen verwendet werden. Fragmente aus Kaninchen- oder Hunde-Fibrinogen, -Fibrin I oder -Fibrin II können verwendet werden, um beispielsweise Antikörper gegen Fibrinogen oder Fibrin- I-Fragmente zu tiermedizinischer Verwendung zu erzeugen. Solche Antikörper können ebenso in Studien verwendet werden, welche sich mit experimenteller Thrombose oder thrombolytischer Therapie befassen. Es ist allerdings zu bemerken, daß bei der Behandlung einer bestimmten Art von Tier der Antikörper von einer verschiedenen Tierart stammen sollte.
Der erfindungsgemäße Test kann zur Messung von Fibrinogen- oder Fibrinabbauprodukten in einer Anzahl von Gruppen traumatisierter Patienten verwendet werden, beispielsweise Patienten mit Verbrennungen, Patienten mit Kopf- oder anderen Körperverletzungen, einer Operation unterzogenen Patienten (wobei die Teste vor, während oder nach der Operation erfolgen können), unter anderem Operationen am offenen Herzen und Coronar-Bypaßoperationen, Hämodialysepatienten, Krebspatienten und Patienten mit Thrombose an tiefgelegenen Venen. Altere Patienten, die sich einer Hüftoperation unterziehen, können beispielsweise akute Thrombose an tiefgelegenen Venen entwickeln. Um diesen Zustand zu lindern, können zweierlei therapeutische Verfahrensweisen angewandt werden, d. h. ein Eingriff zur Entfernung des Thrombins (Gerinnseln) oder Auflösung von Thrombin durch fibrinolytische Agenzien, wie durch Streptokinase oder einen Gewebstyp-Plasminogen-Aktivator (t-PA). Die erfindungsgemäßen Verfahrensweisen können angewandt werden, um die frühesten Stadien der Auflösung von Gerinnsel nachzuweisen, wie durch die vorgenannten thrombolytischen Agenzien indiziert. Die erfindungsgemäßen Verfahrensweisen können zum Nachweis von Fibrinogen- oder Fibrinabbauprodukten bei jeglichem Patienten, der an occlusiver Thrombose leiden könnte oder die Möglichkeit dazu hätte, verwendet werden.
Das erfindungsgemäße MAb/T2G1s kann therapeutisch angewandt werden, um Fibrin II aus dem Blutstrom eines Patienten zu entfernen, der occlusive Thromben entwickeln könnte. Z.B. kann zur Bewirkung solcher Entfernung die Hämodialyse angewandt werden. Bei der Anwendung der Hämodialyse wird das MAb/T2G1s auf Feststoffträger immobilisiert, z. B. auf Glaskörnern. Der Komplex aus auf Feststoffträger immobilisiertem MAb/T2G1s wird dann in die Hämodialysekammer gegeben, und zwar an einer Stelle in der Kammer vor der Rückkehr des Blutes zum Patienten. Entsprechend bewirkt während der Hämodialyse solche Art des Blutstroms durch die Hämodialysekammer, daß das Blut mit dem immobilisierten monoklonalen Antikörper in Berührung kommt, im wesentlichen eine "Reinigung" des Bluts von Fibrin II, bevor das Blut in das Kreislaufsystem des Patienten zurückkehrt.
Die vorliegende Erfindung wird nun im folgenden unter Hinweis auf die nicht-begrenzenden Beispiele beschrieben.

Beispiele

Beispiel 1:

Herstellung von N-DSK, (T)N-DSK & verwandter Fragmente

Human-Fibrinogen wurde von IMCO Corporation Ltd. (Stockholm Schweden) erhalten. N-DSX wurde aus dem Fibrinogen im wesentlichen gemäß der Technik von Blomback et al., J. Biol.Chem., 248, 5806-5820, 1973 hergestellt. Anstelle der Gegenstromverteilung wurde aber die Ionenaustausch- Chromatographie an Sephadex DEAE A50 (Pharmacia, Piscataway; New Jersey) angewandt.
Teilweise reines N-DSK wurde in 0,1-molarem Tris, pH 7,5, auf das Ionenaustauschharz aufgegeben. Das N-DSK wurde aus der Säule mittels eines linearen Salzgradienten aus 0,1-molarem Tris, pH 7,5 (Startpufferlösung), und 0,1-molarem Tris, pH 7,5, enthaltend zusätzlich 0,3-molares NaCl (Endpufferlösung), eluiert. N-DSK oder N-DSK enthaltende Fraktionen aus jeglichem Stadium der Reinigungsprozedur wurden niemals durch Gefriertrocknung konzentriert.
(T)N-DSK und (B)N-DSK wurden durch Abbau von Fibringelen mit Thrombin [Human-Thrombin, 3000 NIH-Einheiten/mg Protein (Sigma, St. Louis, MO)] bzw. Batroxobin [unlöslich gemachtes Enzym aus dem Gift von Bathrops atrox marajoensis, 20 Batroxobin-Einheiten/ml Suspension (Pentapharm Ltd., Basel, Schweiz)] hergestellt. Fibrinogenlösungen wurden wie von Koehn und Canfield, Analyt.Biochem., 116, 349-356, 1981 zubereitet. Die Gerinnung wurde durch Zugabe von 5 Einheiten/ml (Thrombin oder Batroxobin) eingeleitet und der Abbau etwa 6 Stunden bei 37ºC fortgeführt. Die Spaltung mit CNBr und alle anschließenden Isolierungsverfahrensweisen waren mit der für N-DSK beschriebenen Verfahrensweise identisch. (T)N-DSK wurde auch direkt aus N-DSK hergestellt. Lösungen (0,5-1,0 mg/ml) des letzteren wurden in 0,1-molarem Tris enthaltend 0,15-molares NaCl, pH 7,5, zubereitet und diese wurden später in zwei gleiche Fraktionen aufgeteilt. Thrombin (10 NIH-Einheiten/ml) wurde einem Teil zugegeben und ein gleiches Volumen Salzlösung dem anderen Teil zugegeben. Beide Proben wurden 4 Stunden bei 37ºC inkubiert, danach wurde beiden Proben ein Teil (10 ul einer 0,9x10&supmin;&sup4;-molaren Vorratslösung/ml Aufschlußgemisch) des hochspezifischen Thrombin-Inhibitors D-Phe-Pro-Arg-CH&sub2;Cl (Calbiochem - Behring, San Diego, Kalifornien) zugegeben. Fibrinpeptid A (FPA)- und Fibrinpeptid B (FPB)-Radioimmunassays wurden zur Messung der Thrombinspaltprodukte angewandt. Der FPA-Test wurde unter Verwendung der Testpackung und Verfahrensweise von IMCO Corporation Ltd. (Stockholm, Schweden) durchgeführt. Der FPB-Test wurde gemäß der Verfahrensweise von Bilezikian et al., J.Clin. Invest, 56, 438-445, 1975 vorgenommen. Ketten auf Basis von N-DSK wie auch Plasmin-Abbauprodukte von Fibrinogen wurden wie früher beschrieben hergestellt (Blombäck et al., J. Biol. Chem., 241 1496-1512, 1972 und J. Biol. Chem., 248, 5806-5820, 1973; Gardlund et al., Thromb. Res., 1, 371-388, 1972)
Zur Bestimmung der Reinheit von N-DSK und damit verwandten Fragmenten wurden verschiedenartige Techniken angewandt. Analytische und präparative Chromatographie wurden unter Anwendung der Flüssigchromatographie-Einrichtung von Hewlett-Packard 1084B durchgeführt. Die Bedingungen für die Säule und die Chromatographie sind durch Koehn and Canfield, Analyt. Biochem., 116, 349-356, 1981 beschrieben.
Der Elektroimmunassay für N-DSK und verwandte Strukturen war denen aus früheren Beschreibungen ähnlich, (Kudryk et al., siehe oben 1982) Gele wurden zubereitet durch Vermischen von N-DSK-Antiseren (2416) mit heißen Gellösungen zu einer Antiserumkonzentration von etwa 0,4%. Die Gelelektrophorese und die Aminosäureanalyse erfolgten wie beschrieben (Blombäck et al., J.Biol. Chem., 248, 5806-5820, 1973; Hessel et al., Eur. J. Biochem. , 98 521-534, 1979)
Die mit Disulfidbindungen überbrückten N-DSK, (T)N-DSK und (B)N-DSK zeigten leichte aber nachweisbare Mobilitätsunterschiede auf 7%-igen Acrylamidgelen in SDS, wie in Abb. 1 gezeigt. Nach der Reduktion wurde ein charakteristisches Bandenmuster für die Ketten jedes Fragments auf 10%-igen Acrylamidgelen in SDS (nicht gezeigt) erhalten. D.h., daß N-DSK und (B)N-DSK sich lediglich in der Beweglichkeit der Aα-Kette unterschieden. Beim Vergleich mit N-DSK zeigte reduziertes (T)N-DSK in Bezug auf sowohl die Aα- als auch die Bβ-Ketten verschiedene Beweglichkeiten. Diese Beobachtungen standen in Übereinstimmung mit den Berichten anderer Autoren (Hessel, Doktorarbeit, Chem. Dept. Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden, 1975; Hessel et al., Eur.J.Biochem., 98, 521-534, 1979). Um den Gehalt an Fibrinpeptidbestandteil jeder Probe zu bestimmen, wurden die drei N-DSK-Arten mit Thrombin behandelt. Anschließend wurde jedes Aufschlußgemisch auf 9% Trichloressigsäure-Konzentration eingestellt und die Thrombinspaltpeptide, sofern vorhanden, aus dem Überstand durch Adsorption an Sep-Pak- C&sub1;&sub8;-Patronen isoliert, wie früher beschrieben (Koehn and Canfield, siehe oben 1981). Die Peptide wurden später durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) identifiziert, siehe Abb. 2. Sowohl FPA als auch FPB wurden aus N-DSK freigesetzt (Abb. 2a). Das aus dem Thrombinaufschluß von (B)N-DSK gewonnene Hauptpeptid war FPB (Abb. 2b). Keine Peptide wurden freigesetzt aus gelfiltriertem (T)N-DSK nach einem zweiten Aufschluß mit Thrombin.
Die Kettenbestandteile von N-DSK ergaben auf 10%-igen Acrylamidgelen Einzelbanden und Aminosäurezusammensetzungen, welche mit den bereits beschriebenen übereinstimmten (Blombäck et al., siehe oben, 1972,1973; Hessel et al., siehe oben, 1979).
Das Peptid Bβ 1-42 wurde wie folgt durch Aktivierung plasminogenhaltiger Fibrinogenlösungen hergestellt. IMCO- Fibrinogen (Charge F-171) wurde auf eine Konzentration von etwa 4,0 mg/ml in 0,05-molaren Tris, pH 7,4, verdünnt. Nach Zugabe von 100 Einheiten/ml Streptokinase [Charge 112F- 0373), 4500 Einheiten/mg Feststoff, Sigma, St. Louis, MO] ließ man bei. 37ºC während 60 Min. den Abbau vonstatten gehen. Danach wurde das meiste an nicht abgebautem Fibrinogen durch 30-minütiges Erhitzen auf 60ºC ausgefällt. Nach Zentrifugieren wurde der Überstand über eine Sep-Pac- C&sub1;&sub8;-Patrone geleitet (Waters Associates, Milford, MA). Die adsorbierten Peptide, u. a. Bβ 1-42, wurden mit 50%-igem Acetonitril eluiert. Um das Bβ 1-42-Peptid zu reinigen, wurde später die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) angewandt. Die Säulen- und Verfahrensbedingungen waren im wesentlichen wie von Koehn & Canfield, Analyt.Biochem. 116, 349-356, 1981 beschrieben.
Die als Folge der Streptokinaseaktivierung aus Fibrinogen freigesetzten Peptide ergaben ein sehr komplexes HPLC-Muster (nicht gezeigt). Bei Verfolgung der Immunreaktivität der HPLC-Fraktionen mittels des Bβ 15-42-Radioimmunassays wie früher beschrieben (Kudryk et al., siehe oben, 1982) wurden mehrere reaktive Peaks erhalten. Einer davon wurde mittels präparativer HPLC-Versuche isoliert. Wie in Abb. 9a gezeigt, reagierte der bei oder nahe der Fraktion 16 eluierte Peak mit Kaninchenantiserum auf Bβ 15-42. Diese Ergebnisse waren erwartet, da dieses Antiserum Bβ 15-42 von Bβ1-42 nicht unterscheiden kann. (Kudryk et al, siehe oben, 1982). Wenn ein Aliquot desselben Materials, Bβ 1-42, mit Human-Thrombin aufgeschlossen und unter denselben Bedingungen wieder chromatographiert wurde, wurde das in Abb. 9b gezeigte Muster beobachtet. Als Folge des Thrombinaufschlusses verschwand der in Abb. 9a gezeigte Peak und es traten zwei neue Peaks auf. Einer davon ließ sich bei oder nahe bei den Fraktionen 6-8 eluieren und reagierte im Bβ15-42-Immunassay. Dieses Material wurde als Bβ15-42 identifiziert und entstand bei der Thrombinspaltung von B
Bezugszeichenliste
1-42 an der Bindung 14Arg-15Gly. Das IMCO-Standardmaterial Bβ15-42 ließ sich nach der Trennung mittels HPLC unter denselben Bedingungen (nicht gezeigt) ebenso bei dieser Position eluieren. Der zweite Peak, der bei oder nahe bei der Fraktion 21 eluiert wurde, konnte als FPB identifiziert werden. Dies konnte über die bekannte Elutionsposition des FPB-Standards im HPLC-System bestätigt werden. Außerdem reagierte der Peak der Fraktion 21 im FPB-Radioimmunassay (nicht gezeigt).
Das Peptid Bβ 15-42 wurde aus IMCO erhalten, oder direkt aus Bβ 1-42 hergestellt auf dem Wege des vorstehend beschriebenen Abbaus mit Human-Thrombin [3000 NIH-Einheiten/mg Protein, Sigma, St. Louis, MO]. Bei letzterer Verfahrensweise wurde Bβ 1-42 in 0,2-molarem NH&sub4;HCO&sub3; (pH 8,0) gelöst und 90 Minuten bei 37ºC aufgeschlossen. Nach dieser Zeit wurde ein Aliquot (10 ul einer 0,9·10&supmin;&sup4;-molaren Vorratslösung pro ml Aufschlußgemisch) des hochspezifischen Thrombininhibitors D-Phe-Pro-Arg-CH&sub2;Cl (Calbiochem-Behring, San Diego, CA) zugegeben, um den Abbau zu unterbrechen.

Beispiel 2:

Erzeugung monoklonaler Antikörper

Zur Erzeugung von MAb/1-8C6 wurden Mäuse vom Typ BALB/cJ (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) jeweils intraperitoneal (i.p.) mit 0,1 ml einer Emulsion von N-DSK- Lösung (4 mg/ml) und einem gleichen Volumen von vollständigem Freund-Adjuvans immunisiert. Zur Erzeugung von MAb/T2G1 wurden BALB/cJ-Mäuse jeweils i.p. mit 100 ug (T)N-DSK, vermischt mit vollständigem Freund-Adjuvans, immunisiert. In beiden Fällen wurden die Mäuse im wöchentlichen Abstand mit derselben Dosis (unter Verwendung von unvollständigem Freund-Adjuvans) viermal geboostet. Im Fall der Erzeugung von MAB/1-8C6 wurden die Tiere nach 10-wöchiger Pause intravenös (i.v.) unter Verwendung von 100 ug N-DSK in Tris- Salzlösung geboostet. Im Falle der Erzeugung von MAb/T2G1 wurden die Tiere 5 Wochen nach der Erstinjektion i.v. mit 100 ug (T)N-DSK in Tris-Salzlösung geboostet. In beiden Fällen wurde die Milz aus den Mäusen drei Tage später entfernt und eine Einzelzellsuspension durch Pressen des Gewebes durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl hergestellt.
In beiden Fällen erfolgte die Zellfusion gemäß der von Köhler und Milstein, Eur.J.Immun., 6, 511-519, 1976 entwickelten Verfahrensweise. Die Milzzellen wurden mit Myelomzellen [P3X63Ag8.653] in einem Verhältnis von entweder 4:1 (MAb/1-8C6) oder 7:1 (MAb/T2G1s) in 35%-igem Polyethylenglycol-1000 (Koch-Light Labs, Colmbrook, U.K.) in RPMI-1640-Medium (GIBCO Labs, Grand Island, N.Y.) bei Raumtemperatur 1 Minute lang fusioniert. Die Zellen wurden pellettiert, gewaschen und wieder in 215 ml RPMI 1640 enthaltend 10% NCTC 109 (MA Bioproducts, Walkersville, MD) und 20% fötales Kälberserum (Sterile Systems, Logan VT) suspendiert. Normale Milzzellen (108) wurden als Füllschicht zugegeben. Nach Inkubation über Nacht in einer 5% CO&sub2; enthaltenden befeuchteten Atmosphäre bei 37ºC wurde zur Einleitung der HAT-Selektion Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin(HAT)-Medium zugegeben. (Littlefield, Science, 145, 709-710, 1964). Nach Inkubation über Nacht in 5%-igem CO&sub2; bei 37ºC wurden die Zellen in demselben HAT-Medium durch begrenzende Verdünnung auf Kulturplatten mit 96 Vertiefungen [Costar 3596 (Cambridge, MA)] geklont. Hybridomklone wurden 16 Stunden lang kultiviert und dann die Medien auf Antikörper untersucht.

Beispiel 3:

Nachweis von durch Hybridome erzeugten anti- N-DSK - und anti-(T)N-DSK-Antikörpern

Die einleitende Überprüfung der Hybridomkulturmedien erfolgte nach der ELISA-Methode von Engvall, Methods in Enzymology, 70 (Teil A), 419-439, 1980, Acad.Press, N.Y. Die Klonkulturflüssigkeiten wurden auf Mikrotiterplatten aus Polyvinyl klassifiziert (Costar, Cambridge, MA), wobei jede Vertiefung eines von 6 Antigenen enthielt: Fibrinogen, N- DSK, (T)N-DSK, die Aα 1-51-, Bβ 1-118- oder γ 1-78-Ketten von N-DSK, bei einer Konzentration von etwa 5-15 ug/ml in Na&sub2;CO&sub3;/NaHCO&sub3;, pH 9,6. Ein Aliquot von unverdünnter Klonkulturflüssigkeit wurde in jede der 6 "Antigen" -Vertiefungen gegeben. Nach Inkubation und anschließendem Waschzyklus wurde eine geeignete Verdünnung von Reagens auf Basis von Peroxidase-konjugiertem Kaninchen-Immunglobulin gegen Mäuse-Immunglobulin [Accurate Chemicals, Westbury, N.Y.] zugegeben. Enzymgekoppelte IgG-Bindung wurde mit einer H&sub2;O&sub2;- und o-Dianisidinlösung nachgewiesen. Die Farbintensität wurde automatisch mit einem Mikro-ELISA-Autoreader MR580 (Dynatech, Alexandria, VA.) gemessen.
Unter den 182 auf nachweisbare anti-N-DSK-Antikörper getesteten Hybridomklonen erzeugte einer (ATCC HB 8418) eine hohe Konzentration an Antikörper, welcher nicht nur mit dem Immunogen (N-DSK), sondern auch mit intaktem Fibrinogen, (B)N-DSK, Bβ 1-118 und Bβ 1-42 reagierte. Eine große Menge an MAb/1-8C6 wurde bei der Kultivierung des Hybridoms in RPMI 1640, enthaltend 10% NCTC 109 und 20% fötales Kälberserum, erhalten.
Später wurde MAb/1-8C6 durch Fällung mit halbgesättigtem Ammoniumsulfat gereinigt und das aus der zweiten Fällung erhaltene IgG in 0,1-molarem Tris enthaltend 0,02% NaN&sub3; (pH 7,5), gelöst. Die Endlösung machte 1/10 des ursprünglichen Volumens des Kulturmediums aus. Die IgG-Klasse wurde nach Ouchterlony unter Verwendung von Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin enthaltenden klassenspezifischen Antiseren bestimmt (Litton Bionetics Inc., Charleston, SC). Wie in Abb. 3 gezeigt, reagierte MAb/1-8C6 nur mit IgG2a-Antiserum. Die Klasse der leichten Kette des Antikörpers wurde nicht bestimmt.
Unter den 1632 auf anti-(T)N-DSK-Antikörper getesteten Hybridomklonen erzeugten 247 Klone eine sehr hohe Konzentration solcher Antikörper. Die meisten dieser Klonkulturflüssigkeiten reagierten auch auf Platten, die mit N-DSK und Fibrinogen überschichtet worden waren. Allerdings erzeugte das Klon T2G1 Antikörper, welche zusätzlich zur Bindung an alle vorstehend genannten 3 beschichteten Platten auch den ¹²³J-markierten Bβ15-42-Liganden in Lösung banden. Aufgrund seiner vielfältigen Kreuzreaktivität wurde T2G1 als gemischtes Klon angesehen und daher der Subklonierung unterworfen. Ausgehend von der letzteren Prozedur konnte gezeigt werden, daß aus den 96 getesteten Proben ein einzelner Klon (T2G1s) einen Antikörper absonderte, welcher auf ELISA lediglich mit (T)N-DSK-beschichteten Platten reagierte und auch fähig war, ¹²&sup5;J-markierten Bβ 15-42-Liganden in Lösung zu binden.
Nach der Subklonierung wurde eine Massenkultur von Klon T2G1s in RPMI 1640, enthaltend 10% NCTC 109 und 20% Fötal-Kälberserum, hergestellt. Der Antikörper [MAb/T2G1s]; welcher sich in dem verbrauchten Medium dieses Hybridoms anhäufte, wurde durch Fällung mit halbgesättigtem Ammoniumsulfat gereinigt und das aus der zweiten Fällung erhaltene IgG in 0,1-molarem Tris enthaltend 0,02% NaNa&sub3; (pH 7,5) gelöst. Die Endlösung machte 1/10 des ursprünglichen Volumens des Kulturmediums aus. Gemäß der Bestimmung mit dem Ouchterlony-Test, wie vorstehend beschrieben, reagierte MAb/T2G1s nur mit IgG&sub1;-Antiserum. Die Klasse der leichten Kette von MAb/T2G1s wurde nicht bestimmt.

Beispiel 4:

Spezifität von MAb/1-8C6 gegenüber N-DSK und verwandten Strukturen

Wie früher beschrieben, wurde die ursprüngliche Kulturflüssigkeit des Hybridomklons 1-8C6 (ATCC HB8418) durch ELISA auf mit N-DSK oder mit jeglicher der früher erwähnten verwandten Strukturen beschichteten Platten getestet. Stark positive Reaktion wurde erhalten auf Platten mit entweder N-DSK, Fibrinogen oder Bβ 1-118. Mit (T)N-DSK, Aα1-52 oder γ 1-78 beschichtete Platten reagierten nicht. Die Spezifität von MAb/1-8C6 wurde weiter durch kompetitiven Immunassay unter Verwendung von ELISA- und Radioimmunassaymethoden überprüft. ELISA wurde als 2-Stufenverfahren angewandt. Mikrotiterplatten wurden 16 Stunden bei 4ºC mit Bβ 1-118 (5 ug/ml) überschichtet. MAb/1-8C6 wurde mit TPBS (phosphatgepufferte ein Tensid (Tween-20) enthaltende Salzlösung) verdünnt und ergab so einen A&sub4;&sub9;&sub0;/10 Minuten Wert von 1,5-2,0. Diese Verdünnung des Antikörpers wurde mit dem Standard (Bβ 1-118) oder jeglichem anderen erwünschten Konkurrenzstoff gemischt und auf die Platte gegeben. Nach dem Waschen wurde die an die Festphase gebundene Menge an MAb/1-8C6 unter Verwendung des Enzym-anti-Immunglobulin- Konjugats nachgewiesen. Das Substrat und die farbgebenden Lösungen wurden früher schon beschrieben (siehe Beispiel 3). In diesen Tests ergab sich, daß Bβ 1-118, N-DSK und intaktes Fibrinogen mit MAb/1-8C6 reagierten (T)N-DSK, A-1-51 und γ 1-78 reagierten nicht, obwohl alle für den Test verwendeten Lösungen davon einen etwa 100-fachen molaren Überschuß im Vergleich zu Bβ 1-118 N-DSK oder intaktem Fibrinogen aufwiesen.
Identische Ergebnisse wurden nach ELISA unter Verwendung mit entweder N-DSK oder intaktem Fibrinogen beschichteter Platten erhalten.
Im Radioimmunassay bestand der Ligand aus ¹²&sup5;J-markiertem Bβ1-118. Letzterer wurde unter Anwendung der für die Jodierung des Bβ15-42-Peptids aus Human-Fibrinogen beschriebenen Verfahrensweise hergestellt (Kudryk et al., siehe oben 1982). Der gebundene Ligand wurde unter Verwendung von Sac-Cel (donkey anti-mouse cellulose suspensions) abgetrennt, unter Beachtung der vom Hersteller gegebenen Empfehlungen (Wellcome Diagnostics, Research Triangle Park, NC). Der Radioimmunassay bestand aus vier Teilen und schloß zwei getrennte Inkubationsperioden ein. Das Testverfahren war fast identisch mit dem kürzlich von Kudryk et al., (siehe oben 1982) beschriebenen Verfahren, mit den Abweichungen in Bezug auf den Liganden und den zweiten Antikörper, wie schon früher angegeben.
Geeignete Verdünnungen von MAb/1-8C6 und Sac-Cel konnten fast 90% des ¹²³J-markierten Bβ1-118-Liganden binden. Im Radioimmunassay wurden Verdünnungen dieser Reagenzien ausgewählt und ergaben etwa 40%-ige Bindung von Ligand in Abwesenheit jeglichen kalten Konkurrenzstoffs. In diesen Versuchen überstieg die nicht-spezifische Bindung des Liganden nicht die 5%, wenn Puffer oder aus einer Vergleichs-Klonkulturflüssigkeit isoliertes IgG gegen MAb/1-8C6 ausgetauscht wurde. Die spezifische Bindung des Liganden wurde durch steigende Mengen von "kaltem" Bβ1-118 fortschreitend gehemmt. Wie in Abb. 4 gezeigt, wurde bei einer Konzentration von annähernd 5·10&supmin;&sup4; Mol eine 50%-ige Heimung der Ligandenbildung erzielt. Fibrinogen, N-DSK und (B)N-DSK zeigten alle eine starke Konkurrenz. Nach Abb.4 scheint N-DSK ein etwas schwächerer Konkurrenzstoff zu sein im Vergleich zu intaktem Fibrinogen und (B)N-DSK. Allerdings wurden in Folgeversuchen unter Verwendung verschiedener Chargen an N-DSK Hemmkurven erhalten, welche mit Fibrinogen und (B)N-DSK übereinstimmten (nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu konkurrierte (T)N-DSK in dem in Abb. 4 gegebenen Konzentrationsbereich nicht und wurde daher nicht durch MAb/1-8C6 gebunden. Dies wurde mit jeder untersuchten Charge von (T)N-DSK beobachtet. Es wurde eine geringfügige Konkurrenz mit (T)N-DSK nachgewiesen, jedoch nur bei einer Konzentration von über 10&supmin;&sup6; Mol.
Aufgrund der bekannten Spezifität von Thrombin und des Reaktivitätsunterschieds zwischen Bβ1-118 und (T)N-DSK in Bezug auf MAb/1-8C6 wurde Bβ 1-118 mit Thrombin aufgeschlossen, um es als Konkurrenzstoff im Radioimmunassay zu verwenden. Wie in Abb. 5 gezeigt, ergab sich für Bβ 1-118 nach Thrombinspaltung eine eindeutige Mobilitätsveränderung. Dies wurde sowohl an 7- als auch an 10%-igen Acrylamid-Gelen in SDS beobachtet. Diese Mobilitätsänderung stimmt überein mit den von Hessel et al. (siehe oben, 1979) berichteten Befunden und spiegelt die Spaltung der Bindung bei Bβ14Arg-15Gly durch Thrombin wider. Abb. 6 veranschaulicht die mit Bβ1-118 vor und nach Thrombinaufschluß erhaltenen Konkurrenzkurven. Wie man sehen kann, braucht man einen annähernd 2000-fachen molaren Überschuß an abgebauter Kette, um dieselbe Hemmung wie mit nicht-abgebautem Bβ 1-118 zu erzielen. Reines FPB, Bβ 15-42 oder Gemische der beiden Peptide traten im Radioimmunassay im in Abb. 6 gezeigten Konzentrationsbereich nicht in Konkurrenz.
Der Reaktivitätsunterschied zwischen Bβ 1-118 allein und als Teil einer vielkettigen Struktur kann auf den Umstand zurückzuführen sein, daß das Epitop, auf welches MAb/1-8C6 gerichtet ist, nur vollständig reaktiv ist, wenn es auf Fibrinogen und verwandten disulfid-verbrückten Fragmenten oberflächenorientiert vorliegt.
Wie in Abb. 6 gezeigt, ging die meiste Reaktivität von Bβ1-118 verloren, wenn die Kette mit Thrombin abgebaut wurde. Dieses Ergebnis führt zusammen mit der Tatsache, daß (T)N-DSK, freies Bβ 1-14 (FPB) wie auch Bβ 15-42 nicht mit MAb/1-8C6 reagierten, klar vor Augen, daß dieser Antikörper sich auf ein Epitop in der oder rund um die thrombinempfindliche Bindung zwischen Bβ 14Arg-15Gly richtet. Wenn letztere mit Thrombin vollständig gespalten ist, wird alle Immunreaktivität von Bβ 1-118 und verwandten Strukturen aufgehoben.

Beispiel 5:

Spezifität von MAb/T2G1s

Die Spezifität von MAb/T2G1s wurde nach der ELISA- Methode getestet. Mikrotiterplatten wurden 16 Stunden bei 4ºC mit (T)N-DSK (0,8 ug/ml) beschichtet. MAb/T2G1s wurde in TPBS verdünnt und ergab damit einen A&sub4;&sub9;&sub0;/5-Minutenwert von etwa 1,6. Diese Antikörperverdünnung wurde mit Verdünnungen des gewünschten Konkurrenzstoffes gemischt und auf die Platte gegeben. Nach dem Waschen wurde der an die Festphase gebundene Antikörper wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 3) nachgewiesen.
Im ELISA-Test reagierte MAb/T2G1s stark mit (T)N-DSK-beschichteten Platten. Da dieser Antikörper auch den ¹²&sup5;J-markierten Bβ15-42 Liganden in Lösung band, wurden Versuche unternommen, die Platten mit dem Peptid zu beschichten und zu zeigen, daß MAb/T2G1s sich an solche Platten bindet. In diesen Versuchen wurden Vorratslösungen [0,050,1 ug/ml] von Bβ15-42-Peptid in vorstehend beschriebenem Kopplungspuffer zubereitet. Mit diesen Lösungen beschichtete Platten zeigten spezifische Bindung von MAb/T2G1s. Ähnliche Ergebnisse wurden auf Platten erzielt, die mit Bβ 1-42 beschichtet waren, welches mit Thrombin aufgeschlossen war. MAb/T2G1s wurde nicht an mit Bβ 1-42 beschichteten Platten gebunden. In Abb. 10 werden die Ergebnisse eines ELISA-Konkurrenzversuchs unter Verwendung von mit (T)N-DSK beschichteten Platten und MAb/T2G1s gezeigt. Die verwendeten Konkurrenzstoffe waren Bβ 1-42 vor und nach Abbau mit Thrombin. Das Bβ15-42-Peptid ergab eine ähnliche Konkurrenzkurve, wie sie an mit Thrombin aufgeschlossenem Bβ 1-42 beobachtet wurde.
Ebenso wurde ein Radioimmunassay angewandt, um die Spezifität von MAb/T2G1s zu prüfen. Der verwendete Ligand war ¹²&sup9;J-markiertes Bβ 15-42. Letzteres wurde unter Anwendung der bereits beschriebenen Verfahrensweise (Kudryk et al., siehe oben 1982) hergestellt. Der gebundene Ligand wurde unter Verwendung von Sac-Cel (donkey anti-mouse-immunoglobulin cellulose suspensions) abgetrennt unter Beachtung der vom Hersteller gegebenen Empfehlungen (Wellcome Diagnostics, Research Triangle Park, NC). Der Radioimmunassay bestand aus vier Teilen und schloß zwei getrennte Inkubationsperioden ein und war fast identisch mit dem von Kudryk et al. (siehe oben 1982) beschriebenen Test, mit der Abweichung bezüglich des spezifischen [MAb/T2G1s] und des zweiten Antikörpers wie vorstehend angegeben.
Geeignete Verdünnungen des Antikörpers und des zweiten Antikörpers (Sac-Cel) wurden so ausgewählt, daß sich etwa 40%-ige Bindung des ¹²&sup5;J-markierten Bβ 15-42-Liganden in Abwesenheit eines Konkurrenzstoffes ergab. Wie in Abb. 11 gezeigt, wurde die Bindung dieses Liganden durch zunehmende Mengen von "kaltem" Bβ15-42-Standard gehemmt. Der 50%-ige Verdrängungsgrad wurde erreicht bei einer Konzentration von etwa 2·10&supmin;&sup4; Mol. Ähnliche Hemmung wurde beobachtet an mit Thrombin aufgeschlossenem Bβ1-42 und (T)N-DSK (nicht gezeigt). Intaktes Bβ 1-42, N-DSK und (B)N-DSK zeigten wenig Hemmung, wenn überhaupt. Verschiedene Chargen von IMCO-Fibrinogen zeigten leichte Hemmung. Allerdings lagen die molaren Verhältnisse der maximalen Verdrängung des Liganden gegen Bβ 15-42 im Vergleich mit intaktem Fibrinogen im Größenordnungsbereich von 1:250.
Aufgrund der in Abb. 10 und Abb. 11 gezeigten Daten werden die vorstehenden Ergebnisse auf folgende Weise interpretiert. Da FPB ein Teil von Bβ 1-42 ist und sowohl bei (T)N-DSK als auch bei Bβ15-42 fehlt, scheint es naheliegend, daß eine Immunreaktivität zwischen MAb/T2G1s und Fibrinogen oder dessen Fragmenten in allen Antigenen einer vorhergehenden Spaltung der Bindung Bβ14-Arg-15Gly bedarf.
Wie in Abb. 11 gezeigt, wurde mit MAb/T2G1s und intaktem Fibrinogen eine leichte, aber meßbare Kreuzreaktion nachgewiesen. Wie bereits erwähnt, wurde dies mit mehreren verschiedenen Chargen von IMCO-Fibrinogen beobachtet. Eine Erklärung dafür ist, daß solche Fibrinogenzubereitungen eine kleine Menge von Fibrin enthalten, welches als Fibrinogen- Fibrinkomplex in Lösung verbleibt [Scheinoff & Page, 1962]. Dies wird unterstützt durch die Tatsache, daß NH&sub2;-terminale Analysen an solchen Zubereitungen meistens immer geringe Mengen an Glycin aufzeigen. Diese Aminosäure stellt den neuen NH&sub2;-terminalen Rest dar, wenn sowohl FPA als auch FPB infolge der Thrombinwirkung freigesetzt werden [Blombäck & Yamashina, 1958].
Wie in Beispiel 4 beschrieben wurde, zeigte MAb/1-8C6 eine vollständige Kreuzreaktion mit intaktem Fibrinogen. Da MAb/T2G1s nur geringfügig mit verschiedenen Fibrinogenzubereitungen reagiert, waren solche Reaktionen wahrscheinlich auf Spuren von Fibrinverunreinigungen zu rückzuführen. Um den Reaktivitätsunterschied dieser zwei Antikörper gegenüber Fibrinogen zu vergleichen, wurde ein sehr einfacher Versuch mit fibrinogenbeschichteten ELISA- Platten ausgearbeitet. Bei der Zubereitung von mit Fibrino gen und Fibrin beschichteten ELISA-Platten wurde INCO-Fibrinogen (Charge F-155, 4,3 mg/ml) 11500 mit Na&sub2;CO&sub3;/NaHCO&sub3;, pH 9,6, verdünnt und 16 Stunden bei 4ºC auf Polyvinyl-Mikrotiterplatten beschichtet. Nach dem Waschen, "Blockieren" mit 5% BSA [RIA-reines BSA, Sigma, St. Louis, MO] und anschließendem Waschen wurden 100 ul Human-Thrombin [Sigma, St. Louis, MO]-Vorratslösung (1 NIH Einheit/ml in n-Salzlösung) in jede Vertiefung gegeben. Nach ausgewählten Zeitabschnitten wurde das Thrombin durch Zugabe eines gleichen Volumens der vorstehend angegebenen D-Phe-Pro-Arg-CH&sub2;Cl- Vorratslösung gehemmt. Anschließende Waschungen, Reaktionen und Nachweis von gebundenem Antikörper erfolgten in identischer Weise wie vorstehend beschrieben.
Wie in Abb. 12 gezeigt, wurden signifikante A&sub4;&sub9;&sub0;/5-Minuten-Werte mit MAb/1-8C6 erhalten, wenn diese, mit Fibrinogen beschichteten Vertiefungen zugegeben wurde, welche 90 Sekunden oder kürzer mit Thrombinlösung behandelt worden waren. Wenn dieser Antikörper in mit länger als 90 Sekunden lang mit Thrombin behandelte Vertiefungen gegeben wurde, ergab sich ein scharfer Abfall der Farbe, was eine Abnahme der Antikörperbindung bedeutete. Das vollständig vorhersehbare umgekehrte Ergebnis wurde mit MAb/T2G1s erzielt. Es wurde nur eine Hintergrundfarbe beobachtet, wenn dieser Antikörper in nicht-behandelte Vertiefungen gegeben wurde. Allerdings wurden bei zunehmender Zeit der Exposition an Thrombin hochsignifikante A&sub4;&sub9;&sub0;/5-Minutenwerte aufgenommen. Diese Ergebnisse legen nahe, daß der Thrombinabbau in zunehmenden Maße auf der Oberfläche der ELISA-Platte ein Neoepitop freilegte, und daß MAb/2G1s fähig war, mit diesem Neoepitop zu reagieren und sich daran zu binden.

Beispiel 6:

Klinische Anwendungen von MAb/1-8C6

Nachdem die Spezifität von MAb/1-8C6 sichergestellt war, lag daran, seine Brauchbarkeit in klinischen Untersuchungen zu studieren. Zu diesem Zweck wurde Blut von urämischen Patienten in ausgewählten Abständen während der Hämodialyse gesammelt. Die Sammlung und Aufarbeitung erfolgten in identischer Weise wie bereits beschrieben (Kudry et al., Thromb. Res., 25, 277-291, 1982). Um die letzten Spuren von Fibrinogen zu entfernen, wurden lyophilisierte Ethanolextrakte von Patientenplasma weiter gemäß der Verfahrensweise von Koehn and Canfield, Analyt.Biochem, 116, 349-456, 1981 an Einweg-Patronen mit Sep-Pak-C&sub1;&sub8; (Waters Associates, Milford, MA) gereinigt.
In vorangegangenen Versuchen wurde bestimmt, daß solche Patienten sehr hohe Gehalte an Bβ15-42-immunreaktivem Material aufwiesen, d. h. soviel wie das 40- oder mehrfache der 0,41 pMol/ml, die man in normalen Patienten findet (Kudryk et al., siehe oben, 1982). In der vorliegenden Studie lag daran, zu bestimmen, wieviel Prozent, wenn überhaupt, an Bβ15-42-immunreaktivem Material, das man normalerweise in dieser Patientengruppe auffindet, mit MAb/1-8C6 kreuzreagieren würde.
Da Fibrinogen mit MAb/1-8C6 reagiert (Abb. 4), wurden nach schon beschriebenen Methoden (Kudryk et al., siehe oben, 1982) zubereitete Extrakte aus Patientenplasma weiter an Sep-Pak-Cia-Patronen gereinigt. Später wurden die Proben in zwei Fraktionen aufgeteilt und eine davon mit Thrombin (90 NIH-Einheiten/ml bei 37ºC/60 Minuten) abgebaut. Schließlich wurden geeignete Verdünnungen jeder Probe gefertigt und im Radioimmunassay wie in Beispiel 4 beschrieben verwendet.
Tabelle 1 zeigt die Plasmakonzentration von Fibrinogen-, FPA- und Bβ15-42-immunreaktivem Material bei drei Patienten. Es wurden Proben vor und an zwei verschiedenen Zeitpunkten während des Dialyseprogramms gezogen. Die TABELLE 1 Patient (Diagnose) Zeitpkt. der Blut-Probenahe¹ Fibrinogen² Bβ15-42-Immunreaktivität&sup4; nachgewiesen mit (polycyst.. Niere) (Nephrosklerose) (chronische Glomerulonephritis) ¹ Die Blutproben wurden vor der Dialyse (I), nach 2 Std. laufender Dialyse (II) und unmittelbar vor Abkoppeln von der Dialyse, etwa 3 Std. später (III), entnommen. Die Probe I wurde über die Arterienfistel-Nadel entnommen. Die anderen zwei Proben wurden über eine Punktierung der venösen Blutbahn (Auslaßseite) entnommen. ² Wie bereits beschrieben (Kudryk et al., 1982) durch Elektro-Immunassay bestimmt. ³ &sup4; Gemessen mit Hilfe der FPA- und Bβ15-42-Radioimmunassay-Packungen, bezogen bei IMCO Corporation Ltd., Stockholm, Schweden. Die Vorgehensweise für jeden Test wird vom Hersteller empfohlen. &sup5; Der Radioimmunassay ist in "Materials and Methods" beschrieben. Human-Bβ1-118 wurde sowohl als Ligand als auch als Standard verwendet, der Antikörper war MAb/1-8C6.
letzteren zwei Proben stammten von der venösen Blutbahn (Abflußseite). Die FPA-Konzentration in der Probe vor der Dialyse jedes Patienten ergab geringfügig höhere Werte als die 1,4 +/- 0,6 pMol/ml-Gehalte, die man in normalen Patienten unter Verwendung des IMCO-Testkits fand (Wilhelmsson et al. , Clin. Nephrol., 15, 252-258, 1981). Ein Abfall im Gehalt an FPA wurde in Probe 2 bei zwei der drei Patienten beobachtet. Die letzte Probe von allen drei Patienten ergab höhere Werte im Vergleich zu Probe 2.
Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Befunden überein, welche zeigten, daß der FPA-Gehalt während der frühen Stadien der Dialyse normal oder nahezu normal war, wenn die Heparingehalte größer als 0,5 IU/ml waren. Wenn der Heparingehalt unter diesen Wert abfiel, wurden im allgemeinen Zunahmen der FPA-Konzentration beobachtet (Wilhelmsson et al., siehe oben, 1981). Die Wirksamkeit einer Heparintherapie kann auf diese Weise überprüft werden. Z.B. kann eine Anhebung der Plasmagehalte an FPA als Anzeichen für hohe Thrombinaktivität gewertet werden, was zu intravaskulärer Fibrinablage führen kann.
Was die Immunreaktivität von Bβ15-42 betrifft, war der mit Hilfe des Kaninchenantiserums nachgewiesene Wert signifikant höher als die bei normalem Plasma gefundenen 0,41 pMole/ml (Kudry et al., siehe oben, 1982) Der Patient 172 zeigte sehr ähnliche Konzentration in allen drei Proben. Dies war nicht der Fall bei den anderen zwei Patienten, insbesondere wenn man die Gehalte in der Probe vor der Dialyse und in der Probe 3 vergleicht. Die Konzentration an mit MAb/1-8C6 nachgewiesenem Bβ15-42-immunreaktivem Material war ähnlich, jedoch nicht identisch mit der unter Verwendung des Kaninchenantiserums gefundenen Konzentration. Ausgehend von der früher beschriebenen Spezifität von MA/1-8C6 legen diese Ergebnisse nahe, daß das meiste, jedoch nicht alles Bβ- 15-42-immunreaktive Material in einem Peptid oder in Peptiden vorliegt, welche eine intakte Bβ 14Arg-15Gly-Bindung enthalten. Dies wurde teilweise bestätigt, wenn man jede Probe mit Thrombin aufschloß und unter Anwendung beider Systeme erneut testete. Die Konzentration an mit Kaninchenantiserum nachgewiesenem Bβ 15-42- immunreaktivem Material war ähnlich vor-und nach Thrombinaufschluß. Andererseits konnte nur sehr wenig, wenn überhaupt, immunreaktives Material mit Hilfe von MAb/1-8C6 in den mit Thrombin abgebauten Proben gemessen werden (nicht gezeigte Daten).
Um die Natur der in-vivo-Abbauprodukte weiter zu charakterisieren, wurde aus gesammeltem Patientenplasma ein Extrakt bereitet. Das verwendete Plasma stammte von mehreren Patienten, ausgenommen den in Tabelle 1 aufgeführten Patienten, und wurde zu verschiedenen Zeiten während der Dialyse gesammelt. Der Extrakt wurde durch Hochleistungsflüssig-Chromatographie wie von Koehn and Canfield, Analyt. Biochem, 116, 349-356, 1981 beschrieben, fraktioniert. Die Fraktionen wurden später auf FPA- wie auch auf Bβ15-42-Immunreaktivität getestet. Solche Fraktionen; die hohe Bβ15-42-Aktivität aufwiesen, wurden mit Thrombin aufgeschlossen und später unter Anwendung sowohl von Bβ 15-42-Tests als auch mittels des FPB-Immunassays erneut analysiert. Wie in Abb. 7 gezeigt, wurde in den Fraktionen 11-14 FPA gewonnen. Bβ 15-42-Immunreaktivität wurde in den Fraktionen 5-8 unter Verwendung sowohl von Kaninchenantiseren als auch von MAb/1-8C6 nachgewiesen. Wenn jede Fraktion mit Thrombin aufgeschlossen und wieder getestet wurde, konnte eine nur geringe, wenn überhaupt, Änderung der Immunreaktivität mit dem Kaninchenantikörper beobachtet werden. Im Gegensatz dazu traten größere Unterschiede zutage in den mit Thrombin aufgeschlossenen Fraktionen unter Anwendung der anderen zwei Tests. Im Grunde genommen ging alle Immunreaktivität mit MAb/1-8C6 verloren. Signifikante Werte von FPB-Immunreaktivität wurden in den Fraktionen 5-8 nur nach Thrombinabbau erzielt. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, daß einige FPB-Immunreaktivität in den Fraktionen 5-8 und 17-19 vor dem Abbau mit Thrombin nachweisbar war.
Ausgehend von der schon diskutierten Spezifität von MAb/1-8C6 legen diese Ergebnisse nahe, daß das meiste immunreaktive Bβ 15-42-Material in den Peptiden vorlag, welche FPB enthielten. Die in Abb. 7 gezeigten Daten unterstützen diese Folgerung ebenso. D.h., daß die viel früher als das freie FPB eluierenden Peptide spezifisch mit dem FPB-Antiserum reagierten. Daher konnten solche Peptide nur aus Fibrinogen oder Fibrin I, jedoch nicht aus Fibrin II entstanden sein. Mehrere zusätzliche Kommentare müssen bezüglich der in Tabelle 1 und Abb. 7 aufgeführten Daten gemacht werden. Zieht man das Ausmaß an mittels Kaninchen-Antiserum und MAb/1-8C6 nachgewiesenem immunreaktivem Material in Betracht, so ergibt die Probe 2 des Patienten 589 mit dem monoklonalen Antikörper einen signifikant höheren Mengenmeßwert. Eine Erklärung dafür wäre, daß einiges Bβ15-42imunreaktives Material, das man normalerweise mit Hilfe des Kaninchen-Antiserums nachweisen konnte, während der Probenaufbereitung verloren ging. Es wurde bereits gezeigt, daß der Bβ 15-42-Standard bei der Zugabe zu normalem oder Patientenserum einem schnellen Abbau unterliegt (Kudryk et al., siehe oben 1982). In Fraktionen der Hochleistungs- Flüssigchromatographie wurde an den drei in dieser Studie beschriebenen Versuchen mit Bβ-Kette eine Anzahl von Immunreaktivitätsprofilen erhalten. Das in Abb. 7 gezeigte Profil entstammt einem Versuch, in dem ein Extrakt aus gesammeltem Patientenplasma verwendet wurde. Die Chromatographie anderer Proben lieferte ganz andere Ergebnisse. In einigen Fällen wurde eine Bβ-Ketten-Immunreaktivität ebenso in Fraktionen lokalisiert, welche sich nahe beim freien FPA eluieren ließen. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß solche Patienten eine Anzahl von Peptiden aufweisen, welche mit den in diesem Bericht beschriebenen Antikörpern eine Querreaktion eingehen können. Die Identifizierung der genauen Molekularnatur dieser in vivo-Peptide wird nun vorgenommen. Schließlich muß einiges zum hohen Gehalt an Bβ 15-42-immunreaktivem Material bei diesen Patienten bemerkt werden. Da die FPA-Konzentrationen in den Proben 1 und 2 normal oder fast normal waren, ist es augenscheinlich, daß die Fibrinbildung bei allen drei Patienten durch die angewandte Heparindiät wirksam eingegrenzt wurde. Zieht man dies in Betracht, wie auch die Tatsache, daß sogar die Gehalte an Bβ 15-42-immunreaktivem Material vor der Dialyse solchermaßen signifikant erhöht waren, muß man die Frage des behinderten Katabolismus dieser Abbauprodukte erwägen. Diesbezüglich studierten Sherman und Mitarbeiter den Umsatz viel größerer Fibrinogen-Abbauprodukte an mehreren Tiermodellen. Ihre Ergebnisse legten nahe, daß viel eher der Verlust an funktionierendem Nierengewebe als die Urämie an sich für die verminderte Entfernbarkeit von Fibrinogen-Abbauprodukten verantwortlich war. (Hayne und Sherman, Am.J.Path., 71, 219-236, 1973; Tio et al., J. Lab. Clin. Med., 87, 934-946, 1976). Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, ergibt sich bei manchen Patienten ein stetiges Anwachsen dieser Peptide während der Dialyse. Dies könnte das Ergebnis einer Fibrinogenolyse sein, welche in ihrem frühen Stadium noch nicht von einem Anwachsen der FPA-Konzentration begleitet ist. (Bilezikian et al. , J. Clin. Invest., 56 438-445, 1975).
Auf der Grundlage der vorstehenden Daten schließen wir, daß MAb/1-8C6 in klinischen Studien zu mit Fibrino(geno)lyse einhergehenden Krankheitsstadien als brauchbares Reagens dient. Wichtige Information bezüglich der Natur von in vivo erzeugtem Fibrin und die Kinetik von deren Auflösung kann über die Anwendung von Immunassays unter Messung des vorstehend beschriebenen Bβ-Kettenmarkers erhalten werden.

Beispiel 7:

Ermittlung des Vorliegens von Bβ1-42 und BR. 15-42 in klinischen Testproben.

Mit einer 1,4-mm-Nadel wird durch fehlerfreie Venenpunktur Blut von Patienten gesammelt. Nach Verwerfen der ersten 2-3 ml läßt man die folgenden 9 ml Blut direkt in ein 12-ml-Polystyrolröhrchen fließen, welches 1 ml 0,15-molares NaCl mit 1000 IU Heparin und 1000 KIU Trasylol enthält. Das Röhrchen wird sofort dreimal gegen einen Kunststoffilm gewendet und bei 4ºC 20 Minuten lang bei 3000-3500 g zentrifugiert. Jede Plasmaprobe wird direkt weiter verarbeitet oder bei -70ºC aufbewahrt. Gefrorene Plasmaproben werden bei 37ºC schnell aufgetaut und dann sofort wie beschrieben weiterverarbeitet. Die Plasmaverarbeitung erfolgt folgendermaßen. Zu 1,0 ml Plasma in einem 3-ml-Kunststoffrohr wird 1,0 ml (im Eisbad) gekühltes Ethanol gegeben. Nach dem Mischen und 30 Minuten Inkubieren in einem Eisbad wird die Probe wie oben zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues Zentrifugenrohr überführt, weitere 30 Minuten in einem Eisbad aufbewahrt und wiederum zentrifugiert. Der zweite Überstand ist die "aufgearbeitete Plasmaprobe".
Um die letzten Spuren von Fibrinogen aus der "aufgearbeiteten" Plasmaprobe zu entfernen, werden letztere noch einmal über Sep-Pac-C&sub1;&sub8;-Einwegpatronen (Waters Associates, Milford, MA) gemäß der Methode von Koehn und Canfield, Analyt. Biochem., 116, 349-356 (1981) gereinigt.
Jede "aufgearbeitete Plasmaprobe" wird in Kompetitiv-Immunassays getestet: Enzymgekoppelter Immunassay (ELI- SA) oder Radioimmunassay (RIA). Die "aufgearbeitete Plasmaprobe" kann in zwei Fraktionen aufgeteilt werden, von welcher eine zum Nachweis des Vorliegens von Bβ1-42 und die andere zum Nachweis des Vorliegens von Bβ 15-42 verwendet wird. Um unter Anwendung von ELISA auf das vorliegen von Bβ1-42-Antigen zu prüfen, werden Mikrotiterplatten 16 Stunden bei +4ºC mit beispielsweise Bβ 1-42 oder Bβ 1-118 (5 ug/ml) beschichtet. MAb/1-8C6 wird in TPBS (phosphatgepufferte ein Tensid - Tween-20 - enthaltende Salzlösung) so verdünnt, daß sich ein A&sub4;&sub9;&sub0;/10 Minutenwert von 1,5 bis 2,0 ergibt. Diese Verdünnung wird mit Verdünnungen der "aufgearbeiteten Plasmaprobe" gemischt und auf die Platte gegeben. Nach Inkubieren und Waschen wird der festphasengebundene Antikörper wie früher beschrieben nachgewiesen (siehe Beispiel 3).
Um auf das Vorliegen von Bβ 15-42/Antigen unter Anwendung von ELISA zu prüfen, werden Mikrotiterplatten 16 Stunden bei 4ºC mit B(315-42 beschichtet. MAb/T2G1s wird in TPBS so verdünnt, daß sich ein A&sub4;&sub9;&sub0;/5-Minutenwert von etwa 1,6 ergibt. Diese Antikörperverdünnung wird mit Verdünnungen der "aufgearbeiteten Plasmaprobe" gemischt und auf die Platte gegeben. Nach Inkubieren und Waschen wird der an die Festphase gebundene Antikörper wie vorstehend beschrieben nachgewiesen (siehe Beispiel 3).
Um die "aufgearbeitete Plasmaprobe" auf das Vorliegen von Bβ 1-42 Antigen unter Anwendung von RIA zu prüfen, wird die vorstehend beschriebene (siehe Beispiel 4) Arbeitsweise verfolgt. Der Ligand besteht aus ¹²&sup5;J-markiertem Bβ 1-42 oder ¹²&sup5;J-markiertem Bβ 1-118, der Antikörper besteht aus MAb/1-8C6, während der zweite Antikörper aus Esel-anti-Maus-Antikörper, in Cellulose suspendiert, d. h. aus Sac-Cel, besteht (siehe Beispiel 4).
Um unter Anwendung von RIA auf das Vorliegen von Bβ15-42-Antigen zu prüfen, wird nach derselben vorstehend beschriebenen Arbeitsweise verfahren. Der Ligand besteht aus ¹²³J-markiertem B
Bezugszeichenliste
15-42, der Antikörper besteht aus MAb/T2G1s und der zweite Antikörper aus Sac Cel.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper, von Hybridomen erzeugt, wobei die genannten Hybridome durch Fusion von Zellen einer tierischen Myelom-Linie mit Milz-Zellen aus einem Tier, welches vorher mit einem NH&sub2;-terminalen Fragment von Human-Fibrinogen oder Fibrin I immunisiert wurde, gebildet wurden, und wobei anschließend die Hybridomen abgetrennt und ein solches Hybridom ausgewählt wird, welches den monospezifischen Antikörper gegen ein Fragment von Human-Fibrinogen oder Fibrin I erzeugt,

wobei der genannte Antikörper

a) mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human- Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42 der genannten Bβ-Kette, reagiert;

b) nicht mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-14, reagiert; und

c) nicht mit einem Peptidfragement der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 15-42, reagiert.

2. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrinogen durch Spaltung des genannten Human-Fibrinogens oder Fibrins I mit CNBr-gebildet wird.

3. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrinogen N-DSK bzw. wobei das genannte Fragment von Fibrin I (B)N-DSK ist.

4. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrinogen oder Fibrin I ausgewählt ist aus der Gruppe von Bβ 1-118 und Bβ 1-42.

5. Monoklonaler Antikörper gemäß jedem der Ansprüche 1-4, wobei der genannte Antikörper zur Klasse IgG, vorzugsweise zur Unterklasse IgG2a gehört.

6. Monoklonaler Antikörper gemäß jedem der Ansprüche 1-5, wobei der genannte Antikörper hergestellt wird nach einem Verfahren, welches folgende Schritte umfaßt:

a) Ein Tier, vorzugsweise eine Maus, wird mit einer N-DSK enthaltenden Lösung immunisiert;

b) die Milz wird aus jedem Tier von Schritt a) entfernt und aus den Zellen jeder Milz eine Suspension bereitet;

c) die genannten Zellen aus jeder Milz von Schritt b) werden in Gegenwart eines Fusionspromotors mit tierischen Myelomzellen fusioniert;

d) die fusionierten Zellen von Schritt c) werden in voneinander getrennten Vertiefungen in einem Medium, welches die nicht-fusionierten Myelomzellen nicht fördert, verdünnt und kultiviert;

e) der Überstand in jeder Vertiefung, die ein Hybridom für das Vorliegen von Antikörpern gegen Fibrinogen, N-DSK oder gegen jegliche damit verwandte Fragmente enthält, wird ausgewertet;

f) ein Hybridom, welches einen Antikörper erzeugt, der mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42, reagiert, jedoch nicht mit irgendeinem der Peptidfragmente der genannten Bβ-Kette, enthaltend die Aminosäurereste 1-14 oder 15-42, reagiert, wird ausgewählt und geklont; und

g) der Antikörper aus dem Überstand der genannten Klone wird gewonnen.

7. Monoklonaler Antikörper gemäß jedem der Ansprüche 1-6, wobei der genannte Antikörper nach dem Verfahren von Anspruch 6, Schritte (a) bis (f), erzeugt wurde, wobei das Verfahren folgende zusätzliche Schritte einschließt:

g) Die in Schritt (f) erhaltenen Klone werden intraperitoneal auf Tiere übertragen; und

h) die bösartige Ascites oder das Serum der genannten Tiere werden gewonnen, wobei diese Ascites oder das Serum den gewünschten Antikörper enthalten.

8. Monoklonaler Antikörper, erzeugt durch das Hybridom ATCC HB 8418.

9. Monoklonaler Antikörper, von Hybridomen erzeugt, wobei die genannten Hybridome durch Fusion von Zellen aus einer tierischen Myelomlinie mit Milzzellen eines Tieres, welches vorher mit einem NH&sub2;-terminalen Fragment von Human-Fibrin II immunisiert worden war, gebildet wurden, und wobei anschließend die Hybridome abgetrennt und das den monospezifischen Antikörper gegen ein Fragment aus Human-Fibrin II erzeugende Hybridom ausgewählt wird; wobei der genannte Antikörper

a) mit einem Peptidfragment aus der aß -Kette von Human-Fibrin II, enthaltend die Aminosäurereste 15-42 der genannten Bβ-Kette, reagiert;

b) nicht mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-14, reagiert;

c) nicht mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42, reagiert.

10. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 9, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrin II durch Spaltung des genannten Human-Fibrins II mit CNBr gebildet wird.

11. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 9, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrin II (T)N-DSK ist.

12. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 9, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrin II ausgewählt ist aus der Gruppe von Bβ 15-118 und Bβ 15-42.

13. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 9, wobei der genannte Antikörper zur Klasse IgG, vorzugsweise zur Unterklasse IgG&sub1; gehört.

14. Monoklonaler Antikörper gemäß jedem der Ansprüche 9-13, wobei der genannte Antikörper nach einem Verfahren hergestellt wird, welches folgende Schritte umfaßt:

a) Ein Tier, vorzugsweise eine Maus, wird mit einer (T)N-DSK enthaltenden Lösung immunisiert;

b) die Milz aus jedem Tier von Schritt a) wird entfernt und aus den Zellen jeder Milz eine Suspension bereitet;

e) der Überstand in jeder Vertiefung, welche ein Hybridom für das Vorliegen von Antikörpern gegen Fibrin II, (T)N-DSK oder gegen jegliche damit verwandte Fragmente enthält, wird ausgewertet;

f) ein Hybridom, welches einen Antikörper erzeugt, welcher mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human- Fibrin II, enthaltend die Aminosäurereste 15-42, reagiert, jedoch nicht mit irgendeinem der Peptidfragmente der Bβ-Kette von Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend lediglich die Aminosäurereste 1-14 oder 1-42, reagiert, wird ausgewählt und geklont; und

g) aus dem Überstand der genannten Klone wird der Antikörper gewonnen.

15. Monoklonaler Antikörper gemäß jedem der Ansprüche 9-13, wobei der genannte Antikörper nach dem Verfahren von Anspruch 14, Schritte (a) bis (f) hergestellt wird, welches Verfahren folgende zusätzliche Schritte enthält:

(g) die Klone von Schritt (f) werden intraperitoneal auf Mäuse übertragen; und

(h) die bösartige Ascites oder das Serum aus den genannten Mäusen wird gewonnen, wobei die Ascites oder das Serum den gewünschten Antikörper enthalten.

16. Monoklonaler Antikörper, erzeugt durch das Hybridom ATCC HB 8426.

17. Monoklonaler Antikörper gemäß jedem der Ansprüche 9-16, wobei der monoklonale Antikörper mit den Produkten reagiert, welche durch Thrombindigestion von Human-Fibrinogen erzeugt werden, jedoch nicht mit den Produkten, welche aus der Thrombindigestion von Kaninchen-Fibrinogen hervorgehen, reagiert.

18. Monoklonaler Antikörper gemäß jedem der Ansprüche 1-17, wobei die genannte Myelomlinie vorzugsweise Myelomzellen vom Typ P3X6BAg8.653 enthält, und wobei die genannten Milzzellen vorzugsweise aus einer Maus vom Typ BALB/cJ erhalten werden.

19. Hybridom zur Erzeugung des monoklonalen Antikörpers gemäß jedem der Ansprüche 1-18, wobei die genannten Hybridome durch Fusion von Zellen aus einem vorher mit einem NH&sub2;-terminalen Fragment von Human-Fibrinogen oder Fibrin I immunisierten Tier gebildet wurden, wobei das genannte Tier vorzugsweise eine Maus ist, insbesondere eine Maus vom Typ BALB/cJ, und worin die Myelomzellen vorzugsweise Myelomzellen vom Typ P3X63AG8.653 enthalten.

20. Hybridom gemäß Anspruch 19, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrinogen durch Spaltung des genannten Fibrinogens oder Fibrins I mit CNBr gebildet wurde.

21. Hybridom gemäß Anspruch 19, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrinogen N-DSK ist, bzw. wobei das genannte Fragment von Fibrin I (B)N-DSK ist.

22. Hybridom gemäß Anspruch 19, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrinogen oder Fibrin I ausgewählt ist aus der Gruppe von Bβ 1-118 und Bβ 1-42.

23. Hybridom gemäß Anspruch 19, wobei das genannte NH&sub2;-terminale Fragment eine N-DSK enthaltende Lösung ist und die genannte Fusion in Gegenwart eines Fusionspromotors erfolgt.

24. Hybridom mit der Bezeichnung ATCC HB 8418.

25. Hybridom zur Erzeugung des monoklonalen Antikörpers gemäß jedem der Ansprüche 1-18, wobei das genannte Hybridom durch Fusion von Zellen aus einem vorher mit einem NH&sub2;-terminalen Fragment von Human-Fibrin II immunisierten Tier gebildet wurde, wobei das genannte Tier vorzugsweise eine Maus ist und die Milzzellen vorzugsweise aus einer Maus vom Typ BALB/cJ gewonnen wurden.

26. Hybridom gemäß Anspruch 25, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrin II durch Spaltung des genannten Fibrins II mit CNBr gebildet wurde und wobei das genannte Fragment von Human-Fibrin II vorzugsweise (T)N-DSK ist.

27. Hybridom gemäß Anspruch 25, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrin II ausgewählt ist aus der Gruppe von Bβ 15-118 und Bβ 15-42.

28. Hybridom gemäß Anspruch 25, wobei das genannte NH&sub2;terminale Fragment eine (T)N-DSK enthaltende Lösung ist und die genannte Fusion in Gegenwart eines Fusionspromotors erfolgt.

29. Hybridom mit der Bezeichnung ATCC HB 8426.

30. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, umfassend die Bildung von Hybridomen durch Fusion von Zellen aus einer tierischen Myelomlinie mit Milzzellen aus einem vorher mit einem NH&sub2;-terminalen Fragment von Human- Fibrinogen oder Fibrin I immunisierten Tier und die anschließende Abtrennung der daraus hervorgegangenen Hybridome und hieraus die Auswahl eines Hybridoms, welches einen monospezifischen Antikörper gegen ein NH&sub2;-terminales Fragment von Human-Fibrinogen oder Fibrin I erzeugt,

wobei der genannte Antikörper

(i) mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42 der genannten Bβ-Kette, reagiert;

(ii) nicht mit einem Peptidfragment der aß-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-14, reagiert; und

(iii) nicht mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 15-42, reagiert, wobei das genannte Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Ein Tier wird mit einer N-DSK enthaltenden Lösung immunisiert;

(b) aus jedem Tier von Schritt (a) wird die Milz entfernt und aus den Zellen jeder Milz eine Suspension bereitet;

(c) die genannten Zellen jeder Milz von Schritt (b) werden in Gegenwart eines Fusionspromotors mit tierischen Zellen fusioniert;

(d) die fusionierten Zellen von Schritt (c) werden in voneinander getrennten Vertiefungen in einem Medium, welches die nicht-fusionierten Myelomzellen nicht fördert, verdünnt und kultiviert;

(g) der Überstand in jeder Vertiefung, welche ein Hybridom für das Vorliegen von Antikörpern gegen Fibrinogen, N-DSK oder gegen jegliche damit verwandte Fragmente enthält, wird ausgewertet;

(f) ein Hybridom, welches einen Antikörper erzeugt, der mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42, reagiert, jedoch nicht mit irgendeinem der Peptidfragmente der Bβ-Kette, enthaltend lediglich die Aminosäurereste 1-14 oder 15-42, reagiert, wird ausgewählt und geklont.

(g) die genannten Klone werden intraperitoneal auf Tiere übertragen; und

(h) die bösartige Ascites oder das Serum der genannten Tiere wird gewonnen, wobei diese Ascites oder das Serum den gewünschten Antikörper enthalten.

31. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 30, in welchem das genannte Fragment von Human-Fibrinogen oder Fibrin I durch Spaltung des genannten Human-Fibrinogens oder Fibrins I mit CNBr gebildet wird, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrinogen vorzugsweise N-DSK und wobei das genannte Fragment von Fibrin I vorzugsweise (B)N-DSK ist.

32. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 30, in welchem das genannte Fragment von Human-Fibriliogen ausgewählt ist aus der Gruppe von Bβ -1-118 und Bβ 1-42.

33. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, in welchem der genannte Antikörper

(ii) nicht mit einem Peptidfragement der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-14, reagiert; und

(iii) nicht mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin, I enthaltend die Aminosäurereste 15-42, reagiert, wobei das genannte Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Ein Tier wird mit einer N-DSK enthaltenden Lösung immunisiert;

(c) die genannten Zellen aus jeder Milz von Schritt (b) werden in Gegenwart eines Fusionspromotors mit tierischen Myelomzellen fusioniert;

(e) der Überstand in jeder Vertiefung, welche ein Hybridom für das Vorliegen von Antikörpern gegen Fibrinogen, N-DSK oder gegen jegliche damit verwandte Fragmente enthält, wird ausgewertet;

(f) ein Hybridom, welches einen Antikörper erzeugt, der mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42, reagiert, jedoch nicht mit irgendeinem der beiden Peptidfragmente der genannten Bβ-Kette, enthaltend die Aminosäurereste 1-14 oder 15-42, reagiert, wird ausgewählt und geklont; und

(g) der Antikörper aus dem Überstand der genannten Klone wird gewonnen.

34. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers umfassend die Bildung von Hybridomen durch Fusion von Zellen aus einer tierischen Myelomlinie mit Milzzellen eines vorher mit einem NH&sub2;-terminalen Fragment von Human-Fibrin II immunisierten Tieres und die anschließende Abtrennung der Hybridome und die Auswahl des Hybridoms, welches den erwünschten monospezifischen Antikörper erzeugt, wobei der genannte Antikörper

(i) mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II, enthaltend die Aminosäurereste 15-42 der genannten Bβ-Kette, reagiert;

(ii) nicht mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-14, reagiert; und

(iii) nicht mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42, reagiert, wobei das genannte Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Ein Tier wird mit einer (T)N-DSK enthaltenden Lösung immunisiert;

b) aus jedem Tier vom Schritt (a) wird die Milz entfernt und aus den Zellen jeder Milz eine Suspension bereitet;

c) die genannten Zellen jeder Milz von Schritt (b) werden in Gegenwart eines Fusionspromotors mit tierischen Myelomzellen fusioniert;

d) die fusionierten Zellen von Schritt (c) werden in voneinander getrennten Vertiefungen in einem Medium, welches die nicht fusionierten Myelomzellen nicht fördert, verdünnt und kultiviert;

e) der Überstand aus jeder Vertiefung, die ein Hybridom für das Vorliegen von Antikörpern gegen Fibrin II, (T)N-DSK oder gegen jegliche damit verwandte Fragmente enthält, wird ausgewertet;

(f) ein einen Antikörper erzeugendes Hybridom, welches mit dem Peptidfragment aus der Bβ-Kette von Human-Fibrin II, enthaltend die Aminosäurereste 15-42, reagiert, jedoch nicht mit irgendeinem der Peptidfragmente aus der BR -Kette> von Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-14 oder 1-42, reagiert, wird ausgewählt und geklont.

(g) die genannten Klone werden intraperitoneal auf Tiere übertragen; und

(h) die bösartige Ascites oder das Serum der genannten Tiere werden gewonnen, wobei die Ascites oder das Serum den erwünschten Antikörper enthalten.

35. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 34, in welchem das genannte Fragment von Human-Fibrin II durch Spaltung des genannten Human-Fibrins II mit CNBr gebildet wird und wobei das genannte Fragment von Human-Fibrin II vorzugsweise (T)N-DSK ist.

36. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 34, in welchem das genannte Fragment von Human-Fibrin II ausgewählt ist aus der Gruppe von Bβ 15-118 und Bβ15-42.

37. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, in welchem der genannte Antikörper

(iii) nicht mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-42, reagiert; wobei das genannte Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Ein Tier wird mit einer im wesentlichen aus (T)N-DSK bestehenden homogenen Lösung immunisiert;

(e) der Überstand in jeder Vertiefung, die ein Hybridom für das Vorliegen von Antikörpern gegen Fibrin II oder jegliche damit verwandte Fragmente enthält, wird ausgewertet;

(f) ein Hybridom, das einen Antikörper erzeugt, der mit einem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II, enthaltend die Aminosäurereste 15-42, reagiert, jedoch nicht mit irgendeinem der Peptidfragmente der Bβ-Kette von Fibrinogen oder Fibrin I, enthaltend die Aminosäurereste 1-14 oder 1-42, reagiert, wird ausgewählt und geklont; und

(g) der Antikörper wird aus dem Überstand der genannten Klone gewonnen.

38. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms für die Erzeugung des monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch I, in welchem das genannte Verfahren die Fusionierung einer tierischen Myelomlinie mit Milzzellen aus einem vorher mit einem NH&sub2;-terminalen Fragment von Human-Fibrinogen oder Fibrin I immunisierten Tier umfaßt, wobei das genannte Tier eine Maus ist, und wobei die genannte Myelomlinie vorzugsweise Myelomzellen des Typs P3X63Ag8.653 umfaßt und wobei die genannten Milzzellen vorzugsweise aus einer Maus vom Typ BALB-cJ erhalten werden.

39. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms gemäß Anspruch 38, in welchem das genannte Fragment von Human-Fibrinogen oder Fibrin I durch Spaltung des genannten Human- Fibrinogens oder des Fibrins I mit CNBr gebildet wird, wobei das genannte Fragment von Human-Fibrinogen vorzugsweise N-DSK ist, und wobei das genannte Fragment von Fibrin I vorzugsweise (B)N-DSK ist.

40. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms gemäß Anspruch 38, in welchem das genannte Fragment von Human-Fibrinogen aus der Gruppe von Bβ 1-118 und Bβ 1-42 ausgewählt ist.

41. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms gemäß Anspruch 38, in welchem das genannte NH&sub2;-terminale Fragment aus einer N-DSK umfassenden Lösung besteht und die genannte Fusion in Gegenwart eines Fusionspromotors erfolgt.

42. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms zur Erzeugung des monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 1, in welchem die genannte Methode die Fusion einer tierischen Myelomlinie mit Milzzellen eines vorher mit einem NH&sub2;-terminalen Fragment von Human-Fibrin II immunisierten Tieres umfaßt, wobei das genannte Tier eine Maus ist, wobei die genannte Myelomlinie vorzugsweise Myelomzellen des Typs P3X63Ag8.653 umfaßt und wobei die genannten Milzzellen vorzugsweise aus einer Maus vom Typ BALB/cJ erhalten werden.

13. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms gemäß Anspruch 42, in welchem das genannte Fragment von Human-Fibrin II durch Spaltung des genannten Human-Fibrins II mit CNBr gebildet wird und wobei das genannte Fragment von Human-Fibrin II vorzugsweise (T)N DSK ist.

44. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms gemäß Anspruch 42, in welchem das genannte Fragment von Human-Fibrin II ausgewählt ist aus der Gruppe von Bβ 15-118 und Bβ 15-42.

45. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms gemäß Anspruch 42, in welchem das genannte NH&sub2;-terminale Fragment eine (T)N-DSK umfassende Lösung ist und die genannte Fusionierung in Gegenwart eines Fusionspromotors erfolgt.

46. Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines die Aminosäurereste 1-42 enthaltenden Fragments der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I in einer Plasmaprobe auf dem Wege des enzymgekoppelten Immunsorptions-Assays oder des Radioimmun-Assays durch In-Berührung-Bringen der genannten Probe mit einem Antikörper gegen das genannte Fragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, dessen Verbesserung darin besteht, daß der genannte Antikörper aus dem Antikörper von Anspruch I besteht.

47. Verfahren gemäß Anspruch 46, in welchem der genannte Antikörper in Gegenwart eines radioaktiv markierten die Aminosäurereste 1-42 enthaltenden Fragments der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit der genannten Probe vermischt wird und das an den genannten Antikörper gebundene radioaktiv markierte Fragment unter Verwendung eines gegenüber dem genannten Antikörper spezifischen Antikörpers abgetrennt wird

48. Verfahren gemäß Anspruch 46, in welchem der genannte Antikörper mit der genannten Probe vermischt wird, das Gemisch mit einem die Aminosäurereste 1-42 enthaltenden Polypeptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I in Berührung gebracht, und in welchem ein für den genannten Antikörper spezifischer Antikörper an ein Enzym gekoppelt wird.

49. Verfahren gemäß Anspruch 46, in welchem ein enzymgekoppelter Immunsorptions-Assay oder ein Radioimmun-Assay durchgeführt wird und in welchem die Ergebnisse des genannten enzymgekoppelten Immunsorptions-Assays oder des genannten Radioimmun-Assays vorzugsweise mit einem bekannten Standard zur Bestimmung der an einer Normalprobe gemessenen relativen Konzentration eines Antigens in der Testprobe verglichen wird.

50. Verfahren zur Bestimmung der Menge einer in einer Plasmaprobe vorliegenden Menge eines Peptidfragments der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, in welchem das genannte Fragment die Aminosäurereste 1-42 enthält, welches folgende Schritte umfaßt:

a) Die genannte Probe wird mit genannten Mengen von MAb/1-8C6, einem kompetitiven Antigen auf einem festen Träger, wobei das kompetitive Antigen ein die Aminosäurereste 1-42

enthaltendes Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I umfaßt, sowie mit einem enzymgekoppelten Antikörper in Berührung gebracht, wobei der Antikörper sich an Mäuse-Immunoglobulin bindet;

b) man weist die Menge des an das kompetitive Antigen auf dem festen Träger gebundenen MAb/1-8C6 nach, indem man die Menge an gebundenem enzymgekoppelten Antikörper bestimmt.

c) Die Ergebnisse aus den Schritten a) und b) werden mit denen verglichen, welche man unter Verwendung einer standardisierten Menge an bekanntem Antigen, umfassend ein die Aminosäurereste 1-42 enthaltendes Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, erhält.

51. Verfahren zur Bestimmung der Menge an in einer Plasmaprobe vorliegendem Peptidfragment der BR-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, wobei das genannte Fragment die Aminosäurereste 1-42 enthält, welches folgende Schritte umfaßt:

a) Man bringt die genannte Probe mit bekannten Mengen sowohl von MAb/1-8C6 als auch von kompetitivem radiomarkiertem Antigen, umfassend ein die Aminosäurereste 1-42 enthaltendes Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I, solchermaßen zusammen, daß das kompetitive radiomarkierte Antigen sich an das MAb/1-8C6 binden kann;

b) man bringt die genannte Probe, MAb/1-8C6 und das kompetitive radiomarkierte Antigen aus Schritt a) mit einem auf Mäuse-Immunglobulin spezifischen Antikörper zusammen;

c) man trennt das an den Antikörper gebundene radiomarkierte Antigen aus Schritt b) unter Verwendung des Antikörpers aus Schritt b) ab;

d) man ermittelt die Radioaktivität des gebundenen radiomarkierten Antigens aus Schritt c) durch Zählung; und

e) man vergleicht die Ergebnisse aus den Schritten a), b), c) und d) mit denen, die man unter Verwendung einer standardisierten Menge von bekanntem Antigen, enthaltend ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42, erhalten hat.

52. Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines die Aminosäurereste 15-42 enthaltenden Fragments der Bβ-Kette von Human-Fibrin II in einer Plasmaprobe auf dem Wege des enzymgekoppelten Immunsorptions-Assays oder des Radioimmun- Assays, in welchem man die genannte Probe mit einem Antikörper gegen das genannte Fragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II in Berührung bringt, dessen Verbesserung darin besteht, daß der Antikörper der Antikörper aus Anspruch 10 ist.

53. Verfahren gemäß Anspruch 52, in welchem der genannte Antikörper mit der genannten Probe in Gegenwart eines radioaktiv markierten die Aminosäurereste 15-42 enthaltenden Fragments der Bβ-Kette von Human-Fibrin II in Berührung gebracht wird, und in welchem das an den genannten Antikörper gebundene radioaktiv markierte Fragment unter Verwendung des für den genannten Antikörper spezifischen Antikörpers abgetrennt wird.

54. Verfahren gemäß Anspruch 52, in welchem der genannte Antikörper mit der genannten Probe vermischt, das Gemisch mit einem die Aminosäurereste 15-42 enthaltenden Polypeptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II in Berührung gebracht wird, und in welchem ein für den genannten Antikörper spezifischer Antikörper an ein Enzym gekoppelt wird.

55. Verfahren gemäß Anspruch 52, in welchem ein enzymgekoppelter Immunsorptions-Assay oder ein Radioimmun-Assay durchgeführt wird und in welchem die Ergebnisse des genannten enzymgekoppelten Immunsorptions-Assays oder des genannten Radioimmun-Assays vorzugsweise mit einem bekannten Standard zur Bestimmung der in Bezug auf eine Normalprobe relativen Konzentration von Antigen in der Testprobe verglichen wird.

56. Verfahren zur Bestimmung der Menge eines in einer Plasmaprobe vorliegenden Peptidfragments der Bβ-Kette von Human-Fibrin II, wobei das genannte Fragment die Aminosäurereste 15-42 enthält und welches folgende Schritte umfaßt:

a) Man bringt die genannte Probe mit bekannten Mengen von jeweils MAb/T2Gls, einem kompetitiven Antigen auf Feststoffträger, umfassend ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42, und einem enzymgekoppelten Antikörper zusammen, wobei dieser Antikörper sich an Mäuse-Immunglobulin bindet.

b) Man weist die Menge des an das kompetitive Antigen auf Feststoffträger gebundenen MAb/T2Gls durch Bestimmung der Menge an gebundenem enzymgekoppeltem Antikörper nach.

c) Man vergleicht die Ergebnisse aus den Schritten (a) und (b) mit denen, die man unter Verwendung einer standardisierten Menge von bekanntem Antigen, umfassend ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42, erhalten hat.

57. Verfahren zur Bestimmung der Menge eines in einer Plasmaprobe vorliegenden Peptidfragments der Bβ-Kette von Human-Fibrin II, wobei das genannte Fragment die Aminosäurereste 15-42 enthält, und welches folgende Schritte umfaßt:

a) Man bringt die genannte Probe mit bekannten Mengen von jeweils MAb/T2Gls, kompetitivem radiomarkierten Antigen, enthaltend ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42, solchermaßen zusammen, daß das kompetitive radiomarkierte Antigen sich mit dem MAb/T2Gls verbinden kann;

b) man bringt die genannte Probe, MAb/T2Gls und kompetitives radioaktives Antigen aus Schritt a) mit einem für Mäuse-Immunglobulin spezifischen Antikörper zusammen;

c) man trennt das an den Antikörper gebundene radiomarkierte Antigen aus Schritt b) unter Verwendung des Antikörpers von Schritt b) ab;

d) man ermittelt die Radioaktivität des gebundenen radiomarkierten Antigens aus Schritt (c) durch Zählung; und

e) man vergleicht die Ergebnisse aus den Schritten a), b), c) und d) mit denen, die man unter Verwendung einer bekannten Menge von ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 umfassendem Antigen erhalten hat.

58. Verfahren zum Nachweis der Möglichkeit des Einsetzens von occlusiver Thrombose bei einem Patienten, umfassend die Aufteilung einer Plasmaprobe des genannten Patienten in eine erste Fraktion und in eine zweite Fraktion und

a) Behandlung der ersten Fraktion auf folgendem Wege:

i) Man bringt die genannte Fraktion mit bekannten Mengen von jeweils MAb/1-8C6, einem kompetitiven Antigen auf Feststoffträger, wobei das kompetitive Antigen ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42 umfaßt, sowie einem an Enzym gekoppelten Antikörper, wobei der Antikörper sich mit Mäuse-Immunglobulin verbindet, zusammen;

ii) man weist die Menge von an das kompetitive Antigen auf Feststoffträger gebundenem MAb/1-8C6 durch Ermittlung der Menge an gebundenem enzymgekoppeltem Antikörper nach.

iii) man vergleicht die Ergebnisse aus den Schritten i) und ii) mit denen, die man unter Verwendung einer standardisierten Menge von bekanntem ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42 umfassenden Antigen erhalten hat, um die Menge an Peptidfragment aus der Bβ -Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin I mit den Aminosäureresten 1-42 in der ersten Fraktion zu bestimmen;

b) man behandelt die zweite Fraktion folgendermaßen:

i) man bringt die genannte Fraktion mit bekannten Mengen von jeweils MAb/T2Gls, kompetitivem Antigen auf Feststoffträger, wobei das kompetitive Antigen ein Peptidfragment aus der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 umfaßt, sowie einem an Enzym gekoppelten Antikörper zusammen, wobei der Antikörper sich mit Mäuse- Immunglobulin verbindet.

ii) man weist die Menge von an das kompetitive Antigen auf Feststoffträger gebundenem MAb/T2Gls durch Bestimmung der Menge an gebundenem enzymgekoppeltem Antikörper nach.

iii) Man vergleicht die Ergebnisse aus den Schritten i) und ii) mit denen, die man unter Verwendung einer standardisierten Menge von bekanntem ein Peptidfragment der Bβ -Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 umfassenden Antigen erhält, um die Menge an Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 in der zweiten Fraktion zu bestimmen;

c) man vergleicht die Menge an die Aminosäurereste 1-42 umfassendem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin 1 aus Schritt a), iii) mit der Menge an die Aminosäurereste 15-42 umfassendem Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II aus Schritt b), iii) und bestimmt damit, ob Bβ 15-42 gegenüber Bβ 1-42 überwiegt, wobei solches Überwiegen einen Hinweis auf die genannte Möglichkeit für das Einsetzen von occlusiver Thrombose bei dem genannten Patienten ergibt.

59. Verfahren zum Nachweis der Möglichkeit für das Einsetzen von occlusiver Thrombose bei einem Patienten, umfassend die Auftrennung einer Plasmaprobe des genannten Patienten in eine erste Fraktion und in eine zweite Fraktion und

a) Behandlung der ersten Fraktion auf folgendem Wege:

i) man bringt die genannte Fraktion mit bekannten Mengen von jeweils MAb/1-8C6 und kompetitivem radioaktiven ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin 1 mit den Aminosäureresten 1-42 umfassendem Antigen solchermaßen zusammen, daß das kompetitive radiomarkierte Antigen sich mit dem MAb/1-8C6 verbinden kann.

ii) Man bringt die genannte Fraktion, MAb/1-8C6 und das kompetitive radiomarkierte Antigen aus Schritt i) mit einem für Mäuseimmunglobulin spezifischen Antikörper zusammen;

iii) man trennt das an den Antikörper gebundene radiomarkierte Antigen aus Schritt ii) unter Verwendung des Antikörpers aus Schritt ii) ab;

iv) man ermittelt die Radioaktivität des gebundenen radiomarkierten Antigens aus Schritt iii) durch Zählung; und

v) man vergleicht die Ergebnisse aus den Schritten i), ii), iii) und iv) mit denen, die man unter Verwendung einer standardisierten Menge von bekanntem Antigen, umfassend ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin 1 mit den Aminosäureresten 1-42, erhalten hat, um die Menge an Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin 1 mit den Aminosäureresten 1-42 in der ersten Fraktion zu bestimmen;

b) Behandlung der zweiten Fraktion auf folgendem Wege:

i) Man bringt die genannte Fraktion mit bekannten Mengen an MAb/T2Gls, kompetitivem radiomarkiertem ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 umfassenden Antigen solchermaßen zusammen, daß das kompetitive radiomarkierte Antigen sich an das MAb/T2Gls binden kann;

ii) man bringt die genannte Fraktion, MAb/T2Gls und das kompetitive radiomarkierte Antigen aus Schritt i) mit einem für Mäuse-Immunglobulin spezifischen Antikörper zusammen;

iv) man ermittelt die Radioaktivität des gebundenen radiomarkierten Antigens aus Schritt iii) durch Zählung, und

v) man vergleicht die Ergebnisse aus den Schritten i), ii), iii) und iv) mit denen, die man unter Verwendung einer standardisierten Menge an bekanntem Antigen, umfassend ein Peptidfragment der Bβ -Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäurerersten 15-42, erhalten hat, um die Menge an Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II mit den Aminosäureresten 15-42 in der zweiten Fraktion zu bestimmen, und

c) man vergleicht die Menge an die Aminosäurereste 1-42 enthaltendem Peptidfragment aus der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin 1 aus Schritt a), v) mit der Menge an die Aminosäurereste 15-42 enthaltendem Peptidfragment der Bβ -Kette von Human-Fibrin II aus Schritt b), v), womit man ermittelt, ob Bβ 15-42 gegenüber Bβ 1-42 überwiegt, wobei solches Überwiegen einen Hinweis auf die genannte Möglichkeit für das Einsetzen occlusiver Thrombose bei dem genannten Patienten ergibt.

60. Testpackung für die Ermittlung, ob das in einer Testprobe enthaltene Plasma bestimmte Aminosäuresequenzen einschließt, umfassend

(i) den monoklonalen Antikörper von Anspruch 1

(ii) ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrinogen oder Fibrin 1, enthaltend die Aminosäurereste 1-42,

(iii) Human-Fibrinogen, und

(iv) ein enzymgekoppeltes Immunglobulin, das auf tierisches Immunglobulin spezifisch ist.

61. Testpackung gemäß Anspruch 60, in welcher der genannte monoklonale Antikörper der monoklonale Antikörper aus Anspruch 1 ist, wobei das genannte Tier eine Maus ist und wobei das tierische Immunglobulin Mäuse-Immunglobulin ist.

62. Testpackung zur Ermittlung, ob das in einer Testprobe enthaltene Plasma eine bestimmte Aminosäuresequenz einschließt, umfassend

(i) den monoklonalen Antikörper von Anspruch 9

(ii) ein Peptidfragment der Bβ-Kette von Human-Fibrin II, enthaltend die Aminosäurereste 15-42

(iii) Human-Fibrin II und

63. Testpackung gemäß Anspruch 62, in welcher der genannte monoklonale Antikörper der monoklonale Antikörper von Anspruch 9 ist, wobei das genannte Tier eine Maus ist und das tierische Immunglobulin Mäuse-Immunglobulin ist.

64. Testpackung zur Ermittlung, ob das in einer Testprobe enthaltene Plasma bestimmte Aminosäuresequenzen einschließt umfassend

(i) einen ersten monoklonalen Antikörper, wobei der genannte monoklonale Antikörper Anspruch 1 entspricht

(ii) einen zweiten monoklonalen Antikörper, wobei der genannte zweite monoklonale Antikörper Anspruch 9 entspricht,

(iii) Human-Fibrinogen

(iv) Human-Fibrin II und

(v) ein enzymgebundenes Immunglobulin, das auf tierisches Immunoglobulin spezifisch ist.

65. Testpackung gemäß Anspruch 64, in welcher der erste monoklonale Antikörper der monoklonale Antikörper von Anspruch 1 ist, der zweite monoklonale Antikörper der monoklonale Antikörper von Anspruch 9 ist und das tierische Immunglobulin Mäuse-Immunglobulin ist.