DE3117948A1

DE3117948A1 - Anorexigene peptide

Info

Publication number: DE3117948A1
Application number: DE19813117948
Authority: DE
Inventors: David Howard Prof. 70115 New Orleans La. Coy; Andrew Victor Prof. 70002 Metairie La. Schally
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1980-05-06
Filing date: 1981-05-06
Publication date: 1982-02-04
Also published as: FR2489320A1; GB2075516B; JPS572254A; ES8300086A1; BE888648A; ES8304926A1; ES509787A0; FR2502147A1; FR2489320B1; US4328134A; ES501878A0; IT8121530A0; GB2075516A; FR2502147B1; IT1142013B; DE3117948C2

Description

Die Erfindung betrifft Peptide der allgemeinen Formel I

A-B-C (I)

und deren pharmakologisch verträgliche Salze, wobei A einen Rest aus der Gruppe L-Pyroglutamyl (L-H-(pyro)-Glu), D-Pyroglutamyl (D-H-(pyro)-Glu) und L-Homopyroglutamyl (L-H-

homo-(pyro)-Glu) bedeutet,

Ii HtHTi ]<e;;t. ;iw:i iln· Gruppe I.-Hi atidyl (L~Hir>), I)-Hi Mt,idyl (D-His), L-3'-Methylhistidyl (L-N^im-3-MeHis), L-Phenylalanyl (L-Phe), L-p-Aminophenylalanyl (L-p-NHpPhe) und L—ß-(Pyrazolyl-1)-alanyl (L-ß-(pyrazolyl-1)Ala) bedeutet und C einen Rest aus der Gruppe Glycin und dessen niedere Alkylester (GIy-OR, wobei R H oder nieder-Alkyl bedeutet), Glycinamjd und dcsison nioder-Alkylumide (GIy-NlIH, wobei H II oder nieder-Alkyl bedeutet), 2-Amino-1-hydroxyäthyl (Gly-ol), D-Alanin (D-AIa), L-ß-(2-Thienyl)-alanin und NHR bedeutet, wobei

R nieder-Alkyl ist,

mit der Massgabe, dass C nicht Glycin oder Glycinamid ist, wenn A L-Pyroglutamyl und B L-Histidyl bedeuten.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, in diesem Verfahren eingesetzte Zwischenprodukte, die Verwendung dieser Verbindungen als ano.rexigene Mittel zur Behandlung von Fettsucht und anderen pathologischen Zuständen, bei denen eine Vt't'f i iigoruriK dft' Nahrung.·!- oder FuU -ernufriiihnm nufVzHtft IdI , bei Säugetieren, sowie die Verwendung dieser Verbindungen zur Behandlung von pathologischen Zuständen, die bei überschüssiger Sekretion von Magensäure und Pankreasflüssxgkeit auftreten, wie Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre oder akute Pankreatitis, und bei der Behandlung von bestimmten kritischen Zuständen des zentral en Nervensystems, wie Bewußtseinsstörungen oder Koma aufgrund von Hirnverletzungen.

130065/0857

RS CAS 38 (SC-D - i) - 211 7948

Die für die Aminosäuren und deren Reste sowie für die Schutzgruppen verwendeten Abkürzungen beruhen auf Empfehlungen der IUPAC-IUB Comission on Biochemical Nomenclature (vgl. Biochemistry, Bd. 11 (1972), S. 1726. Beispiele dafür sind: (Pyro)-Glu = 5-Oxoprolin oder Pyroglutaminsäure; homo-(pyro)-GIu = Homopyroglutaminsäure; His = Histidin; N^-S-His = 3'-Methylhistidin; Phe = Phenylalanin; p-NHpPhe = p-Aminophenylalanin, ß-(pyrazolyl-1)Ala = ß-(pyrazol-1-yl)-alanin; GIy = Glycin; Gly-ol = 2-Aminoäthanol; und Thi = ß-(2-Thienyl)-alanin.

Sämtliche Aminosäuren besitzen die natürliche oder L-Konfiguration, sofern nichts anderes angegeben ist. D-His ist der Rest von D-Histidin, D-(pyro)-Glu der Rest von D-Pyroglutaminsäure und D-AIa der Rest von D-alanin. Die Abkürzungen Me und Et werden für Methyl und Äthyl verwendet. Für Schutzgruppen werden beispielsweise folgende Abkürzungen verwendet: Bog = tert.-Butyloxycarbonyl; Z = Benzyloxycarbonyl; Tos = Tosyl; Dnp = Dinitrophenyl; N^im = Imidazolstickstoff von Histidin; und Y = eine geeignete verankernde, an einen festen Harzträger gebundene, bei der Festphasensynthese verwendete Gruppe, vorzugsweise

- 0 - CH₂ -

Die humorale Appetitkontrolle, insbesondere über den Hypothalamus, wird seit vielen Jahren diskutiert; vgl. beispielsweise den Übersichtsartikel von Schally et al., Am. J. Med. Sei., Bd. 248 (1964), S. 79 und die darin genannten Literaturstellen. Seit dieser Zeit ist es bekannt, dass der Hypothalamus an der Regulierung der Nahrungsaufnahme beteiligt ist. Eine elektrische Stimulierung des lateralen Hypothalamusbereichs führt zu Hyperphagie und dessen Zerstörung zu Aphagie.

30065/0857

Im Gegensatz dazu bewirkt eine Stimulierung des ventromedialen Kerns eine Verringerung der Nahrungsaufnahme und dessen Zerstörung Hyperphagie und Fettsucht.

Das Fettsuchtsyndrom, das durch Verabfolgung von Goldthioglucose hervorgerufen wird, ist zum Teil die Folge einer mit Hypothalamusläsionen, die durch dieses Mittel hervorgerufen werden, verbundenen Hyperphagie. Die Theorien über die neu-

rale Kontrolle von Hunger, Appetit und Sättegefühl wurden von verschiedenen Autoren diskutiert. Es wurden verschiedene Mechanismen vorgeschlagen:

1) Thermostatische Theorie

Gemäss dieser Theorie regulieren eine spezielle dynamische Wirkung der Nahrung und ihr Einfluss auf die Körpertemperatur den Appetit.

2) Chemostatische Theorien

Diese Theorien postulieren, dass der Appetit durch intrazelluläre oder extrazelluläre Konzentrationen von Glucose (glucostatische Theorie), Lipiden (lipostatische Theorie) und von verschiedenen Metaboliten, wie Serum-Aminosäuren, reguliert wird.

3) Eine weitere Gruppe von Theorien nimmt an, dass Empfindungen des Verdauungstrakts, die beim Essen und beim Vor-, handensein von Nahrung im Magen und im Darm auftreten, den Appetit regulieren. Zu den Faktoren, die am Entstehen des Sättegefühls beteiligt sind oder das Absetzen der Nahrungsaufnahme bewirken, gehören die Dehnung des Magens durch Nahrung oder nicht-nahrhafte Substanzen. Magenkontraktionen können mit dem Hungerverhalten in Beziehung gebracht werden, jedoch sind diese Kontraktionen bei Tieren, die durch Hypothalamusläsionen künstlich in einen aphagischen oder hyperphagischen Zustand versetzt worden sind, die gleichen wie bei Tieren, denen Futter und Wasser vorenthalten wird.

— 5 —

130065/0857

Diese Theorien sind nicht zur Erklärung sämtlicher experimenteller Befunde in der Lage. Hierzu gehört, dass diabetische Tiere Hunger verspüren können. Schally et al., a.a.O., nehmen an, dass die bei Tieren mit Hypothalamusläsionen auftretende Fettsucht eher durch einen humoralen als durch einen neurogenen Mechanismus übertragen wird und dass der Hypothalamus möglicherweise eine Substanz entwickelt, die an der zentralen Appetitkontrolle beteiligt ist-Es werden vorläufige Befunde erläutert, die darauf hinweisen, dass im neurohypophysialen Extrakt eine Substanz vorhanden ist,, die die dynamische Phase der Gewichtszunahme bei mit Goldthioglycose behandelten Mäusen beeinflussen.

Ferner ist ein neuerer kurzer Übersichtsartikel von Schally et al. über den Status der Forschung bezüglich der Hypothalamuskontrolle von Futteraufnahme und Fettsucht erschienen; vgl Recent Progress in Hormone Research, Proceedings of the 1967 Laurentian Hormone Conference, Bd. 24 (1968), S. 497, insbesondere S. 570 bis 571 und die dort genannten Literaturstellen. Zu diesen Literaturstellen gehört die Arbeit von Schally u. Mitarb., Science, Bd. 157 (-1967), S. 210, in der gezeigt wird, dass eine Verabfolgung von aus Hundeduodenum gereinigtem Enterogastron die Nahrungsaufnahme von 17 Stunden ohne Futter belassenen Mäusen verringert. Diese Wirkung ist während der ersten 30 Minuten am grössten, jedoch dauert die kumulative Verringerung mindestens 4 Stunden an. Andere aus Hundeduodenum oder -kolon isolierte Peptide sowie Glucagon, Secretin, Glucose und Rinderserumalbumin erwiesen sich als unwirksam. Diese Autoren vermuten, dass diese Wirkungen auf eine direkte Beseitigung von Hunger-Magenkontraktionen zurückzuführen sind oder dass sie durch das Zentralnervensystem unter Freisetzung von Hypothalamussubstanzen hervorgerufen werden, obgleich ein positiver Beweis für Hypothalamus-Neuroflüssigkeiten, die

130065/08B7

für eine indirekte oder direkte Kontrolle des Appetits verantwortlich sind, damals noch nicht geführt werden konnte,

Es hat den Anschein, dass dieser positive Beweis durch Trygstad et al., Acta Endocrinologica, Bd. 89 (1978), S. 196 geliefert worden ist. Diese Autoren isolierten eine Anzahl von Peptiden aus dem Urin von Patienten, die an kongenitaler, allgemeiner Lipodystrophie (Hypothalamussyndrom) litten. Diese Peptide riefen entsprechende Stoffwechselwirkungen hervor. Nervöse Anorexie ist mit Hypothalamusstörungen verbunden. Bei primärer, nervöser Hypothalamusanorexie ist die Hypothalamus-Hypophysen-Achse gestört, was zu einer geringen Gonadotropin-Freisetzung, Amenorrhoe, einem Verlust des täglichen Rhythmus der ACTH-Ausscheidung, einer verringerten Thyrotropin-Ausscheidung und einem anfänglichen Ansteigen und späteren Abnehmen der Somatotropin-Ausscheidung führt.

Niederschläge aus Urinproben von 25 Patienten mit nervöser Anorexie wurden an mit Sephadex G-25-Gel gepackten Säulen chromatographiert. Es ergab sich eine Einteilung in vier verschiedene chromatographische Muster: Eines war dem Muster von normalen Kontrollpersonen ähnlich, eines zeigte Ähnlichkeit mit dem von Schizophreniepatienten, bei 5 Patienten mit einer hysteriformen Neurose ergab sich ein drittes Muster und 10 Mädchen mit einem primären "Hypothalamus"-Typ von nervöser Anorexie zeigten ebenfalls typische Chromatogramme. Fraktionen mit einem Einfluss auf den Appetit bei Mäusen wurden nur in der letzten Gruppe gefunden, über mehrere chromatographische Stufen wurden zwei appetitbeeinflussende Peptide isoliert. Injizierte man diese Peptide Mäusen, rief eines gesteigerten Appetit hervor, während das zweite eine Appetitverminderung bewirkte. Die Peptide sind in Peptid-Trägerproteine eingehüllt und somit

130065/08B7

gegen einen enzymatischen Abbau geschützt, was ihre Isolierung aus dem Urin ermöglicht.

Die Struktur des anorexigenen Peptids wurde von Reichelt et al., Neuroscience, Bd. 3 (1978), S. 1207 in enger Zusammenarbeit mit Trygstad aufgeklärt. Es handelt sich um das Tripeptid H-(pyro)-Glu-His-GlyOH, was durch Synthese bestätigt wurde.

Bei einer Injektion von 12 nMol täglich des appetitzügelnden Peptids an Mäuse über 20 Tage hinweg verringerte sich die Futteraufnahme etwa 6 Monate lang von 5,7 auf 3,0 g pro Tag. Das Körpergewicht fiel von durchschnittlich 35 g auf ein Minimum von 24 g.

Das Tripeptid besitzt keine akute Wirkung auf den Glucosespiegel im Blut und auf den Insulinspiegel im Serum. Offensichtlich wirkt es auf Rezeptoren in den den Appetit kontrollierenden Hypothalamuszentren.

Das appetitstimulierende Peptid erhöhte die tägliche Futteraufnahme auf über 10 g, wobei das Körpergewicht auf durchschnittlich 57 g anstieg. Die Struktur des appetitstimulierenden Peptids konnte nicht identifiziert werden.

Zwei ähnliche Faktoren, die ein gesteigertes und ein verringertes Futteraufnahmeverhalten zeigen, wurden auch bei Patienten mit genetisch bedingter, metabolischer Fettsucht isoliert.

Erfindungsgemäss wurde nunmehr festgestellt, dass die Peptide der allgemeinen Formel I

A-B-C

in der A, B und C die vorstehend angegebene Bedeutung haben, aktiver sind und eine länger anhaltende Aktivität in bezug auf eine Verringerung des Appetits und eine Senkung der

Nahrungsaufnahme besitzen, als dies beim Tripeptid Pyroglutamyl-histidyl-glycin (H-(pyro)-Glu-His-Gly-OH), das von Trygstad et al., a.a.O. sowie von Reiehelt et al., a.a.O., isoliert wurde, der Fall ist. Die Peptide der allgemeinen Formel I und deren pharmakologisch verträgliche Salze, die biologisch den vorgenannten Peptiden äquivalent sind, sind daher wertvolle appetitzügelnde Wirkstoffe zur Behandlung von Fettsucht und damit verbundenen pathologischen Zuständen, bei denen eine Verringerung der Nahrungsaufnahme erforderlich ist. Diese Wirkstoffe verringern auch die Magen- und Pankreassekretion. Sie eignen sich daher auch zur Behandlung von pathologischen Zuständen, bei denen eine übermässige Bildung von Magensäure und/oder Pankreasflüssigkeit gegeben ist. Ausserdem besitzen sie bestimmte Wirkungen auf das Zentralnervensystem, so dass sie für die akute Behandlung von Bewusstseinsstörungen geeignet sind.

Die erfindungsgemässen Verbindungen besitzen gegenüber dem natürlichen Tripeptid den Vorteil, dass sie aktiver sind und ihre Wirkung länger anhält. Diese beiden Vorteile sind von besonderer praktischer Bedeutung: Aufgrund der geringeren minimalen wirksamen Dosen ergibt sich eine Verringerung der Nebenwirkungen sowie auch der Kosten für die Herstellung der Verbindungen. Aufgrund der länger anhaltenden Wirkung ist eine weniger häufige Verabfolgung erforderlich.

Aufgrund der Tatsache, dass die Peptide der allgemeinen Formel I und deren pharmakologisch verträgliche Salze biologisch äquivalent sind, sind sämtliche vorangehenden und folgenden Hinweise auf die Peptide der allgemeinen Formel I so zu verstehen, dass darunter die Peptide selbst als auch die Salze fallen.

130065/0857

RS CAS 38 (SC-1) - 10 -

Gegenstand der Erfindung sind auch geschützte Zwischenprodukte, die an einen festen Harzträger gebunden sind und die zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I verwendet werden.

Als Schutzgruppen bei der stufenweisen Festphasensynthese der Zwischenprodukte können solche Gruppen eingesetzt werden, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen fernt werden können, ohne dass eine Beeinträchtigung des gewünschten Endprodukts der allgemeinen Formel I eintritt. Vorzugsweise werden diese Schutzgruppen so gewählt, dass sie in einer einzigen Stufe zusammen mit anderen Schutzgruppen, beispielsweise zusammen mit der vorstehend definierten Verankerungsgruppe Y, entfernt werden können. Eine besonders geeignete Schutzgruppe R , die bei der stufenweisen oder Festphasensynthese der vorgenannten Zwischenprodukte eingesetzt wird, ist tert.-Butyloxycarbonyl (Boc).

Bevorzugte Schutzgruppen R zum Schutz des Imidazolstickstoffs von Histidin sind Tosyl (Tos) oder Dinitrophenyl (Dnp). Eine geeignete Schutzgruppe R zum Schutz der Phenylaminogruppe in p-Aminophenylalanin ist die Benzyloxy_r carbonylgruppe (Z). Eine geeignete Verankerungsgruppe zum Verknüpfen mit dem Harzträger ist die vorstehend definierte Gruppe Y, beispielsweise -0-CHp-. Die vorgenannten Schutzgruppen sind gegenüber den Reagentien und unter den Reaktionsbedingungen, die zur Entfernung der Schutzgruppe an der terminalen Aminogruppe und bei den nachfolgenden Kupplungsreaktionen angewendet werden, stabil.

Der Ausdruck "nieder-Alkyl" bedeutet geradkettige oder verzweigte Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen.

Die Peptide der allgemeinen Formel I werden durch stufenweise Festphasensynthese beginnend mit der endständigen Carboxylgruppe hergestellt. Dieses Verfahren lässt sich

130065/0857

RS CAS 38 (SC-1) - 11 -

kurz folgendermassen zusammenfassen: Eine für C oder für

1 1

B, wenn C NHR mit R = nieder-Alkyl bedeutet, gewählte spezielle Aminosäure, die an der der oi-Aminogruppe eine geeignete Schutzgruppe und gegebenenfalls andere Schutzgruppen aufweist und mit der vorstehend definierten Gruppe Y mit dem Harzträger verknüpft ist, wird einer Behandlung zur Entfernung der Schutzgruppe an der oC-Aminogruppe unterzogen und mit der speziellen Aminosäure, die für B oder A, wenn

ι C die vorstehend definierte Bedeutung NHR hat, gekuppelt, wobei als Kupplungsmittel ein geeignetes Dialkyl- oder Dieyeloalkylcarbodiimid gewählt wird. Das vorgenannte Verfahren wird so lange wiederholt, bis die gewünschte Anzahl an Aminosäuren miteinander verknüpft ist. Sodann wird die Schutzgruppe an der terminalen Aminogruppe sowie gegebenenfalls vorhandene andere Schutzgruppen und die Verankerungsgruppe Y entfernt. Nach Entfernen des Lösungsmittels erhält man das gewünschte rohe Peptid. Das Rohprodukt wird chromatographisch, beispielsweise durch Gelfiltration gereinigt, wodurch man das gewünschte Peptid in reinem Zustand erhält.

Die zur Herstellung der Peptide der allgemeinen Formel I verwendeten Ausgangsmaterialien sind entweder handelsübliche Verbindungen oder lassen sich leicht nach an sich bekannten Verfahren herstellen. Sämtliche zur Synthese der genannten Peptide verwendeten Aminosäuren sind im Handel erhältlich, mit Ausnahme von Homo-(pyro)-glutaminsäure, deren Herstellung von Greenstein und Winitz in "Chemistry of the Amino Acids", J. Wiley, New York, 1961, S. 2407 bis 2462 beschrieben ist, und ß-(2-Thienyl)-alanin, dessen Herstellung sich aus der vorgenannten Literaturstelle, S. 2707, ergibt.

- 11 -

130065/0857

RS CAS 38 (SC-I) - 12 -

Geeignete feste Harzträger sind chlormethylierte und hydroxymethylierte Harze, wobei die erstgenannten Harze bevorzugt werden. Bezüglich der Herstellung von Hydroxymethylharzen wird auf M. Bodansky und .J. T. Sheehan, Chem. Ind., London, Bd. 38 (1966), S. 1597 verwiesen. Ein clilormethyliertes Harz wird von der Firma Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, vertrieben. Bei Verwendung des chlormethylierten Harzes wird eine Ester-Verankerungsgruppe mit der an der oi-Aminogruppe geschützten Aminosäure C (oder B, wenn C das vorstehend definierte NHR bedeutet) gebildet, wobei gegebenenfalls weitere Schutzgruppen vorhanden sind.

(geschütztes C oder B) -0 -CH- I ^Harz

träger

Ein zweckmässiges Verfahren zur Umwandlung des verknüpften, geschützten Peptids zum C-terminalen (nieder-Alkyl)-a mid besteht in der Abspaltung des geschützten Peptids vom Harz durch Behandlung mit einem nieder-Alkylamin; vgl. D.H. Coy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 57 (1974), S. 335, wodurch man das entsprechende geschützte Peptid-(niederalkyl)-amid erhält. Anschliessend werden die Schutzgruppen des gebildeten Peptid-(nieder-alkyl)-amids durch Behandlung mit Natrium und flüssigem Ammoniak oder vorzugsweise durch Spaltung mit Chlorwasserstoff entfernt, wodurch man das entsprechende Peptid der Erfindung erhält. Eine andere Verfahrensweise besteht darin, die Spaltung durch Umesterung mit einem niederen Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, in Gegenwart von Triäthylamin durchzuführen, wodurch man den entsprechenden Ester erhält. Dieser Ester kann in das entsprechende (nieder-Alkyl) Amid umgewandelt werden. Anschliessend können auf die vorbeschriebene Weise die Schutzgruppen entfernt werden. Ist die Bildung der freien Carbonsäure erwünscht, wird die Spaltung vorzugsweise mit Fluorwasserstoff in Anisol durchgeführt. Wünscht man die Bildung des Säureamids, führt man die Spaltung mit Ammoniak

13006J/0857

durch. Diesbezüglich wird auch auf J. M.Stewart und J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969, S. 40-49 verwiesen.

Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung wird an der o< -Aminogruppe geschütztes Glycin, vorzugsweise tert.-Butyloxycarbonylglycin, mit Hilfe eines Katalysators, vorzugsweise Cäsiumhydrogencarbonat oder Triäthylamin, mit einem chlormethylierten Harz gekuppelt. Nach der Kupplung des an der c*-Aminogruppe geschützten Glycins an den Harzträger wird die oi-Aminoschutzgruppe entfernt, beispielsweise unter Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder Chlorwasserstoffsäure in Dioxan. Die Entfernung der Schutzgruppe wird bei Temperaturen von etwa 0° bis Raumtemperatur durchgeführt. Es können auch andere Standard-Spaltungsreagentien und -Bedingungen zur Entfernung von speziellen tf-Aminoschutzgruppen angewendet werden; vgl. E. Schroder und K. Lubke, "The Peptides", Bd. 1, Academic Press, New York, 1965, S. 72 bis 75. Nach der Entfernung der oc-Aminoschutzgruppe werden die übrigen an der o( -Aminogruppe geschützten Aminosäuren stufenweise in der gewünschten Reihenfolge unter Bildung des gewünschten Peptids gekuppelt. Die geschützten Aminosäuren werden jeweils in einom 1-fnohen überschuss in den F^iJiphasenreaktor Mnßf¹-bracht. Die Kupplungsreaktion wird in Methylenchlorid oder Gemischen aus Dimethylformamid und Methylenchlorid durchgeführt. In Fällen, bei denen die Kupplung unvollständig verläuft, wird das Kupplungsverfahren vor der'Entfernung der <*-Aminoschutzgruppe und vor der Kupplung der nächsten Aminosäure an die feste Phase wiederholt. Der erfolgreiche Verlauf der Kupplungareaktion in den einzelnen Synthesestufen wird mit Hilfe der Ninhydrinreaktion gemäss E. Kaiser et al., Analyt. Biochem., Bd. 34 (1970), S. 595, überwacht.

- 13 13006 5/0857

Nach erfolgter Synthese der gewünschten Aminosäuresequenz wird das geschütze Peptid vom Harzträger durch Behandlung mit einem (nieder-Alkyl)-amin unter Bildung des geschützten Peptid-(nieder-alkyl)-amids entfernt. Bei Verwendung von Dinitrophenyl oder Tosyl als Schutzgruppe für den Histidylrest werden diese Schutzgruppen ebenfalls während der Behandlung mit dem (nieder-Alkyl)-amin entfernt. Das Peptid kann von dem Harz auch durch Umesterung mit einem niederen Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, in Gegenwart von Triäthylamin abgetrennt werden, wonach der gewonnene Ester chromatographisch an Kieselgel gereinigt wird. Die gewonnene Fraktion kann der Behandlung mit einem (nieder-AlkyD-amin zur Umwandlung des nieder-Alkylesters, vorzugsweise des Methyl- oder Äthylesters, in das carboxyl-endständige (nieder-Alkyl)-amid unterworfen werden. Zu beachten ist, dass gegebenenfalls am Histidylrest vorhandene Dinitrophenyl- oder Tosylgruppen ebenfalls abgespalten werden. Die verbleibenden Seitenkettenschutzgruppen des geschützten Alkylamids werden sodann nach den vorstehend erläuterten Verfahren abgespalten, beispielsweise durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder mit Fluorwasserstoff. Die Abtrennung des gewünschten Peptids vom Harzträger kann auch mit Ammoniak unter Bildung des entsprechenden Amids oder mit Fluorwasserstoff und Anisol unter Bildung der entsprechenden freien Säure vorgenommen werden. Peptide der allgemeinen Formel I, in der C 2-Aminohydroxyäthyl (Gly-ol) bedeutet, werden durch Spaltung eines A-B-Dipeptid-Harzes mit 2-Aminoäthanol hergestellt. Es ist zu beachten, dass gegebenenfalls am Histidylrest vorhandene Dinitrophenyl- oder Tosylgruppen bei diesem Verfahren ebenfalls abgespalten werden.

Wie bereits erwähnt, lassen sich die Peptide der allgemeinen Formel I auch in Form von Salzen mit Säuren erhalten. Beispiele dafür sind Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure und Toluolsulfonsäure, Polymer-

1 3 0£>-©5/-0 8 5 7

säuren, wie Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose, und anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, sowie Schwefelsäure und Phosphorsäure. Gegebenenfalls können spezielle Salze mit Säuren in Salze mit anderen Säuren, beispielsweise in nicht-toxische, pharmakologisch verträgliche Salze übergeführt werden, indem man sie gemäss R.A. Boissonnas et al., HeIv. Chim. Acta., Bd. 43 (1960), S. 1349 mit einem geeigneten Ionenaustauscherharz behandelt. Beispiele für entsprechende Ionenaustauscherharze sind Kationenaustauscher auf Cellulosebasis, wie Carboxymethylcellulose oder chemisch modifizierte, vernetzte Dextran-Kationenaustauscher, beispielsweise solche vom Sephadex C-Typ, sowie stark basische Anionenaustauscherharze, beispielsweise die von J.P. Greenstein und M. Winitz in "Chemistry of the Amino Acids", John Wiley and Sons, Inc., New York und London, 1961, Bd. 2, S. 1456, aufgeführten Harze.

Die Peptide der allgemeinen Formel I und ihre Salze besitzen wertvolle und langanhaltende Wirkungen, nämlich eine appetitzügelnde Wirkung, eine Hemmwirkung auf die Sekretion von Magen- und Pankreassaft sowie eine ZNS-aktivierende Wirkung.

Die appetitverringernde und anorexigene Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I lässt sich durch Fütterungsversuche an Mäusen, Ratten oder Hunden, ähnlich den von Trygstad et al., a.a.O., und von Reichelt et al., a.a.O. beschriebenen Versuchen, bestimmen. Die Hemmwirkung der Peptide der allgemeinen Formel I auf die Magen- und/oder Pankreassekretion wird an unbetäubten Ratten oder vorzugsweise an unbetäubten Hunden mit Speiseröhren-, Magen- und Pankreasfistein oder auch an Hunden mit Heidenhain-Taschen bestimmt; vgl.B.P. Babkin, "Secretion Mechanism of Digestive Glands", 2. Aufl., B.P. Hoeber, New York, 1950, gemäss Zitat "Physiology", Hrsg. E. Seikurt, Little, Brown and Company, Boston, 1963, S. 542 bis 544; L. Olbe, Gastroenterology, Bd. 32 (1959),

- 15 -

130065/0857

S. 460; Antin et al., Journal of Comparative and Physiological Psychology, Bd. 89 (1975), S. 784; und Liebling et al., ibid., Bd. 89 (1975), S. 955. Die Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I auf das Zentralnervensystem, insbesondere ihr charakteristisches Spektrum neurotroper Wirkungen, lässt sich durch eine Reihe von ZNS-Test ermitteln; vgl. beispielsweise A.J. Kastin, R.D. Olson, A.V. Schally und D.H. Coy, Life Scineces, Bd. 25 (1975), S. 401; A.J. Prange, G.R. Breese, J.M. Cott, B.R. Martin, B.R. Cooper, I.C. Wilson und N.P. Plotnikoff, Life Sciences, Bd. 14 (1974), S. 447; und M. Brown und W. Vale, Endocrinology, Bd. 96 (1975), S. 1333.

Mäuse, Ratten und Hunde werden als Versuchstiere zur Bestimmung der appetitverringernden oder anorexigenen Wirkungen von Arzneistoffen sowie zur Bestimmung der Hemmwirkung auf die Magen- und/oder Pankreassekretion bevorzugt, da in zahlreichen Fällen ausgezeichnete Parallelen zwischen Tierversuchen und klinischen Untersuchungen am-Menschen festgestellt wurden, beispielsweise beim Menschen unter kontrollierter oraler oder intragastrischer Ernährung mit flüssiger Diät; vgl. H.A. Jordan, Journal of Comparative and Physiov^. logical Psychology, Bd. 68 (1969), S. 498; G.A. Bray und F.L. Greenway, Clinics in Endocrinology and Metabolism, Bd.5 (1976), S. 455; und H.D. Janowitz, "Role of gastrointestinal tract in regulation of food intake", zitiert in "Handbook of Physiology", Abschnitt 6, Alimentary Canal., Hrsg. CF. Code und W. Heidel, American Physiological Society, Washington, 1967.

Die Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I und ihrer pharmakologisch verträglichen Salze als Appetithemmer und anorexigene Mittel lässt sich unter Verwendung von Ratten zeigen. Ratten werden als Versuchstiere zum Nachweis der Wirkung von Arzneistoffen, die die Nahrungsaufnahme hemmen, bevorzugt. Verschiedene Autoren haben die Parallelität zwischen

13006570857

den Ergebnissen an Ratten und an Menschen festgestellt; vgl. zum Beispiel G.A. Bray in "The Obese Patient", Bd. IX von "Major Problems in Internal Medicine", W.B. Saunders Company, Philadelphia, London, Toronto, 1976. In Kapitel 9 mit dem Titel "Drug Therapy for the Obese Patient" sind unter dem Abschnitt "Pharmacology - Effects on the Central Nervous System", auf S. 364, Tabelle 9-4 Daten aufgeführt, die u.a. die Verringerung der Futteraufnahme bei Ratten durch eine Reihe von anorexigenen Arzneistoffen zeigen. Im Abschnitt "Clinical Use of Anorectic Drugs" wird auf S. 369 in Tabelle 9-7 gezeigt, dass die gleichen Arzneistoffe wie in Tabelle 9-4 auch für die klinische Anwendung geeignet sind.

Aufgrund der vorgenannten Eigenschaften sind die Peptide der allgemeinen Formel I zur Verabreichung an Säugetiere in der Tiermedizin und auch in der Humanmedizin geeignet.

Aufgrund ihrer appetithemmenden und anorexigenen Eigenschaften eignen sie sich zur Behandlung von Fettsucht, einschliesslich der präoperativen Verringerung des Körpergewichts, die häufig bei fettleibigen Patienten vor grösseren Eingriffen erforderlich ist. Die Peptide sind aufgrund ihrer Eigenschaften auch wertvoll zur Behandlung von anderen pathologischen Zuständen, die eine Verringerung der Nahrungsaufnahme und des Körpergewichts erforderlich machen, beispielsweise bei bestimmten Formen von Diabetes oder Kreislauferkrankungen·

Aufgrund ihror Hemmwi rkun/x auf die Sekretion von Magens/iure und Pankreasflüssigkeit eignen sich die Peptide der allgemeinen Formel I zur Behandlung von pathalogischen Zuständen, die mit einer Magen- und/oder Pankreashypersekretion an Magensäure oder Gastrin, Pepsin oder Histamin einhergehen, beispielsweise bei Duodenumgeschwüren oder akuter Pankreatitis.

13 o"o 65/0857

RS CAS 38 (SC-1) - 18 -

Die Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I auf das Zentralnervensystem zeigt ein neurotropes Wirkungsprofil, das sich signifikant von den Profilen tricyclischer Antidepressionsmittel und herkömmlicher Arzneistoffe unterscheidet. Aufgrund ihrer ZNS-aktivierenden Wirkung sind die Peptide der allgemeinen Formel. I wertvolle Wirkstoffe zur Behandlung bei Bewusstseinsstörungen oder Koma aufgrund von Hirnverletzungen, beispielsweise im Fall von zerebralen Traumata oder Tumoren, in schweren Erfrierungsfällen oder bei bestimmten postoperativen Zuständen, sowie bei Bewusstseinsstörungen, die durch bestimmte Gefässerkrankungen oder durch übermässige Arzneimitteleinnahme (z.B. Intoxikationen durch Arzneistoffe) verursacht werden.

Bei Verwendung der Peptide der allgemeinen Formel I oder von deren pharmakologisch verträglichen Salzen bei Säugetieren als appetitzügelndes oder anorexigenes Mittel zur Behandlung von Fettsucht oder anderen pathologischen Zuständen, die eine Verringerung der Nahrungsaufnahme erforderlich machen, bei deren Verwendung als Mittel zur Hemmung einer übermässigen Magen- oder Pankreassekretion oder bei ihrer Verwendung als ZNS-aktivierendes Mittel, beispielsweise an Mäusen, Ratten oder Hunden, können diese Wirkstoffe allein oder zusammen mit pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen eingesetzt werden. Das Verhältnis von Arzneistoff und.Trägerstoff wird durch die Löslichkeit und chemische Natur der Verbindung, den Verabfolgungsweg und die übliche biologische Praxis bestimmt. Beispielsweise kann eine Wirkstoffmenge, die zur Verringerung des Appetits und/oder der Nahrungsaufnahme ausreicht, oral in fester Form zusammen mit Trägerstoffen, wie Stärke, Zucker, bestimmten Arten von Tonen und dergleichen, verabfolgt werden.

- 18 130065/0857

RS CAS 38 (SC-1) - 19 -

In ähnlicher Weise können entsprechende Mengen oral in Form von Lösungen oder Suspensionen verabfolgt werden. Die Verbindungen lassen sich auch parenteral injizieren. Für die orale oder parenterale Verabfolgung werden sterile Lösungen oder Suspensionen in einem pharmakologisch verträglichen flüssigen Trägerstoff, wie Wasser, Äthanol, Propylenglykol oder Pol yä thyl englykol, die andere gelö.ste Stoffe oder Suspendiermittel, beispielsweise zur Herstellung von isotonen Lösungen ausreichende Mengen an Kochsalz oder Glucose, Salze von Gallensäuren, Gummi-arabicum, Gelatine, Sorbitanmonooleat, Polysorbat 80 (Oleatester von Sorbit und dessen mit Äthylenoxid copolymerisierte Anhydride), wie Tween 80, ■enthalten, verwendet.

Die Dosierung der Peptide der allgemeinen Formel T hängt vom Verabfolgungsweg und von der speziellen, gewählten Verbindung ab. Ausserdem hängt sie von der speziellen, zu behandelnden Person ab. Im allgemeinen wird die Behandlung mit kleinen Dosen, die wesentlich unter der optimalen Dosis der Verbindung liegt, begonnen. Anschliessend wird die Dosierung in kleinen Stufen erhöht, bis die optimale Wirkung unter den gegebenen Umständen erreicht wird. Im allgemeinen werden die Verbindungen in Mengen verabfolgt, die eine Verringerung des Appetits und/oder der Nahrungsaufnahme, eine Hemmung der Magen-und/oder Pankreassekretion oder eine Aktivierung des Zentralnervensystems hervorrufen, ohne dass schädliche oder nachteilige Nebenwirkungen auftreten. Derartige Dosen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 1,0 ^Ag bis etwa 250^Ug pro kg Körpergewicht pro Tag, obgleich, wie vorstehend erwähnt, diese Dosen variiert werden können. Besonders bevorzugt sind Dosierungen im Bereich von etwa 5 bis etwa 100^g pro kg pro Tag, vorzugsweise in unterteilten Dosen.

- 19 130065/0857

Die einzelnen pharmakologischen Wirkungen der Peptide der ' allgemeinen Formel I sind, bezogen auf das Gewicht, grosser als bei einer Anzahl von Arzneimitteln, die für die gleichen Zwecke verwendet werden. Darüberhinaus besitzen die meisten der klinisch verwendbaren Appetitzügler eine dem Phenäthylamin verwandte Struktur und weisen daher die mit dieser Struktur verbundenen unerwünschten Nebenwirkungen auf. Die Peptide der allgemeinen Formel I besitzen keine Phenäthylaminstruktur und sind daher frei von diesen Nebenwirkungen. Ausserdem besitzen sie eine geringe Toxizität und gewährleisten somit eine sichere Anwendung.

Bei Verwendung der Peptide der allgemeinen Formel I, vorzugsweise in Form von Salzen mit Säuren, in der Humanmedizin, kann eine systemische Verabfolgung, entweder durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion, oder eine sublinguale oder nasale Verabfolgung, in Verbindung mit pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen durchgeführt, werden.

Es können auch Arzneipräparate für die orale Verabfolgung hergestellt werden. Zu diesem Zweck werden die Wirkstoffe mit geeigneten bekannten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln vermischt und in an sich bekannter Weise zu Präparaten, wie Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen oder dispergierbaren Pulvern, verarbeitet.

Feste Zubereitungen können in Kapseln für die orale Verabfolgung gefüllt werden. Derartige Zubereitungen zur Abfüllung in Kapseln können den festen Wirkstoff im Gemisch mit festen Materialien, die eine Pufferwirkung ausüben, beispielsweise im Gemisch mit kolloidalem Aluminiumhydroxid oder Calciumhydrogenphosphat, oder zusammen mit einem inerten Feststoff, wie Lactose, enthalten.

- 20 -

130065/0857

Präparate in Form von Tabletten können auf an sich übliche Weise überzogen oder in Form von schäumenden oder nichtschäumenden Präparaten bereitgestellt werden. Hierbei können inerte Verdünnungsmittel oder Trägerstoffe, wie Magnesiumcarbonat oder Lactose, zusammen mit üblichen Sprengmitteln, wie Maisstärke und Alginsäure, und Gleitmitteln, wie Magnesiumstearat, verwendet werden.

Zur Verabfolgung auf nasalem Wege in Form von Tropfen oder Sprays, werden die Peptide der allgemeinen Formel I vorzugsweise in einem sterilen, wässrigen Träger eingesetzt, der auch andere gelöste Stoffe, wie Puffer oder Konservierungsmittel, sowie zur Herstellung einer isotonen Lösung ausreichende Mengen an pharmakologisch verträglichen Salzen oder an Glucose enthalten kann. Die Dosen für die intranasale Verabfolgung liegen im Bereich von 1,0 bis 250 ^g/kg/ Tag oder vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 100 ^g/kg/Tag.

Die Peptide der allgemeinen Formel I können auch in Form von Nasenpulvern oder Mitteln zur Einblasung verabfolgt werden. Für diese Zwecke werden die Peptide in feinverteilter Form zusammen mit einem pharmakologisch verträglichen festen Trägerstoff, z.B. mit feinverteiltem Polyäthylenglykol (Carbowax 1540), feinverteilter Lactose oder sehr fein verteiltem Siliciumdioxid (Cab-0-Sil), verabfolgt. Derartige Mittel können auch andere Zusatzstoffe in feinverteilter Form, wie Konservierungsmittel, Puffer oder oberflächenaktive Mittel, enthalten.

Die Peptide der allgemeinen Formel I können auch in Form von lange wirkenden Mitteln mit langsamer Wirkstoffabgabe oder Depotwirkung, wie nachstehend erläutert, vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion oder durch Implantation, verabreicht werden. Derartige Zubereitungsformen sind so

- 21 -

130065/0857

RS CAS 38 (SC-1) - 22 -

beschaffen, dass sie etwa 5 bis etwa 100 pg pro kg Körpergewicht pro Tag freisetzen.

Häufig ist es wünschenswert, die Peptide der allgemeinen Formel I kontinuierlich über längere Zeiträume hinweg in Form von lange anhaltenden Präparaten mit langsamer Wirkstoff abgabe oder Depotwirkung zu verabreichen. Derartige Zubereitungsformen können entweder ein pharmakologisch verträgliches Salz der Wirkstoffverbindung mit einer geringen Löslichkeit in Körperflüssigkeit, beispielsweise -Salze mit Pamoasäure, Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose, oder das Peptid der allgemeinen Formel I in Form eines wasserlöslichen Salzes zusammen mit einem Schutzmittel, das eine rasche Freisetzung verhindert, enthalten. Im letztgenannten Fall kann beispielsweise das Peptid der allgemeinen Formel I mit nicht-antigener, teilweise hydrolysierter Gelatine in die Form einer viskosen Flüssigkeit gebracht oder an einem pharmakologisch verträglichen, festen Trägerstoff, beispielsweise Zinkhydroxid gegebenenfalls zusammen mit Protamin, absorbiert werden. Der Wirkstoff kann auch in Form einer Suspension in einem pharmakologisch verträglichen, flüssigen Trägerstoff verabfolgt werden. Ferner ist auch die Herstellung von Gelen oder Suspensionen mit einem nicht-antigenen Schutzhydrokolloid, z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Natriumalginat, Gelatine, Polygalacturonsäuren, wie Pektin, oder bestimmten Mucopolysaccharide^ zusammen mit wässrigen oder nicht-wässrigen, pharmakologisch verträglichen, flüssigen Trägerstoffen, Konservierungsmitteln oder oberflächenaktiven Mitteln möglich. Beispiele für derartige -Präparate finden sich in üblichen pharmakologischen Handbüchern, wie Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975. Lang wirkende Präparate mit langsamer Wirkstoffabgabe erhält man auch durch Mikroverkapselung in einem pharmakologisch verträglichen Überzugsmaterial,

- 22 -

130065/0857

wie Gelatine, Polyvinylalkohol oder Äthylcellulose. Bezüglich weiterer Beispiele für Überzugsmaterialien und Verfahren zur Mikroverkapselung wird auf J.A. Herbig in "Encyclopedia of Chemical Technology" , Bd. 13, 2. Aufl., Wiley, New York, 1967, S. 436 bis 456 verwiesen. Derartige Präparate sowie Suspensionen von Salzen der Peptide der allgemeinen Formel I, die in Körperflüssigkeiten nur wenig löslich sind, sind so beschaffen, dass sie etwa 5 ;ug bis etwa 100 μ& des Peptids pro kg Körpergewicht pro Tag freisetzen. Vorzugsweise werden sie durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Eine andere Möglichkeit besteht darin, einige der vorstehend aufgeführten festen Präparate, beispielsweise bestimmte wenig wasserlösliche Salze oder Dispersionen oder Adsorbate der Salze mit festen Trägerstoffen, beispielsweise Dispersionen in einem neutralen Hydrogel eines Polymerisats von Äthylenglykolmethacrylat oder ähnlichen vernetzten Monomeren; (vgl. US-PS 3 551 556) in Form von Pellets zuzubereiten, die die vorstehend angegebenen Wirkstoffmengen freisetzen. Diese Pellets können subkutan oder intramuskulär implantiert werden.

Bestimmte Peptide der allgemeinen Formel I, die in Wasser wenig löslich sind, können als Suspensionen in einer wässrigen oder einer Emulsionsgrundlage zubereitet werden. Suspensionen auf Wasserbasis werden mit Hilfe von Netzmitteln, wie Kondensationsprodukte von Polyäthylenoxid und Alkylphenolen, Fettalkoholen oder Fettsäuren und Suspendiermitteln, wie hydrophilen Kolloiden, z.B. Polyvinylpyrrolidon, hergestellt. Suspensionen auf Emulsionsbasis werden durch Suspendieren des Peptids mit Hilfe eines Netzmittels und Suspendiermitteln in der Emulsionsbasis hergestellt, wobei die vorstehend erläuterten Emulgiermittel verwendet werden. Suspensionen können zusätzlich Puffer und/oder Süsstoffe, Aromastoffe, Farbstoffe, Konservierungsmittel und Antioxi-'IaI iutinro VI.. \.&] rnUuill r-n.

130065/0857

Wie vorstehend erläutert, werden Arzneipräparate zur oralen oder parenteralen Verabfolgung aus den Verbindungen der allgemeinen Formel I oder aus deren pharmakologisch verträglichen Salzen so hergestellt, dass 5 bis 100^ug/kg/Tag, vorzugsweise in unterteilten Dosen abgegeben werden. Pro Dosiseinheit können 0,3 bis 15 mg Wirkstoff enthalten sein. Für die parenterale Verabfolgung wird die Verwendung eines wasserlöslichen Peptids der allgemeinen Formel I oder eines wasserlöslichen Salzes eines wenig wasserlöslichen Peptids der allgemeinen Formel I in wässriger, steriler Lösung bevorzugt. Beispiele für Konservierungsmittel sind p-Hydroxybenzoesäuremethyl- und -propylester, die zusammen mit anderen löslichen Bestandteilen, wie zur Herstellung von isotonen Lösungen ausreichenden Mengen an Natriumchlorid oder Glucose, zugesetzt werden. Peptide der allgemeinen Formel I, die in Wasser wenig löslich sind, können auch intramuskulär in Form von Lösungen oder Suspensionen in sterilen, flüssigen, nicht-wässrigen Trägern verabfolgt werden, beispielsweise in pflanzlichen oder tierischen Ölen. Dabei können gegebenenfalls die vorgenannten zusätzlichen Lösungsbestandteile oder Suspendiermittel enthalten sein.

Nachstehend wird das Verfahren zur Herstellung der Peptide der allgemeinen Formel I näher erläutert.

Die carboxylendständige Aminosäure, die für C oder B, wenn C das vorstehend definierte NHR bedeutet, ausgewählt worden ist, wird an der of-Aminogruppe geschützt, vorzugsweise mit tert.-Butoxycarbonyl (R = Bog). Die geschütze Säure wird sodann mit einem Hydroxymethylharz oder vorzugsweise einem chlormethylierten Harz mit Hilfe eines Katalysators, vorzugsweise Cäsiumhydrogencarbonat oder Triäthylamin, gekuppelt. Anschliessend an die Kupplung wird die Schutzgruppe an der o(-Aminogruppe entfernt, beispielsweise unter

- 24 -

130065/0857

RS CAS 38 (SC-1) - 25 -

Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, wie vorstehend erläutert, oder mit Hilfe eines der anderen vorstehend aufgeführten Verfahren. Die Entfernung der Schutzgruppe wird vorzugsweise
temperatur durchgeführt.

gruppe wird vorzugsweise bei Temperaturen von 0 C bis Raum-

Ais chlormethyliertes Harz (1-prozentige Vernetzung) wird vorzugsweise das handelsübliche Produkt der Firma Biorad Laboratories, Richmond, Kalifornien, verwendet.

Die mit Hilfe der vorstehend definierten Verankerungsgruppe an den Harzträger gebundene carboxylendständige Aminosäure, die den Rest C oder B, wenn C NHR bedeutet, darstellt, wird in das Reaktionsgefäss eines automatischen Peptidsynthesegeräts gebracht, das auf folgenden Waschzyklus programmiert ist:

(a) Methylenchlorid,

(b) 33-prozentige Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 mal),

(c) Methylenchlorid,

(d) Äthanol,

(e) Chloroform,

(f) 10% Triäthylamin in Chloroform (2 mal),

(g) Chloroform und
(h) Mi'Uiy IcHK'hlorid.

Dar· gewiKU"liriir Harz wird Modatin in Methylenchlor/id mil einer entsprechend geschützten Aminosäure, die den Rest B oder A, wenn C NHR bedeutet, darstellt, gerührt. Als Schutz-Kruppe für die c<-Aminofunktion wird t.ert.-Butoxyearbony'l (Boc) bevorzugt. Bei den Aminosäuren für den Rest B wird für den Imidazolstickstoff (N^im) von Histidin als Schutzgruppe die Tosylgruppe (Tos) bevorzugt. Als Schutzgruppe für die Phenylaminogruppe in p-Aminophenylalanin wird Benzyloxycarbonyl (Z) bevorzugt. 3-Methylhistidin, ß-(P yrazolyl-1)-alanin und ß-(?-Thienyl)-alanin benötigen mit Ausnahme

- 25 -

130065/085 7

RS CAS 38 (SC-1) - 26 -

der<X-Aminogruppe keinen Schutz. Eine im wesentlichen äquimolare Menge eines Kupplungsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder vorzugsweise Diisopropylcarbodiimid, wird zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur (22 bis 25 C) gerührt. Sodann wird das Aminosäureharz

mit Methylenchlorid (3 mal) gewaschen. Die Schutzgruppe der verknüpften Aminosäure wird mit 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 mal) entfernt. Anschliessend werden die Stufen (c) bis (h) des vorstehend erläuterten Waschzyklus durchgeführt.

Die vorgenannten Stufen werden mit einer entsprechend geschützten Aminosäure, die für den Rest A ausgewählt ist, wenn C eine Aminosäure bedeutet, wiederholt. Das auf diese Weise fertiggestellte geschützte Peptidharz wird 3 mal mit Methylenchlorid und anschliessend 3 mal mit Methanol gewaschen und sodann unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält praktisch die theoretische Ausbeute (96 Prozent oder darüber).

Zur Herstellung eines Peptids der allgemeinen Formel I, in der C NHR bedeutet, oder eines Peptids der allgemeinen Formel I, in der C ein Aminosäure-nieder-alkylamid bedeutet, wird das geschützte Peptidharz bei 0⁰C im entsprechenden nieder-Alkylamin suspendiert und mehrere Stunden gerührt, überschüssiges Alkylamin wird sodann bei Raumtemperatur abgedampft. Das abgespaltene Peptid wird mit Dimethylformamid aus dem Harz ausgewaschen. Das geschützte Peptid wird sodann durch Zusatz von Essigsäureäthylester ausgefällt und filtriert. Man erhält das geschützte Peptid, in dem C NHR oder ein Aminosäure-nieder-alkylamid bedeutet.

Zur Herstellung von geschützten Peptiden, in der C ein Aminosäureamid oder einen Aminosäure-nieder-alkylester bedeutet, wird das vorstehend erläuterte Verfahren unter Verwendung von Ammoniak oder des entsprechenden Alkohols + Triäthylamin an Stelle von nieder-Alkylamin durchgeführt.

1300 6^/08 5 7

RS CAS 38 (SC-1) -27-

Die Entfernung der Schutzgruppen aus dem auf die vorstehende Weise hergestellten Peptid wird durch eine 15- bis 60-minütige, vorzugsweise etwa 30-minütige Behandlung des Materials mit Fluorwasserstoff und Anisol bei 0⁰C durchgeführt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck und das Anisol durch Waschen mit Äther entfernt. Zur Herstellung von Peptiden der allgemeinen Formel I, in der C eine freie Aminosäure bedeutet, wird das entsprechend geschützte Peptidharz auf die vorstehende Weise mit Fluorwasserstoff und Anisol behandelt. Dabei werden gleichzeitig die Schutzgruppen und die Bindung an den Harzträger entfernt. Man erhält das gewünschte Peptid der allgemeinen Formel I, in der C eine freie Aminosäure bedeutet.

Zur Herstellung von Peptiden der allgemeinen Formel I, in der C 2-Aminohydroxyäthyl (Gly-ol) bedeutet, wird das A-B-Dipeptidharz mit 2-Aminoäthanol behandelt, wodurch man direkt das gewünschte Peptid der allgemeinen Formel I, in der C Gly-ol bedeutet, erhält. Gegebenenfalls am Histidylrest vorhandene Dinitrophenyl- oder Tosylschutzgruppen werden gleichzeitig entfernt.

Nachstehend werden biologische Untersuchungen an den Peptiden der Erfindung wiedergegeben.

Die Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I auf die Verringerung des Appetits und der Nahrungsaufnahme bzw. die appetitzügelnde Wirkung wird durch Fütterungsveröuche an Mäusen und Ratten im wesentlichen gemäss den Verfahren von Trygstad et al., a.a.O., und Reichelt et al., a.a.O., ermittelt. Tn regelmäRsigen Abständen wird der tägliche Futterverbrauoh auf 0,1 g genau und dan Körpergewicht auf 1 g genau bestimmt. Die anderen Messgrössen, wie Sauerstoff verbrauch, Körpertemperatur, Glucose- und/oder Insulinspiegel im Plasma und quantitative Aminogramme, werden zu bestimmten Zeitpunkten ermittelt.

130065/0857

RS CAS 38 (SC-1) - 28 - O11-7Q/Q

all/ 34ο

Die Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I auf die Magen- und/oder Pankreassekretion wird an Ratten oder vorzugsweise an Hunden, die mit Speiseröhren-, Magen- und Pankreasfisteln versehen sind, gemäss Babkin, a.a.O., Liebling et al., a.a.O. oder Olbe, a.a.O., bestimmt. Eine Scheinfütterung bei Hunden führte zu einer ausgeprägten Zunahme des Säureausstosses, der 82 Prozent des maximalen Säureausstosses betrug, der durch Verabfolgung von 320 ^g/kg/Std. Histamin erreichbar ist (13,55 + 1,8 niÄ'q/15 min). Gleichzeitig ergab sich ein signifikanter Anstieg des Serum-Gastrinspiegels von einem Grundwert von 32+5 pg/ml auf 73 + 10 pg/ml. Eine Scheinfütterung führte auch zu einer ausgeprägten Zunahme der Pankreas-Proteinsekretion, die 71 Prozent des Maximalwertes betrug, der durch Verabfolgung von 0,5 ^g/kg/Std. Caerulein erreichbar ist (650 + 86 mg/ 15 min). Die Peptide der allgemeinen Formel I verringerten bei intravenöser Infusion in Dosen von 25 bis 50 ^ug/kg/Std.. 30 Minuten vor und während der Scheinfütterung den maximalen Säureausstoss um etwa 34 Prozent ohne signifikante Veränderung des Serum-Gastrinspiegels und die Pankreas-Proteinausscheidung um etwa 38 Prozent.

Bei Hunden mit Magenfisteln und Heidenhain-Taschen führte s., die gastrische Verabreichung eines Leberextraktfutters zu einer ausgeprägten Zunahme des Säureausstosses, die etwa 90 Prozent des Maximalwertes betrug, der durch Verabfolgung von Histamin an Hunde mit Magenfisteln erreichbar ist, und etwa"35 Prozent des Maximalwerts bei Hunden bei Heidenhain-Taschen betrug, während die Serum-Gastrinspiegel in sehr signifikanter Weise auf mehr als das 2-fache des Grundwerts von 29 + 5 pg/ml auf 76 + 12 pg/ml stiegen. Bei Verabfolgung der Peptide der allgemeinen Formel I durch 1-stündige intravenöse Infusion während des Fütterungsplateaus in Dosen von 50 jag/kg/Std. wurde die durch die Fütterung mit Leberextrakt induzierte Säuresekretion bei Hunden mit

- 28 130065/085 7

rs cAs 38 (sc-1) - 29 - 311 79A8

Magenfisteln um 35 Prozent und bei Hunden mit Heidenhain-Taschen um 41 Prozent verringert, ohne dass signifikante Veränderungen der Serum-Gastrinspiegel auftraten. Die Peptide der allgemeinen Formel I hemmen auch den durch Fütterung bedingten Insulin- und Gastrinanstieg.

Bei Hunden mit Pankreasfisteln stimulierte eine normale Fütterung pankreatisches HCO-" zu 80 Prozent des Maximalwerts, der durch Verabfolgung von 3 KU/kg/Std. Secretin erreichbar ist, und die Proteinausscheidung zu 92 Prozent des Maximalwerts, der mit 0,5 ^g/kg/Std. .Caerulein erreichbar ist. Die auf die vorstehend angegebene Weise verabfolgten Peptide der allgemeinen Formel I verringerten während der zweiten Stunde nach der Fütterung den HCO-" -Ausstoss um 35 Prozent und den Protein (Enzym)-Ausstoss um 46 Prozent, ohne Brechreiz oder andere Nebenwirkungen hervorzurufen.

Dir vornl'.ohonclon Ergobni:··μ<? zeigen klar, dass di« Peptide der allgemeinen Formel I die Hirn-, Magen- und Darmphasen der Magen- und Pankreassekretion hemmen, vermutlich über eine Suppresion der neuro-hormonalen Mechanismen, die für diese Sekretionen verantwortlich sind. Bei der Hirnphase handelt es sich um die neurale, psychische oder Appetitphase der Magensekretion, deren Hemmung eine Unterdrückung des Appetits und die anorexigene Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I zeigt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

P-Pvrog]utamvl-L-histidvl-(to3vl·)~gl·vcv.^-0-CHp-Harz, L' 11- (p.vru) Ülü-llis(M^H"~l{ *) -Uly-O-CIL, -Uara. IiV.-- .lua.,.

2,70 g (1,00 mMol Glycin) des Boc-Glycinharzes der Formel

- 29 -

130065/0857

Bog

- GIy - O - CH₂ - Harz

werden in das Reaktionsgefäss eines automatischen Peptid-Synthesegeräts (Beckmann Modell 990) gegeben, das auf folgenden Waschzyklus programmiert ist:

(a) Methylenchlorid,

(b) 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 mal, 1 bzw. 25 Minuten),

(c) Methylenchlorid,

(d) Äthanol,

(e) Chloroform,

(f) 10% Triäthylamin in Chloroform (2mal jeweils 2 Minuten),

(g) Chloroform und
(h) Methylenchlorid.

Das gewaschene Harz wird sodann mit 3,0 mMol tert.-Butyloxycarbonyl-tosyl-histidin in Methylenchlorid gerührt und mit 3,0 mMol Diisopropylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Peptidharz wird den Stufen (a) bis (h) des vorgenannten Waschzyklus unterworfen. Sodann werden 3,0 mMol D-Pyrog^lutaminsäure auf die gleiche Weise angekuppelt, wodurch man die Titelverbindung erhält.

Das fertige Tripeptidharz wird 3 mal mit Methylenchlorid und anschliessend 3 mal mit Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen erhält man 2,89 g Material.

Das Glycinharz dieses Beispiels wird aus handelsüblichem, chlormethyliertem Harz (1% Vernetzung, Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien) hergestellt.

Beispiel 2 D-Pyroglutamyl-L-histidyl-glycin

2,89 g des gemäss Beispiel 1 erhaltenen, geschützten Tri-

- 30 130065/0857

RS CAS 38 (SC-1) - 31 -

peptidharzes werden 45 Minuten bei O⁰C in 40 ml Fluorwasserstoff und 10 ml Anisol suspendiert. Sodann wird der Fluorwasserstoff mit Hilfe eines Stroms aus trockenem Stickstoff abgedampft. Das Anisol wird durch Waschen mit Ä'ther entfernt.

Das rohe Peptid wird durch Gelfiltration an einer mit Sephadex G 15 (chemisch modifiziertes, vernetztes Dextran,"fine") gepackten Säule der Abmessungen 2,5 x 95 cm gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen (320 bis 340 ml) werden lyophilisiert. Man erhält 320 mg D-H-(pyro)-Glu-His-Gly-OH in Form eines farblosen, flockigen Pulvers.

Das Produkt verhält sich bei, der Dünnschichtchromatographie in 4 verschiedenen Lösungsmitteln auf Kieselgelplatten homogen. Dabei werden jeweils 20 bis 30 yg in Form von Flecken aufgebracht. Die Entwicklung erfolgt mit Chlorgas und anschliessendem Besprühen mit Stärkereagens. Es ergeben sich folgende R „-Werte: 1-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:5, obere Phase), 0,08; Essigsäureäthylester : Pyridin : Essigsäure : Wasser (5:5:1:3) 0,28; 1-Butanol: Essigsäure : Wasser Essigsäureäthylester (1:1:1:1) 0,18; 2-Propanol : 1 m Essigsäure (2:1) 0,20.

Bei der Aminosäureanalyse ergeben sich folgende Werte: GIu 1,03, GIy 1,00, His 0,99.

Beispiel 3

3 Teile D-Pyroglutamyl-L-histidyl-glycin werden in 1000 Teilen destilliertem, pyrogenfreiem Wasser gelöst. Zur Herstellung einer isotonen Lösung wird eine ausreichende Menge Natriumchlorid zugesetzt. Das Gemisch wird durch Autoklavisieren sterilisiert und in Ampullen abgefüllt. Man erhält Mlir I iit'n.i I oli.il OMUMK f'l'il· ' iK-M'flpfHl ! ni-hc. /'wm'kr.

- 31 13006S/0857

Beispiel 4

Ein Geraisch aus 12 Teilen D-Pyroglutarayl-L-histidyl-glycin und 500 Teilen weissem Magnesiumcarbonat und 20 Teilen Magnesiumstearat wird zu groben Stücken ^erpresst. Die Stücke werden granuliert, durch ein 8 mesh-Sieb (2,38 mm) gegeben und verpresst. Die auf diese Weise erhaltenen Tabletten eignen sich zur oralen Verabfolgung.

Beispiel 5

Ein Gemisch aus 12 Teilen D-Pyroglutamyl-L-histidyl-glycin und 500 Teilen weissem Magnesiumcarbonat wird durch Zumischen einer Lösung von 2 Teilen Natrium-dioctyl-sulfosuccinat in einer ausreichenden Menge Methanol granuliert. Das Granulat wird durch ein 12 mesh-Sieb (1,68 mm) gegeben und bei 50 bis 55 C getrocknet. Sodann wird das Granulat nochmals durch ein 12 mesh-Sieb gegeben. Nach Zusatz von 8 Teilen Magnesiumstearat wird das Gemisch zu Tabletten für die orale Verabfolgung verpresst.

Beispiel 6

Ein Gemisch aus 24 Teilen D-Pyroglutamyl-L-histidyl-glycin, 475 Teilen Lactose, 94 Teilen Maisstärke und 3 Teilen Magnesiumstearat wird zu groben Stücken verpresst. Die Stücke werden zu einem Granulat zerkleinert, das durch ein 8 mesh-Sieb (2,38 mm) gegeben wird. Das Granulat wird sodann mit einer ausreichenden Menge einer Lösung von 15 Teilen Schellack und 3 Teilen Rizinusöl in 800 Teilen Äthanol überzogen. Hierauf werden 3 Teile Magnesiumstearat zugesetzt. Das Granulat wird zu Tabletten für die orale Verabreichung verpresst.

- 32 -

130065/08 5 7

Beispiel 7

24 Teile D-Pyroglutamyl-L-histidyl-glycin werden in einer Kugelmühle mit 576 Teilen Lactose vermischt. Das Gemisch wird in Gelatinekapseln abgefüllt. Man erhält ein Präparat für die orale Verabfolgung.

Ende der Beschreibung

- 33 -

Claims

Patentansprüche

1 .y Peptide der Formel A-B-C und deren pharmakologisch verträgliche Salze, wobei

A einen Rest aus der Gruppe L-Pyroglutarayl, D-Pyroglutamyl und L-Homopyroglutamyl bedeutet,

B einen Rest aus der Gruppe L-Histidyl, L-3'-Methylhistidyl, D-Histidyl, L-Phenylalanyl, L-p-Aminophenylalanyl und L-ß-(Pyrazolyl-1)-alanyl bedeutet und C einen Rest aus der Gruppe Glycin, Glycinamid, Glycin-(nieder-alkyl)-amide, Glycin-nieder-alkylester, 2-Amino-1-hydroxyäthyl, D-Alanin, L-ß-(2-Thienyl)-alanin und

ι 1

NHR bedeutet, wobei R nieder-Alkyl ist, mit der Massgabe, dass C nicht Glycin oder Glycinamid ist, wenn A L-Pyroglutamyl und B L-Histidyl bedeuten.

1 3 0_0 ^ S / O 8 S 7

RS CAS 38 (SC-1) -2- 3 Π 7948
2. D-Pyroglutamyl-L-histidyl-glycin nach Anspruch 1.

ρ ο
3. Harzgebundene Peptide der Formel R -A-(R^J _TB)-C-0-CH_o-Harz,

2 λ

wobei R Boc bedeutet, R Dnp oder Tos bedeutet und A, B

und C die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 haben.

ρ 21
4. Harzgebundene Peptide der Formel R-A-(R -B)-C-O-CH -Harz,

2 4

wobei R Boc bedeutet, R Z bedeutet und A, B und C die

gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 haben.
5. tert.-Butyloxycarbonyl-D-pyroglutamyl-L-(N^im-tosyl)-histidyl-glycyl-O-CHp-Harz nach Anspruch 3·

13006S/0ÖS7