DE3034899A1 - Vorrichtung zur kontinuierlichen elektrophorese - Google Patents

Description

• VO?.RIC-XnrzG ZTm KOiiTINUIERLICEN ELEtETROPEIOfiEzE
• Elektrophoreseverfahren, d.h. Trennung verschieden elektrisch geladener Teilchen (ionisierte Atome und Moleküle) im elektrischen Feld, spielen in der analytischen und präparativen Chemie eine wichtige Rolle. Unter zahlreichen technischen und prinzipiellen Varianten wird in der modernen Biochemie am häufigsten die lD i s k - Elektrophorese zur Reinheitsprüfung und Identifikation biologisch relevanter Moleküle, insbesondere von Proteinen, als hochempfindliche Methode eingesetzt. Dem Verfahren liegt hinsichtlich pH - Wert, Pufferzusammensetzung und Gelnorengröße des Trägers -man verwendet meist Polyacrylamid- ein diskontinuierliches Trennsystem zugrunde. Durch diese Diskontinuitäten lassen sich vor dem eigentlichen Trennbeginn des Gemischs in Praktionen sehr schmale und gleichzeitig hochkonzentrierte Startzonen, die für die Schärfe der Trennung entscheidend sind, erzeugen. Das hohe Auflösungsvermögen der Disk-Elektrophorese wird bedingt durch den einleitenden Konzentrierungseffekt im Sammelgel und den anschließenden Molekularsieb-Elektrophoreseeffekt im Trenngel.
• Letzterer bewirkt eine Trennung der Moleküle nicht nur nach ihrer elektrischen Gesamtladung, sondern auch nach deren Größe (Molelculargewicht) und Gestalt (Konformation). Vorzeichen und Größe der elektrischen Ladungen von Proteinmolekülen können durch Veränderung des Lösungsmittel - pH-Wertes (meist Puffersysteme) festgelegt werden.
• Abbildung 1 zeigt schematisch den Aufbau einer üblichen Disk-Elektrophorese-Apparatur. Zwei Pufferreservoirs, oberes und unteres, stehen über eine Reihe senkrecht angeordneter Behälter, meist Glasrohre, miteinander in Verbindung. Die Rohre (Laufrohre) enthalten jeweils Sammelgel (oberes Rohrdrittel) und Trenngel (untere zwei Drittel des Rohres). Zur Inbetriebnahme des Gerätes wird zuerst das untere Reservoir mit Pufferlösung gefüllt. Dann werden die zu untersuchenden Proben von oben her auf die Sammelgeloberflächen der einzelnen Rohre gegeben.
• Die Apparatur wird schließlich nach sorgfältiger Füllung des oberen Reservoirs mit Pufferlösung zusammengefügt und unter elektrische Spannung gesetzt. Insgesamt wählt man die Puffersysteme so, daß die Teilchen als Anionen vorliegen und sich zum unteren Anodenraum hin bewegen Die Baufrichturg erfolgt jedenfalls zzer von oben nach uiiten.
• Die bisher in Laboratorien und Handel verwendeten Vorrichtungen zur Disk-Elektrophorese haben folgende Nachteile: 1) Einführung und Entnahme der Gelbehälter sind kompliziert und umstündlich und erfordern eine annähernd vollkommene Demontage der Appa ratur, Manipulationen können nur bei abgeschaltetem elektrischem Sturz: erfolgen.
• 2) Nach Abschalten des Stromes verbreitern sich die Substanzzonen im Gel sehr rasch durch Diffusion: eng zusammenl egende Fraktionen schmiren ineinander,und der zuvor erzielte scharfe Trenneffekt wird rückhäufig.
• 3) Unmöglich sind Probeentnahmen bei gleichzeitig störungsfreiem, kontinuierlichem Ablauf des Prozesses. Beim Umgang mit unbekannten, zu identifizierenden Substanzen sind aber gelegentliche Probenahmen von großer Bedeutung, um das Verhalten der Verbindung und die dafür optimalen Versuchsbedingungen rasch in Griff zu bekommen.
• All diese Nachteile werden durch unsere Erfindung spezieller Vorrichtungen eliminiert.
• Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur kontinuierlichen Elektrophorese, dadurch gekennzeichnet, daß die mit einem Gel gefüllten Behälter die beiden Pufferräume mittels eines elastischen Ringes abdichtend voneinander trennt, wobei die Behälter in der Vorrichtung jeweils mit Hilfe eines Schraubringes, welcher einen Schlitz enthält, fixiert sind und die mit Gel gefüllten Behälter am oberen Ende mit einem Rohr, welches am einen Ende mit einem Schraubgewinde und einem elastischen Ring versehen ist, überstülpt sind, Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur kontinuierlichen Ele:.-trophorese, dadurch gekennzeichnet, daß man die mit einem Gel gefüllten Behälter mit Hilfe einer speziellen Vorrichtung in die Elektrophcresevorrichtung einbringt, wobei die Abdichtung der Behälter gegenübe den beiden Pufferräumen mittels eines elastischen Ringes erfolgt, die Fixierung der Behälter in der Elektrophoresevorrichtung mit Hilfe einer den Behälter konzentrisch umgebenden Schraube gewährleistet wird, danach den oberen Pufferraum mittels eines, an einem Ende mit einem Schraubgewinde und einem Dichtungsring versehenen Rohres gegenüber dem mit Gel gefüllten Behälter abdichtet und den mit Gel gefüllten Behälter unter elektrischer Spannung der Vorrichtung entnimmt.
• PRINZIP DER VORRICHTUNGEN Die Disk-Elektrophoreseapparatur ist in Abbildung 2 dargestellt. Unteres und oberes Pufferreservoir sind über 12 Glasröhrcnen, welche mit Gel gefüllt sind, miteinander verbunden. Jedes Röhrchen ist oben mit einer Dichtung im Mittelteil der Apparatur fixiert. Ein Ablaufen der oberen Pufferlösung längs der Außenseiten der Glasrohre in den unteren Behälter ist somit ausgeschlossen. Der Mittelteil wird während des Elektrophoreseprozesses mit Kühlsole oder Leitungswasser, je nach Xühlbedarf durchspült und somit die beim Elektrophoresevorgang freiwerdende Joulesche Wärme abgeführt. Als Elektroden dienen Platindrähte, welche in den beiden Pufferräumen jeweils unten und kreisförmig, ZU: Mittelpuit (Apparatwrachse) konzentrisch angeordnet sind.
• Abbildung 3 zeigt ein Gelrohr, von einem elastischen Dichtungsring und einer Halterungsschraube ungeben. Das Rohr wird in einen Schlüssel geschoben, welcher innen hohl ist und ebenfalls einen elastischen Ring enthält. Dieser Ring ist so bemessen, daß er das Gelrohr in Vertikalposition stabil festzuhalten in der Lage ist, es aber andererseits im Bedarfsfalle bei Zug wieder freigibt. Der untere Teil des Schlüssels ist aus V2A-Stahl,.der Griffteil aus PVC gefertigt. Bei Manipulationen mit dem Gerät greifen die beiden Metallzungen in die Schlitze des Schraubringes ein, wie aus Abbildungen 4 und 5 zu entnehmen ist.
• Die Einführung eines Gelrohres in die Elektrophoreseapparatur sowie dessen Fixierung ist in Abbildung 6 gezeigt. In Abbildung 7 ist ein bereits fixiertes Gelrohr dargestellt.
• Zur Entfernung eines Gelbehälters wird zunächst die Oberseite, d.h.
• die in den oberen Pufferbehälter hineinragende Seite des entsprechenden Gelrohres gegenüber dem oberen Pufferraum abgeschottet (vgl. AD-bildung 8). Dies erfolgt mittels eines Rohres,welches am einen Ende ein Schraubgewinde und einen Dichtungsring enthält (vgl. Abbildung 9)t Zunächst befindet sich in Innenraum dieses Rohres Pufferlösung, welch mit der Pufferlösung außen vor dem Festschrauben des Rohres kommuniziert Die Lösung wird aus dem Innenraum mittels einer Saug'rorrichtung (Pipette o.ä.) abgezogen, und das Gelrohr kann jetzt mit dem bereits beschriebenen Schlüssel in umgekehrter Weise wie beim Einbringen, der Apparatur entnommen werden. An Stelle des Gelröhrc;nens setzt man ein, ebenfalls wieder mit Dichtungsring und Schraubring versehenes Glasstäbchen oder einen Kunststoffstab. Dies dient zur Abdichtung der freigewordenen Öffnung. Auch diese Handhabung erfolgt mit dem erwähnten Schlüssel. Das Abschottungsrohr kann jetzt abgeschraubt und zur Entfernung weiterer Gelrohre nach dem gleichen Verfahren benutzt werden.
• Sowohl Einführung als auch Entfernung der Gelbehälter tonnen gefahrles bei laufender ADnaratur doch. unter elektrischer SnannunC ausgeführt werden. Der Elektrosphoresevorgang wird dadurch nicht -snlerDrochen, ,zc die Substanzzonen bleiben durch die Wahrung der Kontinuität scharf wie aus den Abbildungen 11 und 12 zu entnehmen ist.
• Die Abbildungen 11 und 12 zeigen die verschiedenen Wanderungsgeschwindigkeiten einer mit Fremdproteinen verunreinigten Fraktion des Enzyms ß-Galaktosidase, in Abhängigkeit verschiedener Elektrophoresezeiten.
• Die Proben wurden nach dem beschriebenen Verfahren der Apparatur bei 300 Volt entnommen und ausgewertet. Man beachte die Scharfzeichnung der einzelnen Substanzbanden.
• LEGENDEN ZU DEN ZEICHNUNGEN Abb. 1 Schematische Darstellung einer üblichen Disk - Elektrophoreseapparatur Abb. 2a Seitenansicht der Disk - Elektrophoreseapparatur, bestehend aus oberem und unterem Pufferreservoir sowie einem,12 Gelröhrchen enthaltenden, kühlbaren Mittelteil Abb. 2b Disk - Elektrophoreseapparatur,Draufsicht,mit Anordnung der 12 Gelröhrchen.Die zur jeweiligen Elektrode im Zentrum des unteren bzw. oberen Nff erraumes angeordneten Stomzuführungen sind sichtbar Abb. 3 Msnipulationsschlüssel (oben) zur Einführung und Entfernung der Gelrohre.Gelrohr (unten) mit Dichtung und Befestigungsschraube Abb. 4 Dichtung,Befestigungsschraube und unterer Teil des Manipulationsschlüssels Abb. 5 Manipulationsschlüssel,das Gelrohr festhaltend.Die beiden Laschen des Schlüssels sind in die beiden Schlitze des Befestigungsrings eingerastet Abb. 6 Befestigungsprozedur eines Gelrohres Abb. 7 In der Apparatur befestigtes Gelrohr Abb. 8 Gelrohr mit darüber geschraubtem Abschottungsrohrtzur Entnahme Abb. 9 Abschottungsrohr aus Plexiglas Abb. 10 Entnahme eines Gelrohres mittels Manipulationsschlüssels.Gelrohr und Schlüssel sind dabei durch das Abschottungsrohr hermetisch von der Flüssigkeit des oberen Pufferraumes getrennt Abb. 11 Beispiel eines Disk - Elektrophoreselaufs des Enzyms ß-Galaktosidase (Molekulargewicht ca. 500 000 Dalton) unter kontinuierlichen Entnahmebedingungen.Die erste Entnahme erfolgte nach 30 Minuten und wurde im Zeitraum zwischen 30 und 90 Minuten wiederholt.I)ie zunehmend scharfe Auftrennung der Fraktionen mit zunehmender Zeit ist sichtbar Abb. 12 Vergrößerung von Abb. 11 Leerseite

Claims (6)

1. PATENTANSPRÜCHE 1) Einrichtung zur kontinuierlichen Elektrophorese, dadurch gekennzeichnet, daß die mit einem Gel gefüllten Behälter die beiden Pufferräume mittels eines elastischen Ringes abdichtend voneinander trennt, wobei die Behälter in der Vorrichtung jeweils mit Hilfe eines Schraubringes, welcher einen Schlitz enthält, fixiert sind und die mit Gel gefüllten Behälter am oberen Ende mit einem Rohr, welches am einen Ende mit einem Schraubgewinde und einem elastischen Ring versehen ist, überstülpt sind.
2. 2) Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Gel gefüllten Behälter aus Glas oder Kunststoff sind.
3. 3) Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der elastische Ring aus Perbunan oder Siliko£{autschuk ist.
4. 4) Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Rohr aus Kunststoff ist.
5. 5) Einrichtung nach einem der Ansprüche 2 oder 4, dadurch gekennzeic net, daß der Kunststoff Plexiglas ist.
6. 6) Verfahren zur kontinuierlichen Elektrophorese, dadurch gekennzeic net, daß man die mit einem Gel gefüllten Behälter mit Hilfe einer speziellen Vorrichtung in die Elektrophoresevorrichtung einbringt wobei die Abdichtung der Behälter gegenüber den beiden Pufferräunien mittels eines elstischen Ringes erfolgt, die Fixierung der Behälter in der Elektrophoresevorrichtung mit Hilfe einer den Behalter Monzentrisch umgebenden Schraube gewährleistet wird, danach den oberen Pufferraum mittels eines, an einem Ende mit einem Schraubgewinde und einen Dichtungsring versehenen Rohres gegenüber den mit Gel gefüllten Behälter abdichtet und den mit Gel gefüllten Behälter unter elektrischer Spannung der Vorrichtung entnimmt 7) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezielle Vorrichtung einen innen mit Hohlraum versehenen Stab benutzt, welcher im Hohlraum einen elastischen Ring enthält, der den Gelbehälter in Senkrechtstellung festhält und/oder in gleicher Weise freigibt und die mit einem Schlitz versehene Schraube durch zwei seitliche Zungen bewegt.