DE3035118A1

DE3035118A1 - Verfahren zur kultivierung von schwimmenden tierzellen, zellkultureinheit fuer schwimmende tierzellen und zellkultivierungsvorrichtung

Info

Publication number: DE3035118A1
Application number: DE19803035118
Authority: DE
Inventors: Fusakazu Chigasaki Kanagawa Hayano; Koichi Fuji Shizuoka Yoshida
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd; Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1979-09-18
Filing date: 1980-09-17
Publication date: 1981-03-19
Also published as: FR2476124A1; US4391912A; GB2062006A; DE3035118C2; GB2062006B; FR2476124B1; JPS5642584A

Description

Anmelder: Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha, Osaka, Japan

Verfahren zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen, Zellkultureinheit für schwimmende Tierzellen und Zeilkultivier ungs vorrichtung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen bzw. schwimmenden tierischen Zellen in einer Zellkultureinheit, die Hohlfasern enthält. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen in einer Zellkultureinheit, die aus einem Gehäuse und Hohlfasern mit offenen Enden besteht, welche in dem Gehäuse eingeschlossen sind, wobei man ein Kulturmedium durch die Hohlfasern einführt und die schwimmenden Tierzellen in dem Raum zwischen dem Gehäuse und den Hohlfasern kultiviert. Die Erfindung betrifft ferner eine ZeIlkultureinheit für schwimmende -Tierzellen, die man bei dem Verfahren verwendet.

Es sind verschiedene Methoden zur Kultivierung von Tierzellen bekannt. Tierzellen umfassen solche, die wachsen und sich vermehren, während sie an eine Wachstumsoberfläche gebunden sind (sie werden als "haftende Zellen" bezeichnet), und solche, die in einem schwimmenden Zustand wachsen und sich vermehren (sie werden als "schwimmende Zellen" bezeichnet). Es

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wurden beträchtliche Portschritte bei der Kultivierung von haftenden Zellen gemacht.

Derartige haftende Zellen können im allgemeinen nur in einer einzigen Schicht auf der Oberfläche wachsen und sich vermehren, auf der sie haften. Richard A. Knazek et al. erzielten jedoch ein dreidimensionales Wachstum und eine dreidimensionale Vermehrung von haftenden Zellen durch eine Methode, bei der man die haftenden Zellen auf der äußeren Oberfläche von semipermeablen Hohlfasern oder Kapillaren wachsen läßt und ein Kulturmedium durch die Hohlfasern oder Kapillaren durchleitet (Journal of Medicine, Bd. 296, Nr. 3, Seiten 154 159 (1977)). Ferner ist in der US-PS 3 997 396 eine Methode zur Erzielung von dreidimensionalem Wachstum und dreidimensionaler Vermehrung haftender Zellen beschrieben, bei der man die haftenden Zellen auf einer Oberfläche einer Hohlfasermembran wachsen läßt und Sauerstoff der anderen Oberfläche zuführt.

Schwimmende Zellen sind im Vergleich zu haftenden Zellen im allgemeinen schwach bzw. anfällig ( siehe Jingansaibo no Baiyo, Asakura Shoten, Tokyo, S. 4-4 (1975) (Shoichi Oboshi et al.))· Es wurde daher als schwierig angesehen, die schwimmenden Zellen in der gewünscht hohen Dichte wachsen und sich vermehren zu lassen.

Diese Annahmen führten zu dem Schluß, daß alle genannten Methoden unter Verwendung von Hohlfasern auf die Kultivierung der haftenden Zellen beschränkt sind.

Methoden, die man im allgemeinen bei der Kultivierung von schwimmenden Zellen anwendet, sind beispielsweise eine stationäre Methode der schwimmenden Kultur bzw. eine stationäre Schwimmkulturmethode und eine Suspensionskulturmethode unter Anwendung von beispielsweise Schütteln oder rotierendem Rühren. Diese Methoden weisen jedoch die nachstehenden Nachteile

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auf: (1) Man benötigt eine riesige Vorrichtung, weil es schwierig ist, die Zellen in hoher Dichte wachsen und sich vermehren zu lassen; (2) es ergeben sich Schwierigkeiten beim Abtrennen der Zellen von beispielsweise den Nährstoffen, metabolischen Produkten und Abfällen; (3) es ist schwierig, das Kulturmedium kontinuierlich auszutauschen; und (4) die Möglichkeit der Verunreinigung durch andere Mikroorganismen ist groß. Es war daher höchst wünschenswert, diese Nachteile insbesondere deswegen zu überwinden, weil die schwimmenden Zellen metabolische Produkte erzeugen, die vom medizinischen und tiermedizinischen Standpunkt aus wichtig sind, z.B. zur Diagnose und medizinischen Behandlung verschiedener Krankheiten.

Es wurden bemerkenswerte Portschritte bei dem Wachstum und der Vermehrung von haftenden Tierzellen erzielt, und es ist bereits möglich, die haftenden Tierzellen dreidimensional wachsen und sich vermehren zu lassen, d.h. wie ein Gewebe, indem man Hohlfasern verwendet. Andererseits wurde die Kultivierung der schwimmenden Zellen bisher auf die beschriebene übliche Weise durchgeführt. Bei diesen Methoden ist es schwierig, die schwimmenden Zellen in hoher Dichte wachsen und sich vermehren zu lassen. Dadurch ergeben sich verschiedene Probleme bei der Herstellung von brauchbaren metabolischen Produkten aus den schwimmenden Zellen durch ihre Kultivierung in großen Mengen.

Es ist Aufgabe der Erfindung ein Kultivierungsverfahren vorzusehen, das das Wachstum und die Vermehrung von schwimmenden Tierzellen sowohl in hoher Dichte als auch kontinuierlich ermöglicht. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, eine Zellkultureinheit vorzusehen, die man zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen wirksam verwenden kann.

ErfindungBgemäß wurde folgendes festgestellt: Wenn man schwimmende Tierzellen in einer Zellkultureinheit, welche ein Ge-

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häuse und Hohlfasern mit offenem Ende umfaßt, die in dem Gehäuse eingeschlossen sind, in dem Raum zwischen dem Gehäuse und den Hohlfasern kultiviert, indem man ein Kulturmedium durch das Innere der Hohlfasern leitet, wachsen die schwimmenden Zellen und vermehren sich in hoher Dichte. Während es im allgemeinen wünschenswert ist, daß der Porendurchmesser der Hohlfasern im Bereich von etwa 2 bis 10 nm (20 bis 10 A) liegt, wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß bei einem Porendurchmesser der Hohlfasern im Bereich von 10¹bis 5 x 10⁵ nm (10² bis 5 x 10⁴" 1) die schwimmenden Zellen in sogar noch höherer Dichte wachsen und sich vermehren.

Vermutlich ist die Ursache dafür die Tatsache, daß unter den erfindungsgemäßen Bedingungen der Austausch der Nährstoffe im Kulturmedium gegen die Stoffwechselprodukte und Abfälle in den Zellen sehr glatt verläuft, wodurch man eine Umgebung erzielt, die für das Wachstum und die Vermehrung der Zellen vorteilhaft ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann man allgemein auf schwimmende Tierzellen anwenden, und man erzielt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gute Ergebnisse bei der Vermehrung von schwimmenden Zellen, die man durch Zellfusion mit anderen Zellen erhalten hat.

Nachstehend wird die Erfindung durch Figuren näher erläutert. Es zeigen:

- Figur 1 eine perspektivische Ansicht einer Zellkultureinheit, die man bei der Ausführung der Erfindung verwenden kann;

- Figur 2 einen Querschnitt, der entlang der Linie A-A von

Figur 1 verläuft;

- Figur 3 einen Querschnitt, der entlang der Linie C-C von

Figur 1 verläuft;

- Figur 4 einen Querschnitt, der entlang der Linie B-B von

Figur 1 verläuft;

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- Figur 5 eine perspektivische Ansicht einer anderen Ausführungsform der Zellkultureinheit, die man bei der Durchführung der Erfindung verwenden kann;

- Figur 6 einen Querschnitt, der entlang der Linie D-D von

Figur 5 verläuft;

- Figur 7 ein Schema, das eine Zellkultivierungsvorrichtung

unter Verwendung von erfindungsgemäßen Zellkultur— einholten darstellt; und

- Figur 8 ein Diagramm, das die Differenz in der Zelldichte

bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenüber einer Methode des Standes der Technik zeigt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung schwimmender Tierzellen, wobei man eine Zellkultureinhelt verwendet, die ein Gehäuse und Hohlfasern mit offenem Ende und einem Porendurchmesser von 2 bis 1Cr nm (20 bis 10 1) umfaßt, die im Gehäuse eingeschlossen sind, und wobei jeweils beide Endender genannten Hohlfasern zur Außenseite des Gehäuses off en sind bzw. durch die Gehäuse wandung (gegebenenfalls mit Hilfe von Zu- und Ableitungen) geführt sind, und wobei man ein Kulturmedium durch das Innere der Hohlfasern fließen läßt und die schwimmenden Tierzellen im Eaum zwischen dem Gehäuse und den Hohlfasern wachsen läßt.

Zunächst werden die Zellkultureinheiten und die Vorrichtung näher erläutert, die man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwenden kann.

Der Aufbau der Zellkultureinheit ist nicht speziell begrenzt, sofern die Hohlfasern einen Porendurchmesser von 2 bis 10 nm (20 bis ^0■^} 1) aufweisen, in dem Gehäuse eingeschlossen sind und die beiden Enden der Hohlfasern zur Außenseite des Gehäuses offen sind.

Geeignete Beispiele sind nachstehend anhand der Figuren erläutert.

Die Figuren 1 bis 4 zeigen eine Ausführungsform einer Zellkultureinheit gemäß der Erfindung, bei der eine Mehrzahl von

Hohlfasern 1 in einem Gehäuse 2 eingeschlossen sind, das man durch Verbindung zweier Flachmaterialien bzw. Platten in Taschenform erhalten hat. Die Hohlfasern 1 werden auf jeder Seite durch Befestigungsschichten 3 und 3' an Ort und Stelle gehalten; und das Innere der Hohlfasern 1 ist nach außen offen. Die Rohre 4 und 4', die mit dem Inneren der Hohlfasern 1 in Verbindung stehen, sind zur Außenseite des Gehäuses offen bzw. durch die Gehäusewandung (Seitenwände 6 und 6¹ des Gehäuses in den Figuren 1 bis 3 und 5 bis 6) geführt. Man kann ein Kulturmedium durch die Rohre 4 und 4¹ einführen und abziehen. Ferner sind die Rohre 5 und 5¹ vorgesehen, die mit dem Raum in Verbindung stehen, der zwischen den Hohlfasern und dem Gehäuse 2 vorgesehen ist, und die zur Außenseite des Gehäuses offen sind. Durch diese Rohre 5 und 5" kann man die schwimmenden Zellen einführen und abziehen. Die Seitenwände

6 und 6¹ verschließen beide Enden des Gehäuses 2 und halten gleichzeitig die Rohre 4 und 4' an Ort und Stelle. Die Wände

7 und 7¹ halten die Rohre 5 und 5' an Ort und Stelle und dichten die Rohre 5 und 5¹ gegen die Platten ab.

Die Figuren 5 und 6 zeigen eine weiter® Ausfuhrungsform, bei der man ein Gehäuse bildet, indem man die Verbindungsglieder 2b und 2b' vorsieht, die die Rohre 4 und 4^ssn beiden Enden einer Röhre 2a aufweisen, die eine Mehrzahl von Hohlfasern 1 faßt. Diese Hohlfasern 1 werden an jedem Ende durch Befestigungsschichten 3 und 3' auf oben beschriebene Weise an Ort und Stelle gehalten, und die Rohre 5 und 5% durch die man die schwimmenden Zellen einführt und abzieht, sind an den Seitenwänden der Röhre 2a vorgesehen« Man kann ein weites Rohr als Röhre 2a verwenden. Der innere Durchmesser der Röhre ist nicht begrenzt, beträgt im allgemeinen jedoch etwa 5 mm bis etwa 10 cm.

Wenn man bei den genannten Ausführungsfortsen das Gehäuse aus einem weichen Material herstellt, muß man die Rohre 5 und 5' nicht vorsehen, weil man die schwimmenden Zellen unter Verwendung einer Spritze einführen und abziehen kann.

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Die beschriebenen Zellkultureinheiten kann man in einer Kultivierungsvorrichtung gemäß Eigur 7 vorsehen, wobei man beide offenen Enden der Hohlfasern in beispielsweise Zellkultureinheit 8 mittels einer Pumpe 10 mit einem Vorratsbehälter 11 für das Kulturmedium unter Verwendung eines Rohres 9 verbindet, das aus einem Material mit ausgezeichneter Gasdurchlässigkeit besteht. Die gesamte Vorrichtung oder die Vorrichtung mit Ausnahme der Pumpe 10 ordnet man in einem Kohlendioxidgas-Inkubator 12 an und führt die Kultivierung bei einer konstanten Temperatur durch.

Die Hohlfasern können aus einer beliebigen semipermeablen Substanz hergestellt sein, die keine schädlichen Einflüsse auf die schwimmenden Zellen ausübt.- Geeignete Beispiele für derartige Substanzen sind Polysulfon, Polyäthersulfon, PpIyacrylnitril, Celluloseacetat, Polycarbonat, Polymethylmethacrylat und Kupferoxidammoniak-Cellulose. Von diesen Substanzen bevorzugt man Polysulfon und Polyäthersulfon, weil sie das Wachstum und die Vermehrung schwimmender Zellen in hoher Dichte erlauben,und weil man sie dampfsterilisieren kann.

Um die Wachstumsgeschwindigkeit bzw. Wachstumsrate der schwimmenden Zellen zu steigern, ist es nötig, große Mengen an Nährstoffen und Sauerstoff rasch und kontinuierlich zuzuführen und Zellabfälle rasch und kontinuierlich zu entfernen. Um die rasche und kontinuierliche Zufuhr und Abfuhr zu erzielen, sollten die Porendurchmesser in den Wänden der Hohl— fasern mindestens 2 nm (20 A) betragen. Der Grund dafür ist vermutlich, daß man Riesenmoleküle, die für die Vermehrung der schwimmenden Zellen nötig sind, wie z.B. Proteine und Nucleinsäuren, von der Seite des Vorratsbehälters des Kulturmediums zuführen muß. Wenn jedoch der Durchmesser der Poren in den Wänden der Hohlfasern 10 nm (10^ A) überschreitet, gehen die schwimmenden Zellen durch die Poren durch,und man kann das erfindungsgemäße Verfahren nicht durchführen. Wenn der Durchmesser der Poren in den Wänden der Hohlfasern größer ist und die Durchdringungsgeschwindigkeit der Substanzen hö-

her ist, ist die Vermehrungsgesehwind igke it der schwimmenden Zellen jedoch nicht immer notwendigerweise größer»und der geeignete Porendurchmesser für eine maximale Vermehrung und Erhaltung variiert in Abhängigkeit vom Typ der schwimmenden Zellen. Im allgemeinen beträgt der optimale Porendurchmesser lO^bis 5 x 1O⁵ nm (10² bis 5 x 1O⁴ I)* Selbstverständlich können in diesem Pail Poren mit einem Durchmesser von weniger als 10 nm (10 A) und Poren mit einem Durchmesser von mehr als 5 x 10^ nm (5 x 10 1) auch vorhanden sein_s sofern ihr Durchmesser weniger als 10 nm (10-⁵ A) beträgt.

Die Hohlfasern, die man erfindungsgemäß verwendet, kann man leicht gemäß den US-PSen 3 871 950, 3 888 771 und 3 896 und den GB-PSen 1 506 785 und 1 565 113 herstellen.

Die Befestigungsschicht kann aus einem beliebigen Material hergestellt sein, das die schwimmenden Zellen nicht schädigt und durch eine Sterilisierungsstufe nicht beeinträchtigt wird. Insbesondere bevorzugt man einen Silikonpolymer-Klebstoff.

Verschiedene Materialien kann man zur Bildung des Gehäuses verwenden, sofern sie keine nachteiligen Einflüsse auf die schwimmenden Zellen ausüben. Beispiele für derartige Materialien sind Glas, Polycarbonat, Polystyrol, Silikonpolymere, Polysulfon, Polyäthylen und Polyurethan. Um ausreichende Mengen an Sauerstoff zur Vermehrung der Zellen zuzuführen, bevorzugt man jedoch Materialien mit einer ausgezeichneten Gasdurchlässigkeit, wie z.B. einen dünnen Silikonpolymerfilm oder ein dünnes Silikonpolymerrohr, einen dünnen Silikonpolymerfilm, der mit einem Polyesternetz verstärkt ist, einen dünnen Polybutadienfilm oder ein dünnes Polybutadienrohr, einen dünnen Silikon/Polycarbonat-Mischpolymerfilm oder ein dünnes Silikon/Polycarbonat-Mischpolymerrohr, einen porösen PoIytetrafluoräthylenfilm (Teflonfilm) oder einen porösen Polypropylenfilm. Die Dicke des Films oder Eohrs beträgt vorzugsweise 0,05 bis 3 mm.

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Als Material der Rohre zum Einführen und Abziehen des Kulturmediums und der schwimmenden Zellen kann man die gleichen Materialien verwenden, wie man für das Gehäuse verwendet.

D_as Rohr zur Verbindung der Zellkultureinheit mit dem Vorratsbehälter des Kulturmediums ist auch zweckmäßig aus einem Material mit ausgezeichneter Gasdurchlässigkeit hergestellt. Beispiele für derartige Materialien sind Silikonpolymer, Polybutadien und ein Silikon/Polycarbonat-Mischpolymeres. Während man das Kulturmedium durch das Rohr leitet, führt man Sauerstoff dem Kulturmedium durch das Rohr zu.

Die Zellen, die man mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kultivieren kann, sind keinen Begrenzungen unterworfen, sofern sie schwimmende Zellen sind. Beispiele für derartige schwimmende Zellen sind genauer in Soshiki Baiyo, Asakura Shoten, Tokyo, Seiten 265 bis 275 (1970),(Junnosuke Na kai et al.)und Jingansaibo no Baiyo, Asakura Shoten, Tokyo (1975),(Shoichi Oboshi et al. geschrieben. Typische Beispiele für schwimmende Zellen sind Lymphocytenzellen, Knochenmarktumorzellen, Lymphomzellen, Leukämiezellen, Brustkrebszellen, leberkrebszellen und Leukozytenzellen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders wirksam bei der Vermehrung von Knochenmarktumorzellen, Leukämiezellen und Lymphocytenzellen, und es ist ferner besonders wirksam bei der Vermehrung von schwimmenden Zellen, die man durch Zellfusion von Knochenmarktumorzellen und anderen Zellen erhalten hat, wie z.B. Milzzellen oder Lymphocytenzellen.

Den Arbeitsgang der Kultivierung gemäß der Erfindung kann man auf nachstehende Weise durchführen, obwohl er nicht darauf begrenzt ist.

Zuerst sterilisiert man die ZellkultureinheIt, die Rohre und den Vorratsbehälter für das Kulturmedium getrennt voneinander oder in dem Zustand, in dem sie miteinander verbunden sind. Für diese Sterilisation kann man beispielsweise eine Dampfsterilisation, Gassterilisation, Bestrahlungssterilisation oder

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Formalinsterilisation anwenden. Insbesondere bevorzugt man die Dampfsterilisation, weil der Arbeitsgang einfach ist und man keine Nachbehandlung nach der Sterilisation braucht. Da man Polysulfon und Polyäthersulfon dampfsterilisleren kann, kann man sie vorteilhaft als Material für die Hohlfasern verwenden. Im Pail beispielsweise der Gassterilisation oder Formalinsterilisation ist es nötig, beispielsweise das restliche Gas oder Formalin aus der Vorrichtung nach der Sterilisation vollständig auszuwaschen, indem man wiederholt Kulturmedium durch die Kultivierungsvorrichtung durchleitet.

Nach der Sterilisation kann man die schwimmenden Zellen in den Raum zwischen den Hohlfasern und dem Gehäuse unter Verwendung einer Spritze einimpfen. Als schwimmende Zellen verwendet man im allgemeinen Zellen, die in einem Kulturmedium suspendiert sind. Die Zelldichte der Suspension für die Einimpfung beträgt vorzugsweise 1Cr bis 5 x 10 Zellen/ml, obwohl sie je nach Typ der Zellen variieren kann.

Nach Beendigung des Einimpfens setzt aan di© gesamte Kultivierungsvorrichtung oder die Vorrichtung mit Ausnahme der Pumpe in den KohlendioxidgasInkubator, in den man ©in Gasgemisch von L_uft/CO₂ oder 0₂/C0₂ zuführt. Die C0₂-Konz©ntration beträgt vorzugsweise 5 bis 10 Gew.-%. Die Temperatur im Inkubator stellt man auf etwa 35 bis 58 ⁰C ein, und man hält das Innere des Inkubators ständig in einem ausreichend feuchten Zustand, so daß man verhindert, daß Wasser zu sehr aus dem durchtränkenden Medium bzw. Perfusat entfernt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeigt ©ine Anzahl von Vorteilen gegenüber den Methoden des Standes der Technik.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Vermehrungsgeschwindigkeit der schwimmenden Zellen groß, und man kann sie in höherer Dichte als bei der Suspensionsmethode wachsen lassen. Im allgemeinen sind die schwimmenden Zellen im Gegensatz zu den haftenden Zellen so schwach, daß es schwierig ist, sie

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in hoher Zelldichte zu kultivieren. Wenn die Zelldichte zunimmt, wird vermutlich die gegenseitige Beeinflussung zwischen den Zellen stark, und erschwert es ihnen, ihr Leben aufrecht zu erhalten. Demgemäß nimmt man an, daß das Kultivierungsverfahren gemäß der Erfindung die kontinuierliche und rasche Zufuhr von Nährstoffen und Sauerstoff und die kontinuierliche und rasche Entfernung von Zellabfällen durch die Hohlfasern erlaubt, wodurch man Bedingungen erzeugt, die genügend vorteilhaft für die Zellen sind, so daß sie die nachteiligen Wirkungen der gegenseitigen Beeinflussung zwischen den Zellen überwinden.

Daher erlaubt die Kultivierungsmethode gemäß der Erfindung eine Minimalisierung der Yorrichtungsgröße bei der Kultivierung großer Mengen von schwimmenden Zellen. Ferner kann man aufgrund der Semipermeabilität der Hohlfasern ein Kulturmedium mit einem Gehalt an einem metabolischen Produkt, das von den schwimmenden Zellen erzeugt wurde, in relativ hoher Beinheit leicht von den Zellen abtrennen; beispielsweise kann man ein Kulturmedium, das Antikörper oder alpha-Fetoprotein enthält, leicht von Knochenmarktumorzellen bzw. Leberkrebszellen abtrennen, wenn man die Zellkultureinheit der schwimmenden Tierzellen gemäß der Erfindung verwendet. Das metabolische Produkt kann man aus dem so erhaltenen Kulturmedium auf übliche Weise abtrennen. Beispielsweise kann man ein alpha-Petoprotein reinigen, indem man das Kulturmedium, das man von Leberkrebszellen abgetrennt hat, gegen eine Ammoniumsulfatfraktionierung aussalzt bzw. mit Ammoniumsulfat fraktioniert aussalzt, mit einer Pufferlösung dialysiert und mit einer Ionenaustauschchromatographie entwickelt. Insbesondere sind die Methoden zur Herstellung von spezifischen Antikörpern durch Zellfusion von Knochenmarktumorzellen und verschiedenen Zellen, die Antikörper erzeugen, in letzter Zeit fortgeschritten (she. European Journal of Immunology, Bd. 6, Seiten 511 - 519 (1976)). Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Kultivierung von Hybridzellen geeignet, die spezifische Antikörper erzeugen, und die man durch eine derartige Zellfusion erhalten hat, und es

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ermöglicht die Herstellung von verschiedenen hochreinen Antikörpern in großen Mengen. Demgemäß ist der medizinische und tiermedizinisehe Wert der Erfindung bedeutend.

Ferner ist es bei den Methoden des Standes der Technik nötig, die Zellen von dem Kulturmedium abzutrennen, um periodisch das Kulturmedium auszutauschen. Andererseits ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine derartige Abtrennung nicht nötig, und man kann das Kulturmedium kontinuierlich zuführen. Das ist ein großer Vorteil zur Erzielung einer praktischen Massenkultivierung.

Ferner ist bei der Methode der Suspensionskultivierung die Möglichkeit einer Verunreinigung mit Mikroorganismen bemerkenswert groß, wie z.B. mit Bakterien oder Schimmel, und man muß beträchtliche Aufmerksamkeit bei der Kultivierung über lange Zeiträume aufwenden. Andererseits können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, sobald die schwimmenden Zellen aseptisch eingeimpft sind, keine Mikroorganismen durch die Wände der Hohlfasern durchgehen und sich mit den schwimmenden Zellen vermischen. Daher kann man aseptische Bedingungen leicht über lange Zeiträume aufrecht erhalten. Sogar wenn das Kulturmedium durch Mikroorganismen verunreinigt werden sollte, werden die schwimmenden Zellen nicht durch die Mikroorganismen verunreinigt.

Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen, wie g<»B. Lymphocytenzellen, Knochenmarktumorzellen, KnochenmarHjumorzellen, die man durch Zellfusion mit anderen Zellen erhalten hat, Lymphomzellen, Leukämiezellen, Leukocytenzelleüj, Brustkrebszellen oder Leberkrebszellen, wobei man ein Kulturmedium in eine Zellkultureinheit einführt, die ein Gehäuse und eine Mehrzahl von Hohlfasern umfaßt, die in dem Gehäuse eingeschlossen sind, wobei die Hohlfasern an beiden Enden zur Außenseite des Gehäuses offen sind und einen Porendurchmesser von etwa 2 bis 1Cr nm

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(20 bis 1Cr X) aufweisen, und wobei man ein Kulturmedium durch das Innere der Hohlfasern durchleitet und die schwimmenden Tierzellen in dem Raum zwischen dem Gehäuse und den Hohlfasern kultiviert. Die Erfindung betrifft ferner eine Zellkultureinheit aiit schwimmenden Tierzellen, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert. Beispiel 1:

Sechs Arten von Polysulfonhohlfasern mit einem inneren Durohmesser von 250 jam, einem äußeren Durchmesser von 350 jum und einem Porendurchmesser von 1,8 nm, 3 nm, 5 nm, 10 nm, 20 nm bzw. 50 nm (18 A, 30 I₁ 50 i, 10² A, 2 χ 10² i, bzw. 5 x 10² 1) stellte man her, indem man ein aromatisches Polysulfon in einer gemischten Lösung von^N-Methylpyrrolidon (Lösungsmittel), Dimethylsulfoxid (nicht als Lösungsmittel), Wasser und Natriumnitrat löste und in Wasser (Koagulierungsflüssigkeit) durch eine Ringlochdüse (hollow-shaped nozzle)extrudierte. Danach führte man je 100 jeder der Polysulfonhohlfasern in eine Silikonpolymerröhre mit einem inneren Durchmesser von 1 cm, einem äußeren Durchmesser von 1,3 cm und einer Länge von 8 cm ein und verschloß beide Enden der Silikonröhre zusammen mit dem Bündel der Hohlfasern unter Verwendung eines Silikonpolymer-Klebstoffs. Nachdem der Silikonpolymer-Klebstoff gehärtet war, schnitt man die Silikonröhren an ihren Enden ab und stellte dadurch Zellkultureinheiten mit einer Silikon-Befestigungsschicht und Hohlfasern mit offenen Enden her. Danach verband man Silikonpolymerrohre, von 50 cm Länge (innerer Durchmesser 3 mm, äußerer Durchmesser 5 mm) mit beiden Enden der wie beschrieben hergestellten Zellkultureinheiten unter Verwendung von Verbindungsgliedern. Diese Silikonpolymerrohre verband man mittels einer Pumpe mit einem 200-ml-Vorratsbehälter des Kulturmediums, der aus Silikonpolymer hergestellt war, und stellte dadurch eine Zeilkultivierungsvorrichtung her.

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Nach der Dampfster11isation der wie oben hergestellten ZeIlkultivierungsvorrichtung führte man 100 ml eines Kulturmediums (bestehend aus 80 fa von mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Kulturmedium und 20 % Pferdeserum) in den Vorratsbehälter für das Kulturmedium ein und ließ es durch das Innere der Hohlfasern mit Hilfe der Pumpe zirkulieren. Die Gesamtmenge einer Lösung, die man durch Suspendieren von 1,08 χ 10 Knochenmarktumorzellen von Mäusen (MPC-11) in 1 ml des gleichen Kulturmediums wie oben hergestellt hatte, impfte man mit einer Spritze in den Raum zwischen den Hohlfasern und dem Gehäuse.

Die Vorrichtung mit Ausnahme der Pumpe setzte man in eine Isotherme Kammer, die man bei 38 ⁰C hielt, und führte etwa 200 bis 300 ml/min (pro 0,03 m Kammerflache ) eines Gasgemisches, das aus 95 $> luft und 5 i° CO₂ bestand, in die isotherme Kammer ein. Man entnahm Proben über einen Zeitraum und bestimmte die Anzahl der vermehrten Zellen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. In diesem Fall tauschte man am 7. und am 15. Tag das Kulturmedium aus.

Tabelle 1

Porendurchmesser Anzahl der eingeder Hohlfasern impften Zellen (A = 0,1 nm)

9. Tag

18. Tag

18 (Vergleich)

50 10²

2 χ 10' 5 x 10'

1,08 χ 10'

1,20 χ 10'

1,35 χ ΙΟ'

3,00 χ 10_ 4,20 χ ίο] 5,00 χ 10^ 5,70 χ 10'

1,20 x 10⁽

0,81 χ 10

1,23 χ 10 1,75 x 10 1,90 x 10 2,10 x 10

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Beispiel 2:

- AtT

Man verwendete drei Arten von Celluloseacetathohlfasem mit einem inneren Durchmesser von 250 um, einem äußeren Durchmes-

2 ser von 350 pm und Porendurchmessern von 10 nm, 2 χ 10 nm

bzw. 5 x 10⁵ nm (10² 1, 2 χ 10⁵ 1, 5 x 10* 1). Jeweils 30 der genannten Hohlfasern führte man in drei Silikonpolymerröhren ein, die jeweils einen inneren Durchmesser von 1 cm, einen äußeren Durchmesser von 1,3 cm und eine Länge von 8 cm aufwiesen, und man stellte eine Zelllcultivierungsvorrichtung auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 her.

Nur die Zellkultureinheit sterilisierte man mit Äthylenoxid— gas 5 h lang,und die anderen Teile dampfsterilisierte man. Nach der Sterilisation ließ man 100 ml des gleichen Kulturmediums wie in Beispiel 1 durch die Vorrichtung zirkulieren und tauschte es gegen frisches Kulturmedium einmal am Tag aus. Diesen Arbeitsgang wiederholte man 3 ü lang und entfernte das restliche Äthylenoxid.

Danach impfte man Knochenmarktumorzellen von Mäusen (MPC-11) auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 ein und ließ sie wachsen. Man entnahm Proben über einen Zeitraum und zählte die Anzahl der vermehrten Zellen mit einem Mikroskop. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Porendurchmesser Anzahl der der Hohlfasern eingeimpften (A = 0,1 nm) Zellen

9. Tag

18. Tag

10*

2 χ 10' 5 χ 10^

1.00 χ 10*

3,50 χ 10⁷ 1,50 χ 10⁸ 4,75 χ 10⁷ 2,00 χ 10⁸ 3,00 χ 10⁷ 1,40 χ 10⁸

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(Am 7. und am 15. Tag tauschte man das Kulturmedium aus.)

Zum Vergleich ließ man die gleichen Zellen wie oben in dem gleichen Kulturmedium wie oben mit einer Suspensionamethode wachsen. Als Suspensiousmethode wandte man die Anzapfmethode im 100 ml-Maßstab (100 ml scale tapping method) an. Die Ergebnisse sind in Figur 8 gezeigt, wobei A die Kultivierungsergebnisse unter Verwendung der Kultureinheit aus den Hohlfasern mit einem Porendurchmesser von 2 χ 10 nm (2 χ 10 A) anzeigt und B die Ergebnisse unter Anwendung der Suspensionsmethode anzeigt. Der Pfeil f· in Figur 8 zeigt an, daß man das Kulturmedium ausgetauscht hatte.

Beispiel 3:

Unter Verwendung von 30 Oelluloseacetathohlfasern mit einem inneren Durchmesser von 250 um, einem äußeren Durchmesser von 350 jum und einem Porendurchmesser von 2 χ 10 nm (2 χ 10^ A) stellte man eine Zellkultivierungsvorrichtung auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 her.

Gemäß der Methode, die im European Journal of Immunology, Bd. 6, Seiten 511 bis 519 (1976) (Millstein et al.) beschrieben ist, erhielt man Erythrocytenantikörper von Schafen durch Zellfusion von Knochenmarktumorzellen von Mäusen (MPC-11) und Milzzellen von Mäusen, die man mit Schafserythrocyten immunisiert hatte.

10 dieser Zellen suspendierte man in 1 ml des Kulturmediums, impfte es in die genannte Zellkultureinheit ein und ließ es darin unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 wachsen.

Zum Vergleich kultivierte man die Zellen mit der gleichen Suspensionsmethode wie in Beispiel 2.

Die Veränderung in der Zellanzahl im Laufe der Zeit unter-

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suchte man,und die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Kultivierungs- Anzahl der 9. Tag 18. Tag methode eingeimpften

Zellen

Zellkultureinheit r _n ο

mit Hohlfasern ■ 10° 4,50 χ 10' 2,2 χ 10° Suspensionsmethode

(10 ml) (Anzapf- _{Λ 7}

methode) 10°/<al 2,10 χ 10'/ml _{8 0 χ 10} ⁷/mi

Beispiel 4:

Unter Verwendung verschiedener Hohlfasern stellte man ZeIlkultivierungsvorrichtungen auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 her. Man impfte Burkitt-Lymphomzellen von menschlichen Leukämiezellen und Knochenmarktumorzellen von Mäusen in die Zellkult ivierungs vorrichtung auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 und ließ sie wachsen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Beispiel 5:

Periphere Lymphocyten, die man vom Menschen genommen hatte (she. Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Seiten 17 bis 18 (leslie Hudson und Frank C. Hay)) suspendierte man in einem Kulturmedium RPMI 1640 (mit einem Gehalt an 20 $ Embryoserum von Kühen), so daß man eine Zelldichte von 10/ml bzw. 5 χ 10/ml erzielte. Auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 impfte man sie in die gleiche Zellkultivierungsvorrichtung wie in Beispiel 2 ein. Nach einer Woche entnahm man die Zellen aus der Vorrichtung und maß die Aktivität der Lymphocyten mit dem Pigmentausschlußtest (pigment excluding test) s.o. Seiten 30 bis 32) unter Verwendung von Trypanblau und verglich sie mit der vor dem Einimpfen. Zur gleichen Zeit

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Tabelle 4:

Zelltyp Material der Hohlfasern

innerer Poren-

Anzahl der Zellen 18. Tag

2S£/ Sess

äußerer (S =
Durch- 0,1 nm)
messer
(tun)

Lymphom-	Polycarbonat	200/250	25	2,00 χ 10^b 5	,00	X	10
zellen von	Cellulose acetat	200/250	10⁵	" 1	,20	X	10
mensch- < liehen	Polyacryl nitril	250/350	50	" 7	,00	X	10
Leukämie
zellen

Knochenmark-
tumorzellen
von Mäusen

Polymethylmethacrylat

Polycarbonat

Polyäthersulfon

250/350
200/250
250/350

40
25
40

2,50 χ 10¹ 7,00 χ 10*

1,10 χ 10

wiederholte man den Arbeitsgang unter Verwendung der Methode der stationären Schwimmkultur; die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5:

Restaktivität am 7. Tag

Methode Zahl der eingeimpften Zahl der eingeimpft

Zellen (106/_ml) ten Zellen (5 x 10⁶/ml)

Kultivierung unter Verwendung von

Hohlfasern 80 75

Stationäre Schwimmkultur 60 0

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Restaktivität am 7. Tag =
Pigmentausschlußfähigkeit am 7. Tag

Pigmentausschlußfähigkeit vor dem Einimpfen

χ 100

Die Offenbarung umfaßt auch den korrespondierenden englischen Text.

Der Ausdruck "Tierzellen" umfaßt in diesem Zusammenhang auch menschliche Zellen.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Kulturmedium in eine Zellkultureinheit einführt, die ein Gehäuse und eine Mehrzahl von Hohlfasern im Gehäuse eingeschlossen umfaßt, wobei die Hohlfasern an ihren beiden Enden zur Außenseite des Gehäuses offen sind und einen Porendurchmesser von etwa 2,0 nra bis 1(r nm (20 bis 10-* I) aufweisen, und daß man das Kulturmedium durch das Innere der Hohlfasern durchleitet und die schwimmenden Tierzellen im Raum zwischen dem Gehäuse und den Hohlfasern kultiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Hohlfasern mit einem Porendurchmesaer von 1ü bis 5 x 10 nm (10² A bis 5 x 1O^4- 1) verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Hohlfasern verwendet, die aas Polysulfon oder PoIyäthersulfon hergestellt sind.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als schwimmende Tierzellen Knochenmarktumorzellen, Leukämiezellen, Lymphocytenzellen oder Knochenmarktumorzellen verwendet, die man durch Zellfusion mit Milzzellen oder Lymphocytenzellen erhalten hat.

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5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als schwimmende Tierzellen Knochenmarktumorzellen verwendet, die man durch Zellfusion mit Milzzellen oder Lymphocytenzellen erhalten hat.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gehäuse verwendet, das aus Silikonpolymer, Polybutadien oder einem Silikon/Polycarbonat-Mischpolymer hergestellt ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zellkultureinheit verwendet, die mit einem Vorratsbehälter für ein Kulturmedium mit einem Rohr aus Silikonpolymer, Polybutadien oder einem SiIikon/Polycarbonat-Mischpolymer verbunden ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Silikonpolymer-Klebstoff als Befestigungsschicht verwendet, die beide Enden der Hohlfasern an Ort und Stelle hält.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die schwimmenden Tierzellen in die Zellkultureinheit in einer Anfangskonzentration von 10 bis 5 χ 10 Zellen/ml einimpft.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellkultureinheit in einen Kohlendioxidgas-Inkubator einsetzt, in dem die COg-Konzentration 5 bis 10 Gew.-# beträgt.

11. Zellkultureinheit zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Gehäuse und eine Mehrzahl von Hohlfasern, die in dem Gehäuse eingeschlossen sind, wobei die Hohlfasern an ihren beiden Enden zur Außenseite des Gehäuses offen sind

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und einen Poreadurohmesser von ©twa 2 bis 10 nm (20 1 bis 10·⁵ A) aufweisen, und durch eine Anordnung, die das Durchleiten eines Kulturmediums durch das Innere der Hohlfasern und die Kultivierung von schwimmenden Tierzellen im Raum zwischen dem Gehäuse und den Hohlfasern erlaubt.

12„ Zellkultureinheit nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch einen Porendurchmesser der Hohlfasern im Bereich von 10 nm bis 5 x 10³ nm (10² A bis 5 x 10⁴ A).

13. Zellkultureinheit nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse aus Silikonpolymer, Polybuta=» dien oder einem Silikon/Polycarbonat-Mlschpolymer hergestellt

14· Zellkultur inhe it nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkultureinheit mit einem Vorratsbehälter für das Kulturmedium durch ein Rohr verbunden ist, das aus Silikonpolymer_? Polybutadien oder einem Silikon/ Polycarbonat-Mischpolymer hergestellt ist.

15. Zellkultureinheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen Silikonpolymer-Kl©bstoff als Befest igungsschiehtg die beide Enden der Hohlfasern an Ort und Stelle hält.

16. Zellkultivierungsvorrichtung, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Zellkultureinheit für schwimmende'Tierzellen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche enthält.

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