DE3147193A1 - Method for the preparation of a pullulan composition having limited molecular weight distribution, method for the preparation of a plasma expander, and method for the preparation of a hyperkinesis agent using the pullulan composition and this agent - Google Patents
Method for the preparation of a pullulan composition having limited molecular weight distribution, method for the preparation of a plasma expander, and method for the preparation of a hyperkinesis agent using the pullulan composition and this agentInfo
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Abstract
Description
Verfahren zur Herstellung einer Pullulanzubereitung mitProcess for making a pullulan preparation with
begrenzter Molekulargewichtsvertsilung, Verfahren zur Herstellung eines Plasmaausdehnungsmittels , Verfahren zur Herstellung eines Hyperkinesemittels unter Verwendung der Pullulanzubereitung und diese Mittel.limited molecular weight distribution, method of manufacture a plasma expansion agent, a method for producing a hyperkinesis agent using the pullulan preparation and these remedies.
Pullulan ist ein Glucan, das man durch Kultivierung des Mikroorganismus Aureobasidium pullulans in einem Medium mit einem Gehalt an Sacchariden, wie z.B. Mono- und/oder Oligosacchariden in submerser Kultur bzw. unter Tauchbedingungen (submerged conditions) erhalten hat, und das im wesentlichen aus Maltotrioseeinheiten besteht, die linear über a-1 ,6-glucosidische Bindungen polymerisiert sind.Pullulan is a glucan that is obtained by cultivating the microorganism Aureobasidium pullulans in a medium containing saccharides, e.g. Mono- and / or oligosaccharides in submerged culture or under immersion conditions (submerged conditions), and that essentially from maltotriose units exists, which are polymerized linearly via α-1,6-glucosidic bonds.
Pullulan mit einem Molekulargewicht von 80 000 bis 300 000 wurde im technischen Maßstab hergestellt und für verschiedene Anwendungen, wie z.B. für Lebensmittel und chemische Industrien zur Verfügung gestellt, wo die Uberlegenen Eigenschaften von Pullulan, wie z.B. seine Wasserlöslichkeit, Eßbarkeit, Haftfähigkeit und leiohte Formbarkeit zu einem Film vorteilhaft ausgenfitztw«rden.Pullulan with a molecular weight of 80,000 to 300,000 was used in manufactured on a technical scale and for various applications, e.g. for food and chemical industries provided where the superior properties of pullulan, such as its water solubility, edibility, adhesiveness and leiohte Formability into a film can advantageously be exploited.
Um einen weiteren Anwendungsbereich zu eröffnensuntersuchte man die Molekulargewichtsverteilung von handelstWblichem Pullulan mit verschiedenen Gewichtsmitteln des Mol<kulargewichts (nachstehend als 1?Mwll abgekürzt) mit Hilft von Gelfiltration und bestimmte ihr Verhältnis des Gewichtsmittels des Molekulargewichtes zum Zahlenmittel de Molekulargewichtes (nachstehend als "Mw/Mn" abgekUrzt) Es wurde festgestellt, daß das gesamte handelsübliche untersuchte Pullulan eine relativ breite MolekulargewicFtsverteilung von mehr als etwa 2,0 aufwies.In order to open up a further area of application, the Molecular weight distribution of commercial pullulan with various weight averages of the molecular weight (hereinafter abbreviated as 1? MwII) with the aid of gel filtration and determined their ratio of weight average molecular weight to number average de molecular weight (hereinafter abbreviated as "Mw / Mn") It was found that all of the commercial pullulan tested had a relatively broad molecular weight distribution greater than about 2.0.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer Pullulanzubereitung mit einer begrenzter Molekulargewichtsverteilung Mw/Mn vorzusehen; die insbesondere 1,5 nicht iibersteigt.It is the object of the invention to provide a method for producing a To provide pullulan preparation with a limited molecular weight distribution Mw / Mn; which in particular does not exceed 1.5.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt: (1) Bei der partiellen Hydrolyse des eingesetzten Pullulans gilt: je höher das Molekulargewicht einer Fraktion im Ausgangsstoff ist, umso anfälliger ist diese Fraktion für die Hydrolyse; und (2) man kann die gewünschte Pullulanzubereitung mit einer begrenzten Molekulargewichtsverteilung leicht in höherer Ausbeute durch Fraktionieren eines partiellen Hydrolysates von Pullulan mit einem Fällungsmittel erhalten, wie z.B. mit einem organischen Lösungsmittel.According to the invention, it was found: (1) During partial hydrolysis of the pullulan used: the higher the molecular weight of a fraction in the The starting material, the more susceptible this fraction is to hydrolysis; and (2) one can get the desired pullulan preparation with a limited molecular weight distribution easily in higher yield by fractionating a partial hydrolyzate of Obtain pullulan with a precipitant, such as an organic solvent.
Als das eingesetzte Pullulan, das man erfindungsgemäß verwenden kann, kann man eine beliebige Pullulanzubernitung verwenden, sofern man die ,ewUnschte Pullulanzubereitung mit einem Mw/Mn-Wert von nicht mehr als 1,5 aus seinem partiellen Hydrolysat erhalten kann: Im allgemeinem ist ein eingesetztes Pullulan gwit einem höheren Mw-Vert als jener der gewünschten Pullulanzubereitung geeignet.As the pullulan used, which can be used according to the invention, you can use any pullulan preparation, as long as you want it Pullulan preparation with an Mw / Mn value of not more than 1.5 from its partial Hydrolyzate can be obtained: In general, a pullulan used is gwit one higher Mw-Vert than that of the desired pullulan preparation.
Anwendbare Bedingungen für die partielle Hydrolyse sind Jene, worunter die partielle Hydrolyse des AuegAngastoffes Pullulan bewirkt wird, und man steigert weiter Qie Ausbeute der gewünschten Pullulanzubereitung: Beispielsweise kann man die Hydrolyse erzielen, indem man eine wässerige Lösung des Ausgangsstoffes Pullulan mit einer organischen oder anorganischen Saure, wie z.B. Milchsäure, Zitronensäure, Salzsäure oder Schwefelsäure; einem Enzym, wie z.B. Cyclodextringlucanotransferase (EC 2.4.1.19), a-Amylase (EC 3.2.1.1), Pullulanase (EC 3.2.1.41), Isopullulanase (EC 3.2.1.57) oder Isoamylase (EC 3.2.1.68); oder mit einem Ultraschallgerät behandelt; unter diesen Methoden sind jedoch Jene unter Verwendung von Säure oder Enzym vom Standpunkt der großtechnischen Herstellung besonders bevorzugt.Applicable conditions for the partial hydrolysis are those below the partial hydrolysis of the exhaust gas Pullulan is effected and one further increases the yield of the desired pullulan preparation: for example the hydrolysis can be achieved by adding an aqueous solution of the starting material Pullulan with an organic or inorganic acid, such as lactic acid, citric acid, Hydrochloric acid or sulfuric acid; an enzyme such as cyclodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19), α-amylase (EC 3.2.1.1), pullulanase (EC 3.2.1.41), isopullulanase (EC 3.2.1.57) or isoamylase (EC 3.2.1.68); or treated with an ultrasound machine; however, among these methods are those using acid or enzyme from Particularly preferred from the point of view of large-scale production.
Das Sammeln der gewünschten Pullulanfraktion aus deqi partiellen Hydrolysat kann man im allgemeinen entweder durch eine fraktionierte Ausfällung unter Verwendung eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels, wie z.B. Methanol, Äthanol, Isopropanol oder Aceton, oder durch eine fraktionierte Lösung, gegebenenfalls in Kombination mit einer oder mehreren anderen Methoden durchfUhren, wie z.B.Collecting the desired pullulan fraction from deqi partial hydrolyzate can generally be done either by using fractional precipitation a water-soluble organic solvent such as methanol, ethanol, isopropanol or acetone, or by a fractionated solution, optionally in combination by one or more other methods, such as
Gelfiltration und/oder renrsung mit einem Membranfilter.Gel filtration and / or separation with a membrane filter.
Die derart erhaltene Pullulanfraktion kann man im allgemeinen durch Entfärben mit Aktivkohle und/oder Entionisation mit einem Ionenaustauscher reinigen. Man kann einen farblosen transparenten Sirup leicht durch Membranfiltration und Einengen bzw. ein weißes pyrogenfreies Pullulanpulver durch Membranfiltration, Einengen, Trocknen und gegebenenfalls pulverisieren erhalten.The pullulan fraction obtained in this way can generally be passed through Clean decolorization with activated carbon and / or deionization with an ion exchanger. One can easily get a colorless transparent syrup through membrane filtration and Concentrate or a white pyrogen-free pullulan powder by membrane filtration, concentration, Drying and optionally pulverizing obtained.
Da die derart erhaltene Pullulanzubereitung aus hochgereinigten wasserlöslichen linearen Polymerketten mit einem Rw/Mn-Wert von nicht mehr als 1,5 besteht, kann man sie vorteilhaft als zuverlässiges wasserlösliches Polymeree verwenden: Beispielswelse ist für die Gelfiltration oder Fltaslgohromatographie eine Pullulanzubereitung mit einem iw/Mn-Wert von etwa 1,1 bis 1,3 besonders bevorzugt. Für die Anwendungszwecke ist eine Standardausstattung bzw. ein Standardsatz von wasserlösliches Polymeren mit verschiedenen Pullulanzubereitungen mit bekannten Mw/Mn-Werten von beispielsweise 20 000, 30 000, 40 000, 50 000 und 80 qDO zweckmäßig verwendbar.Since the pullulan preparation obtained in this way from highly purified water-soluble linear polymer chains with an Rw / Mn value of not more than 1.5 they can be used advantageously as reliable water-soluble polymers: example catfish is for gel filtration or liquid chromatography a pullulan preparation with an iw / Mn value of about 1.1 to 1.3 are particularly preferred. For the purposes of application is a standard equipment or set of water-soluble polymers with various pullulan preparations with known Mw / Mn values of, for example 20,000, 30,000, 40,000, 50,000 and 80 qDO can be used appropriately.
Die Pullulanzubereitung, die man erfindungsgemäß erhalten hat, findet verschiedene Anwendungen in Plasmaausdennungsmitteln bzw. Plasmaentspannungsmitteln und Hyperkinesemitteln: Man kann sie herstellen, indem man eine Pullulanzubereitung mit einem Rw/Mn-Wert von nicht mehr als 1,5 (Mw = 30 000 bis 90 000) löst, eine wässerige Pullulanlösung mit einer Konzentration von etwa 4 bis 10 % (Gewicht/ Volumen) bezogen auf die trockenen Feststoffe erhält, ein isotonisches Mittel, wie z.B. ein Mineralsalz (mineral) und/oder ein Saccharid zu der Lösung zugibt und schließlich die erhaltene isotonische Pullulanlösung sterilisiert.The pullulan preparation obtained according to the invention is found various applications in plasma expansion agents and plasma relaxation agents and hyperkinesis drugs: they can be made by making a pullulan preparation with an Rw / Mn value of not more than 1.5 (Mw = 30,000 to 90,000) solves a aqueous pullulan solution with a concentration of about 4 to 10% (weight / volume) based on dry solids, an isotonic agent such as a Mineral salt (mineral) and / or a saccharide is added to the solution and finally the isotonic pullulan solution obtained is sterilized.
Nachstehend wird die Erfindung durch Versuche näher erläutert.The invention is explained in more detail below by means of experiments.
Versuch 1: Herstellung eine Pullulans mit einer be«;renzten MolekulargewLchtsverteilung.Experiment 1: Production of a pullulan with a limited molecular weight distribution.
3 gleiche Teile einer 10 -igen (Gewicht/Volumen) wkisserigen Pullulanlösung mit einem Mw/Mn-Wert von 2,5 (Mw = 150 000) behandelte man folgendermaßen: (A) Einen der drei gleichen Teile unterwarf man der weiteren Verarbeizung ohne Hydrolyse; (B) einen weiteren der drei gleichen Teile säuerte man auf einen pH-Wert von etwa 2 mit Schwefelsäure an, ließ bei diesem pH-Wert und 80 °C 2 h lang stehen und bewirkte eine partielle Hydrolyse und neutralisiert nach der Hydrolyse rasch die Lösung; und (C) zu dem letzten der drei gleichen Teile gab man eine handelsübliche a-Amylase "Neospitase" (Nagase and Company, Ltd., Osaka, Japan) in einer Menge von 550 dextrinogenen Einheiten/g Pullulan zu, inkubierte die Mischung bei einem pH-Wert von 5,5 und 60 0C 20 h lang, bewirkte eine enzymatische Hydrolyse, erwärmte danach und inaktivierte die enzymatir3che Restaktivität. Danach gab man zu allen drei gleichen Teilen (A), (B) und (C) Methanol zu, erhielt eine Jeweilige Konzentration von 43 Volumen, während man bei 30 oO hielt, entfernte die erhaltenen unteren Schichten, gab danach zu den zurückbleibenden oberen Schichten Methanol zu und erhielt eine jeweilige Konzentration von 60 Volumen-%. Nach dem Stehenlassen sammelte glan dir erneut gebildeten unteren Schichten gemeinsam, pulverisierte sie und erhielt Pullulanzubereitungen mit einem itw/n-Wert von 1,4 (w -60 000).3 equal parts of a 10% (weight / volume) wkisserigen pullulan solution with an Mw / Mn value of 2.5 (Mw = 150,000) was treated as follows: (A) One the three equal parts were subjected to further processing without hydrolysis; (B) Another of the three equal parts was acidified to a pH of about 2 with sulfuric acid, left to stand at this pH value and 80 ° C. for 2 hours and caused partial hydrolysis and, after hydrolysis, rapidly neutralizes the solution; and (C) to the last of the three equal parts were given a commercially available one α-Amylase "Neospitase" (Nagase and Company, Ltd., Osaka, Japan) in an amount of To 550 dextrinogenic units / g pullulan, the mixture incubated at pH from 5.5 and 60 ° C. for 20 h, caused enzymatic hydrolysis, then heated and inactivated the residual enzymatic activity. Then you gave the same to all three Parts of (A), (B) and (C) methanol, each got a concentration of 43 Volume while holding at 30 oO removed the lower layers obtained, then added methanol to the remaining upper layers and obtained one respective concentration of 60% by volume. After standing, glan collected you re-formed lower layers together, pulverized them and obtained pullulan preparations with an itw / n value of 1.4 (w -60,000).
Die Ausbeuten bezogen auf das eingesetzte Pullulan sind in Tabelle 1 angegeben.The yields based on the pullulan used are shown in the table 1 specified.
Tabelle 1: Behandlung ohne Hydrolyse Hydrolyse Säure Enzym Ausbeute (%) 16 48 55 Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 1 ersichtlich ist, kann man eine größere Menge des gewünschten Pullulans erzielen, indem man es aus dem partiellen Hydrolyse sammelt, als wenn man es aus dem intakten Pullulan sammelt.Table 1: Treatment without hydrolysis hydrolysis acid enzyme yield (%) 16 48 55 As can be seen from the results in Table 1, one can obtain a Obtain a larger amount of the desired pullulan by removing it from the partial Hydrolysis collects like collecting it from the intact pullulan.
Zur Erklärung dieser Ergebnisse untersuchte man mit Gelfiltration die MolekulargewSchtsverteilung, indem mun geringe Mengen des Hydrolysotes in bestimmten Intervallen während der partiellen Eydrll7lyse sammelte. Es wurde festgestellt, daß bei der partiellen Hydrolyse unter Verwendung von Säure oder Enzym gilt: je höher das Molekulargewicht einer Fraktion des eingesetzten Pullulans ist, umso anfälliger ist diese für die Hydrolyse: Demgemäß ergibt eine geeignete auswahl der Hydrolysebedingungen eine maximale Ausbeute des gewünschten Pullulans, bis zu etwa 40 bis 60 . Ferner wurde festgestellt, daß eine partielle Hydrolyse mit Enzym eine relativ höhere Ausbeute als Jene mit Säure ergibt.Gel filtration was used to explain these results the molecular weight distribution by taking small amounts of the hydrolysis matter in certain Intervals during the partial ehydride lysis. It was determined, that in the case of partial hydrolysis using acid or enzyme, the following applies: the higher the molecular weight of a fraction of the pullulan used, the more susceptible it is is this for hydrolysis: Accordingly, a suitable selection of hydrolysis conditions results a maximum yield of the desired pullulan, up to about 40 to 60. Further it was found that partial hydrolysis with enzyme had a relatively higher yield than those with acid.
Versuch 2: Intravenöse Injektion von Pullulanen mit verschiedenen $w/Pin-wertßn.Experiment 2: Intravenous injection of pullulans with different $ w / pin values
Vier Plasmaausdehnungslösungen für den Test mit intravenöser Injektion stellte man her, indem man gleiche Teile von Pullulanzubereitungen mit einem Mw/n-Wert von 2,8, 2,0, 1,5 bzw. 1,2 (Mw = 60 000) in einer physiologischen Kochsalzslösung auflöste, eine Konzentration von 6 % (Gewicht/Volumen) erzielte und die erhaltenen aliquoten Lösungen sterilisierte.Four plasma dilatation solutions for intravenous injection test was prepared by adding equal parts of pullulan preparations with an Mw / n value of 2.8, 2.0, 1.5 and 1.2 (Mw = 60,000) in a physiological saline solution dissolved, achieved a concentration of 6% (weight / volume) and the obtained aliquots sterilized.
Die Plasmaausdehnungsmittel injizierte man Kaninchen rasch intrevenös, welche etwa 3,0 kg wogen, in einer Jeweiligen Dosis von 100 ml/kg innerhalb von etwa 15 min und führte danach Beobachtungen des venösen Druckes und der Urinausscheidung durch: Man bestimmte den venösen Druck (mmH20) vor und nach der Injektion und verwendete den Faktor, den man durch Dividieren des venösen Druckes nach der Injektion durch Jenen vor der Injektion erhalten hatte, als Kriterium zur Bewertung der Belastung des Ereislaufsystems; und die Pullulanmengen, die im Urin innerhalb von 2 h nach der Injektion ausgeschieden wurdenobestimmte man und verwendete das Ausscheidungsverhältnis (%), das das Verhältnis der Menge des ausgeschiedenen Pullulans zu jener des injizierten Pullulans ausdrück@e, als Kriterium zur BeMtertung des zirkulierenden Pullulatls und sg seiner Plasmaentsannungsbsw. Plasmazusdehnungswirtung.The plasma dilatants were injected rapidly intravenously into rabbits, which weighed about 3.0 kg, in a respective dose of 100 ml / kg within about 15 min and then made observations of venous pressure and urine output by: The venous pressure (mmH20) before and after the injection was determined and used the factor obtained by dividing the venous pressure after injection by Those received before the injection as a criterion for assessing the exposure the circulatory system; and the amount of pullulan that was found in the urine within 2 hours excreted by injection was determined and the excretion ratio was used (%), which is the ratio of the amount of excreted pullulan to that of the injected Pullulans express @ e, as a criterion for evaluating the circulating pullulatl and so-called his plasma desannungsbsw. Plasma expansion management.
Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt, worin alle Werte Mittelwerte von zwei Kaninchen sind.The test results are shown in Table 2, in which all values Mean values of two rabbits are.
Tabelle 2: Rw/n 2,8 2,0 1,5 1,2 venöser Druck (Höhe) 2,1 1,7 1,3 1,2 Ausscheidungsverhältnis (%) 45 32 17 13 Bewertung ()* (t)* (+)** (+)** Bemerkungen: Bewertung: (+) sorz9glich; (+) normal; iLnd (-) schlecht -*) Vergleich; und **) gemäß der ErfinduRlg.Table 2: Rw / n 2.8 2.0 1.5 1.2 Venous pressure (height) 2.1 1.7 1.3 1.2 Elimination ratio (%) 45 32 17 13 Evaluation () * (t) * (+) ** (+) ** Comments: Evaluation: (+) careful; (+) normal; iLnd (-) bad - *) comparison; and **) according to the invention.
Wie aus den Ergebnissen von Tabelle 2 ersichtlich ist, erzielt man durch Verwendung eines Pullulans mit einem Mw/Mn-Wert von nicht mehr als 1,5 eine leichte Erhöhung des venösen Druckes und keine rasche Ausscheidung im Urin des inJizierten Pullulans; daher ist das Pullulan als Plasmaausdehnungs- bzw. PlamastreckungJmittel sehr gee¢n-t.As can be seen from the results in Table 2, by using a pullulan having an Mw / Mn value of not more than 1.5 one slight increase in venous pressure and no rapid excretion in the urine of the injected Pullulans; therefore pullulan is used as a plasma expansion agent very gee ¢ n-t.
Danach fraktionierte man ein Pullulan mit einem Mw/Mn-Wert von 2,8 (Mw = 60 000) durch Gelfiltration in zwei Proben: Die eine Probe wies ein durchschnittliches Molekulargewicht von nicht mehr als 15 000 und die andere ein mittleres Molekulargewicht von mehr als 150 000 auf; die Proben injizierte man Kaninchen getrennt wie beschrieben. Als Ergebnis erzielte man mit der InJektion der ersten Probe einen Anstieg des venösen Druckes um das etwa 1,2-fache, jedoch eine Ausscheidung im Urin bis zu 80 %; im Gegensatz dazu erzielte man durch InJektion der letzteren Probe ein Ausscheidung im Urin von etwa 7 , Jedoch einen Anstieg des venösen Druckes um das etwa 3-fache.A pullulan with an Mw / Mn value of 2.8 was then fractionated (Mw = 60,000) by gel filtration in two samples: One sample had an average one Molecular weight of not more than 15,000 and the other having an average molecular weight of more than 150,000; the samples were injected into rabbits separately as described. As a result, with the injection of the first sample, an increase in the venous level was achieved About 1.2 times the pressure, but up to 80% excretion in the urine; in the In contrast, an excretion was obtained by injection of the latter sample in the urine of about 7, however, an increase in venous pressure of about 3 times.
Diese Ergebnisse führten zu dem nachstehenden Schluß: Bei einem Pullulan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von nicht mehr als 15 000 ist die benötigte Halbwertazeit von der InJektion bis zur Ausscheidung im Urin sehr kurz, was nur eine höhere Belastung bzw. Anstrengung der Nieren ergibt; und daher kann man keine Plasmaausdehnungswirkung dabei erwarten; andererseits besteht bei der Verwendung eines Pullulans mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von mehr ais 150 000 die Gefahr eines relativen Anstiegs des venösen Druckes nach einer raschen Intravenösen Injektion, daher würde die Wirkung auf das Kreislaufsystem extrem ansteigen.These results led to the following conclusion: On a pullulan with an average molecular weight of not more than 15,000 is the required half-life from injection to excretion very briefly in the urine, which only results in greater stress or strain on the kidneys; and therefore, no plasma expansion effect can be expected therefrom; on the other hand exists when using a pullulan with an average molecular weight of more than 150,000 there is a risk of a relative increase in venous pressure a rapid intravenous injection, thus reducing the effect on the circulatory system increase extremely.
Demgemäß sollte das Pullulag, das für ein Plasmaaus<Lehnungamittel verwendbar ist, eine begrenzte Molekulargewit:htsverteilung aufweisen, wobei der i/Mn-Wert 1,5 nicht übersteigt, das man erhalten hat, indem man sowohl den den Anteil mit niedrigerem Molekulargewicht ( ( 15 000) als au<h des Anteil mit höherem Molekulargewicht ( > 150 000) soweit als möglich zusätzlich dazu vermindert, daß man das Mol1lkulargewicht auf einen Wert von 30 000 bis 90 000 gebracht hat, wie in der JP-Patentanmeldung Serien-Nr. 63 976/79 yorgeschlagen wurde.Accordingly, the pullulag should be used for a plasma from <leaning agent is usable, have a limited molecular weight distribution, the i / Mn value does not exceed 1.5 obtained by adding both the portion with a lower molecular weight ((15,000) than the proportion with a higher Molecular weight (> 150,000) reduced as far as possible in addition, that the molecular weight has been brought to a value of 30,000 to 90,000, as in JP patent application serial no. 63 976/79 was proposed.
Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Herstellung einer Pullulanzubereitung mit einer begrenzten Molekulargewichtsverteilung, das die partielle Hydrolyse eines eingesetzten Pullulans, das Fraktionieren des erhaltenen partiellen Pullulanhydrolysates und das Sammeln der Eraktion mit einem Mw/Mn-Wert von nicht mehr als 1,5 umfaßt.The invention thus relates to a method for producing a pullulan preparation with a limited molecular weight distribution that allows partial hydrolysis of a used pullulan, the fractionation of the partial pullulan hydrolyzate obtained and collecting the fraction having an Mw / Mn of not more than 1.5.
Erfindungsgemäß kann man eine beliebige Pullulanzubereitung mit einer begrenzten Molekulargewichtsverteilung und einem gewünschten Molekulargewicht in höherer Ausbeute er;ielen und vorteilhaft für Plasmaausdehnungsmittel und Hyperkinesemittel wie auch für zuverXässige PullulanzubereitMngen verwenden.According to the invention you can any pullulan preparation with a limited molecular weight distribution and a desired molecular weight in Higher yield is expected and beneficial for plasma dilatants and hyperkinesis agents as well as for reliable pullulan preparations.
Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.The invention is explained in more detail below by means of examples.
Beispiel 1: Eine 10 %-ige (Gewicht/Volumen) wässerige Pullulanlösung, die man durch Auflösen von 200 g Pullulan als Ausgangsstoff mit einem Rw/Mn-Wert von 2,3 (Mw = 300 000) in Wasser hergestellt hatte, säuerte man auf einen pH-Wert von etwa 2 mit Salzsäure an, inkubierte bei 80 °C 2 h lang, bewirkte eine partielle Hydrolyse und neutralisierte danach lrit Natriumhydroxid.Example 1: A 10% (weight / volume) aqueous pullulan solution, which can be obtained by dissolving 200 g pullulan as a starting material with an Rw / Mn value of 2.3 (Mw = 300,000) in water, acidified to pH from about 2 with hydrochloric acid, incubated at 80 ° C for 2 h, caused a partial Hydrolysis and then neutralized sodium hydroxide.
Danach kühlte man die Lösung des partiellen Pullulanhydrolysates auf 30 oC ab, gab Methanol zu und erhielt eine Konzentration von 40 Volumen-%, während man die Temperatur aufrecht erhielt. Nach dem Entfernen der erhaltenen unteren Schicht, gab man zu der zurückbleibenden oberen Schicht Methanol zu, erzielte eine Konzentration von 55 Volumen-%, lieB danach die Mischung stehen und sammelte danach die erneut gebildete untere Schicht.The solution of the partial pullulan hydrolyzate was then cooled 30 oC from, added methanol and obtained a concentration of 40% by volume, while the temperature was maintained. After removing the obtained lower layer, when methanol was added to the remaining upper layer, concentration was achieved of 55% by volume, then left the mixture to stand and then collected the again formed lower layer.
Danach entfernte man das Methanol aus der unteren Schicht durch Destillation und reinigte die zurückbleibende wässerige Pullulanlösung durch Entfärben mit Aktivkohle, Entionisieren mit Ionenaustauschern der H- und OH-Form und Membranfiltration. Das erhaltene produkt engte man ein, trocknete es, pulverisierte es und erhielt etwa 90 g weißes Pullulanpulver mit einem Xw/n-Wert von 1,4 (w ~ 50 000).Thereafter, the methanol was removed from the lower layer by distillation and cleaned the remaining aqueous pullulan solution by decolorizing with activated charcoal, Deionization with ion exchangers of the H and OH form and membrane filtration. That obtained product was concentrated, dried, pulverized and obtained about 90 g white pullulan powder with an Xw / n value of 1.4 (w ~ 50,000).
Beispiel 2: Eine 20 %-ige (Gewicht/Voluen) wässerige Pullulanlösung, die man durch Auflösen von 200 g Pullulan als Ausgrngsstoff mit einem Rw/gn-Wert von 2,6 (Mw = 80 000) in Wasser.Example 2: A 20% (weight / volume) aqueous pullulan solution, which can be obtained by dissolving 200 g pullulan as a starting material with an Rw / gn value of 2.6 (Mw = 80,000) in water.
hergestellt hatte, säuerte man awf einen pH-Wert voii etwa 2 mit Schwefelsäure an, unterwart sie danach der partiellen Hydrolyse bei 80 °C 2 h lang und neutralisierte danach die erhaltene Lösung des partiellen Pullulanhydrolysateq mit Natriumhydroxid.had prepared, one acidified awf a pH value of about 2 with sulfuric acid on, then subject to partial hydrolysis at 80 ° C for 2 hours and neutralized then the resulting solution of the partial Pullulanhydrolysateq with Sodium hydroxide.
Danach gab man zu der Lösung Äthanol, erzielte eine Konzentration von 50 Volumen-% während man bei 40 °C hielt, entfernte die erhaltene untere Schicht, gab zu der Surückbleibenden oberen Schicht Äthanol zu, erzielte eine Kon2entration von 70 Volumen-% und sammelte danach die erneut gebildete untere Schicht.Ethanol was then added to the solution and a concentration was achieved of 50% by volume while maintaining at 40 ° C, removed the lower layer obtained, added ethanol to the remaining upper layer, achieved a concentration of 70% by volume and thereafter collected the re-formed lower layer.
Die untere Schicht reinigte man wie in Beispiel 1 und erhielt etwa 70 g weißes Pullulanpulver mit einem Rw/n-Wert von 1,3 ( - 30 000).The lower layer was cleaned as in Example 1 and obtained about 70 g white pullulan powder with an Rw / n value of 1.3 (- 30,000).
Beispiel 3: Eine 5 %-ige (Gewicht/Volumen) wässerige Pullulanlösung, die man durch Auflösen von 200 g pullulan als Ausgangsstoff mit einem Mw/Mn-Wert von 2,3 (2w F 200 000) in Wasser erhalten hatte, hydrolysierte man partiell wie in Beispiel 1 und neutralisierte danach.Example 3: A 5% (weight / volume) aqueous pullulan solution, which can be obtained by dissolving 200 g pullulan as a starting material with an Mw / Mn value of 2.3 (2w F 200,000) in water was partially hydrolyzed as in Example 1 and then neutralized.
Zu der Lösung des partiellen Pullulanhydrolysates gab man Aceton bis zu einer Konzentration von 20 Volumen-%, entfernte die erhaltene untere Schicht, gab zu der zurückbleibenden oberen Schicht Aceton und erhielt eine Konzentration von 45 Volumen-ffi.Acetone was added to the solution of the partial pullulan hydrolyzate at a concentration of 20% by volume, removed the obtained lower layer, added acetone to the remaining upper layer and obtained a concentration of 45 volume ffi.
Die erneut gebildete untere Schicht sammelte man, reinigte sie wie in Beispiel 1 und erhielt etwa 80 g weißes Pullulanpulver mit einem Mw/Mn-Wert von 1,5 (w = 85 000).The re-formed lower layer was collected, cleaned like in Example 1 and obtained about 80 g of white pullulan powder with an Mw / Mn value of 1.5 (w = 85,000).
Beispiel 4: Zu einer 10 %-igen (Gewicht/Volumen) wässerigen Pullulanlösung, die man durch Auflösen von 200 g Pullulan als Ausgangsstoff mit einem Mw/Rn-Wert von 2,3 (Mw, = 300 000) in Wasser hergestellt hatte, gab man eine Cyclodextringlucanotranferase (EC 2.4.1.19), wie in der JP-AS 27 791/78 beschrieben ist, in einer Menge von 150 dextrinogenen Einheiten/ g Pullulan und unterwarf die Mischung einer enzymatischen Hydrolyse bei 65 0c und einem pH-Wert von 6,0 20 h lang.Example 4: To a 10% (weight / volume) aqueous pullulan solution, which is obtained by dissolving 200 g of pullulan as a starting material with an Mw / Rn value of 2.3 (Mw, = 300,000) in water, a cyclodextrin glucanotransferase was added (EC 2.4.1.19), as described in JP-AS 27 791/78, in an amount of 150 dextrinogens Units / g pullulan and subjected the mixture to enzymatic hydrolysis 65 0c and a pH of 6.0 for 20 hours.
Nach der Hydrolyse unterbrach man die enzymatische Reaktion, indem man bei 90 0C 15 min lang erwärmte.After the hydrolysis, the enzymatic reaction was interrupted by it was heated at 90 ° C. for 15 minutes.
Die erhaltene Lösung des partiellen Pullulanhydrolyeates fraktionierte man mit Methanol, reinigte die gewünschte Fraktion, engte sie ein und pulverisierte sie wie ir Beispiel 1 und erhielt etwa 10!i g weißes Pullulanpulver mit den gleichen Rw/n- und Mw-Wertes. wie in Beispiel 1.The resulting solution of the partial pullulan hydrolyte fractionated the desired fraction was purified with methanol, concentrated and pulverized they as in Example 1 and obtained about 10 g of white pullulan powder with the same Rw / n and Mw values. as in example 1.
Beispiel 5: Zu einer 20 -igen (Gewicht/Volumen) wässerigen Pul.ulanlösung, die man durch Auflösen von 200 g Pullulan a3.s Ausgangsstoff mit einem Rw/Mn-Wert von 2,6 (Mw = 80 000) in Wasser hergestellt hatte, gab man eine handelsübliche Pullulanase (EC 3.2.1.41), ein Produkt von Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japan, in einer Menge von 4 Einheiten/g Pullulan und unterwarf die Mischung einer enzymatischen Hydrolyse bei einem pH-Wert von 6,0 und 50 0C 30 h lang. Nach der Unterbrechung der enzymatischen Reaktion durch Erwärmen fraktionierte man die Lösung des partiellen Pullulanhydrolysates mit Äthanol, reinigte die gewünschte Fraktion, engte sie ein und pulverisierte sie wie in Beispiel 2 und erhielt etwa 80 g weißes Pullulanpulver mit einem Mw/Mn-Wert von 1,1 (Mw = 20 000).Example 5: To a 20% (weight / volume) aqueous Pul.ulan solution, which can be obtained by dissolving 200 g pullulan a3.s starting material with an Rw / Mn value of 2.6 (Mw = 80,000) in water, a commercially available pullulanase was added (EC 3.2.1.41), a product of Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japan, in an amount of 4 units / g pullulan and subjected the mixture to one enzymatic hydrolysis at a pH of 6.0 and 50 ° C. for 30 hours. After Interrupting the enzymatic reaction by heating, the solution was fractionated of the partial pullulan hydrolyzate with ethanol, purified the desired fraction, constricted and pulverized it as in Example 2 to obtain about 80 g of white Pullulan powder with an Mw / Mn value of 1.1 (Mw = 20,000).
Beispiel 6: Zu einer 5 %-igen (Gewicht/Volumen) wässerigen Pulllllanlösung, die man durch Auflösen von 200 g Pullulan als Ausgangsstoff mit einem Mw/in-lKert lron 2,1 (Mw = 200 0;)0) in Wasser hergestellt hatte, gab man eine handelsübliclAe a-Amylase "Neoapitasew (Nagase and Compang, Ltd. Osaka, Japan) in einer Menge von 500 dexlçrinogenen Einheiten/g Pullulan zu, inkubierte die Mischung bei einem pH-Wert von (i,4 und 55°C 24 h lang und bewirkte eine enzymatische Hydrolyse.Example 6: To a 5% (weight / volume) aqueous Pulllllan solution, which can be obtained by dissolving 200 g of pullulan as a starting material with an Mw / in-lKert Iron 2.1 (Mw = 200 0;) 0) in water was given a commercial standard α-amylase "Neoapitasew (Nagase and Compang, Ltd. Osaka, Japan) in at an amount of 500 dexlçrinogenic units / g pullulan, the mixture was incubated at pH (1.4 and 55 ° C for 24 hours and caused enzymatic hydrolysis.
Nach der Unterbrechung der Hydrolyse durch Erwärmt fraktionierte man die erhaltene Lösung des partiellen ellulanhydrolysates mit Aceton, rginigte die gewünschte Fraktion, engte sie ein und pulverisierte sie wie in Beispie} 3 und erhielt etwa 110 g weißes Vullulanpulver mit den zeichen Mw/Mn- und Mw-Werten wie in Beispiel 3.After the hydrolysis was interrupted by heating, fractionation was carried out the resulting solution of the partial ellulanhydrolyzate with acetone, the desired fraction, it was concentrated and pulverized as in Example 3 and obtained about 110 g of white Vullulan powder with the symbols Mw / Mn and Mw values as in the example 3.
Beispiel 7: Zu einer 10 %-igen (Gewicht/Volumen) wässerigen Pullulanlösung, die man durch Auflösen von 200 g Pullulan als Ausgangsstoff mit einem Mw/Mn-Wert von 2,3 (Mw = 200 000) in Wasser hergestellt hatte, gab man eine handelsübliche Isoamylase (EC 3.2.1.68), ein Produkt von Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japan, in einer Menge von 200 dextrinogenen Einheiten/ g Pullulan zu, inkubierte die Mischung bei einem pH-Wert von 4,3 und 50 °C 20 h lang und bewirkte eine enzymatische partielle Hydrolyse.Example 7: To a 10% (weight / volume) aqueous pullulan solution, which is obtained by dissolving 200 g of pullulan as a starting material with an Mw / Mn value of 2.3 (Mw = 200,000) in water, a commercial one was given Isoamylase (EC 3.2.1.68), a product of Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japan, at the rate of 200 dextrinogenic units / g pullulan too the mixture at pH 4.3 and 50 ° C for 20 hours and caused an enzymatic partial hydrolysis.
Nach der Unterbrechung der Hydrolyse durch Erwärmen fraktionierte man die erhaltene Lösung des partiellen Pullulanhydrolysates mit Methanol, reinigte die gewünschte Fraktion, engte sie ein und pulverisierte sie wie in Beispiel 1 und erhielt etwa 90 g weißes Pullulanpulver mit einem Rw/Mn-Wert von 1,2 (Mw = 40 000).After interrupting the hydrolysis by heating fractionated the resulting solution of the partial pullulan hydrolyzate was purified with methanol the desired fraction, concentrated and pulverized as in Example 1 and received about 90 g of white pullulan powder with an Rw / Mn value of 1.2 (Mw = 40,000).
Beispiel 8: Eine 10 -ige (Gewicht/Volumen) wässerige PullulanXösung, die man durch Auflösen von 200 g Pullulan als Ausgangsstoff mit einem Mw/Mn-Wert von 2,1 (Mw = 580 000) in einer NaCl-Lösung von 0,05 Mol/l hergestellt hatte, behandelte man mit einer Ultraschallvorrichtung "Branson Ultrasonic Cleaner Model 12", von Yamato Scientifio Co., Ltd., Tokyo, Japan, 30 min lang bei 45 kHz und liner Ausgangeleistung von 50 W und bewirkte die partielle Hydrolyse des Ausgangsstoffs Pullulan.Example 8: A 10% (weight / volume) aqueous pullulan solution, which is obtained by dissolving 200 g of pullulan as a starting material with an Mw / Mn value of 2.1 (Mw = 580,000) in an NaCl solution of 0.05 mol / l one with an ultrasonic device "Branson Ultrasonic Cleaner Model 12" from Yamato Scientifio Co., Ltd., Tokyo, Japan, For 30 min at 45 kHz and liner output power of 50 W and caused the partial hydrolysis of the starting material Pullulan.
Die erhaltene Lösung des partiellen Pullulanhydrolysates fraktionierte man mit Methanol, rsinigte die gewünsoiite Fraktion, engte sie ein und pulverisierte sie wie in Beispiel 1 und erhielt etwa 70 g weißes Pullulanpulver mit den gleichen Rw/n- und Rw-Werten wie in Beispiel 1.The resulting solution of the partial pullulan hydrolyzate fractionated the desired fraction was washed with methanol, concentrated and pulverized they as in Example 1 and obtained about 70 g of white pullulan powder with the same Rw / n and Rw values as in example 1.
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