DE3200662C2

DE3200662C2 - Nitrosoharnstoffderivate, Verfahren zu deren Herstellung und Arzneimittel diese enthaltend

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Publication number: DE3200662C2
Application number: DE3200662A
Authority: DE
Inventors: Tetsuo Musashino Tokio/Tokyo Suami
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-01-12
Filing date: 1982-01-12
Publication date: 1986-08-28
Also published as: GB2091261A; DE3200662A1; FR2497800B1; US4452814A; JPS57116043A; GB2091261B; FR2497800A1; CA1186686A

Abstract

Es werden neue Nitrosoharnstoffderivate hoher Inhibitorwirkung gegenüber Leukämie und Tumoren beschrieben, die sie zu wertvollen pharmazeutischen Substanzen macht. Diese Verbindungen entsprechen den Formeln (I), (II) und (III): (Formeln I, II und III) wobei R ↑1, R ↑2 und R ↑4 gleich oder verschieden sein können, und jeweils für Wasserstoff, eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkanoyl- oder eine heterocyclische Gruppe, R ↑3 für den Rest am α-Kohlenstoffatom einer α-Aminosäure, n für 2 oder 3, X für Chlor, Fluor und/oder Brom und Ac für eine Alkanoylgruppe stehen.

Description

R¹ R³ R⁴

\ I I

NCOCHNCONCh₂CH₂X (I)

R² NO

Bei der Definition für R³ bedeutet die Formulierung »der Rest an dem «-Kohlenstoffatom einer a-Aminosäure« eine Gruppe, die eine Aminosäure bildet, wenn sie mit einem Kohlenstoffatom verbunden ist, an die eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe und ein Wasserstoffatom gebunden sind. So bedeutet die Gruppe R'

I

—^CH—

einen solchen Rest einer a- Aminosäure, der auftritt oder sich ableiten läßt, wenn die α-Aminogruppe und die a-Carboxylgruppe von dem Molekül der α-Aminosäure entfernt werden. Beispielsweise kann die Gruppe

R¹

— CH-

der Formel

— C H —,nämlich —CH₂—

besitzen; diese ist aus Glycin abgeleitet, indem die Amino- und Carboxylgruppe vom Glycinmolekül entfernt wird; oder sie kann die Formel

CH₃

— CH-

besitzen, die in gleicher Weise vom Alanin abgeleitet ist, oder die Formel:

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CH₂-
-CH-

die in gleicher Weise vom Phenylalan.-n abgeleitet ist, oder die Formel:

CH₂OH
JO _CH —

die vom Serin abgeleitet ist, oder die Formel:
CH,CONH,

— CH-

die vom Asparagin abgeleitet ist, usw. Zu typischen Vertretern solcher Rest R³ zählen solche am c-KohlenstofT-atom von Glycin, Alanin, Phenylalanin, Sarcosin, Serin, Tryptophan, Prolin, Methionin, Cystein, Tyrosin, Valin, Leucin, Isoleucin, Threonin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Lysin, Hydroxylysin, Histidin und Arginin.

Als zweite Gruppe neuer Nitrosoharnstoffderivate gelten erfindungsgemäß Verbindungen der Formel (/I) gemäß Anspruch 1:

R¹ R⁴

NCO(CH₂) NCONCH₂CH₂X (II)

" ι

NO

, in der R¹, R² und R⁴ für Wasserstoff und X für Chlor stehen wobei η 2 oder 3 ist.

f. Als dritte Gruppe neuer Nitrosoharnstoffderivate werden erfindungsgemäß Verbindungen der Formel (III)

gemäß Anspruch 1 zur Verfugung gestellt

rOH

-O NHCCH₂NHCNCH₂CH₂Ci (III)

HO

NHAc

in der Ac für eine Acetylgruppe steht.

Erfindungsgemäß können die NitrosohamstofTderivate gemäß Formel (I) auf zwei verschiedenen Wegen hergestellt werden. Im ersten Weg wird eine Verbindung der Formel (IV):

R¹ R³ R⁴

NCOCHNH (IV)

in der R¹, R², R³ und R⁴ die zuvor gegebene Bedeutung besitzen, mit p-Nitrophenyl N-(2-haloäthyl)-N-nitrosocarbamat bei Temperaturen von O bis 5O⁰C in einem geeigneten Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran umgesetzt. Der zweite Weg besteht in der Umsetzung einer Verbindung der Formel (V):

R¹ R³ R⁴

NCOCHNCONHCh₂CH₂X (V)

/
R

in der R¹, R², R³, R⁴ und X die vorgegebene Bedeutung besitzen, mit einem Nitrosierungsmittel in einem geeigneten Lösungsmittel. Alle üblichen Nitrosierungsmittel, wie Natriumnitrit, Stickstofftrioxid, Stickstofftetroxid, Nitrosylchlorid und ähnliche sind verwendbar. Zu geeigneten Lösungsmitteln für diese Reaktion zählen organische Lösungsmittel wie Ameisensäure, Essigsäure und ähnliche. Die Reaktionstemperatur kann normalerweise im Bereich von 0° bis 80°C liegen.

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Die Verbindungen gemäß Formel (I), die auf einem dieser beiden Wege hergestellt wurden, können aus der Reaktionslösung leicht abgetrennt und in üblicher Weise einschließlich mittels eines Ionenaustauscherharzes, Säulenchromatographie und/oder Umkristallisieren mit einem organischen Lösungsmittel gereinigt werden.

Die Nitrosoharnstoffderivate gemäß Formel (II) können erfindungsgemäß in gleicher Weise wie die Verbindungen gemäß Formel (I) hergestellt werden. So können sowohl die erste als auch der zweite Weg zur Herstellung von Verbindungen gemäß Formel (I) zur Herstellung der Verbindungen gemäß der Formel (II) unter der Voraussetzung beschatten werden, daß die Ausgangsverbindungen gemäß Formel (IV) und (V) durch Verbindungen der Formeln (VI) und (VII) ersetzt werden:

R⁴

NCO(CH₂) NH

R⁴

NCO(CH₂) NCONHCH₂CH₂X

(VI)

(VII)

OAc

O N₃

AcO

OAc

katalytische Hydrierung

AcO

10

20

wobei R¹, R², R⁴, X und η die zuvor gegebene Bedeutung besitzen.

In Formel (III) ist Ac die Acetylgruppe.

Die NitrosoharnstofTderivate gemäß Formel (III) können erfindungsgemäß auf folgendem Weg hergestellt werden:

30

35

Peptidisierung mit N-geschütztem Glycin

AcO

OAc

-O NHCCH₂NHZ OAc

NHAc

(X)

•40

45

50

OH-Schutzgruppenabspaltung

HO

55

60

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, O NHCCH₂NH₂
5 N-Schutzgruppen- / \| Il ^NO

-OH

abspaltung υλ\Ι / ^Base

r-un J-O N
(\?^H / O ONO ^{(Z =} Benzyloxycarbonylgruppe)

NHCCH₂NHCNCH₂CH₂Ci

HO ^ f

²⁰ NHAc

(ΙΠ)

25 Die katalytische Hydrierung des Azidderivats (VIII) zu der Aminoverbindung (IX) kann in üblicher Weise beispielsweise in Gegenwart von Raney-Nickel im Methanol durchgeführt werden.

Bei der folgenden Peptidisierung des Aminoderivats (IX) kann das N-geschützte Glycin vorzugsweise in Form eines aktiven Esters verwendet werden, der durch Umsetzung des N-geschützten Glycins mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in einem geeigneten Lösungsmittel in geeigneter 30 Weise hergestellt wird. Die Peptisierung, bzw. die Peptidbildung geschieht durch Umsetzung des Aminoderivats (IX) mit dem aktiven Ester bei einer Temperatur im Bereich von 0° bis 5O⁰C in Gegenwart einer Base, wie Triäthylamin, Ν,Ν-Dimethylamin und/oder Monoäthylamin in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Methanol, Äthanol und/oder Dioxan und führt zur Verbindung (X).

Die Abspaltung der OH-Schutzgruppe der Verbindung (X) kann in üblicher Weise, beispielsweise durch Um-35 setzung der Verbindung mit Natriummethoxid in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt werden. Nachfolgend kann die Abspaltung der N-Schutzgruppe Z (Benzyloxycarbonylgruppe) der Verbindung (XI) in üblicher Weise, beispielsweise durch katalytische Hydrierung in Gegenwart von Palladiumschwarz unter Bildung der Verbindung (XII) erfolgen.

Die Endstufe derPeptisation kann erreicht werden durch Umsetzung der Verbindung (XII) mitp-Nitrophenyl 40 N-(2-chloräthyl)-N-nitrosocarbamat bei einer Temperatur von 0° bis 50° C in Gegenwart einer Base wie Triäthylamin in einem geeigneten Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran zu der Verbindung (III).

Die Isolierung der Verbindung (III) aus der Reaktionslösung und ihre Reinigung kann in analoger Weise wie bei der Herstellung der Verbindungen (I) und (II) beschrieben, erfolgen.

Zu geeigneten Nitrosoharnstoffderivaten gemäß Formel (I) zählen:

N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]glycinamid;
N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]sarcosinamid;
N-[N'-(2-Ch!oräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-phenylalaninamid;
N-[N'-(2-ChloräthyI)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-tyrosinamid;
50 N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-valinamid;

N-[N'-(2-ChloräthyI)-N'-nitrosocarbamoyl]-DL-leucinamid;
N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-serinamid;
N-[N'-(2-Chloräthyl )-N'-nitrosocarbamoyl]-L-methioninamid; und
N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-prolinamid.

Zu geeigneten Beispielen von Nitrosoharnstoffderivaten gemäß Formel (II) zählen:

N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-jß-a!aninamid; und
N-tN'-(2-ChIoräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-y-aminobuttersäureamid.

Ein typisches Beispiel für die Nitrosoharnstoffderivate gemäß Formel (III) ist2-Acetamid-l-[[[[(2-chloräthyl)-nitrosoaminolcarbonyljglycylJaminoH^-didesoxy-iS-D-glucopyranose.

Die antileukämische Aktivität eines typischen erfindungsgemäßenNitrosoharnstofTderivats gemäß Formel (I) wurde hinsichtlich Leukemia L 1210 bei Mäusen untersucht; Einzelheiten werden im folgenden beschrieben. 65

Verbindung

N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]glycinamid.

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Tiere

Männliche BDF, Müuse, etwa 7 Wochen alt und mit einem Gewicht von 22 ± 1 g wurden in Gruppen von 5 Tieren je Versuch eingesetzt.

5 Tumorzellen

Lcukemia-L 1210-Zellen wurden intraperitonäal in einer Konzentration von 1 X 10'' Zellen/0,05 ml/Maus eingeimpft.

Methode

Die Testverbindung wurde in einer physiologischen Salzlösung gelöst; es wurde eine Serie von Lösungen vorbestimmter Konzentrationen hergestellt; jeweils 0,1 ml jeder Lösung wurde jeder Maus intraperitonäal einmal täglich, beginnend 24 Stunden nach Einimpfen der Tumorzellen, in drei aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Die antileukämische Aktivität der Testverbindung wurde anhand der Überlebenstage und prozentualer Erhöhung der Lebensdauer gemessen. Der prozentuale Anstieg der Lebensdauer (ILS) wurde wie folgt berechnet:

ILS(%) = 1^-X 100

7': Mittlere Anzahl der Überlebenstage der behandelten Tiere
C: Mittlere Anzahl der Überlebenstage der unbehandelten Tiere

Der Kontrollversuch wurde in gleicher Weise wie die Testversuche mit der Ausnahme durchgeführt, daß 0,1 ml der physiologischen Salzlösung anstelle der Lösung der Testverbindung verabreicht wurde. Die Versuchsergebnisse werden in der folgenden Tabelle wiedergegeben.

Die Versuchsergebnisse zeigen deutlich, daß die erfindungsgemäßen neuen Nitrosoharnstoffderivate hohe ILS-Werte bei sehr geringer Dosis ohne Auftreten von Ascites aufweisen; es kann hieraus gefolgert werden, daß sie in der Humanmedizin zur chemotherapeutischen Behandlung von leukämischen und Tumorerkrankungen geeignet sind.

Die Nitrosoharnstoffderivate gemäß Formeln (I), (II) und (III) gemäß Erfindung sind desweiteren durch ihre geringe Toxizität gekennzeichnet. In der folgenden Tabelle wird die akute Toxizität einiger typischer Vertreter der Verbindungen gemäß Formel (I) mit Hilfe des LD₅o-Wertes aufgezeigt, wobei diese Verbindungen intraperitonäal (i. p.) oder intravenös (i. v.) männlichen BDF|-Mäusen im Alter von etwa 6 Wochen verabreicht und die Beobachtungen nach Ablauf von 21 Tagen gemäß der Litchfield-Wilcoxon-Methode durchgeführt wurden:

50

Verbindung LD50 (mg/kg)

i. p. i. v.

Dosis der	Mittlere Anzahl der	ILS (%)
Verbindung	Überlebenstage
(mg/kg)	behandelt/Vergleich
16	>60,0/7,7	>679,2
8	>60,0/7,7	>679,2
2	14,0/7,7	81,8
1	10,6/7,7	37,7
0,5	10,2/7,7	32,5

N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso- 21,2 22,4

carbamoyl]glycinamid

N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso- 392,0 426,6

carbamoyfjsarcosinamid

N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso- 219,6 195,4 _6Q

carbamoyl]prolinamid

Erfindungsgemäß wird ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfugung gestellt, die therapeutisch wirksame Mengen eines Nitrosoharnstoffderivates gemäß Formel (I), (II) und/oder (III) zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichem Träger, Verdünnungsmittel oder üblichen Arzneimittelträger enthält,

Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in an sich bekannter Verabreichungsform zur oralen Verabreichung oder zur Injektion für Menschen, oder in geeigneter Form zu oraler, Injektion- oder intraperitonäaler Verabreichung für Tiere vorliegen. Geeigneter Weise liegt deshalb die pharmazeutische Zusammensetzung als

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Lösung in einer Ampulle, in Kapselform, Tablettenform, Pulvergranulat oder ähnlicher Form für orale Verabreichung oder zur Injektion vor.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind allein oder in Verbindung mit anderen an sich bekannten therapeutischen Zugaben geeignete Mittel zur Behandlung von leukämischen und Tumorerkrankungen bei Mensch und Tier, wobei dieses Mittel in geeigneten Zeitabständen dem Patienten in geeigneten therapeutischen Dosen verabreicht wird. Die tatsächlich zu verabreichende Menge hängt von derjeweiligen einzelnen Verbindung, der verwendeten Zusammensetzung, der Art der Verabreichung der vorausgesehenen Dauer der Verabreichung und anderen Variablen ab. Natürlich spielen auch die dem Fachmann geläufigen Einflüsse der Konstitution des Patienten, wie Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Ernährung, Metabolismus und Excretion, Sensitivität, und Art und Umfang der Erkrankung eine Rolle. Die zu verwendende Dosierung kann sich der Fachmann in Kenntnis der aufgezählten Parameter leicht erarbeiten.

Im folgenden wird anhand von Beispielen die Herstellung der erfindungsgemäßen Nitrosoharnstoffderivate sowie die Herstellung der Ausgangs- und Zwischenprodukte beschrieben.

15 Beispiel 1

Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]glycinamid
H₂NCCH₂NH₂-H₂NCCH₂NHCNCH₂CH₂Ci

O O ONO

Glycinamidhydrochlorid (200 mg, 1,81 mmol) wurden in Wasser (10 ml) gelöst. Der Lösung wurde Amberiite IRA-400 (OH~-Form), ein stark basisches Anionenaustauscherharz von Rohm & Haas (5,4 ml) zugesetzt und die Mischung 15 Minuten gerührt, um die Dehydrochlorierung zu bewirken.

Nach Abfiltern des Harzes wurde das Filtrat im Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde in Methanol (3 ml) gelöst und tropfenweise mit einer Lösung von p-Nitrophenyl-N-(2-chloräthyl)-N-nitrosocarbamat(520 mg, 1,05 Mol je Mol Ausgangsverbindung) in Tetrahydrofuran (7 ml) in der Dunkelheit unter Rühren versetzt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionslösung dünnschichtchromatographisch mit einem Entwickler auf Chloroform/Methanolbasis (5 : 1 Volumenverhältnis), analysiert, wobei die Bildung eines Kondensationsproduktes durch Ausbildung eines einzelnen Flecks mit einem Rf-Wert von 0,62 bestätigt wurde. Die Reaktionslösung wurde dann im Vakuum zu einem tiefgelben öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch über Silicagel (Wakogel C-300,5 g, ein Produkt der Wako Pure Chemical Co., Ltd.) mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/Äthanolbasis (8 : 1 Volumenverhältnis) gereinigt, wobei das Eluat aus der Silicagelsäure in Fraktionen gesammelt und die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, vereinigt und zu einem schwachgelben öligen Rückstand (350 mg) konzentriert wurden. Der Rückstand wurde aus Äthyläther kristallisiert, anschließend mit Äthanol gewaschen und ergab N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]glycinamid (275 mg) als schwachgelbe prismenartige Kristalle.
Ausbeute 72,9%; Schmelzpunkt 125-126°C (Zersetzung)

Elementaranalyse:
Berechnet für C₅H₉N₄O₃Cl, MW = 208,611:

45 C: 28,79, H: 4,25, N: 26,86, Cl: 17,00%,

Gefunden: C: 29,00, H: 4,35, N: 26,56, Cl: 17,35%.

Beispiel 2 50

Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]sarcosinamid

CH, OCH₃

I III

CICH₁CH₂NHCNCH₁CONH₅-CICH₂Ch₂NCNCH₁CONH₁

Il I

O NO

N-fN'-^-ChloräthylJcarbamoylJsarcosinamid (100 mg, 0,516 mmol) wurde in 99%iger Ameisensäure (0,7 ml) unter Eiskühlung gelöst, und langsam mit Natriumnitrit (53,4 mg, 1,5 Mole je Mol Ausgangsverbindung) versetzt; die Mischung wurde zur Vervollständigung der Reaktion weitere 30 Minuten gerührt Dann wurde Amberiite IR-120 (H⁺-Form), ein stark saures Kationenaustauscherharz von Röhm & Haas (1 ml) und Methanol (1 ml) der gebildeten Reaktionsmischung zugesetzt und 10 Minuten gerührt. Nach Abfiltrieren des Harzes wurde die Reaktionslösung im Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch über Silicagel (Wakogel C-300) mit einem Enlwicklcrsystem aufToluol-Äthanolbasis (3 : I Volumenverhältnis) gereinigt, wobei das Eluat in Fraktionen gesammelt und die Fraktionen, die das Hauptprodukt enthielten, vereinigt und im Vakuum zu N-fN'^-ChloräthylJ-N'-nitrosocarbamoyllsarcosinamid (62 mg) als weißer kristalliner Rückstand konzentriert.

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Ausbeute 53,9%; Schmelzpunkt 86-88°C (Zers.) Elementaranalyse: Berechnet für Q₁H₁₁N₄O₃Cl, MW = 222,637:

C: 32,37, H: 4,98, N: 25,17, Cl: 15,93%, Gefunden: C: 32,14, H: 4,88, N: 24,81, Cl: 16,18%.

Beispiel 3

Herstellung von 2-Acetamido-l-[[[[(2-chloräthyI)nitrosoamino]carbonyi]glycyl]amino]-1,2-dideoxy-jS-D-glucopyranose

OH

O NHCCH₂NHCOCh₂-

HO

OH

O NHCCH₂NH₂

NHCOCH,	/	I₂NIICNCn₂CH₂Cl	NHCOCH₃
(XI)	K HO ^N	ΟΝΟ	(XU)


pOH
— Ο NIlCCI
L/¹ °
NHCOCH,
(ΠΙ)

Verbindung (Xl) (210 mg, 0,51 mmol), die gemäß A. Yamamoto et al (Chem. Pharm. Bull. 13 (1965) 1036) hergestellt wurde, wurde in Methylcellosolve (15 ml) gelöst; die Lösung wurde katalytisch in Gegenwart von Palladiumschwarz (25 mg) unter einem Anfangswasserstoffdruck von 3,52 kg/cm² (50 psi) über Nacht zur Bildung der freien Aminoverbindung (XII) hydriert.

Nach Entfernung des Katalysators durch Filtrieren wurde die Reaktionslösung im Vakuum zu einem weißen schmierigen Rückstand konzentriert. Dieser wurde in Methanol (7 ml) suspendiert, wozu Triäthylamin (25,8 mg, 0,5 Mol je Mol Ausgangsverbindung) zugesetzt wurde; dann wurde eine Lösung von p-Nitrophenyl-N-(2-chloräthyl)-N-nitrosocarbamat (419 mg, 3 Mol je Mol Ausgangsverbindung) in Tetrahydrofuran (7 ml) tropfenweise über einen Zeitraum von etwa 15 Minuten unter Rühren in der Dunkelheit zugesetzt. Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur zur Vervollständigung der Reaktion weitere drei Stunden gerührt; Dann wurde die Reaktionslösung dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/ Mclhanolhasis(3 : 1 Volumenverhältnis) analysiert, wodurch die Anwesenheit eines Hauptflecks mit einem Rf-Wcrt von 0,37 für das gewünschte Produkt mit UV Absorption bestätigt wurde, wobei ein zweiter Fleck mit einem Rf-Wert von 0,18 für ein Nebenprodukt und ein schwacher Fleck des Ausgangsprodukts auftraten. Die Reaktionslösung wurde dann bei Zimmertemperatur im Vakuum zu einem tiefgelben öligen Rückstand konzentrier!, der dann mit Methanol/Isopropyläther in üblicher Weise zu einem schwachgelben festen Rückstand behandelt wurde. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch über Silicagel (Wakogel C-300, 10 g) mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/Äthanolbasis (8 : 1 Volumenverhältnis) und dann mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/Methanolbasis (4 : 1 Volumenverhältnis) gereinigt, wobei die Zugabe mit Chloroform/Methanol (2 : 1 Volumenverhältnis) erfolgt. Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,37 mit einer UV Absorption wurden vereinigt, im Vakuum konzentriert und aus Aceton/Äthylacetat die gewünschte Verbindung (III) (96 mg) ausgefällt.

Ausbeute 45,7%; Schmelzpunkt: 122°C Spezifische Drehung [a]$ + 34,5° (c 0,4, Methanol);

Elementaranalyse: Berechnet Tür C_nH₂₂N₅O₁Cl, MW = 411,803:

C: 37,91, H: 5,39, N: 17,01, Cl: 8,61%, Gefunden: C: 37,88, H: 5,72, N: 16,62, Cl: 8,23%.

60 65

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Beispiel 4

Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-jS-aIaninamid
(1) N-Benzyloxycarbonyl^-alaninamid

HCIH₂NCH₂CH₂COOCH₃-Z-NHCh₂CH₂CONH₂

I (Z = Benzyloxycarbonylgruppe)

jß-Alaninmethylesterhydrochlorid (1,0 g, 7,16 mmol) wurde in Wasser (3,5 mi) gelöst, und mit Chloroform

(40 ml) und einer 33%igen Lösung Benzyloxycarbonylchlorid in Toluol (4,5 ml) versetzt; dann wurde tropfen- ;|

weise eine wäßrige 2n-Natriumcarbonatlösung (16,5 ml) unter kräftigem Rühren und Eiskühlung zugesetzt. L?ie f

gebildete Mischung wurde bei diesen Bedingungen weitere 30 Minuten gehalten und dann zur Vervollständi- |

gung der Reaktion weitere 30 Minuten bei Zimmertemperatur.

Die Reaktionsmischung setzte sich in verschiedenen Schichten ab. Die wäßrige Schicht wurde mit Chloro-

„ - - - fs

form gewaschen (2x10 ml). Die Chloroformschichten wurden vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat |

getrocknet. Nach Entfernung des Natriumsulfats wurde der Chloroformextrakt im Vakuum zu Methyl-N-benzyloxycarbonyl-/-alaninat in Form eines öligen Rückstands konzentriert und getrocknet. Der Rückstand wurde in mit Ammoniakgas gesättigtem Methanol (20 ml) bei 0⁰C gelöst; die gebildete Lösung wurde 5 Tage verschlossen bei Zimmertemperatur stehengelassen.

Die Reaktionslösung wurde dann dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Benzol/ Äthanolbasis (9 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierbei wurde bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wert von 0,48 Für Methyl-N-benzyloxycarbonyl-^S-alaninat verschwand, und daß ein Hauptfleck mit einem Rf-Wert von 0,14 für die gewünschte Verbindung und ein zweiter Fleck mit einem Rf-Wert von 0,35 für geringe Mengen eines Nebenprodukts auftraten. Die abgeschiedenen kleinen prismenartigen Kristalle wurden als gewünschte Verbindung durch Filtrieren abgetrennt (795 mg). Das Filtrat wurde konzentriert und dann in einem Kühlschrank aufbewahrt und ergab weitere 494 mg gewünschter Verbindung als Sekundärkristalle.
Gesamtausbeute: 1,289 g; Ausbeute: 81,0%;

Schmelzpunkt: 164-165°C;

Elementaranalyse:
Berechnet für C₁H_nN₂O₃, MW = 222,238:

C: 59,45, H: 6,35, N: 12,61%,
Gefunden: C: 59,67, H: 6,41, N: 12,44%.

(2) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-jß-alaninamid

Il

Z-NHCH₂CH₂CONH₂ ^CICH₂CH₂NCNHCH₂Ch₂CONH₂

j
NO

Die in Stufe (1) erhaltene Verbindung (300 mg, 1,35 mmol) wurde in Methylcellosolve (10 ml) gelöst; die Lösung wurde katalytisch in Gegenwart von Palladiumschwarz (30 mg) unter einem AusgangswasserstofTdruck von 3,52 kg/cm² (50 psi) über Nacht katalytisch hydriert.
Nach Entfernung des Katalysators durch Filtrieren wurde das Filtrat in Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde in Methanol (3 ml) gelöst, wozu Triäthylamin (68 mg) zugesetzt wurde; dann wurde tropfenweise über einen Zeitraum von etwa 5 Minuten unter Rühren und in Dunkelheit eine Lösung von p-Nitrophenyl-N-(2-chloräthyl)-N-nitrosocarbamat(443 mg, 1,2 Mol je Mol Ausgangsverbindung) in Tetrahydrofuran (5 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur zur Vervollständigung der Reaktion für weitere 60 Minuten gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/Methanolbasis (7 : 1 Volumenverhältnis) analysiert, wobei bestätigt wurde, daß praktisch ausschließlich eine einzige Verbindung mit einem Fleck mit einem Rf-Wert von 0,40 und mit UV Absorption gebildet worden war.

Die Reaktionslösung wurde in Vakuum zu einem tiefgelben öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch über Silicagel (Wakogel C-300,15 g) mit einem Entwicklersystem aufChloro-

form/Äthanolbasis (8 : 1 Volumenverhältnis) gereinigt. Die Fraktionen mit Gehaltan der gewünsch ten Verbindung wurden vereinigt und im Vakuum zu einem schwachgelben öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde aus Äthyläther zu der gewünschten Verbindung (176 mg) kristallisiert.
Ausbeute: 58,6%; Schmelzpunkt: 95-97°C(Zers.);

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Elementaranalyse:
Berechnet fur C₆H₁₁N₄O₃Cl, MW = 222,637:

C: 32,37, H: 4,98, N: 25,17, Cl: 15,93%,

GeRinden: C: 32,14, H: 4,96, N: 24,95, Cl: 16,07%.

Beispiel 5
Herstellung von N-N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl-y-aminobuttersäureamid

(1) N-Benzyloxycarbonyl-y-aminobuttersäureamid HCI-H₂NCh₂CH₂CH₂COOCH₃ ^Z-NHCH₂CH₂Ch₂CONH₂

Methyl-y-aminobutyrathydrochlorid (1,5 g, 9,76 mmol) wurde gemäß Beispiel 4 (1) zu Methyl-N-benzyloxycarbonyl-y-aminobutyrat als öligem Rückstand benzoyloxycarbonyliert. Der Rückstand wurde in einem ammonia kgasgesättigten Methanol (30 ml) bei 0⁰C gelöst; die Lösung wurde 5 Tage bei Zimmertemperatur verschlossen gehalten.

Die Reaktionslösung wurde dann dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Benzol/ Äthanolbasis (9 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; es wurde bestätigt, daß der Fleck bei Rf gleich 0,50 für Methyl-N-benzyloxycarbonyl-jj-aminobutyrat verschwand, und daß ein Hauptfleck mit einem Rf-Wert von 0,12 für die gewünschte Verbindung und ein zweiter Fleck mit einem Rf-Wert von 0,39 für geringe Mengen eines Nebcnproduktes auftraten.

Die Reaktionslösung wurde im Vakuum zu einem weißen kristall-nen Rückstand konzentriert, der mit einer geringen Menge Methanol versetzt wurde, und die gebildete gewünschte Verbindung abfiltriert; es wurden 1,45 g erhalten.
Ausbeute 62,9%; Schmelzpunkt: 128-130⁰C;

Elcmentaranalyse:

Berechnet für C₁₂H₁₆N₃O₁, MW = 236,264:

! C: 61,00, H: 6,83,. N: 11,86%,

Gerunden: C: 61,43, H: 7,10, N: 11,73%.

(2) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyI]-)'-aminobuttersäureamid

Il

ZNHCH₂CH₂CH₂CONh₂ S-CICH₂CH₂NCNHCH₂CH₂CH₂CONh₂

NO

.:. Die in Stufe (1) erhaltende Verbindung (300 mg, 1,27 mmol) wurde in Methylcellosolve (10 ml) gelöst; die Lösung wurde in Gegenwart von Palladiumschwarz (30 mg) unter einem Ausgangswasserstoffdruck von 3,52 kg/cm² (50 psi) über Nacht katalytisch -hydriert.

Nach Entfernung des Katalysators durch Filtrieren wurde das Filtrat im Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde in Methanol (3 ml) gelöst, zu dem Triäthylamin (64 mg, 0,5 Mol je Mol Ausgangsverbindung) zugesetzt wurde; dann wurde eine Lösung von p-Nitrophenyl-N-(2-chloräthyl)-N-nitrosocarbamat (417 mg, 1,2 Mol je Mol Ausgangsverbindung) in Tetrahydrofuran (5 ml) tropfenweise über 5 Minuten unter Rühren in Dunkelheit zugesetzt. Die Mischung wurde zur Vervollständigung der Reaktion weitere 60 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/Methanolbasis (7 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; es wurde bestätigt, daß im wesentlichen eine einzige Verbindung mit einem Fleck bei Rf gleich 0,39 mit UV-Absorption gebildct worden war.

Die Reaktionslösung wurde im Vakuum zu einem tiergelben öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch über Silicagel (Wakogel C-300,15 g) mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/Äthanolbasis (8 : 1 Volumenverhältnis) gereinigt. Fraktionen mit Gehalt an dem gewünschten Produkt wurden vereinigt und im Vakuum zu einem hellgelben kristallinen festen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde mit Äthylether gewaschen und ergab 190 mg der gewünschten Verbindung. Ausbeute: 63,2%; Schmelzpunkt: 102-103,5⁰C (Zers.);

Elcmentaranalyse:
Berechnet für C₇Hi₃N₄O₃Cl, MW = 236,663:

C: 35,52, H: 5,54, N: 23,68, Cl: 14,98%,
Gefunden: C: 35,83, H: 5,58, N: 23,82, Cl: 14,65%.

32 OO 662

Beispiel 6

Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-phenylanlaninamJd
(1) N-rN'-Q-ChloräthyOcarbamoylJ-L-phenylalaninamid

-CK₂CHCONH₂ > <JO/^~ ^CH2— CHCONH₂

NH₂ NHCNHCH₂CH₁Ci

Il ο

L-Phenylalaninamid (ein handelsübliches Produkt von Sigma Chemical Co.; 400 mg, 2,44 mmol) wurde in Methanol (6 ml) gelöst, zu der dann tropfenweise 2-Chlorätnylisocyanat (0,24 ml, 1,2 Mol je Mol Ausgangsverbindung) bei Zimmertemperatur unter Rühren zugegeben wurden; dann wurde die Mischung unter diesen Bedingungen zur Vervollständigung der Reaktion für weitere 20 Minuten gehalten.

Die Reakiionslösung wurde dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/ Methanolbasis (7 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierdurch wurde bestätigt, daß der Fleck bei Rf gleich 0,21 für die Ausgangsverbindung verschwand und ein einzelner Fleck mit einem Rf-Wert von 0,42 für das gewünschte Produkt auftrat.

Die Reaktionslösung wurde im Vakuum zu einem weißen kristallinen festen Rückstand konzentriert; der Rückstand wurde dann mit Isopropanol gewaschen und ergab 553 mg der gewünschten Verbindung.
Ausbeute: 84,1%; Schmelzpunkt 158-160⁰C; [a]f + 3,0° (c 0,54, Methanol);

Elementaranalyse:
Berechnet für C₁₂H₁JMjO₂CI, MW = 269,729:

C: 53,43, H: 5,98, N: 15,58, Cl: 13,15%,

Gefunden: C: 53,49, H: 6,02, N: 15,34, CI: 12,90%.

(2) N-[N'-(2-ChIoräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-phenylalaninamid .

-CH₂CHCONH₂ > <( JV-CH₂CHCONH₂

I X^/ I

NHCNHCH₂CH₂Ci NHCNCH₂CH₂CI

0 ONO

Die in Stufe (1) erhaltene Verbindung (400 mg, 1,48 mmol) wurde in 99%iger Ameisensäure (3 ml) gelöst, zu der dann Natriumnitrit (113 mg, 1,1 Mol je Mol Ausgangsverbindung) über etwa 5 Minuten unter Rühren und Eiskühlung zugesetzt wurden; die Reaktionsmischung wurde unter diesen Bedingungen zur Vervollständigung der Reaktion für weitere 30 Minuten gehalten.

Die Reaktionslösung wurde dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/ Methanolbasis (9 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; es wurde hierbei bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wert von 0,33 für die Ausgangsverbindung verschwand und ein einzelner Fleck mit einem Rf-Wert von 0,51 für das gewünschte Produkt, das UV-Absorption zeigte, auftrat.

Dann wurde Amberlite 1R-120 (H⁺-Form) (5 ml), das in Methanol suspendiert war, der Reaktionslösung zugesetzt und die Mischung für 20 Minuten gerührt. Nach Entfernung des Harzes durch Filtrieren wurde das Filtrat im Vakuum konzentriert und anschließend azeotrop mit Äthanol zu einem kristallinen festen Rückstand destilliert. Der Rückstand wurde mit Methyläther gewaschen und ergab 310 mg der gewünschten Verbindung.
Ausbeute: 70,0%; Schmelzpunkt: 113-115°C (Zers.); [aß- - 30,6° (c 0,36, DMF);

Elementaranalyse:
Berechnet für C₁₂H₁₅N₄O₃CI, MW = 298,729:

C: 48,24, H: 5,06, N: 18,76, Cl: 11,87%,
Gefunden: C: 47,94, H: 5,01, N: 18,44, Cl: 11,58%.

32 OO 662

Beispiel 7

Herstellung von N-fN'-ii-ChloräthyO-N'-nitrosocarbamoyll-L-tyrosinamid (1) N-[N'-(2-Chloräthyl)carbamoyl]-L-tyrosinamid

HO-^MV-Ch₂CHCONH₂ > HO-^(J)V-CH₂-CHCONH₂

NH₂ NHCNHCH₂CH₂Ci

Il ο

L-Tyrosinamid (handelsübliches Produkt von Sigma Co.; 400 mg, 2,22 mmol) wurde in Methanol (8 ml) gelöst; dann wurden tropfenweise 2-Ch!oräthy!isocyanat (0,22 m!) bei Zimmertemperatur unter Rühren zügesetzt; währenddessen schieden sich einige Minuten nach dem Beginn der Zugabe weiße Kristalle aus. Nach 20 Minuten wurde die überstehende Flüssigkeit dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/Methanolbasis (7 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierbei wurde bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wert von 0,09 für die Ausgangsverbindung verschwand und ein einzelner Fleck mit einem Rf-Wert von 0,24 für das gewünschte Produkt auftrat.

Der abgesetzte weiße kristalline Festkörper wurde abfiltriert und mit heißem Methanol gewaschen; hierbei handelt es sich um die erste Fraktion der gewünschten Verbindung (296 mg). Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und ergab eine weiße feste Masse, die mit heißem Methanol gewaschen wurde und eine zweite Fraktion der gewünschten Verbindung (252 mg) ergab. Gesamtausbeute: 548 mg; Ausbeute: 86,4%; Schmelzpunkt 187-189°C (Zers.); {a]² _D ^: + 0,4° (c 0,5, DMF);

Elementaranalyse:
Berechnet für CjH₁₆N₃O₃Cl, MW = 285,729:

C: 50,44, H: 5,64, N: 14,71, Cl: 12,41%,
Gefunden: C: 50,18, H: 5,68, N: 14,47, CI: 12,10%.

(2) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-tyrosinamid

CH₂CHCONH₂ >■

NHCNHCH₂Ch₂CI NHCNCH₂CH₂Cl

O ONO

Die in Stufe (1) eihaitene Verbindung (200 mg, 0,64 mmol) wurde in 99%iger Ameisensäure (1,5 ml) gelöst, wo/:u dann Natriumnitrit (48,6 mg, 1,1 Mol je Mol Ausgangsverbindung) über etwa 5 Minuten unter Rühren und Eiskühlung zugesetzt wurde. Die Reaktionsmischung wurde dann zur Vervollständigung der Reaktion unter diesen Bedingungen für weitere 30 Minuten gehalten; während dieser Zeit verfärbte sich diese Mischung deutlich rötlich-braun.

Die Reaktionslösung wurde dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/ Methanolbasis (7 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierbei wurde bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wert von 0,24 für die Ausgangsverbindung verschwunden war und ein Hauptfleck bei Rf gleich 0,48 für das gewünschte Produkt, das UV-Absorption besaß, auftrat; gleichzeitig trat ein zweiter Fleck mit einem Rf-Wert von 0,68 für ein Nebenprodukt, das ebenfalls UV-Absorption aufwies, auf.

Dann wurde Amberlite IR-120 (H⁺-Form) (5 ml), das in Methanol suspendiert war, der Reaktionslösung zugesetzt; die Mischung wurde 20 Minuten gerührt; hierbei ergab sich ein tief rot-brauner öliger Rückstand. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch über Silicagel (Wako-Gel C-300,10 g) mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/Methanolbasis (7 :1 Volumenverhältnis) gereinigt. Fraktionen mit Gehalt an der gewünschten Verbindung wurden vereinigt, im Vakuum konzentriert und azeotrop mit Äthanol zu einem kristallinen festen Rückstand destilliert. Der Rückstand wurde mit Isopropyläther gewaschen und ergab 113 mg der gewünschten Verbindung. Ausbeute: 51,3%; Schmelzpunkt: 135,5-137°C (Zers.); [affi - 30,4° (c 0,5, DMF);

Elcmentaranalyse:
Berechnet für CjH₁₅N₄O₄CI, MW = 314,729:

C: 45,75, H: 4,80, N: 17,80, Cl: 11,27%,
Gefunden: C: 45,53, H: 4,99, N: 17,57, Gl: 11,45%.

32 OO 662

Beispiele |

Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-valinamid
(1) N-[N'-(2-Chloräthyl)carbamoyl]-L-valinamid

CH₃ CH₃

\cHCHCONH₂ > \cHCHCONH₂

ΓΗ I Γ H I

³ NH₂-HCl ³ NHCNHCH₂CH₂Ci

Il ο

L-Valinamidhydrochlorid (ein handelsübliches Produkt von Sigma Co.; 200 mg, 1,31 mmol) wurde in Methanol (6 ml) gelöst; hierzu wurde dann Amberlite IRA 400 (OH"-Form) (4 ml), suspendiert in Methanol, zugesetzt; die Mischung wurde zur Dehydrochlorierung 20 Minuten gerührt.

Nach Abfiltrieren des Harzes wurde das Filtrat auf ein Volumen von etwa 2 ml konzentriert; hierzu wurden dann tropfenweise 2-Chloräthylisocyanat (0,16 ml, 1,5 Mol je Mol Ausgangsverbindung) zugesetzt. Nach einigen Minuten schieden weiße Kristalle aus. Nach 20 Minuten wurde die überstehende Flüssigkeit dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/Methanolbasis (5 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierbei wurde bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wert von 0,36 für die Ausgangsverbindung verschwunden war, während ein einzelner Fleck mit einem Rf-Wert von 0,74 für das gewünschte Produkt auftrat.
Die ausgeschiedenen Kristalle wurden abfiltriert und mit Methanol gewaschen; es wurde die erste Fraktion der gewünschten Verbindung (135 mg) erhalten. Das Filtrat wurde im Vakuum zu weißen Kristallen konzentriert; diese wurden aus Methanol umkristallisiert und ergaben die zweite Fraktion der gewünschten Verbindung (114 mg).
Gesamtausbeute: 249 mg; Ausbeute: 85,7%; Schmelzpunkt: 197-199°C; [a]jj + 48,9° (c 0,45, DMF)

Elementaranalyse:

Berechnet für C₈H₁₆N₃O₂Cl, MW = 221,689:

C: 43,34, H: 7,28, N: 18,96, Cl: 15,99%,
Gefunden: C: 43,29, H: 7,15, N: 18,75, Cl: 16,15%.

(2) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-valinamid

CH₃ CH₃

\CHCHCONH₂ >■ \cHCHCONH₂

^CH3 NHCNHCH₂CH₂Ci ^CH3 NHCNCH₂CH₂CI

Ii Ii I

O ONO

Die in Stufe (1) erhaltene Verbindung (200 mg, 0,90 mmol) wurde in 99%iger Ameisensäure (1,5 ml) gelöst; dann wurde Natriumnitrit (93 mg, 1,5 Mol je Mol Ausgangsverbindung) über etwa 5 Minuten unter Rühren und Eiskühlung zugesetzt; die Reaktionsmischung wurde unter diesen Bedingungen zur Vervollständigung der Reaktion für weitere 30 Minuten gehalten.

Die Reakticnslösung wurde dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/ Methanolbasis (9 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierbei wurde bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wert von 0,27 für die Ausgangsverbindung verschwunden war, während gleichzeitig ein einzelner Fleck mit einem Rf-Wert von 0,50 für das gewünschte Produkt, das UV-Absorption zeigte, auftrat.

Dann wurde Amberlite IR-120 (H⁺-Form) (4 ml), das in Methanol suspendiert war, der Reaktionslösung zugesetzt und die Mischung 20 Minuten gerührt. Nach Abtrennung des Harzes durch Filtrieren wurde das Filtrat im Vakuum unterhalb 30°C zu einem fahlgelben kristallinen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde mit Äthyläther gewaschen und ergab 181 mg der gewünschten Verbindung.

Ausbeute: 80,0%; Schmelzpunkt 1I5-117°C (Zers.); [a]% + 60,7° (c 0,6, DMF);

Elementaranalyse:
Berechnet für C₈H₁₅N₄O₃Cl, MW = 250,689:

C: 38,33, H: 6,83, N: 22,35, Cl: 14,14%,
Gefunden: C: 38,26, H: 6,55, N: 22,53, Cl: 14,35%.

.32 OO 662

Beispiel 9
Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-DL-leucinamid

(1) N-tN'-^-ChloräthyOcarbamoylj-DL-leucinamid

CH₃ CH₃

\cHCH₂CHCONH₂ > \cHCH₂CHCONH₂

^CH3 NH₂-HCl ^CH3 NHCNHCH₂CH₂Ci

DL-Leucinamidhydrochlorid (ein handelsübliches Produkt von Sigma Co.; 200 mg, 1,20 mmol) wurde in Methanol (6 ml) gelöst; dann wurde Amberlite IRA 400 (OH"-Form) (3,6 ml), in Methanol suspendiert, zugegebcn und die Mischung für 20 Minuten zur Dehydrochlorierung gerührt.

Nach Abfiltrieren des Harzes wurde das Filtrat auf ein Volumen von etwa 2 ml konzentriert; es wurde tropfenweise 2-Chloräthylisocyanat (0,16 ml, 1,5 Mol je Mol Ausgangsverbindung) bei Zimmertemperatur unter Rühren zugegeben; die Mischung wurde unter diesen Bedingungen für weitere 20 Minuten zur Vervollständigung der Reaktion gehalten.

Die Reaktionslösung wurde dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/ Methanolbasis (5 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierdurch wurde bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wert von 0,25 für die Ausgangsverbindung verschwunden war, während ein einzelner Fleck mit einem Rf-Wert von 0,57 für das gewünschte Produkt auftrat.

Die Reaktionslösung wurde im Vakuum zu einem weißen kristallinen festen Rückstand konzentriert, der aus Äthanol umkristallisiert wurde. Es wurde eine erste Fraktion (196 mg) und eine zweite Fraktion (33 mg) der gewünschten Verbindung erhalten.
Cesamtausbeute: 229 mg; Ausbeute: 80,9%; Schmelzpunkt: 156-158°C;

Elementaranalyse:

Berechnet Tür CjH₁₈N₃O₂Cl, MW = 235,715:

C: 45,86, H: 7,70, N: 17,83, Cl: 15,04%,
Gefunden: C: 46,05, H: 7,67, N: 17,56, Cl: 15,28%.

(2) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-DL-leucinamid CH₃ CH₃

^ ³

CH-CH₂CHCONH₂ > >CHCH,CHCONH,

I I

NHCNHCH₂CH₂Ci ^CH3 NHCNCH₂CH₂Cl

11 IM

O ONO

Die in Stufe (1) erhaltene Verbindung (400 mg, 1,70 mmol) wurde in 99%iger Ameisensäure (2,5 ml) gelöst; dann wurde Natriumnitrit (129 mg, 1,1 Mol je Mol Ausgangsverbindung) über etwa 5 Minuten unter Rühren und Eiskühlung zugesetzt; dann wurde die Reaktionsmischung unter diesen Bedindungen für weitere 30 Minuten zur Vervollständigung der Reaktion gehalten.

Die Reaktionslösung wurde dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf der Basis von Chloroform/Methanol (9 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierbei wurde bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wert von 0,23 für die Ausgangsverbindung verschwunden war, während ein Hauptfleck mit einem Rf-Wert von 0,49 für das gewünschte Produkt mit UV-Absorption und gleichzeitig ein zweiter Fleck mit einem Rf-Wert von 0,38 Tür ein Nebenprodukt auftraten.

Dann wurde Amberlite IR-120 (H⁺-Form) (6 ml), suspendiert in Methanol, der Reaktionslösung zugesetzt und die Mischung 20 Minuten gerührt. Nach Entfernung des Harzes durch Filtrieren wurde das Filtrat im Vakuum unterhalb 30°C zu einem hellgelben öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde in einem Excikator einige Tage zum Absetzen der Kristalle aufbewahrt. Die Kristalle wurden mit Isopropyläther gewaschen und ergaben 298 mg der gewünschten Verbindung.

(In einer zweiten und späteren Synthese kann die Kristallisation durch Zugabe von Kristallkeimen erfolgen.) Ausbeute: 66,3%; Schmelzpunkt: 82-84°C;

Elementaranalyse:
Berechnet für C₉H₁₇N₄O₃Cl, MW = 264,715:

C: 40,83, H: 6,47, N: 21,17, Cl: 13,39%,
Gefunden: C: 40,60, H: 6,43, N: 20,98, CI: 13,20%.

32 OO 662

Beispiel 10

Herstellung von N-tN'-^-ChloräthyO-N'-nitrosocarbamoyn-L-serinamid
(1) N-[N'-(2-Chloräthyl)carbamoyl]-L-serinamid

HOCh₂CHCONH₂ > HOCH₂CHCONh₂

NH₂-HCl NHCNHCH₂CH₂Ci

Il

L-Serinaidhydrochlorid (ein handelsübliches Produkt von Sigma Co.; 300 mg, 2,13 mmol) wurde in Methanol (20 ml) gelöst; dann wurde Amberlite IRA 400 (OH~-Forrn) (6,4 ml), suspendiert in Methanol, zugesetzt; die Mischung wurde dann zum Dehydrochlorieren 20 Minuten gerührt.

Nach Abfiltrieren des Harzes wurde das Filtrat auf ein Volumen von etwa 5 ml konzentriert; dann wurde tropfenweise 2-ChloräthyIisocyanat (0,21 ml, 1,2 Mol je Mol Ausgangsverbindung) bei Zimmertemperatur unter Rühren zugesetzt; die Mischung wurde dann unter diesen Bedingungen für weitere 20 Minuten zur Vervollständigung der Reaktion gehalten.

Die Reaktionslösung wurde dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/ Methanolbasis (4 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierbei wurde bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wert von 0,1 für die Ausgangsverbindung verschwunden war, während ein einzelner Fleck mit einem Rf-Wert von 0,33 Tür das gewünschte Produkt auftrat.

Die Reaktionslösung wurde im Vakuum zu einem weißen kristallinen Rückstand konzentriert; dieser wurde dann mit Isopropanol gewaschen und ergab 338 mg der gewünschten Verbindung.
Ausbeute: 75,6%; Schmelzpunkt 131 -132°C; [a]js + 35,7° (c 0,6, Methanol);

Elementaranalyse:
Berechnet für C₆H₁₂N₃O₃Cl, MW = 290,637:

C: 34,37, H: 5,77, N: 20,05, CI: 16,91%,
Gefunden: C: 34,14, H: 5,78, N: 19,80, Cl: 17,13%.

(2) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-serinamid

HOCh₂CHCONH₂ > HOCH₂CHONH₂

NHCNHCH₂CH₂Ci NHCNCH₂CH₂Cl

I! IM

O ONO

Die Verbindung aus Stufe (1) (200 mg, 0,954 mmol) wurde in 99%iger Ameisensäure (1,5 ml) gelöst; dann wurde Natriumnitrit (72 ;ng, 1,1 Mol je Mol Ausgangsverbindung) über etwa 5 Minuten unter Rühren und Eiskühlung zugesetzt; die Reaktionsmischung wurde dann weitere 30 Minuten zur Vervollständigung der Reaktion unter diesen Bedingungen aufbewahrt.

Die Reaktionslösung wurde dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/ Methanolbasis (7 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierbei wurde bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wert von 0,15 für die Ausgangsverbindung verschwunden war, während ein einzelner Fleck mit einem Rf-Wert von 0,35 für das gewünschte Produkt mit UV-Absorption auftrat.

Dann wurde Amberlite IS-120 (H⁺-Form) (3 ml), suspendiert in Methanol, der Reaktionslösung zugegeben und die Mischung 20 Minuten gerührt. Nach Entfernung des Harzes durch Filtrieren wurde das Filtrat im Vakuum bei 30⁰C konzentriert und anschließend azeotrop mit einer Mischung aus Chloroform/Methanol (9 : 1 Volumenverhältnis) destilliert; es wurde ein schwachgelber kristalliner Rückstand erhalten. Dieser Rückstand wurde mit Äthylacetat gewaschen und ergab 151 mg der gewünschten Verbindung.
Ausbeute: 66,3%; Schmelzpunkt 117-120⁰C (Zers.); [a]² _D ^l + 57,6° (c 0,7, Methanol);

Elementaranalyse:

Berechnet für C₅H₁₁N₄O₄Cl, MW = 238,637:

C: 30,20, H: 4,65, N: 23,48, Cl: 14,86%,
Gefunden: C: 30,43, H: 4,80, N: 23,25, Cl: 15,05%.
65

32 OO 662

Beispiel 11
HersteJi.-in» von N-rN'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-methioninamid

(1) N-[N'-(2-Chloräthyl)carbamoyl]-L-methioninamid

CH₃SCh₂CH₂CHCONH₂ > CH₃SCH₂CH₂CHCONh₂

NH₂-HCl NHCNHCH₁CH₂Ci

Il "

L-Methioninamidhydrochlorid (ein handelsübliches Produkt von Sigma Co.; 200 mg, 1,08 mmol) wurde in Methanol (6 ml) gelöst; dann wurde Amberlite IRA 400 (OH~-Form) (3,2 ml), suspendiert in Methanol, zugesetzt und die Mischung für 20 Minuten zur Dehydrochlorierung gerührt.

Nach Abfiltrieren des Harzes wurde das Filtrat auf ein Volumen von etwa 3 ml konzentriert; dann wurde trop- J-

fcnwcise 2-Chloräthylisocyanat (0,11 ml, 1,2 Mol je Mol Ausgangsverbindung) bei Zimmertemperatur unter Rühren zugegeben; die Mischung wurde dann unter diesen Bedingungen zur Vervollständigung der Reaktion für weitere 20 Minuten gehalten.

Die Reaktionslösung wurde dünnschichtchromatographisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/ Methanolbasis (5 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierbei wurde bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wertvon 0,28 für die Ausgangsverbindung verschwunden war, während gleichzeitig ein einzelner Fleck mit einem Rf-Wert von 0,58 für das gewünschte Produkt auftrat.

Die Reaktionslösung wurde im Vakuum zu einem weißen kristallinen feston Rückstand konzentriert. Der

Rückstand wurde aus Äthanol umkristallisiert und ergab eine erste Fraktion des gewünschten Produktes (198 mg) und eine zweite Fraktion (39 mg).
Gesamtausbeute: 237 mg; Ausbeute: 86,2%; Schmelzpunkt 150-151°C; [a]^: _D ^: + 5,2° (c 0,42, Methanol);

Elementaranalyse:

Berechnet Tür C₀H₁₆N₃O₂ClS, MW = 253,749:

C: 37,86, H: 6,36, N: 16,56%,

Gefunden: C: 37,71, H: 6,18, N: 16,33%.

(2) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitrosocarbamoyl]-L-methioninamid CH₃SCH₂Ch₂CHCONH₂ ^

I I

NHCNHCH₂CH₂Ci NHCNCH₂CH₂Cl

^ O ONO

Die in Stufe (1) erhaltene Verbindung (700 mg, 2,76 mmol) wurde in 99%iger Ameisensäure (6 ml) gelöst;

dann wurde Natriumnitrit (210 mg, 1,1 Mol je Mol Ausgangsverbindung) über etwa 5 Minuten unter Rühren und Eiskühlung zugesetzt; dann wurde die Reaktionsmischung unter diesen Bedingungen für weitere 30 Minuten zur Vervollständigung der Reaktion stehengelassen.

Die Reaktionslösung wurde dünnschichtchromatoferaphisch mit einem Entwicklersystem auf Chloroform/ Methanolbasis (9 : 1 Volumenverhältnis) analysiert; hierbei wurde bestätigt, daß der Fleck mit dem Rf-Wert von 0,33 Tür die Ausgangsverbindung verschwunden war, während eine Hauptfleck mit einem Rf von 0,65 für das gewünschte Produkt mit UV-Absorption zusammen mit einem zweiten Fleck mit einem Rf-Fleck von 0,51 Tür ein Nebenprodukt auftraten.

Dann wurde Amberlite IR-120 (H⁺-Form) (9 ml), suspendiert in Methanol, der Reaktionslösung (die leicht braun gefärbt war) zugesetzt und die Mischung 20 Minuten gerührt. Nach Entfernung des Harzes durch Filtrieren wurde das Filtrat im Vakuum bei 30⁰C oder bei niedrigerer Temperatur konzentriert und anschließend azeotrop mit einer Mischung aus Methanol und Isopropyläther zu einem kristallinen festen Rückstand destilliert. Der Rückstand wurde mit Äthyläther gewaschen und ergab 555 mg der gewünschten Verbindung. Ausbeute: 71,2%; Schmelzpunkt 95-97°C; [a)² _D ² + 18,7° (c 0,45, DMF);

Elcmcntaranalyse:
Berechnet Tür C₈Hi₅N₄O₃ClS, MW = 282,749:

C: 33,98, H: 5,35, N: 19,82%,
Gefunden: C: 34,27, H: 5,40, N: 19,63%.

32 OO

Beispiel 12 (Vergleichsbeispiel)

Neben der besonderen Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen in der chemotherapeutischen Behandlung von leukämischen und Tumorerkrankungen weisen sie geringe Toxizität auf. In der folgenden Tabelle sind 5 die Ergebnisse von Vergleichsversuchen wiedergegeben, bei denen eine erfindungsgemäße Verbindung mit zwei vorbekannten wirksamen Nitrosohamstoffverbindungen hinsichtlicht ihrer akuten Toxizität anhand des LD₅₀-Wertes verglichen wurden. Hierbei wurden diese Verbindungen intraperitoneal (i. p.) männlichen BDF,-Mäusen im Alter von etwa sechs Wochen verabreicht und die Werte nach Ablauf von 21 Tagen gemäß der Litchfield-Wilcoxon-Methode genommen: 10

Verbindung LD₅₀

(mg/kg)

l-(2-Chloräthyl)-3-cycIohexyl-l-nitroso- 90,0

harnstoff (gemäß J. Med. Chem., 9, 892 (1966)

l-(2-Chloräthyl)-3-(4-methyl-cyclohexyl)- 38,2

²⁰ 1 -nitrosoharnstoff (gemäß Cancer, 31,

_; 1164-1169 (lSi73))

N-tN'-p-ChloräthyO-N'-nitrosocarbamoyl]- 392,0 sarcosinamid (Beispiel 2)

18

Claims

Patentansprüche: 1. Nitrosoharnstoffderivate der Formel (I)

in der R¹ und R² für WasserstotTund R⁴ für WasserstofToder eine Methyl-Gruppe steht, R³ der Rest am «-Kohlenstoffatom einer σ-Aminosäure ist und X ein Chloratom darstellt oder
der Formel (II):

R¹ R⁴

\ I

NCO(CH₁) NCONCH₁CH₂X (II)

R² NO

in der R¹, R² und R⁴ für Wasserstoff und X fur Chlor stehen, und η gleich 2 oder 3 ist, oder
der Formel (III):

OH

O NHCCH₂NHCNCH₂CH₂Ci

(III)

ONO

NHAc

in der Ac für eine Acetylgruppe steht.
2. Verfahren zur Herstellung von Nitrosoharnstoffderivaten der Formeln (I) oder (II) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise a) eine Verbindung der Formel (IV) oder (VI):

R¹

R' R⁴

NCOCHNH

R¹

(IV)

R⁴

NCO(CH₂) NH

(Vl)

in denen R¹, R², R\ R⁴ und /; die in Anspruch 1 gegebene Bedeutung besitzen, mit p-Nitrophenyl-N-(2-chloräthyl)-N-nitrosocarbamat umsetzt oder b), daß man eine Verbindung der Formel (V) oder (VII):

R¹ R³ R⁴

\ I I

NCOCHNCONHCh₂CH₂X R² R¹ R⁴

(V)

NCO(CH₂) NCONHCH₂CH₂X

(VIl)

in denen R¹, R², R⁴, η und X die in Anspruch 1 gegebene Bedeutung besitzen, mit einem NiirosierungsrriiUel umsetzt.

32 OO 662
3. Arzneimittel enthaltend als Wirkstoff ein Nitrosoharnstoffderivat der Formeln (I), (II) oder (III) gemäß Anspruch 1.

Die Erfindung betrifft neue Nitrosoharnstoffderivate mit großer Inhibitorwirkung gegenüber Leukämie und Tumoren, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und ihre pharmazeutische Verwendung.

Es wurden zahlreiche Verbindungen vorgeschlagen, die Leukämie und Tumore wirkungsvoll inhibieren sollen, wozu auch Nitrosoharnstoffderivate zählen. Zu bekannten Nitrosoharnstoffderivaten zählt Streptozotocin N-fN'-Methyl-N'-nitrosocarbamoyD-D-glucosamin und dessen Derivate wie Methylglucosaminid (z. B. US-PS 35 77 406 und US-PS 37 67 640); diese Verbindungen sind jedoch hinsichtlich ihrer nicht ausreichenden Wirksamkeitgegenüber Leukämie und Tumoren und/oder wegen unerwünschter Nebenwirkungen unbefriedigend. Zu einer anderen Klasse von Nitrosoharnstoffderivaten zählen Halogenalkylnitrosoharnstoffe, wobei ein typischer Vertreter der 1,3-bis(2-Chloräthyl)-l-nitrosoharnstoff (abgekürzt BCNU) (siehe beispielsweise A. Goldin et al, Cani-er Chemotherapy Rept., 40, 57 (1964) und T. P. Johnston et al., Journal of Medicinal Chemistry 9, 892-911 (1966)) ist.

Es wurde ebenfalls über die Synthese und die chemischen und pharmokologischen Eigenschaften einer ganzen Reihe von Nitrosoharnstoffen berichtet; in diesem Zusammenhang wurden als hochinteressante Verbindungen Glycosylderivate von Nitrosoharnstoffen (beispielsweise US-PS 40 86 415, US-PS 41 57 439 und US-PS , ,42 20 643) und hydroxy-substituierte Cyclohexylderivate von Nitrosoharnstoffen (beispielsweise US-PS ,41 80 655) vorgeschlagen. Die in diesem Zusammenhang interessanteste Verbindung ist l-(2-Chloräthy])-3-(/?- D-glucopyranosyl)-l-nitrosoharnstoff (abgekürzt GANU) sowie l-(2-Chloräthyl)-3-l,3/2N-dihydroxycyclohexyl)-l-nitrosoharnstoff (abgekürzt als DONU), wobei beide dieser Verbindungen ein breites Spektrum Antitumoraktivität gegen verschiedene Arten experimenteller Leukämie und Tumoren mit positiver Perspektive für einen wirksamen Einsatz zur chemotherapeutischen Behandlung von Krebs in der Humanmedizin.

Erfindungsgemäß wurden nunmehr drei Niirosohamstoffderivatgruppen gefunden, die überaus hohe Inhibitoraktivität gegenüber Leukämie und Tumoren bei gleichzeitig niederer Toxizität aufweisen, wie in in vivo Versuchen gefunden wurde.

Erfindungsgemäß betrifft die erste Gruppe neuer Nitrosoharnstoffderivate Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch 1: