DE3448145C2

DE3448145C2 -

Info

Publication number: DE3448145C2
Application number: DE3448145A
Authority: DE
Inventors: Masanori Tachikawa Tokio/Tokyo Jp Ikuzawa; Yoshiharu Oguchi; Kenichi Tokio/Tokyo Jp Matsunaga; Noriyuki Sagamihara Kanagawa Jp Toyoda; Takao Machida Tokio/Tokyo Jp Furusho; Takayoshi Tokio/Tokyo Jp Fujii; Chikao Kunitachi Tokio/Tokyo Jp Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1983-08-11
Filing date: 1984-08-10
Publication date: 1989-09-21
Also published as: DE3448153C2; DE3448149C2; DE3448148C2; DE3448155C2; DE3448151C2; DE3448150C2; DE3429551C2; DE3448152C2; DE3429551A1; DE3448154C2; US5008243A; US4820689A; DE3448144C2

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Glycoproteins mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 und 18 bis 38 Gew.-% Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. Zur Behandlung von Proteinurie.

Das von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2412) stammende Glycoprotein ist auf dem Markt bereits erhältlich als Antitumor-Arzneimittel unter dem Warenzeichen Krestin.

Die Stämme Corioulus versicolor (Fr.) Quel. FERM-P Nr. 2412 und FERM-P Nr. 2414 wurden von dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology bei der American Type Culture Collection am 30. Juli 1979 unter der ATCC Nr. 20 547 und der ATCC Nr. 20 545 hinterlegt.

Da das Glycoprotein eine geringe Säugetiertoxizität aufweist und die Intestinalmikroflora nicht stört, kann eine das Glycoprotein als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) enthaltende pharmazeutische Zubereitung über einen langen Zeitraum hinweg verabreicht werden. Außerdem ist das Glycoprotein frei von der Gefahr der Verursachung von Mißbildungen und/oder allergischen Reaktionen und daher stellt das Glycoprotein eine extrem sichere (gefahrlose) Substanz dar.

Das Glycoprotein ist eine bereits bekannte Substanz und ist beispielsweise beschrieben in den japanischen Patentpublikationen 17 149/1971, 36 322/1976, 14 274/1981, 14 276/1981, 39 288/1981 und der japanischen Patentanmeldung Nr. 57-1 34 496, wonach das Glycoprotein erhalten wird durch Kultivieren einer Basidiomyceten-Fungi-Species, die zum Genus Coriolus gehört, Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000, wobei die auf diese Weise in Form eines Extrakts erhaltene Substanz etwa 18 bis 38 Gew.-% Proteine enthält und ein Molekulargewicht von 5000 bis 300 000, bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren, aufweist.

Zahlreiche pharmakologische Eigenschaften sind in der Firmenschrift "Outline of PSK", Seiten 28 bis 30 beschrieben.

Aus der DE-AS 26 59 808 ist die Verwendung dieses Glycoproteins zur Bekämpfung von Tumoren bekannt.

Das aus den Mycelen von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. stammende Glycoprotein hat eine leberbraune Farbe und einen Stickstoffgehalt von 2 bis 8%, in vielen Fällen von 3 bis 6%. Verschiedene Farbreaktionstests, die mit dem erfindungsgemäßen Glycoprotein durchgeführt wurden, ergaben die folgenden Ergebnisse:

α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion (Molish-Reaktion)
Purpurrot
Indol-Schwefelsäure-Reaktion (Dische-Reaktion)	Braun
Anthron-Schwefelsäure-Reaktion	Grünlich-Blau
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion	Braun
Trytophan-Schwefelsäure-Reaktion	Purpurrot-Braun
Lowry-Folin-Verfahren	Blau
Ninhydrin-Reaktion nach der Chlorwasserstoffsäure-Hydrolyse	Grünlich-Blau

Das Molekulargewicht des Glycoproteins beträgt 5000 bis 300 000, gemessen unter Anwendung eines

Der Saccharidanteil des Glycoproteins besteht hauptsächlich aus β-D-Glycan und die Struktur des Glycan-Restes ist eine verzweigte Struktur, die 1 → 3-, 1 → 4- und 1 → 6-Bindungen aufweist. Von den Aminosäuren, die den Proteinanteil des Glycoproteins bilden ist die Menge der sauren Aminosäuren, wie z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure und dgl., und diejenige der neutralen Aminosäuren, wie Valin, Leucin und dgl., verhältnismäßig groß und die Menge der basischen Aminosäuren, wie z. B. Lysin, Argenin und dgl., ist verhältnismäßig klein. Das Glycoprotein ist in Wasser löslich und in Hexan, Benzol, Chloroform, Methanol und Pyridin fast unlöslich. Das Glycoprotein zersetzt sich langsam bei einer Temperatur von etwa 120°C, wenn es erhitzt wird.

Wie aus der folgenden Tabelle I ersichtlich, ist die Säugetier-Toxizität des Glycoproteins extrem niedrig und es ruft bei Tieren kaum irgendwelche Nebenwirkungen hervor. Insbesondere ist es bekannt als eine sehr sichere (gefahrlose) Substanz für Lebewesen.

Tabelle I

Die in dem Test zur Bestimmung des obengenannten akuten Toxizitätswertes (LD₅₀ mg/kg) verwendeten Mäuse waren solche vom Stamm ICR-JCL, 4 bis 5 Wochen nach der Geburt und mit einem Körpergewicht von 21 bis 24 g. Die in dem gleichen Test verwendeten Ratten waren solche vom Stamm Donryu, 4 bis 5 Wochen nach der Geburt und mit einem Körpergewicht von 100 bis 150 g. Das Glycoprotein wurde in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst und auf jedem in Tabelle I angegebenen Weg verabreicht. Nach der Verabreichung wurden die generellen Symptome, die Mortalität und das Körpergewicht jedes der so behandelten Tiere 7 Tage lang beobachtet und dann wurden sie getötet und einer Autopsie unterworfen.

Wie in der Tabelle I angegeben, wurde sowohl im Falle der Mäuse als auch im Falle der Ratten selbst bei der maximalen Dosis, die verabreicht werden konnte, kein Todesfall festgestellt, so daß das Glycoprotein für Lebewesen extrem sicher (gefahrlos) ist bis zu einem solchen Grade, daß der Wert für die LD₅₀ tatsächlich nicht festgestellt werden konnte.

Als Ergebnis der Prüfung der physiologischen und pharmazeutischen Eigenschaften des von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. stammenden Glycoproteins wurde gefunden, daß das Glycoprotein eine der Proteinurie bessernde Aktivität aufweist, und darauf beruht die vorliegende Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 (bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren) und 18 bis 38 Gew.-% an Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (Fr.) Quel., Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele und Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt, zur Behandlung von Proteinurie.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die Änderung der Proteinmenge im täglichen Urin der Donryu-Ratte, bei der durch Verabreichung von AN nephrosisartige Symptome hervorgerufen worden waren, mit dem Ablauf der Zeit sowie die Änderung der Proteinmenge in dem täglichen Urin der Donryu-Ratte, der zuerst das Glycoprotein und dann AN verabreicht worden war, mit dem Ablauf der Zeit;

Fig. 2 die Änderung der Proteinmenge im Urin eines Patienten mit Lupus nephritis vor und während der Verabreichung des Glycoproteins an den Patienten mit dem Ablauf der Zeit; und

Fig. 3 die Änderung der Proteinmenge im Urin des Patienten mit diabetischer Nephropatie mit dem Ablauf der Zeit vor und während der Verabreichung des Glycoproteins.

Das Glycoprotein weist eine die Proteinurie bessernde Wirkung auf und wird daher für die Behandlung von Nephrosen und des Nierensyndroms verwendet.

Nachfolgend werden die pharmakologischen Eigenschaften des Glycoproteins beschrieben, und zwar die Aktivität in bezug auf die Besserung der Proteinurie.

Da bei Versuchen mit Ratten, die Nephrose-artige Symptome aufwiesen, und auch bei klinischen Versuchen an einem Patienten, der unter Lupus nephritis litt, die Verabreichung des Glycoproteinpräparates zu einer Verminderung des Proteingehalts im Urin des Tieres und des Patienten führte, wurde dadurch bestätigt, daß das Glycoprotein eine Aktivität in bezug auf die Besserung der Proteinurie aufweist und geeignet ist zur Behandlung des Nephrose-Symptoms bzw. von Protenurie.

Das Glycoproteinpräparat kann wie folgt angewendet werden:

Das Glycoprotein kann in Kombination mit irgendeinem anderen aktiven Bestandteil (Wirkstoff) konventioneller pharmazeutischer Zubereitungen zur Besserung des Nieren-Syndroms, wie z. B. Dexamethason, Betamethason, Prednisolon, Indometacin, Dipyridamol und Cyclophosphamid, verwendet werden.

Die Verabreichung der pharmazeutischen Zubereitung kann unter Anwendung eines von mehreren Wegen erfolgen.

Das Glycoprotein kann oral oder parenteral, vorzugsweise oral, an Menschen verabreicht werden. Die orale Verabreichung umfaßt die sublinguale Verabreichung und die parenterale Verabreichung umfaßt die subkutane Injektion, die intramuskuläre Injektion, die intravenöse Injektion und die Instillation. Die wirksame Menge der Verabreichung des Glycoproteins hängt von der Species, dem Alter, individuellen Unterschieden und dem Krankheitszustand des Patienten ab, im Falle der Behandlung von Humanpatienten beträgt die tägliche Dosis jedoch 10 bis 1000 mg, vorzugsweise 200 bis 600 mg pro kg Körpergewicht, die gleichmäßig aufgeteilt wird in 1 bis 3 Portionen, um 1 bis 3mal pro Tag verabreicht zu werden.

Im Falle der oralen Verabreichung kann die pharmazeutische Zubereitung in fester Form vorliegen, beispielsweise in Form einer Tablette, eines Granulats, eines Pulvers und einer Kapsel, sie kann in flüssiger Form vorliegen, beispielsweise in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen und Sirupen, sie kann in Form von Mischungen vorliegen, die nach dem Schütteln verwendet werden, oder sie kann in einer festen Form vorliegen, die nach dem Auflösen in sterilisiertem Wasser, das keine pyretische Substanz enthält, verwendet wird. Die in fester Form vorliegende pharmazeutische Zubereitung kann konventionelle Zusätze enthalten, wie z. B. Bindemittel, Verdünnungsmittel, Gleitmittel, Desintegratoren, Netzmittel, und die in flüssiger Form vorliegende pharmazeutische Zubereitung kann üblicherweise verwendete Zusätze und Konservierungsmittel enthalten. Im Falle einer Injektion kann die pharmazeutische Zubereitung weitere Zusätze, wie z. B. Stabilisatoren, Puffer, Konservierungsmittel und isotonische Agentien enthalten, und das Produkt wird nach dem Abfüllen in eine Dosierungseinheitsampulle oder in einen konventionellen Behälter auf den Markt gebracht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung des Glycoproteins

In 4 l einer wäßrigen 0,1 n Natriumhydroxidlösung wurden 200 g getrocknetes Mycel von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. ATCC 20 545 mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% und einem ungefähren Stickstoffgehalt von 2,5% eingeführt und die Mycele wurden unter Rühren bei einer Temperatur von 90 bis 95°C 1 h lang extrahiert und dann wurde die Mischung auf unter 50°C abgekühlt und nach dem Einstellen des pH-Wertes der auf diese Weise abgekühlten Mischung auf 7,0 mit einer wäßrigen 1 n Chlorwasserstoff säurelösung wurde das gelöste Material durch Saugfiltrieren aus der Mischung entfernt und das auf diese Weise entfernte feste Material wurde mit 500 ml Wasser gewaschen. Die Mischung aus dem Filtrat und den Waschwässern, die 4,2 l betrug, wurde unter Verwendung eines Desktop-Ultrafilters der Firma Amicon Inc. (ausgestattet mit der Ultrafiltrationsmembran PM-5) unter Rühren und Kühlen unter einem Arbeitsdruck von 1,5 kg/cm² bei 10°C einer Ultrafiltration unterworfen, wodurch die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt wurden, wonach eingeengt wurde, so daß man 300 ml des behandelten wäßrigen Extrakts erhielt. Der wäßrige Extrakt wurde einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man etwa 26,6 g einer pulverförmigen Substanz mit einer leberbraunen Farbe in einer Ausbeute von 13%, bezogen auf die Mycele, erhielt. Die auf diese Weise erhaltene pulverförmige Substanz hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,5% und eine Elementaranalysezusammensetzung von 40,5% Kohlenstoff, 6,2% Wasserstoff, 5,8% Stickstoff und Rest Sauerstoff. Die pulverförmige Substanz war in Wasser leicht löslich.

Die pulverförmige Substanz wies eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Vermehrung des transplantierten Sarkoms 180 von bis zu 90%, wenn sie intraperitoneal der transplantierten Maus injiziert wurde, und bis zu 65%, wenn sie oral der transplantierten Maus verabreicht wurde, auf.

Beispiel 1a) Herstellung des Glycoproteins

In 4 l einer wäßrigen 0,1 n Natriumhydroxidlösung wurden 200 g getrocknetes Mycel von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. ATCC-Nr. 20 547 mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% und einem ungefähren Stickstoffgehalt von 2,5% eingeführt und die Mycele wurden unter Rühren bei einer Temperatur von 90 bis 95°C 1 h lang extrahiert und dann wurde die Mischung auf unter 50°C abgekühlt und nach dem Einstellen des pH-Wertes der auf diese Weise abgekühlten Mischung auf 7,0 mit einer wäßrigen 1 n Chlorwasserstoffsäurelösung wurde das gelöste Material durch Saugfiltrieren aus der Mischung entfernt und das auf diese Weise entfernte feste Material wurde mit 500 ml Wasser gewaschen. Die Mischung aus dem Filtrat und den Waschwässern, die 4,1 l betrug, wurde unter Verwendung eines Desktop-Ultrafilters der Firma Amicon Inc. (ausgestattet mit der Ultrafiltrationsmembran PM-5) unter Rühren und Kühlen unter einem Arbeitsdruck von 1,5 kg/cm² bei 10°C einer Ultrafiltration unterworfen, wodurch die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt wurden, wonach eingeengt wurde, so daß man 280 ml des behandelten wäßrigen Extrakts erhielt. Der wäßrige Extrakt wurde einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man etwa 28,3 g einer pulverförmigen Substanz mit einer leberbraunen Farbe in einer Ausbeute von 14%, bezogen auf die Mycele, erhielt. Die auf diese Weise erhaltene pulverförmige Substanz hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,3% und eine Elementaranalysezusammensetzung von 41,2% Kohlenstoff, 6,1% Wasserstoff, 5,8% Stickstoff und Rest Sauerstoff. Die pulverförmige Substanz war in Wasser leicht löslich.

Die pulverförmige Substanz wies eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Vermehrung des transplantierten Sarkoms 180 von bis zu 95%, wenn sie intraperitoneal der transplantierten Maus injiziert wurde, und bis zu 68%, wenn sie oral der transplantierten Maus verabreicht wurde, auf.

Beispiel 2 Aktivität in bezug auf die Besserung eines nephroseartigen Krankheitszustands

An zwei Gruppen von Donryu-Ratten mit einem Gewicht von jeweils 200 g, die aus fünf Tieren bestanden, wurde das Glycoprotein verabreicht und zwar an jede der Ratten der ersten Gruppe kontinuierlich 5 Tage lang in einer oralen täglichen Dosis von 500 mg/kg, und dann wurde ein Aminonucleosid (nachstehend als AN bezeichnet) subcutan injiziert in Form einer Lösung in einer physiologischen Kochsalzlösung einmal am Tag 6 Tage lang in einer täglichen Dosis von 15 mg/kg. AN ist bekannt dafür, daß es eine Proteinurie hervorruft. An jede der Ratten der zweiten Gruppe wurde kein Glycoprotein verabreicht, es wurde jedoch AN auf die gleiche Weise wie bei der ersten Gruppe verabreicht.

Danach wurde der Urin an jedem Tag aus den so behandelten Ratten der beiden Gruppen gesammelt, um den Stickstoffgehalt in den Urinproben nach der Kjeldahl-Methode zu bestimmen, aus dem der Gehalt an Protein darin errechnet wurde.

Die Ergebnisse sind in der Fig. 1 dargestellt. Wie aus der Fig. 1 ersichtlich, konnte durch vorherige Verabreichung des Glycoproteins das Auftreten der Proteinurie, hervorgerufen durch AN, unterdrückt werden.

Beispiel 3 Behandlung einer Lupusnephrose

Einer Frau von 35 Jahren, bei der Lupusnephrose diagnostiziert worden war, wurde das Glycoprotein kontinuierlich mehr als einen Monat lang in einer täglichen Dosis von 3 g oral verabreicht in Kombination mit der oralen Verabreichung von Prednisolon in einer täglichen Dosis, wie sie in der Fig. 2 angegeben ist, 10 Tage lang. Ihr Urin wurde täglich gesammelt und analysiert zur Bestimmung des Stickstoffs darin, wobei der erhaltene Wert auf die Proteinmenge in dem täglichen Urin umgerechnet wurde. Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt. Wie aus der Fig. 2 ersichtlich, war das Glycoprotein aktiv in bezug auf die Besserung der Lupusnephrose.

Beispiel 4 Behandlung einer diabetischen Nephropathie

Einer Frau von 45 Jahren, bei der eine diabetische Nephropathie diagnostiziert worden war, wurden Prednisolon und Endoxan® wie in der Fig. 3 angegeben, oral verabreicht und ab dem in der Fig. 3 angegebenen Zeitpunkt wurde mit der oralen Verabreichung des Glycoproteins in einer täglichen Dosis von 3 g begonnen. Ihr Urin wurde täglich gesammelt und auf seinen Stickstoffgehalt analysiert, wobei die Daten auf die Proteinmenge in dem Urin umgerechnet wurden und auch in der Fig. 3 angegeben sind.

Wie aus der Fig. 3 ersichtlich, war das Glycoprotein wirksam in bezug auf die Besserung der diabetischen Nephropathie.

Beispiel 5 Formulierung einer pharmazeutischen Zubereitung

Kapseln, die jeweils 330 mg des Glycoproteins enthielten, wurden hergestellt durch Füllen von harten Kapseln Nr. 0 mit dem Glycoprotein, so wie es vorlag, unter Verwendung einer automatischen Füllvorrichtung unter Druck.

Claims

Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 (bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren) und 18 bis 38 Gew.-% Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (FR.) Quel., Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt, zur Behandlung von Proteinurie.