DE3231627C2

DE3231627C2 - Elektrophoresegel auf Polysaccharidbasis und dessen Anwendung

Info

Publication number: DE3231627C2
Application number: DE19823231627
Authority: DE
Inventors: William Gurske
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1981-01-19
Filing date: 1982-01-11
Publication date: 1987-06-19
Also published as: IT8219190A0; WO1982002599A1; IT1151101B; US4319976A; DE3231627T1; SE452197B; SE8205388L; SE8205388D0

Description

Die Erfindung betrifft ein Elektrophorese-Gel zur Trennung von Serumproteinen sowie dessen Verwendung.

Elektrophoretische Verfahren zur Trennung von Serumproteinen sowie Elektrophorese-Gele zur Verwendung bei diesen Elektrophorese-Verfahren sind dem Fachmann bekannt, vergleiche Cawley, "Electrophoresis and Immunoelectrophoresis", Little, Brown and Company, Boston, Mass. (1969). Allgemein sind die zur Trennung von Serumproteinen verwendeten elektrophoretischen Gele von einem Typ, der ein Polysaccharid enthält. Auch ein Puffer mit einem basischen pH-Wert liegt gewöhnlich in diesen Elektrophorese- Gelen vor.

Typische Polysaccharide, wie sie in Elektrophorese-Gelen nach dem Stande der Technik verwendet werden, sind unter anderem Stärke, Celluloseacetat, Agar, Agarose sowie Kombinationen hiervon.

Typische in Elektrophorese-Gelen nach dem Stande der Technik verwendete Puffer mit einem basischen pH-Wert sind unter anderem die in der Tabelle I des obengenannten Werks von Cawley, Seiten 331-332, angegebenen basischen pH-Puffer.

Darüber hinaus können derartige Elektrophorese-Gels weitere Zusätze für besondere Zwecke enthalten. So ist aus der US- PS 37 66 047 ein Elektrophorese-Gel auf Polysaccharid-Basis bekannt, bei dem zum Zweck der Verbesserung der Trennschärfe (Selektivität) des Gels gegenüber eng verwandten Proteinen das Puffer-System als wesentlichen Bestandteil einen aliphatischen Aminoalkohol, vorzugsweise Amino-Methyl-Propan (AMP), enthält, und bei dem des weiteren als antibakteriell wirkendes Konservierungsmittel ein Zusatz von Äthylendiamintetra- Essigsäure (EDTA) vorgesehen ist.

Aus der US-Patentschrift 39 59 251 ist bekannt, daß Agar, das ein bekanntes und übliches Elektrophorese-Gel darstellt und vorzugsweise auch als Grundpolysaccharid für die Zwecke der vorliegenden Erfindung anwendbar ist, im unbehandelten Zustand bereits ein Gemisch von Polysacchariden darstellen kann, das u. a. auch bereits saure Carboxylgruppen enthaltende Polysaccharide aufweisen kann. Hieraus ist jedoch nicht die gezielte Anwendung eines oder mehrerer zusätzlicher saurer Polysaccharide aus der genannten Gruppe gemäß dem Grundgedanken der Erfindung bekannt; außerdem ist in der US- Patentschrift 39 59 251 angegeben, daß die Gegenwart von carboxylgruppen-haltigen Bestandteilen in dem Agar die Verwendung als Elektrophorese-Gel störend beeinträchtigen kann und deshalb die Verringerung des Carboxylgehalts praktisch auf Null vorzuziehen ist.

Ein Problem bei den Elektrophorese-Verfahren nach dem Stande der Technik zur Trennung von Serumproteinen besteht darin, daß eine beträchtliche Zeitdauer (in der Größenordnung von 30 Minuten und länger) erforderlich ist, bis die Serumproteine fixiert, d. h. für die visuelle Beobachtung zugänglich werden. Diese verhältnismäßig lange Protein-Fixierperiode macht das Serum-Elektrophorese- Verfahren nach dem Stande der Technik zu einer zeitaufwendigen Prozedur.

Es wäre daher sehr erwünscht, über ein Gel für ein Elektrophorese- Verfahren zur Trennung von Serumproteinen zu verfügen, bei welchem die Protein-Fixierperiode relativ kurz ist. Ein derartiges verbessertes Elektrophorese-Gel zur Trennung von Serumproteinen würde es dem klinischen Laboratorium ermöglichen, dem Diagnostiker lebenswichtige Information in einer kürzeren Zeitdauer zu liefern.

Der Erfindung liegt als Aufgabe die Schaffung eines für ein derartiges elektrophoretisches Trennverfahren geeigneten Elektrophorese-Gels zugrunde, dessen Verwendung bei der Trennung von Serumproteinen eine schnellere Fixierung der Serumproteinfraktionen ermöglicht.

Zu diesem Zweck ist bei einem Elektrophorese-Gel der o. g. Art gemäß der Erfindung vorgesehen, daß das Elektrophorese-Gel zusätzlich ein saures Polysaccharid aus der Gruppe Arabinsäure, Tragantsäure, Karayasäure, Alginsäure und Pektinsäure und/oder Salz(e) hiervon enthält.

Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß sich durch das Vorliegen eines sauren Polysaccharids (oder Salzes hiervon) als zusätzlicher Bestandteil in dem Polysaccharid-Elektrophorese-Gel eine beträchtliche Verringerung der Protein-Fixierdauer erzielen läßt.

Zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete saure Polysaccharide sind unter anderem Arabinsäure, Tragantsäure, Karaya-Säure, Alginsäure, Pektinsäure. Das bevorzugte saure Polysaccharid ist Arabinsäure.

Zur Verwendung für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Salze von sauren Polysacchariden sind unter anderem deren Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Beispiele derartiger saurer Polysaccharidsalze sind unter anderem Gummiarabicumsäure, Tragantgummisäure, Karayagummisäure, Algingummisäure und Pektingummisäure.

Grund-Polysaccharide, welche bevorzugt in dem Elektrophorese- Gel gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind Agar und Agarose. Die Agarose kann entweder niedrig- elektroendosmotische Agarose, mittel-elektroendosmotische oder hoch-elektroendosmotische Agarose sein. Besonders bevorzugt wird als Polysaccharid in dem elektrophoretischen Gel gemäß der Erfindung hoch-elektroendosmotische Agarose verwendet.

Vorzugsweise besitzt der erfindungsgemäß verwendete Puffer einen pH-Wert von 7 bis 10. Besonders bevorzugt weist der Puffer einen pH-Wert von 8 bis 9 auf.

Das elektrophoretische Gel gemäß der Erfindung kann gegebenenfalls des weiteren ein Konserviermittel enthalten. Typische Konserviermittel sind unter anderem Antibiotika, halogenierte organische Verbindungen sowie anorganische Verbindungen. Ein für die Zwecke der Erfindung geeignetes, leicht verfügbares Konserviermittel ist Natriumazid.

Das erfindungsgemäße Elektrophorese-Gel kann gegebenenfalls auch ein Alkylpolyol mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 2 bis 4 Hydroxylgruppen enthalten. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Alkylpolyole sind unter anderem Äthylenglykol, Propandiol, Butandiol, Pentandiol und Glycerin. Vorzugsweise weist das Alkylpolyol 2 bis 4 Kohlenstoffatome auf.

Die in dem Elektrophorese-Gel gemäß der Erfindung verwendeten jeweiligen genauen Konzentrationen der verschiedenen Bestandteile sind nicht kritisch. Jedoch weist das Elektrophorese-Gel gemäß der Erfindung vorzugsweise von 0,4 bis 1,5% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose; von 0,01 bis 5% Gewicht/ Volumen Arabinsäure; bis zu 20% Volumen/Volumen Äthylenglykol; bis zu 1% Gewicht/Volumen Natriumazid; sowie einen Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 10 und einer Molarität von 0,001 bis 3 auf. Besonders bevorzugt weist das Elektrophorese-Gel gemäß der Erfindung von 0,7 bis 1,2% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose; von 0,5 bis 1,5% Gewicht/Volumen Arabinsäure; von 1 bis 10% Volumen/Volumen Äthylenglykol; von 0,05 bis 0,15% Gewicht/Volumen Natriumazid; sowie einen Puffer mit einem pH-Wert von 8 bis 9 und einer Molarität von 0,05 bis 1 auf. In optimaler Ausführung weist das Elektrophorese-Gel gemäß der Erfindung etwa 1% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose; etwa 1% Gewicht/Volumen Arabinsäure; etwa 5% Volumen/Volumen Äthylenglykol; etwa 0,1% Gewicht/Volumen Natriumazid; sowie einen Barbitalpuffer mit einem pH-Wert von etwa 8,6 und einer Molarität von etwa 0,05 auf.

Die Elektrophorese-Gele gemäß der Erfindung können nach einem beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, vergleiche beispielsweise Cawley, a. a. O. Allgemein wird die Gel-Lösung durch Mischen ihrer verschiedenen Bestandteile bei gleichzeitiger Erhitzung des Gemischs auf eine Temperatur von 80 bis 100°C hergestellt. Das Elektrophorese-Gel kann nach üblichen Formgebungs- oder Gießverfahren hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen Gele können bei praktisch jeder bequemen Temperatur, beispielsweise bei Temperaturen von 2°C bis 40°C, vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 18°C bis 26°C, gelagert werden. Vorzugsweise werden die Elektrophorese-Gele bis zur Gebrauchsanwendung in versiegelten Kunststoffbehältern aufbewahrt.

Die Aufgabe der Proben zu den erfindungsgemäßen elektrophoretischen Gelen kann nach einem beliebigen, im Stande der Technik verwendeten Verfahren erfolgen, beispielsweise mittels einer Mikroliter-Injizierspritze. Die Elektrophorese- Gele können bei 100 V über 20 Minuten der Elektrophorese unterworfen werden. Falls gewünscht, können die Gele in einem Alkohol/Essigsäure-Gemisch aus beispielsweise 60% Alkohol, 30% entionisiertem Wasser und 10% Eisessigsäure fixiert werden. Außerdem können die Gele gegebenenfalls bei 80°C bis 90°C getrocknet werden.

Beispiel 1

Die beiden in der Tabelle I angegebenen Elektrophorese- Gel-Zusammensetzungen wurden jeweils gemäß dem nachfolgenden Versuchsprotokoll verwendet, zur Veranschaulichung des verbesserten Elektrophorese-Verfahrens gemäß der Erfindung für die Trennung von Serumproteinen und des verbesserten Elektrophorese-Gels hierfür. Der einzige Unterschied zwischen den beiden in diesem Vergleichsexperiment verwendeten Elektrophorese-Gelen bestand darin, daß das innerhalb des Rahmens der Erfindung liegende Elektrophorese- Gel Arabinsäure, d. h. ein spezielles saures Polysaccharid, enthielt, während das außerhalb des Rahmens der Erfindung liegende Elektrophorese-Gel frei von jeglichem saurem Polysaccharid war.

Protokoll Elektrophorese-Verfahren

1.0Eine Serumprobe wurde nach einem Schablonen- Verfahren auf die Oberfläche des Gels aufgebracht. 2.0Das Gel wurde in einem Barbitalpuffer mit pH 8,6 der Elektrophorese unterworfen. 3.0Das Gel wurde in eine entionisiertes Wasser, Äthylalkohol und Eisessigsäure (3 : 6 : 1) enthaltende Fixierlösung bis zum Ausfällen gebracht und beobachtet.

Die bei Ausführung dieses Versuchsprotokolls für die beiden Gelzusammensetzungen gemäß Tabelle I erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Wie die Serumprotein-Fixierzeiten in Tabelle I zeigen, ermöglicht ein Elektrophorese-Verfahren zur Trennung von Serumproteinen unter Verwendung des verbesserten Elektrophorese- Gels gemäß der Erfindung die Fixierung von Serumproteinen in weniger als 3 Minuten. Demgegenüber konnte mit einem ähnlichen Verfahren, das sich lediglich darin unterschied, daß das dabei verwendete Elektrophorese-Gel keinerlei saures Polysaccharid (in welchem der Säureanteil wenigstens eine Carboxylgruppe enthält) oder die Salze eines derartigen sauren Polysaccharids enthält, das Serumprotein selbst nach einer Periode von 30 Minuten nicht fixiert werden.

Claims

1. Elektrophorese-Gel auf Polysaccharidbasis zur Verwendung bei der elektrophoretischen Trennung von Serumproteinen, wobei das Elektrophorese-Gel ein oder mehrere Grundpolysaccharid(e) sowie einen Puffer mit einem basischen pH-Wert enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Elektrophorese-Gel zusätzlich ein saures Polysaccharid aus der Gruppe Arabinsäure, Tragantsäure, Karayasäure, Alginsäure und Pektinsäure und/oder Salz(e) hiervon enthält.

2. Elektrophorese-Gel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bzw. die Salz(e) des sauren Polysaccharids aus der Gruppe Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze gewählt ist/sind.

3. Elektrophorese-Gel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es das Salz des sauren Polysaccharids und einen Puffer mit einem basischen pH-Wert, vorzugsweise im Bereich von 7 bis 10 und besonders bevorzugt im Bereich von 8 bis 9, aufweist.

4. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zuzsätzlich ein Konservierungsmittel, vorzugsweise Natriumazid, aufweist.

5. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Alkylpolyol mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, und 2 bis 4 Hydroxylgruppen enthält.

6. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche und insbesondere nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Grund-Polysaccharid aus der Gruppe Agar und Agarose gewählt ist.

7. Elektrophorese-Gel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das saure Polysaccharid hoch-elektroendosmotische Agarose ist.

8. Elektrophorese-Gel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkylpolyol Äthylenglykol ist.

9. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch die Gehalte

(a) von 0,4 bis 1,5%, vorzugsweise von 0,7 bis 1,2%, und besonders bevorzugt etwa 1% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose,
(b) von 0,01 bis 5%, vorzugsweise von 0,5 bis 1,5%, und besonders bevorzugt etwa 1% Gewicht/Volumen Arabinsäure,
(c) bis zu 20%, vorzugsweise von 1 bis 10%, und besonders bevorzugt etwa 5% Volumen/Volumen Äthylenglykol,
(d) bis zu 1%, vorzugsweise von 0,05 bis 0,15%, und besonders bevorzugt etwa 0,1% Gewicht/Volumen Natriumazid und
(e) daß der Puffer einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 10, vorzugsweise im Bereich von 8 bis 9, besonders bevorzugt von etwa 8,6, sowie eine Molarität im Bereich von 0,001 bis 3, vorzugsweise von 0,05 bis 1, besonders bevorzugt von etwa 0,05, besitzt.

10. Anwendung des Elektrophorese-Gels nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche mit einem Elektrophorese-Verfahren zur Bestimmung der relativen Verteilung von Proteinen.