DE3034529A1 - Leukorekrutin, ein entzuendungsmediatorprotein aus saeugerserum zur induzierung einer leukozytosereaktion, herstellungsverfahren, gewinnung in meloekularer einheitlicher, kristallisierbarer und biologisch spezifisch wirkender form und leukorekrutin enthaltendes arzneimittel - Google Patents

Description

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Die Zerstörung von körpereigenem Gewebe bei Entzündungen,
welche durch nicht-immunologische und/oder durch immunologische Prozesse verursacht werden, führt zur Bildung verschiedener endogener Substanzen (Mediatoren und Hormone).
Sie regulieren die komplexen Einzelschritte der Aktivierung des Entzündungs- und des Gewebereparaturprozesses. Die

Mediatoren entstehen entweder durch begrenzte und regulierte Proteolyse vom Plasma- oder Serumfaktoren als humorale
Mediatoren, oder sie werden durch aktive Sekretion und/oder Zell-Lyse aus Zellen und Geweben als zelluläre Mediatoren

freigesetzt. Sie sind Teil des Körperabwehrsystems, dessen systemische und lokale Aktivierung sie mitregulieren.
Die Mediatoren tragen dadurch zur Entfernung und Entgiftung der zerstörten körpereigenen Stoffe und/oder der eingedrungenen Fremdkörper bei. Ferner ermöglichen sie durch Regulierung der Zellteilungs- und Gewebewachstumsprozesse bei der Wundheilung die Wiederherstellung der physiologischen Funktionen des Organismus. Wie die klassischen Hormone endokriner Drüsen sind auch die Entzündungsmediatoren Stoffe, die nur in sehr geringer Konzentration als Spuren im Gewebe oder im Blut vorhanden sind.

Bei der Aktivierung des Kinin-, des Koagulations- und des
Komplementsystems sowie anderer Blutprotein- und Zellfaktoren entsteht eine Vielzahl von Mediatoren, die für die verschiedenartigsten biologischen Aktivitäten des aktivierten Serums verantwortlich sind. Die Leukozytosereaktion (Leukozytenmobilisierung und -rekrutierung aus dem Knochenmark in das Blut) ist eine derartige, durch Mediatorwirkung ausgelöste Reaktion. Die Rekrutierung von Leukozyten aus dem Knochenmark ist ein gemeinsames Merkmal von akuten Entzündungprozessen, beispielsweise bakteriellen Infektionen oder dem

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Infarkt des Herzmuskels. Die Leukozytosereaktion ist ein Teil eines Regelkreises des Abwehrsystems des Körpers, welcher dlo st ruküiirc! 1.1c und funkLlonelle Bereitschaft des Organismus zur Gewebereparatur aufrechterhält.

Für den normalen konstanten Bereich der Blutleukozytenkonzentration wurden zwei negative Rückkopplungsmechanismen postuliert. Einer davon soll für die Produktion der Zellen im Knochenmark verantwortlich sein, der andere für die Abgabe der Zellen in das Blut; vgl. D.R. Boggs, Annu. Rev.

Physiol. Bd. 28 (1966), S. 39. In diesen Regelkreisen sollten auch humorale Mediatoren eine Rolle spielen; vgl. V. Menkin, Biochemical Mechanisms in Inflammation, 2. Ausgabe, Charles C.Thomas, Springfield, Illinois, 1956. V. Menkin zeigte dann auch zum ersten Mal, daß lösliche Mediatoren in den Mechanismen ebenfalls mitwirken, welche die Blutleukozytenkonzentration über den normalen Bereich erhöhen. (Leukozytosereaktion). Er isolierte auch ein kristallisierbares, aber damals nicht näher charakterisiertes Protein aus Entzündungsexudaten, das in vivo eine Leukozytosereaktion auslösen konnte.

In diesen frühen Versuchen, welche ein wertvolles Gedankengut über die Bildung und mögliche Wirkungsweise von Ent-Zündungsmediatoren lieferten, konnte aber damals einerseits weder ausgeschlossen werden, daß die Verunreinigung mit bakteriellen Endotoxinen, die den Proteinpräparaten zugeschriebenen Aktivitäten stimuliert hatten (vgl. D.R. Boggs, a.a.O. (1966)), noch konnte andererseits ausgeschlossen werden, daß Verunreinigungen mit anderen Spurenproteinen Artefaktaktivitäten bewirkten, da damals die heute zur Verfügung stehenden Methoden zur selektiven Reinigung komplizierter Gemische und Analyse der molekularen Einheitlichkeit von Proteinen nicht zur Verfügung standen.

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Zahlreiche verschiedene Faktoren können eine Leukozytosereaktion im Organismus auslösen. Dazu gehören Infektionen, Immunreaktionen, mechanische Gewebeschädigungen, psychischer Stress oder auch die Aufnahme üppiger Mahlzeiten.

Hauptforschungsproblem war deshalb die Entwicklung zuverlässiger in vitro Testsysteme, welche zu in vivo Testsystemen der Leukozytosereaktion korrelierbare Ergebnisse erbrachten. A.S. Gordon und Mitarbeiter (Ann. N.J. Acad.

Sei., Bd. 113 (1964), S. 766) entwickelten ein solches aufwendiges in vitro Testsystem. Sie erhielten damit einen Leukozytose induzierenden Plasmafaktor. Seine Natur wurde nicht näher aufgeklärt und seine Funktion muß ehor als Teil der Rückkopplungsmechanismen gesehen werden, welche erniedrigte Blutleukozytenkonzentrationen (Leukopenien) zum Normalwert korrigieren helfen können.

K. Rother, Eur. J. Immunol., Bd. 2 (1972), S. 550 bis 558 entwickelte ein anderes, einfacheres in vitro Testsystem zum Nachweis der Leukozytenmobilisierung aus dem Knochenmark. Er hat als erster die Ansicht vertreten, daß ein humoraler Faktor aus der dritten Komponente des Komplementsystems bei der Leukozytosereaktion eine Rolle spielt. Als Folge dieser Erkenntnisse wurden Proteinpräparate hergestellt, die aber entweder nicht näher charakterisiert wurden, molekular nicht einheitlich waren und/oder biologisch nicht spezifisch sind. Auch waren die Methoden zu deren Gewinnung ungeeignet, um wägbare Ilengen eines Mediators der Leukozytosereaktion zu erhalten. Neue Erfahrungen mit Entzündungsmediatoren zeigen (vgl. J.H. Wissler, Eur. J.

Immunol. Bd. 2 (1972), S. 73 - 96), daß diese Spurenstoffe sind, welche im nanomolekularen Konzentrationsbereich aktiv sind. Zu ihrer Herstellung in molekular einheitlicher Form in wägbaren Mengen sind Reinigungsverfahren notwendig, welche große Volumina an Ausgangsmaterial leicht handhaben lassen.

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Aus kleinen Serumvolumina von Kleintieren wurde beispielsweise eines dieser Proteinpräparate durch Aktivierung des Serumkomplementsystems hergestellt und mit einer fraktionierten Ammoniumsulfatfällung, einer Elektrophorese und einer Molekularsiebchromatographie angereichert; vgl.

K. Rother, a.a.O. Dieses Proteinpräparat induziert den Austritt von Leukozyten aus einem isolierten Rattenferaur in vitro sowie eine Leukozytosereaktion in vivo. Die Leukozytosereaktion in vivo scheint komplex zu sein. Sie ist zweiphasisch und nur teilweise durch ein Antikörperserumpräparat zur Komplementkomponente C3 inhibierbar; vgl. K. Rother u. Mitarb., Z. Immun.-Forsch.-Immunbiology, Bd. 155 (1978), S. 55.

Ein ähnliches Proteinpräparat (Molekulargewicht 10 0OO bis 12 000 Daltons) wurde von B. Ghebrehiwet und J.H. Müller-Eberhardt, J. Immunol., Bd. 123 (1979), S. 616 bis 621, durch Spaltung eines Präparates der Komplementkomponente C3 mit Trypsin hergestellt. Dieses Präparat wurde durch Elektrophorese oder alternativ über einen Ionenaustauscherschritt und eine Elektrophorese gereinigt. Das Proteinpräparat enthält kein Tyrosin als Aminosäure-Strukturkomponente; vgl. B. Ghebrihiwet und J.H. Müller-Eberhardt, a.a.O (1979) Das rrotednpräparat mobiliert Leukozyten in vitro und induziert eine Leukozytosereaktion bei Kaninchen in vivo bei einer spezifischen Aktivität von 10 μg/kg (1 nmol/kg). Darüberhinaus wurde festgestellt, daß dieses Präparat mehr als eine biologische Aktivität besitzt. Es erhöht auch die Kapillarpermeabilität und hat dazu lokale phlogistische Wirkung (Emigration von Leukozyten in das Gewebe), vgl. B. Ghebrehiwet und J.H. Müller-Eberhard a.a.O. (1979).

Die Leukozytenmobilisierung aus dem Knochenmark und die Leukozytenrekrutierung in das Blut werden heute einerseits biologisch entweder in vitro nach dem von K. Rother, Eur. J. Immunol., Bd. 2 (1972), S. 550 bis 558, entwickel-

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ten Testsystem (Rattenfemur) oder in vivo durch zeitabhängige periodische Zählung und Differenzierung der ver-SfcHitfäCtfclHpMi ^esalifday Iö4>«irl Bu 1 Mt fcSlul HCU.J-I Qcilic: Jot »II Hill at suchenden Substanzlösung gemessen. Andererseits kann man physikalisch-chemisch das Leukorekrütin durch die verschiedenen üblichen Methoden der Immunodiffusion oder Immunelektrophorese gegen ein anti-Leukorekrutin-Immunoglobulinpräparat messen, das man aus dem erfindungsgemäßen, molekular einheitlichen, gereinigten Leukorekrutin herstellen kann. Mit diesen Testsystemen kann man im Serum oder Plasma nach deren Aktivierung durch KontaktreakLionen mit zahlreichen hochmolekularen, körperfremden Stoffen (wie Immunkomplexe, Endotoxine oder Schlangengifte), Mikroorganismen (z.B. Pseudomonas) und proteolytischen Fermenten Leukozyten rekurtierende Aktivität auffinden (vgl.

K. Rother a.a.O. (1972); B. Gebrehiwet und J.H. Müller-Eberhard a.a.O. (1979)), obwohl in bestimmten Fällen lange Inkubationszeiten (beispielsweise 5 Tage) erforderlich sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein natürliches Leukozytose induzierendes (Leukozyten rekurtierendes, mobilisierendes) Protein aus Säugerserum in molekular einheitlicher, kristallisierbarer Form bereitzustellen, das einen biologisch spezifischen natürlich wirkenden Mediator der Leukozytosereaktion darstellt und sich zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes von Säugern, z.B. des Menschen eignet. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein wirtschaftliches sowie labormäßig und technisch handhabbares Verfahren zur Herstellung und Gewinnung dieses Spurenproteins aus Serum zu schaffen, bei dem es in hochgereinigtem, molekular einheitlichem, kristallisierbarem Zustand und in wägbaren Mengen erhalten werden kann. Diese

Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst. 35

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natürliches Die Erfindung betrifft demnach ein /Leukozytose induzierendes (Leukozyten rekrutierendes, mobilisierendes) Protein, (nachstehend als "Leukorekrutin", abgekürzt "LR" bezeichnet), das gekennzeichnet ist durch folgende Eigenschaften: a) biologische Wirkungen in vivo und in vitro:

- positive Leukozytosereaktion und Leukozytenrekrutierung in das Blut in vivo;

- zur positiven Wirkung hinsichtlich der Leukozytosereaktion ist das Blut, das Blutplasma oder das Blutserum im Blutkreislaufsystem nicht erforderlich:

sie wird auch in Kulturlösungen und Blutersatzmitteln verursacht;

- Schwellendosis der Wirksamkeit ist 8 bis 25 ng (1 bis 3 pMol) Leukorekrutin/kg Sauger;

- aktive Schwellenblutkonzentration ist 30 pMol Leukorekrutin/Liter;

- konzentrationsabhängige (ED-abhängige) Phasensequenzen der Leukozytosereaktion: Zeitverschiebung von Intensität (Leukozytenzahl) und Zahl (einfache, zweifache oder mehrfache) Phasen der Leukozytenrekrutierung aus dem Knochenmark in Abhängigkeit der Leukorekrutindosis gemäß den Figuren 3 bis 5;

- neben polymorphkernigen und mononuklären Leukozyten werden insbesondere auch jugendliche Leukozytenformen aus dem Knochenmark rekrutiert;

- LD₅₀ nicht bestimmbar, da keine letalen Wirkungen, selbst bei mehr als der 100 000-fachen Dosis der physiologisch aktiven Schwellendosis ersichtlich;

- positive Leukozytenmobilisierung direkt aus dem Knochenmark in vitro (auch in blutfreien Systemen, z.B. Zellkultur- und Salzlösung);

- keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest;

- keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

- keine spasmogene Aktivität auf gestreifte (Skelett-)-. muskulatur;

- keine chemische Anlockung (Chemotaxis) von Leukozyten

(neutrophile, eosinophile, Makrophagen) in vitro;

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- keine positive oder negative chemokinetische Wirkung auf Leukozyten (neutrophile, eosinophile, Makrophagen) in vitro;

- keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

- keine signifikante pyrogene Wirkung in vivo (gem. Figur 2) ,

- kein Endotoxingehalt und keine endotoxingleichen oder -ähnlichen Wirkungen;

- keine Lysewirkungen auf Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten in vitro;

- keine Entzündungswirkung in situ;

- positive biologische Aktivität (Leukozytosereaktion) vollständig hemmbar durch heterologe, spezifische, anti-Leukorekrutin-Antikörperserumfraktionen (anti-Leukorekrutin-Immunoglobuline).

b) Physikalisch-chemische Eigenschaften:

- Typische Proteineigenschaften und Proteinreaktionen

(Folin- und Biuretreaktion);

- Schmelzpunkt: etwa 200⁰C (Zers. unter Luft- und Sauerstoffausschluß);

- kein normaler, freier und selbständiger Blut-, Blutplasma- oder Blutserumbestandteil;

- es entsteht durch regulierte, limitierte Proteolyse

bei Kontaktreaktionen des Blutes, Blutplasmas oder 30

Blutserums, auch in zellfreien in-vitro Systemen als humoraler Mediator;

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur) etwa 8500 Daltons;

- keine Proteinquartärstruktur in Form physikalisch gebundener Peptiduntereinhoiton: natives Protein besteht nur aus einer Peptideinhoit,-

- elektrophoretische Wandung bei pH 7,4O in Acrylamid-. matrizen: anodisch;

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- löslich in wäßrigen Medien einschließlich 20 % Äthanol bei einem pH-Wert von mindestens 4,0 bis 10,0;

- unlöslich in (NH₄)₂SQ₄~Lösung bei einer Sättigung über 61 % (2,50 mol (NH₄)₂S0 /1);

- konstanter Temperaturkoeffizient der Löslichkeit in

Ammoniumsulfatlösungen zwischen -10°C und +50⁰C;

- es kristallisiert in doppelbrechenden optisch anisotropen Kristallen aus Anunoniumsulfatlosungen mit über 61 %

-Q Ammoniumsulfatsattigung (2,50 mol (NH.)„S0./1),

- unlöslich in Chloroform, Benzol, Xylol und anderen apolaren, nicht wäßrigen und mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln;

- denaturiert in Chloroform, Benzol und Xylol; Zerstörung der Konformationsstruktur (Sekundär- und Tertiärstruktur) und der biologischen Aktivität;

- es enthält unter anderem die Aminosäuren Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, Alanin, Glycin, Lysin, Serin, Valin, Glutaminsäure, Arginin, Leucin; - Adsorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Figur 1;

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle I:

_Λ _ . . w . m 1 ITi η ι r~* m ■ *^ ii ^ ι ι ~ ι ~ ■ ^* "

	Tabelle I
Wellenlänge, nm	■p 1 mg, 1 cm
280	0,53
260	0,42
277 (max)	0,54
250 (min)	0,36
290	0,32
400	0
450	0
500	0
550	0
600	0
700	0
800	0
850	0
900	0
1000	0
E280/E260	1 ,26

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- es adsorbiert reversibel in Struktur und biologischer

Aktivität an Anionen~und Kationenaustauschern, CaIciumphosphatgel und Hydroxylapatit und kann nativ der Volumenverteilungschromatographie unterworfen werden. 5

Das Leukorekrutin (LR) ist ein Entzündungsmediator mit topobiochemisch und biologisch spezifischer Wirkung, welche auf vom Entzündungsort entfernte Zielzellen (Knochenmark), gerichtet ist. Seine biologische Aufgabe ist die Rekrutierung von Knochenmarksleukozyten in das Blut (Leukozytosereaktion). Das Leukorekrutin ist kein normaler selbständiger Blut- oder Serumbestandteil. Es entsteht bei der regulierten und limitierten Proteolyse z.B. mit der Kontaktaktivierung des Serum-Komplementsystems neben einer Vielzahl von anderen Mediatoren, die teils noch unbekannt, teils aber auch bekannt sind, wie beispielsweise Anaphylatoxin und Cocytotaxin; vgl. J.H. Wissler, Eur. J. Immunol., Bd. 2 (1972), S. 73 bis 96.

Anaphylatoxin besitzt spasmogene Aktivität für glatte Muskulatur, wirkt auf Papillarmuskel und erhöht die Kapillarpermeabilität der Blutgefäße. Auf diesen Wirkungen beruht seine Schockaktivität. Ferner ist dieses Protein chemotaktisch aktiv für eosinophile Leukozyten. Es hat bei physiologischen Konzentrationen keine signifikante chemotaktische Aktivität für neutrophile und mononukleäre Leukozyten. Ferner hat es auch keine pyrogene, leukozytenaggregierende und leukozytenrekrutierende Wirkung. Das physiochemisch sehr ähnliche Cocytotaxin hat nur eine signifikante chemotaktische Aktivität für eosinophile Leukozyten. Es hat im Gegensatz zum Anaphylatoxin keine Schockaktivität, keine signifikante spasmogene Aktivität für glatte Muskulatur und keine kapillarpermeabilitätserhöhende Wirkung. Wie das Anaphylatoxin hat auch das Cocytotaxin keine chemotaktische Aktivität für neutrophile und mononukleäre Leukozyten, sowie keine pyrogene, leukozytenaggregierende und leukozytenrekrutierende Wirkung.

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Das erfindungsgemäß erstmals isolierte, in hochreinem, molekular einheitlichem, kristallinem Zustand gewönne und charakterisierte Leukorekrutin ist dem Anaphylatoxin und dem Cocytotaxin physikochemisch sehr ähnlich. Es hat aber keine der Aktivitäten des Anaphylatoxins und des Cocytotaxins. Es ist also chemotaktisch inaktiv für alle Leukozytenarten und induziert keine Schockreaktionen oder andere ersichtlichen systemisch abträglichen Reaktionen: Leukorekrutin hat auch keine chemokinetische und Riagozytose stimulierende Aktivitat für die verschiedenen Leukozytenarten. Ferner ist es ohne kapillarpermeabilitätserhöhende, ohne pyrogene und ohne spasmogene Wirkung.

In vielen seiner biologischen und chemischen Eigenschaften unterscheidet sich das Leukorekrutinprotein von strukturellen und funktionellen Eigenschaften der bakteriellen Endotoxine. Dies bedeutet, daß Leukorekrutin als Entzündungsmediatorprotein keine lokale, am Entzündungsort relevante phlogistische Wirkung hat. Leukorekrutin wirkt, ähnlich wie die bekannten Hormone endokriner Drüsen, spezifisch nur auf dem Entzündungsort ferner Zielzellen, das Knochenmark und dessen Leukozyten. Es induziert eine Leukozytosereaktion durch Rekrutierung neuer Knochenmarksleukozyten in das Blut in vivo bzw. in die Kulturlösung in vitro. Die durch Leukorekrutin induzierte Leukozytosereaktion ist ähnlich dem von K. Rother, a.a.O. (1972) und K. Rother u. Mitarb. a.a.O. (1978) beschriebenen komplexen Ablauf der Leukozytenrekrutierung aus dem Knochenmark. Die molekularen Eigenschaften des Leukorekrutins, besonders aber seine zur Aktivität notwendigen niedrigen Blutspiegel,weisen auch auf die Horraonähnlichkeit dieses Entzündungsmediators hin. Sie sind vergleichbar mit den wirksamen Blutinsulinkonzentrationen. Die

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aktive Schwellen/isr 8 bis 25 ng (1 bis 3 pmol) Leukorekrutin pro-- kg Versuchsorganismus. Dies entspricht einer berech-³^ neten Konzentration von 30 pmol Leukorekrutin/1 Liter Blut. Überträgt man diese Daten auf in vivo-Verhältnisse, so

bedeutet dies, daß die Umwandlung von schon etwa 200 nl

Blutserumprotein pro kg Organismus in Leukorekrutin durch limitierte Proteolyse genügen, um eine Verdoppelung der Leukozytenzahl im Blut zu bewirken. In diesen molekularen Eigenschaften, besonders nämlich der ausgeprägten biologischen Spezifität, dem Gehalt an aromatischen Aminosäuren (Tyrosin) und in einer 300 bis 1000-fachen besseren spezifischen Aktivität unterscheidet sich das durch regulierte und limitierte Proteolyse mittels Kontaktaktivierung von Säugerserum dargestellte Leukorekrutinprotein von den anderen in der Literatur beschriebenen Leukozytose induzierenden Proteinpräparaten; vgl. K. Rother, a.a.O (1972) und B. Ghebrehiwet und H.J. Müller-Eberhardt, a.a.O. (1979).

Das Leukorekrutin kann physikalisch-chemisch durch das erfindungsgemäß mit molekular einheitlichem Leukorekrutin hergestellte spezifische anti-Leukorekrutin-Antikörperserum oder dessen anti-Leukorekrutin-Immunglobulinfraktionen nach den verschiedenen üblichen Methoden der Immunodiffusion und Immunelektrophorese quantativ bestimmt werden. Die Aktivität des Leukorekrutins kann in vitro durch den Rattenfemur-Test nach K. Rother, a.a.O. (1972), sowie in vivo nachgewiesen werden. Durch intravenöse Verabreichung von Leukorekrutin beim Meerschweinchen in der niedrigen Dosis von etwa 25 ng/kg (3 pmol/kg - berechnete Blutkonzentration etwa 30 pmol/Liter) wird mindestens eine Verdoppelung der Zahl der Leukozyten im Blut innerhalb von 60 Minuten erreicht. Der Anstieg der Leukozytenzahl hängt von der Leukorekrutinkonzentration ab. die Figuren 3 bis 5 zeigen Beispiele der durch verschiedene Leukorekrutxnkonzentrationen verursachten Leukozytosereaktio nen. Die Leukozytose kann weitere 3 bis 5 Stunden dauern, wobei mono-, bi- oder sogar multiphasische Reaktionen auftreten können. Neben neutrophilen und mononukleären Zellen werden auch jugendliche Leukozytenformen rekrutiert. Bis zur unphysiologischen Konzentration von 100 μΐηοΐ/ΐ besitzt das Leukorekrutin weder chemotaktische noch chemokinetische

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noch phagozytose stimulierende Aktivität für neutrophile, eosinophile und mononukleäre Leukozyten vom Mensch, Kaninchen, Schwein, Hund, Meerschweinchen oder Ratte, ferner keine Kontraktionswirkung auf die glatte Muskulatur des Meerschweinchenileums, keine kapillarpermeabilitätserhöhende Wirkung im Hauttest beim Meerschweinchen mit Evans Blau als intraven s injiziertem Marker. Schließlich besitzt es auch keine ersichtliche Schockwirkung, selbst bei intravenöser Applikation der 10 000 bis 1OO 000-fachen Dosis der biologisch aktiven Menge beim Meerschweinchen oder Kaninchen, sowie keine pyrogene Wirkung am Kaninchen (standardisierte Methode nach Europ. Pharmacopoe 1975 - rektale Temperaturmessung), noch irgendeine andere sichtbare systemische biologische Reaktion bei intravenöser Verabreichung einer hohen Dosis von 1 mg/kg (etwa 100 nmol/kg) bei Meerschweinchen und Ratten.

In Figur 2 ist ein Pyrogen-Standardtest nach Europ. Pharmacopoe 1975 an drei verschiedenen Kaninchen (a, b und c) vom Durchschnittsgewicht von etwa 3 kg dargestellt, der durch intravenöse Verabreichung von Schweineleukorekrutin >. in einer Menge von 1 μΐ (15 μg) in 1 ml (0,9 Gewicht/Volumen)-prozentiger physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt wurde. Dies ist etwa das 200 bis 500-fache der biologisch aktiven Schwellendosis. In den Diagrammen der Figur 2 ist der rektal bestimmte Temperaturverlauf bei den Kaninchen vor (VA),während (*) und kurz nach (P) sowie weiterhin 30 bis 180 Minuten nach der Applikation graphisch dargestellt. Nur beim Kaninchen (a) wird eine Temperaturerhöhung von 0,1⁰C festgestellt.

Europ. Pharmacopoe 1975, britische und amerikanische (USP) Standards erlauben die Bezeichnung "pyrogenfrei" für Präparate, welche in drei Versuchskaninchen als Summe aller Abweichungen der rektalen Temperatur den Wert 2,6⁰C nicht überschreiten. Demnach ist das Leukorekrutinpräparat gemäß diesen Bestimmungen pyrogenfrei und ohne pyrogene Wirkung. Dieses äußerst sensitive Kriterium auf Verunreinigungen mit bakteriellen

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Endotoxlnen und anderen ubiquitären Pyrogenen zeigt die große Wirksamkeit des Reinigungsverfahrens für Leukorekrutin und ein Parameter für die biologische Spezifität.

In den Figuren 3 bis 5 ist die Induzierung der Leukozytosereaktion im Meerschweinchen bei Verabreichung von Leukorekrutin graphisch-dargestellt. Die Figuren zeigen die Anzahl der Leukozyten im Blut nach einer bestimmten Zeit (Verabreichung des Leukorekrutins zur Zeit t = 0). In Figur 3 ist der Verlauf der Leukozytosereaktxon bei Verabreichung von 100 ng (12,5 pmol), in Figur 4 der Verlauf der Verabreichung von 500 ng (60 pmol) und in Figur ¹S der Verlauf box Verabreichung von 500 \iq (60 nmol) Leukorekrutin aus Schweineserum pro kg Meerschweinchen dargestellt. Die Messungen erfolg-

^ ten in Abständen von etwa 3 bis 30 Minuten durch Auszählen der in einem bestimmten Blutvolumen (10 nl) vorhandenen Leukozyten.

Das erfindungsgemäß hergestellte und gewonnene Leukorekrutin ²" stellt einen wertvollen, körpereigenen Wirkstoff dar, der zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes des Körpers, z.B. des Immunstatus, verwendet werden kann. Das Leukorekrutin. eignet sich zur spezifischen Beeinflussung von Leukozytosereaktionen und Leukozytenfunktxonen, beispielsweise bei Ent-Zündungsreaktionen und beim Herzinfarkt Ferner kann das Leukorekrutin zur Herstellung des Leukorekrutin-Antikörpers verwendet werden, der zur spezifischen Beeinflussung von Leukämien eingesetzt werden kann. Ein weiteres Anwendungsgebiet des Leukorekrutins ist die spezifische Beeinflussung von Anämien und Leukopeniezuständen.

Das Leukorekrutin wird in Form üblicher Arzneimittel parenteral, vorzugsweise intravenös, Säugern, z.B. Menschen,in einer Tagesdosis von 10 ng/kg bis 100 μg/kg gegeben. 35

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Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des Leukorekrutins/ das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Serum einer regulierten und limitierten Proteolyse mittels Kontaktaktivierung unterwirft, welche durch die Ermittlung neuer Kontaktstofformen in kurzer Frist durchgeführt werden kann, anschließend die Proteine von den anderen Bestandteilen des Serums abtrennt und hierauf die Proteine chromatographiert und das Leukorekrutin gewinnt. Dabei wird ein stark angereichertes und bereits verhältnismäßig reines Leukorekrutinpräparat erhalten, das anschließend durch weitere Reinigungsstufen von verbliebenen Fremdproteinen abgetrennt werden kann. Nach dieser Endreinigung wird molekular einheitliches, hochreines und kristallines (kristallisierbares) Leukorekrutin erhalten.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird nach der Kontaktaktivierung des Serums, bei der das Leukorekrutin gebildet wird, zunächst eine Serum-Hauptprotein-Rohfraktion von den übrigen Bestandteilen des Serums abgetrennt. Dies kann zweck-

²^ mäßigerweise durch Kationenaustauscherreaktion erfolgen, wobei CM-Sephadex C 50 als Kationenaustauschersubstanz bevorzugt ist. Die dabei erhaltene positiv adsorbierende und eluierte Proteinmasse, welche von anderen, negativ adsorbierenden Serumbestandteilen (u.a. Lipide, Glykoproteine usw.) abgetrennt wird, kann dann zur Gewinnung des Leukorekrutins an Hydroxylapatit chromatographiert werden. Aus Gründen, die nachstehend erläutert werden, ist es jedoch im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, vor der Chromatographie an Hydroxylapatit zumindest einen Teil, insbesondere den Großteil der begleitenden Fremdproteine vom Leukorekrutin durch gezielte Trennverfahren abzutrennen. Bei den Mediatoren, zu denen auch das Leukorekrutin gehört, handelt es sich um Spurenstoffe, die nur in sehr geringer Menge im Serum vorkommen. 100 Liter kontaktaktiviertes Serum (entsprechend 250 bis 300 Liter Blut) enthalten etwa 7 bis 8 kg Protein neben anderen Stoffen. Nur etwa 0,3 bis 3 g davon (je nach Spezies und

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Art der Kontaktreaktion)sind Leukorekrutin, wovon maximal 10 bis 20 % isoliert werden können, da jeder Reinigungsversuch komplex ist und nur in beschränkter Ausbeute verläuft. Voraussetzung für eine praktische Verwertung des Leukorekrutins ist aber seine Herstellung und Gewinnung in nennenswerten Mengen. Dafür müssen sehr große Blutvolumina aufgearbeitet werden. Im Prinzip kann als Ausgangsmaterial auch Vollblut oder Blutplasma verwendet und der Kontaktaktivierung unterworfen werden. Da aber weder die Blutzellen im VoIlblut noch das Fibrinogen im Blutplasma zur Leukorekrutinbildung als humoraler Mediator notwendig sind, wird der leichteren Handhabbarkeit wegen Blutserum als Ausgangsmaterial bevorzugt.

Die Verwendung von Hydroxylapatit ist für die strukturschonende Reingewinnung von Leukorekrutin von wesentlicher Bedeutung. Aus technischen und wirtschaftlichen Gründen ist es aber mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden, größere Proteinvolumina, d-h·· also z.B. die Serum-Hauptprotein-Rohfraktion großer Serummengen, an Hydroxylapatitsäulen zu chromatographieren. Einerseits neigt nämlich Hydroxylapatit bei größeren Proteinvolumina sehr stark zur Verstopfung und wird dadurch unbrauchbar. Andererseits ist Hydroxylapatit teuer, was seinem Einsatz in größerem Maßstab entgegensteht. Aus diesen Gründen ist es im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, aus der Proteinfraktion des Serums, in der das Leukorekrutin enthalten ist, bereits vor der Chromatographie an Hydroxylapatit einen Großteil der begleitenden Premdproteine durch geeignete Verfahrensschritte abzutrennen und dadurch das Proteinvolumen, das auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden muß, entscheidend zu verkleinern.

Allgemein bestehen Reinigungsverfahren für Eiweißkörper (Proteine) und andere Naturstoffe aus einer Sequenz kombinierter Trennungsverfahren, welche Molekülgrößen-, Ladungs-, Form-, Strukturstabilitäts- und Moleküloberflächenbeschaffen-

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heitsunterschiede zwischen dem gesuchten Naturstoff und den begleitenden Fremdstoffen zur Trennung ausnutzen. Dementsprechend können zahlreiche Kombinationen verschiedenster Trennungsverfahren zur Reinigung eines Proteins erarbeitet werden. Für die Handhabungseigenschaften, technische Ausfühbarkeit, Automatisierbarkeit und Wirtschaftlichkeit eines Reinigungsverfahrens sowie für die Qualität des gesuchten Naturproduktes ist deshalb nicht allein die Art der verwendeten Trennungsschritte von Bedeutung, sondern insbesondere

¹^ deren optimierte Gestaltung und deren sinnvolle Kombination in einer Reinigungssequenz innerhalb der Rahmens der Strukturstabilität und der anderen Strukturparameter des gesuchten Stoffes. Das heißt auch, daß selbst die Benutzung gleicher oder ähnlicher Trennungsprinzipien (z.B. Molekularsieb-

^ filtration, Dialyse, Ionenaustauschadsorptionen, usw.) , aber in unterschiedlicher Kombination,für die Handhabungsfähigkeit und Wirtschaftlichkeit des Reinigungsverfahrens entscheidend sein können. In bestimmten Fällen ist die Benutzung oder Unterlassung einer einzigen Technik (z.B. Hydroxylapatitchromatographie, Zonenpräzipitationschromatographie, usw.) an einer bestimmten Stelle der Reinigungssequenz, oder innerhalb einer begrenzten Teilsequenz, von ausschlaggebender Bedeutung für die Qualität des gesuchten Naturproduktes sowie für die Handhabungsfähigkeit und die Wirtschaftlichkeit seines Reinigungsverfahrens. Klar aufgezeigt werden diese allgemeinen Zusammenhänge und Grundprinzipien der Naturstoffreinigung beispielsweise an der allgemein bekannten Tatsache, daß in einen wirtschaftlich vernünftigen und technisch handhabungsfähigen Naturstoffreinigungsverfahren ein Dialyse-Ultrafil-

trations- oder Lyophilisierungsschritt nicht sinnvoll ist, bevor das Gesamtausgangsvolumen oder die Ausgangskonzentration der begleitenden Fremdbestandteile des Naturstoffrohextraktes nicht auf mindestens 1/500 bis 1/1000 durch andere

Verfahrensschritte reduziert wurde.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des erfinchingsgemäßen Verfahrens wird ein Teil der begleitenden Fremdproteine durch Positivadsorption an Calciumphosphatgel oder durch Negativadsorption an einen Anionenaustauscher, insbesondere DEAE-Sephadex-A 50, von der Leukorekrutin enthaltenden Hauptproteinfraktion des Serums abgetrennt. Bei diesen Ausführungsformen kann vor der Chromatographie an Hydroxylapatit im ersten Fall eine etwa lOprozentige, im zweiten Fall eine etwa 30prozentige Verminderung des Gehaltes an Fremdproteinen erreicht werden. Da diese Verminderung des Volumens der Proteinfraktion nur verhältnismäßig gering ist, das Verfahren aber andererseits rasch und einfach durchgeführt werden kann, eignen sich diese Ausführungsformen insbesondere für eine Arbeit im Laboratoriums- und halbtechnischen Maßstab. Zusammen mit der Herstellung der Serumhauptproteinrohfraktion durch Kationenaustauscherverfahren kann damit eine Volumenverminderung von 1000 ml Serum auf etwa 25 ml Protein vor dem Aufbringen auf Hydroxylapatit erreicht werden. Besonders bevorzugt zu diesem Zweck ist eine Ausführungsform, bei welcher mit den LR enthaltenden Serumproteinen erst ein Anionenaustauscherreaktionsschritt und dann ein CaIciumphosphat-Adsorptionsschritt durchgeführt wird.

In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Abtrennung eines Großteils der begleitenden Fremdproteine von der Proteinfraktion des Serums durch fraktioniertes Eluieren und/oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol und/oder mindestens eine Molekularsiebfiltration. Besonders bevorzugt ist in dieser Ausführungsform eine Verfahrensweise, bei der mindestens zwei der genannten Trennstufen nacheinander durchgeführt werden. Diese besonders bevorzugte Ausführungsform ermöglicht die schonende Aufarbeitung großer Mengen von Serum und damit die Gewinnung nennenswerter Mengen an Leukorekrutin in rascher und wirtschaftlicher Weise. Da der weitaus größte Teil der begleitenden Fremdproteine vor der für die Produktqualität kritischen Chromatographie an

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Hydroxylapatit abgetrennt wird und somit nur ein kleiner Bruchteil (in besonders bevorzugten Ausführungsformen weniger als etwa 0,09 %) der gesamten Proteinmenge des serums auf den Hydroxylapatit gebracht werden muß, kann ein Ansatz mit beispielsweise mindestens 100 bis 200 Liter kontaktaktiviertem Serum begonnen werden (ca. 300 bis 600 Liter Blut). Ausgehend von beispielsweise 100 Liter kontaktaktiviertem Serum kann das Proteinvolumen, in dem praktisch noch die Gesamtmenge an Leukorekrutin enthalten ist, vor dem Aufbringen auf den Hydroxylapatit auf weniger als etwa 100 bis 200 ml, d.h. mit einem Faktor von kleiner als 1/500 bis 1/1000, verringert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Gewinnung des Leukorekrutins in seiner nativen Konformation.

Das Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des Leukorekrutins wird nachstehend im einzelnen erläutert:

a. Herstellung von Leukorekrutin im Serum. Regulierte und limitierte Proteolyse des Serums durch Kontaktaktivierung und Abtrennen der Leukorekrutin enthaltenden Serumhauptproteinrohfraktion von den übrigen Bestandteilen des Serums und Bereitung eines Leukorekrutin enthaltenden Serumhaupt pro te inrohkon ζ entrate s

Ausgangsmaterial für die Herstellung und Gewinnung des Leukorekrutins (im folgenden der Kürze halber stets nur noch mit LR bezeichnet) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist wie erwähnt zweckmäßigerweise das Blutserum von Säugern. Der leichten Verfügbarkeit wegen ist das Serum von Mensch, Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Hund, Katze, Kaninchen, Ratte oder Meerschweinchen bevorzugt. Das Serum wird auf übliche Weise durch Koagulieren von Blut und Abtrennen des Blutkuchens, beispielsweise durch Filtration und/oder Zentrifugieren, gewonnen und danach zur Bildung von LR beispielsweise mit Dex-

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trän, Hefe, bakteriellen Endotoxinen oder mit einem Immunkomplex als Kontaktstoff vorzugsweise unter Rühren inkubiert.

Vorzugsweise wird zur Leukorekrutinbildung erfindungsgemäß eine speziell zubereitete physikalische Form von Dextran oder Bäckerhefe verwendet. Diese beiden Kontaktstoffe erfordern für die Leukorekrutinbildung aus seinen Vorstufen eine nur kurze Inkubationszeit (z.B. genügt 1 Stunde bei 37°C, während andere Kontaktstoffe eine Inkubationszeit bis zu 5 Tagen erfordern (vgl. G. Ghebrehiwet und H.J.Müller-Eberhard, a.a.O. (1979)). Durch Kontaktaktivierung des Blutes, des Plasmas oder des Serums werden verschiedene kompliziert zusammengesetzte Blutproteinsysteme aktiviert. Zu diesen Systemen gehören die bekannten Koagulations-, Kinin- und Komplementproteinsysteme. Bei der Aktivierung durch Kontakt mit körperfremden, hochmolekularen Stoffen werden die inaktiven Proteine dieser Systeme zum Teil in proteolytische Fermente umgewandelt, welche wiederum einen anderen Teil der Proteine dieser Systeme in komplexer Weise in Form einer Aktivitätskaskade begrenzt durch Regelkreise spalten. Dabei entstehen die erwähnten humoralen Entzündungsmediatoren. Es hängt dabei oft von der physikalischen Form eines Kontaktstoffes ab, ob und wie diese Aktivitätskaskaden ausgelöst werden. Beispielsweise kann weder nieder- noch hochmolekulares, leicht lösliches Dextran eine solche Aktivitätskaskade des Komplementsystems so auslösen, daß sie mit beobachtbarer Schnelligkeit abläuft. Bringt man jedoch leicht lösliches Dextran in eine andere physikalische Form, so ist die gleiche chemische Substanz zur Aktivierung einer solchen Serumproteinkaskade fähig. Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst.

Als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines kontaktaktiven Dextrans eignen sich alle Dextransorten mit einem Molekulargewicht größer als 100 000 Daltons. Das leicht lösliche kontaktinaktive Dextran wird 7 Tage bei 90 bis 160⁰C, Vorzugs-

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weise 110 bis 13o°C, im trockenen Umluftstrom erhitzt. Nach dem Abkühlen wird es durch Zerklopfen grob zerkleinert und dann zu einem Korn der Durchschnittsgröße von 0,5 bis 3 mm gemahlen (z.B. in einer Kugelmühle oder in einem Mörser). Man erhält ein kontaktaktives, gekörntes, zum Gel quellbares, unlösliches Dextran, das zur Leukorekrutinbildung bei einstündigem Kontakt mit Serum fähig ist.

Bäckerhefe wird vor der Verwendung als Kontaktmittel für die Leukorekrutinbildung im bis zu etwa 10-fachen Volumen Wasser gekocht. Der Zellbruchstückschlamm wird von den im Überstand gelösten Zellbestandteilen durch Dekantieren oder Zentrifugieren (10 000 χ g mindestens 5 Minuten) abgetrennt und erneut mit Wasser gekocht. Diesen Vorgang wiederholt man solange, bis der überstand eine Extinktion unter 0,1 bei 280 und 260 nm hat. Der unlösliche, kontaktaktive Zellwandrückstand der Hefe wird lyophilisiert, getrocknet oder feucht nach Berechnung des Trockensubstanzanteils verwendet.

Die Kontaktaktivierung des Serums für die Leukorekrutinbildung ist nach ausreichender Inkubationszeit bei 20 bis 45°C, Vorzugs weise bei 37⁰C, welche vorzugsweise bei der Verwendung von Dextran und Hefe/etwa 1 Stunde beträgt, beendet. Das inkubierte Serum wird zweckmäßigerweise auf eine Temperatur von etwa 0 bis 8⁰C abgekühlt. Alle folgenden Vorgänge werden bevorzugt in diesem Temperaturbereich durchgeführt, wenn keine anderen Angaben gemacht werden. Ebenso werden im folgenden bevorzugt alle Lösungen mit 0,001 mol/1 Cystein versetzt. Der unlösliche, zur Inkubierung zugesetzte Stoff wird danach vom inku-

bierten Serum in üblicher Weise vollständig abgetrennt , beispielsweise entweder durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren (10 000 χ g mindestens 10 Minuten).

Zur Herstellung eines LR enthaltenden Serumhauptprotein-

rohkonzentrates wird das inkubierte, LR enthaltende Serum nun zur Abtrennung von den übrigen unerwünschten Serumbestand-

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teilen mit einem Kationenaustauscher behandelt. Als Kationenaustauscher eignen sich hierfür beispielsweise mit Epichlorhydrin vernetzte Dextranmatrizen (Sephadex), an welche funktionelle Gruppen mit Kationenaustauscherkapazität gekoppelt sind. Sie können nach Verwendung durch Regeneration wiederholt gebraucht werden. Bevorzugt wird ein schwach saurer Kationenaustauscher in der Na⁺-Form, wie CM-Sephadex C-50, verwendet, und die Behandlung bei einem pH-Wert von 4 bis 6 durchgeführt. . Das inkubierte Serum kann zur Erleichterung der Einstellung der Beladungsgleichgewichte vor der Behandlung mit dem Kationenaustauscher mit einer Proteine nicht schädigenden Salzlösung verdünnt werden, welche eine zu 0,2 mol NaCl/Liter äquivalente maximale Ionenstärke hat. Sie kann gleichzeitig der Einstellung des pH-Wertes dienen. Ein spezielles Beispiel für eine derar-

^ tige Salzlösung ist eine 0,001 mol/1 Kaliumphosphat-Acetatpufferlösung mit einem Gehalt von 0,2 mol/1 NaCl und einem pH-Wert von 4,5. Diese Kationenaustauscherreaktion kann sowohl als Chromatographieverfahren als auch als technisch leicht

handhabbares Eintopfverfahren gestaltet werden. . 20

Der Kationenaustauscher wird dem Serum in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, um die Hauptproteinfraktion des Serums zu adsorbieren. Üblicherweise genügt dazu etwa 1 Volumenteil gequollener Ionenaustauscher pro Volumenteil Serum. Sodann wird die überstehende Flüssigkeit von dem mit den Proteinen beladenen Kationenaustauscher, beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Der beladene Kationenaustauscher wird durch Waschen mit Wasser oder einer Salzlösung, welche eine in 0,2 mol/1 NaCl äquivalente maximale Ionenstärke hat, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 6 und einer Temperatur von vorzugsweise höchstens etwa 15°C von anhaftenden, nicht adsorbierten Serumbestandteilen befreit. Ein spezielles Beispiel für eine zum Auswaschen geeignete Salzlösung, ist die erwähnte Kaliumphosphat-Acetatpufferlösung vom pH-Wert 4,5.

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Der von negativ adsorbierten Rohseruinbestandteilen befreite/ mit den Proteinen beladene Kationenaustauscher wird nun mit einer Proteine nicht schädigenden wäßrigen Salzlösung eluiert. Vorzugsweise wird hierzu eine Salzlösung hoher Ionenstärke mit einem pH-Wert von etwa 4 bis 10 verwendet. Spezielle Beispiele für derartige Salzlösungen sind eine wäßrige 0,5 mol/1 Kaliumphosphatlösung vom pH-Wert 6,5 bis 7,5 oder eine 2 bis 5 mol/1 Natriumchloridlösung vom gleichen pH-Wert.
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Die erhaltene, die Hauptserumproteine und LR enthaltende Proteineluatlösung wird sodann zur nachfolgenden Auftrennung der Proteine konzentriert. Dieses Konzentrieren (Abtrennen des Großteils der wäßrigen Salzlösung von den Proteinen) kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise können die Proteine durch Lyophilisieren, ultrafiltration oder Entwässerungsdialyse an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Daltons konzentriert werden. Bevorzugt wird die vollständige Präzipitation des LR und seiner Begleitproteine durch Aussalzen mittels Einstellen des Eluats auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 3,25 bis 3,7 mol/1 (80 bis 90 % Ammoniumsulfatsättigung) durchgeführt. Hierzu wird Ammoniumsulfat in einer Menge von etwa 630 g/l Eluat zugesetzt (Sättigung etwa 90 %). Der pH-Wert wird da-

²^ bei vorzugsweise auf etwa 4 bis 9 und die Temperatur zwischen 40°C, vorzugsweise zwischen 0 und 8°C/gehalten. Die LR enthaltenden ausgefällten Proteine fallen als Proteinschlamm an und werden dann beispielsweise durch Filtrieren, Dekantieren oder Zentrifugieren von dem praktisch proteinfreien überstand abgetrennt. Die Zentrifugation erfolgt zweckmäßigerweise bei mindestens 10 000 χ g während mindeste-ns 45 Minuten, bevorzugt 1 Stunde einstufig; oder zweistufig bei niedrigeren Kraftwirkungen in der ersten Stufe und einer Wiederholung bei höheren Kräften, z.B. 10.000 bis 50 000 χ g, für den Überstand der ersten Stufe durch Durchfluß zentrifugation.

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Die Konzentrierung des Kationenaustauscher-Eluats kann auch nach einem anderen Verfahren, beispielsweise durch Ultrafiltration oder Lyophilisieren, vorgenommen werden. Diese Verfahren sind jedoch zeitraubender und relativ teuer.

In diesem Fall sollte aber zweckmäßigerweise das erhaltene Proteinkonzentrat zur weiteren Behandlung nach dem erfin-

auf

dungsgemäßen Verfahren ebenfalls ^eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3,7 mol/1 gebracht werden, wobei auch ein

Proteinschlamm entsteht.
10

B. Grobreinigung des Leukorekrutins: Abtrennung des überwiegenden Teils der begleitenden Fremdproteine von LR In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird aus dem in Stufe A erhaltenen Serumhauptproteinrohkonzentrat ein Teil der begleitenden Fremdproteine neben anderen Stoffen, wie Lipide, von dem zu gewinnenden LR durch Positivadsorption an Calciumphosphatgel abgetrennt. Dazu wird das in stufe A erhaltene, LR enthaltende Serumhauptprotein-Rohkonzentrat beispielsweise in 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat pufferlösung gelöst, welche 0,2 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,60 hat. Die LR enthaltende Proteinlösung wird bis zur Ammoniumsulfatfreiheit gegen diesen Puffer an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Daltons dialysiert oder ultrafiltriert oder einer durch entsprechende Ausschlußgrenzen charakterisierton Entsalzungsmolekularsiebfiltrationschromatographie unterworfen. Die ammoniumsulfatfreie, im angegebenen Puffer äquilibrierte Proteinlösung wird mit 50 ml Calciumphosphatgel (pro Volumen Proteinkonzentratlösung, welche von 1 Liter Serum erhalten wurde) versetzt und etwa 1 Stunde vorzugsweise bei 0 bis 8⁰C gerührt. Danach wird das Gel durch Zentrifugieren bei 10 000 χ g innerhalb 5 Minuten wieder abgetrennt. Das Gel wird noch dreimal mit 100 ml der genannten Pufferlösung gewaschen. Die Waschpufferlösungen werden mit der negativ adsorbierten, LR enthaltenden Proteinlösnung vereinigt. Diese erhaltene Proteinlösung kann durch Fällung der

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Proteine durch Zusatz von Ammoniumsulfat wieder in der beschriebenen Weise konzentriert werden. Der anfallende, LR enthaltende Proteinniederschlag kann dann in einem weiteren bevorzugten Verfahren weiter verarbeitet werden. 5

In einer zweiten Ausführungsform wird aus dem LR enthaltenden kontaktaktivierten Serum direkt, oder aus dem nach Abschnitt A erhaltenen Serum-Hauptproteinrohkonzentrat, oder aus dem nach der Calciumphosphatgelbehandlung erhaltenen Proteinkonzentrat ein Teil der begleitenden Fremdproteine von dem zu gewinnenden LR durch Negativadsorption und/oder Elutionschromatographie an einem Ani-onenaustauscher abgetrennt.

Dazu wird im Fall der Verwendung des kontaktaktivierten Serums ein Volumenteil Serum mit mindestens 4 Volumenteilen Wasser oder einer Proteine nicht schädigenden Salzlösung versetzt (Erniedrigung des NaCl-Gehaltes auf höchstens 0,03 mol/1, die Mischung auf eine tris-HCl-Konzentration von höchstens 0,01 mol/1 gebracht und ein pH-Wert von mindestens 8,0 eingestellt. Danach wird das dem doppelten Serumvolumen entsprechende Volumen eines Anionenaustauschers zugesetzt. Als Anionenaustauscher eignen sich hierfür beispielsweise mit Epichlorhydrin vernetzte Dextranmatrizen (Sephadex), an welche funktionelle Gruppen mit Anionenaustauscherkapazität gekoppelt sind. Sie können nach Verwendung durch Regeneration wiederholt gebraucht werden. Bevorzugt wird ein schwacher in einer Pufferlösung vorgequollener und äquilibrierter Anionenaustauscher in der Cl -Form, wie DEAE-Sephadex-A verwendet und die Behandlung bei einem pH-Wert von 8 bis 10 durchgeführt. Ein spezielles Beispiel für eine solche Pufferlösung ist 0,01 mol/1 tris-HCl, welche 0,03 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 8,0 hat.

Der Anionenaustauscher wird dem Serum in einer Menge zuge- ^⁵ setzt, die zur vollständigen Adsorption des LR und seiner positiv adsorbierbaren Begleitproteine ausreicht, üblicherweise genügen dazu zwei Volumenteile gequollener Anionenaustauscher pro Serumvolumen. Die Reaktion kann entweder als

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Chromatographxeverfahren oder als leichter handhabbares
Eintopfadsorptionsverfahren gestaltet werden. Im Eintopfverfahren wird die überstehende Flüssigkeit mit den negativ adsorbierten Proteinen von dem mit den positiv adsorbierten LR und anderen Proteinen beladenen Anionenaustauscher, beispielsweise durch Filtrieren, in der Chromatographiesäule,
Dekantieren oder Zentrifugieren (im Eintopfverfahren) abgetrennt. Der beladene Anionenaustauscher wird durch Waschen
mit Wasser oder einer Salzlösung, welche eine zu 0,03 mol/1 NaCl äquivalente maximale Ionenstärke hat, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8 bis 10 und einer Temperatur von vorzugsweise höchstens etwa 15°C von anhaftenden, negativ adsorbierten Serumbestandteilen befreit. Ein spezielles Beispiel für eine zum Auswaschen geeignete Salzlösung ist die erwähnte

tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 8,0.

Der von negativ adsorbierten Serumbestandteilen befreite,
mit LR und anderen Proteinen beladene Anionenaustauscher wird nun mit einer Proteine nicht schädigenden wäßrigen Salzlö-

sung eluiert, welche eine größer als 0,1 mol/1 NaCl entsprechende Ionenstärke und einen pH-Wert zwischen 6,0 und 10,0
hat. Vorzugsweise wird eine Salzlösung hoher Ionenstärke mit einem pH-Wert von 4,0 bis 10,0 verwendet. Ein spezielles Beispiel für eine derartige Salzlösung ist eine 2,0 mol/1 NaCl-Lösung, welche mit 0,01 mol/1 Piperazin-HCl zum pH-Wert 6,5 gepuffert ist und welche 0,001 mol/1 Cystein enthält.

Wird die Anxonenaustauscherreaktxon als Chromatographieverfahren gestaltet, so kann die Elution von LR und anderer
Proteine auch durch einen linearen NaCl-Konzentrationsgradienten erfolgen. LR wird eluiert bei einer Ionenstärke von 0,15 mol/1 NaCl beim pH-Wert 6,5.

Die erhaltene, LR enthaltende Proteineluatlösung wird sodann zur nachfolgenden weiteren Abtrennung der Proteine in üblicher Weise, bevorzugt durch Aussalzpräzipitation der

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Proteine bei einer Anunoniumsulfatsättigung von 90 % konzentriert und das erhaltene LR-Proteinkonzentrat in einem weiteren bevorzugten Verfahren weiter verarbeitet.

Werden für die Anionenaustauscherreaktion das nach der Calciumphosphatgelbehandlung erhaltene Proteinkonzentrat oder das gemäß Abschnitt A erhaltene Serumhauptprotein-Rohkonzentrat verwendet/ welche in Proteinschlammform vorliegen, so werden diese Proteinschlämme erst durch Dialyse bis zur Ammoniumsulfatfreiheit an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Daltons gegen Wasser oder eine Proteine nicht schädigende Salzlösung mit niedriger lonenstärke, vorzugsweise gegen den erwähnten 0,01 mol/1 tris-HCl-Puffer, der 0,03 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 8,0 hat, aufgelöst. Mit den klaren Proteinlösungen wird dann für die Anionenaustauscherreaktion genau so verfahren, wie für das kontaktaktivierte Serum.

Nach der dritten, besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Abtrennung der Fremdproteine aus dem in Stufe A erhaltenen Proteinkonzentrat durch fraktioniertes Eluieren und/oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol und/oder mindestens eine Molekulars iebfiltration.
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Bei dieser Ausführungsform kann bereits durch einmalige Durchführung eines der erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren eine beträchtliche Menge an Begleitproteinen abgetrennt und eine befriedigende Belastungsverminderung der Hydroxylapatitsäule erreicht werden. Beispielsweise werden im physiologischen pH-Bereich durch eine fraktionierte Eluierung etwa 30 %, durch eine Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol etwa 60 bis 70 % oder durch eine Molekularsiebfiltration bis zu 90 % der begleitenden Fremdproteine abgetrennt. Jedoch haften.die in dem Konzentrat enthaltenen Proteine trotz ihres verschiedenen Molekulargewichts häufig sehr stark aneinander. Sie

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werden in der Molekularsiebfiltration beispielsweise durch Bestehen nicht idealer Gleichgewichte bei Proteinpolyelektrolyten oft unvollständig entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt. Es empfiehlt sich deshalb mindestens zwei der genannten Trennverfahren hintereinander durchzuführen. Vorzugsweise wird das LR enthaltende Serumhauptproteinrohkonzentrat dazu z.B. zunächst fraktioniert eluiert und danach einer Molekularsiebfiltration unterzogen, oder es wird zunächst eine Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol und danach eine MoIekularsiebfiltration durchgeführt. Bevorzugt sind ferner Kombinationen aus fraktioniertem Eluieren und/oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol mit mindestens einer präparativen und einer analytischen Molekularsiabfiltration. AiLe diaaä Kombinationen der erwähnten Trennschritte sind Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dabei gehört es zum Kenntnisstand des Fachmanns, daß bestimmte Folgen von trennschritten weniger sinnvoll sind als andere Kombinationen. Beispielsweise ist dem Fachmann bewußt, daß bei Durchführung einer präparativen Molekularsiebfiltration nach einer analytischen Molekularsiebfiltration neben der unhandlichen Verfahrensweise auch ein schlechteres Gesamtergebnis in Bezug auf die Trennwirkung erhalten wird als bei umgekehrter Reihenfolge.

Besonders bevorzugt sind in dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens folgende Kombinationen der Trennverfahren:

a) eine fraktionierte Eluierung, gefolgt von zwei präparativen und zuletzt einer analytischen Molekularsiebfiltration;

b) eine fraktionierte Eluierung, gefolgt von einer Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol, danach einer präparativen und zuletzt einer analytischen Molekularsiebfiltration;

c) eine Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol, gefolgt von einer oder zwei präparativen und zuletzt einer analytisehen Molekularsiebfiltration.

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^ Die Durchführung der einzelnen Trennverfahren zur Abtrennung¹ des Großteils der begleitenden Fremdproteine von LR nach dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nachstehend im einzelnen erläutert.

Bei der fraktionierten Eluierung des Proteinkonzentrates wird - nahezu unabhängig vom Molekulargewicht - der Teil der Fremdproteine aus dem Konzentrat entfernt, der bei höheren Ammoniumsulfatkonzentrationen löslich ist als LR. Dieses Trennverfahren läßt sich deshalb besonders vorteilhaft in einem schnellen und kapazitätsmäßig nicht beschränkten Eintopfverfahren zusammen mit der Herstellung des Proteinkonzentrates durchführen. Falls mehrere Trennschritte nacheinander angewendet werden, wird die fraktionierte Eluierung aus

^⁵ diesen Gründen bevorzugt als erster Schritt durchgeführt.

Vor der fraktionierten Eluierung muß das zu behandelnde Proteingemisch auf eine Atnmoniumsulfatkonzentration gebracht werden, die zur Fällung aller Proteine ausreicht. Eine solehe Lösung hat einen Ammoniumsulfatgehalt von etwa 3,7 mol/1, (bei O bis 8⁰C), d.h. sie ist zu etwa 90 % gesättigt. Die Einstellung auf diesen Ammoniumsulfatgehalt erfolgt beispielsweise am Ende der Abtrennung der gesamten LR enthaltenden Serumhauptproteinrohfraktion aus dem Serum (Abschnitt A).

Die Konzentration des Kationenaustauschereluates wird entweder direkt durch Ausfällung der Proteine mit Ammoniumsulfat vorgenommen, oder das Konzentrat wird, falls es nach einem anderen Verfahren, wie Ultrafiltration oder Lyophilisierung, aus dem Eluat erhalten wurde, anschließend mit

Ammoniumsulfat bis zur angegebenen Konzentration versetzt.

Für die fraktionierte Eluierung wird die Ammoniumsulfatkonzentration des Proteinkonzentrates sodann durch Zugabe einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit auf etwa 2,6 mol/1

eingestellt. Als Proteine nicht schlädigende Flüssigkeit kann Wasser oder vorzugsweise eine gepufferte Salzlösung ver-

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wendet werden. Vorzugsweise wird dabei ein pH-Wert von etwa 4 bis 8,5 und eine Temperatur von etwa 0 bis 8⁰C eingehalten. Ein spezielles Beispiel für eine geeignete gepufferte Salzlösung ist eine 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,1 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von 6,3 aufweist. Bei Verwendung von Wasser oder einer (ammoniumsulfatfreien) Salzlösung sind für die gewünschte Erniedrigung der Ammoniumsulfatkonzentration etwa 0,4 Volumenteile pro Volumenteil Proteinkonzentrat erforderlich. 10

Die Ammoniumsulfatkonzentration der erhaltenen Aufschlämmung darf nicht wesentlich unter etwa 2,6 mol/1 eingestellt werden, weil sonst auch LR aufgelöst würde. Andererseits ist aber auch eine Einstellung auf eine höhere Ammoniumsulfatkonzentration als etwa 2,6 mol/1 unzweckmäßig, weil dann weniger Fremdproteine in Lösung gehen und die Wirksamkeit der fraktionierten Eluierung geringer wird. Die Aufschlämmung wird, um eine vollständige Lösung der bei der eingestellten Ammoniumsulfatkonzentration löslichen Fremdproteine zu erreichen, einige Zeit, vorzugsweise etwa 10 bis 24 Stunden, vorzugsweise unter Rühren, bei den angegebenen Temperatur- und pH-Bedingungen gehalten. Anschließend wird der verbliebene Proteinniederschlag vom Überstand, beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren, abgetrennt.

Die fraktionierte Eluierung ist im Prinzip eine umgekehrte fraktionierte Fällung. Deshalb ist es grundsätzlich auch möglich, diesen Reinigungsschrit t als fraktionierte Fällung durchzuführen. Hierzu wird das Kationenaustauschereluat statt auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 3,7 mol/1 nur auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 2,6 mol/1 gebracht. Die dabei ausgefallene, LR enthaltende Proteinfraktion wird vom löslichen Überstand abgetrennt. Dem Fachmann auf dem Gebiet der Proteinfraktionierung ist aber be-

^⁵ kannt, daß die fraktionierte Eluierung wegen der Kinetik von Fällungsgleichgewichten häufig ein wesentlich selektiveres

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Trennverfahren mit höheren Ausbeuten darstellt als die fraktionierte Fällung. Dies gilt auch für die LR-Fraktionierung.

Bei der Fällung begleitender Fremdproteine mit einem wasserlöslichen Alkohol wird zur Abtrennung eines Teils der Fremdproteine vom LR die Tatsache ausgenützt/ daß ein Teil der Fremdproteine, nicht aber LR, unter bestimmten Bedingungen durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkohols zu der Proteinlösung ausgefällt werden. Da bei der Alkoholfällung ebenso wie bei der fraktionierten Eluierung .ein Großteil der Begleitproteine unabhängig von ihrem Molekulargewicht von LR abgetrennt wird, wird dieser Trennschritt vorzugsweise im Anschluß an die fraktionierte Eluierung oder anstelle dieses Reinigungsschrittes durchgeführt. Dadurch wird, wenn anschließend eine Molekularsiebfiltration durchgeführt wird, die dabei verwendete Säule in beträchtlichem Maße entlastet.

Die Behandlung mit einem Alkohol wird bei einem pH-Wert von etwa 3,5 bis 5,5, vorzugsweise von etwa 4,0,und einer Temperatur von höchstens etwa 8°C, vorzugsweise höchstens etwa 5°C, durchgeführt. Die Einhaltung des angegebenen pH-Bereichs ist von Bedeutung, da bei niedrigeren pH-Werten eine Schädigung der zu isolierenden Proteine eintreten kann und bei höheren pH-Werten die Wirksamkeit der Fällung geringer ist. Durch Einstellung des pH-Wertes im angegebenen Bereich allein wird jedoch noch keine Fällung der Fremdproteine erreicht.

Der waiiserlöslicha Alkohol wird in einer Menge von etwa 180 bis 25O, vorzugsweise etwa 200 Volumenteilen, pro 1000 VoIumenteile Proteinlösung zugegeben. Bei geringeren Alkoholmengen kann eine vollständige Fällung nicht erreicht werden, während eine höhere Alkoholkonzentration keine stärkere Fällungswirkung besitzt, aber die Gefahr einer Schädigung des zu isolierenden Mediators durch Konformationsumwandlung mit sich brxngt. Spezielle Beispiele für geeignete wasserlösliche Alkohole sind Methanol, Äthanol, Propanol und Äthylenglykol. Vorzugsweise wird als wasserlöslicher Alkohol Äthanol verwendet.

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Zur Durchführung der Alkoholfällung wird das (ammoniumsulfathaltige) Serumhauptproteinrohkonzentrat aus dem Kationenaustauschereluat oder der Proteinrückstand der fraktionierten Eluierung in einem möglichst kleinen Volumen einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit gelöst. Ein spezielles Beispiel für eine geeignete Lösung ist 0,01 mol/1 Ammoniumacetatlösung, die 0,2 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von 5,0 hat. Danach wird der pH-Wert der Lösung beispielsweise mit Eisessig, vorzugsweise unter Rühren, auf den angegebenen Bereich eingestellt und der Alkohol zugesetzt. Zur Ausfällung der Fremdproteine wird dio Lösung sodann, vorzugsweise unter Rühren, einige Zeit bei den angegebenen Bedingungen gehalten. Die ausgefällten Fremdproteine werden danach, beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren,in der beschriebenen Weise von dem LR gelöst enthaltenden überstand abgetrennt. Der Alkohol kann dann beispielsweise durch entweder Dialyse oder Ultrafiltration (vorzugsweise an einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Daltons)oder auch Lyophilisieren aus der verbliebenen Proteinlösung abgetrennt werden. Wird nachfolgend zur weiteren Reinigung von LR ein Molekularsiebfiltrationsschritt angewendet, so wird der Alkohol direkt ohne die vorgenannten Hilfsmethoden aufgrund seines niedrigen Molekulargewichtes (46 Daltons für C₃H₅OH) von LR (ca. 8 500 DaI-

tons) abgetrennt.

Die Molekularsiebfiltration bewirkt eine Auftrennung der Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht. Da ein überwiegender Teil der LR begleitenden, verbliebenen Fremdproteine ein höheres Molekulargewicht als LR aufweist, kann ihre Abtrennung auf diese Weise erreicht werden. Für die Trennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht wird ein hydrophiles, in Wasser quellendes Molekularsieb verwendet. Beispiele für geeignete Molekularsiebe sind mit Epichlorhydrin vernetzte Dextrane (Sephadex), mit Acrylamid vernetzte Agarosen (Ultrogele) und raumvernetzte Acrylamide

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(Biogele), deren Ausschlußgrenzen größer als die zur Auftrennung verwendeten Separationsgrenzen sind.

Die Molekularsiebfiltration wird, falls mehrere Trennstufen zur Anwendung kommen, vorzugsweise nach einer fraktionierten Eluierung und/oder Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol durchgeführt. Bei dieser Verfahrensweise wird bereits ein Teil der Fremdproteine aus allen Molekulargewichtsbereichen durch die vorangehenden Trennstufen entfernt,und die Menge der durch das Molekularsieb aufzutrennenden Proteine ist deshalb bereits wesentlich geringer. Je nach dem Längen-Durchmesser-Verhältnis der verwendeten Säule und dem Teilchendurchmesser der Gelmatrix, welche die theoretische Bodenzahl der Säule beeinflussen, wird die Molekularsiebfiltration als "präparativ" oder "analytisch" bezeichnet. Sie wird als "präparativ" bezeichnet, wenn die Chromatographie an Säulen mit einem Dimensionsverhältnis Länge : Durchmesser bis 10 : und einer Beladung von bis zu 1/3 des Säuleninhalts bzw. unter voller Ausnutzung des gesamten, matrizentypischen Separationsvolumens durchgeführt wird. "Analytisch" bedeutet ein Längen-Durchmesser-Verhältnis über 10:1, vorzugsweise etwa 50:1, und eine Beladung bis maximal 3 % des Säuleninhaltes.

Bei der präparativen MolekularSiebchromatographie werden GeI-matrizen mit möglichst großer Teilchengröße benutzt, um schnelle Durchflußraten der oft etwas viskosen Proteinlösungen bei möglichst niedrigen Drucken zu erzielen. Bei der analytischen Molekularsiebfiltration wird die Teilchengröße der Gelmatrix so klein wie möglich gewählt, um eine maxima-Ie theoretische Bodenzahl der Säule bei technisch und

sicherheitsmäßig vertretbarem Druck und einer Flußgeschwindigkeit der mobilen Phase von 2 bis 4 cm/h zu erreichen. Diese Parameter sind von der Gelmatrixstruktur abhängig und von Gel zu Gel verschieden.
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Falls mehrere präparative Molekularsiebfiltrationen nacheinander durchgeführt werden, kann die Separationsgrenze abgestuft gewählt werden. Beispielsweise kann in einem ersten Filtration S schritt: eine Separat Inn Rtn^nzp von 20· <">O0 naH^-v- und in einem zweiten Schritt eine Separationsgrenze von 13 000 Daltons eingestellt werden. Daran anschließend kann eine analytische Molekularsiebfiltration mit Separationsgrenzen von 11 000 und 6 000 Daltons durchgeführt werden. Die Ausschlußgrenze des verwendeten Gels muß jedenfalls größer als etwa 10 000 Daltons sein, um eine Volumenverteilung von LR (MG etwa 8500) zwischen der stationären Gelmatrixphase und der mobilen wäßrigen Pufferphase zu ermöglichen.

Die "Ausschlußgrenze" bezeichnet den hydrodynamischen Parameter eines gelösten Teilchens, welcher der Porengröße der Gelmatrix entspricht. Teilchen mit größerem hydrodynamischen Parameter können nicht mehr in die Gelmatrix eindringen (Volumenverteilungskoeffizient K = 0). Die "Separationsgrenze" bezeichnet einen zur Trennung von gelösten Teilchen ζweckmäßigerweise festgesetzten hydrodynamischen Parameter, der zwischen einem Volumenverteilungskoeffizienten K = 0 und K_D = 1, liegt.

Zur Molekularsiebfiltration werden die Proteine gelöst in einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit auf das Molekularsieb aufgebracht. Ein spezielles Beispiel für ein geeignetes Lösungsmittel ist 0,01 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung mit einem Gehalt von 0,3 mol/1 NaCl und einem pH-Wert von 6,5. Nach der Filtration werden die LR-enthaltenden Fraktionen gesammelt. Die darin enthaltenen Proteine werden vorzugsweise durch Einstellen auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3,7 mol/1 (90 % Sättigung) konzentriert. Nach dem Abtrennen vom Überstand werden sie wieder in einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit gelöst und gegebenenfalls einem weiteren Reinigungsschritt unterzogen.

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Zwischen den vorstehend erläuterten Reinigungsschritten kann die Proteinlösung im Bedarfsfall durch Dialyse oder Ultrafiltration (vorzugsweise an Membranen mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Daltons), beispielsweise gegen Natriumkaliumphosphatpufferlösung, von unerwünschten Salzen gereinigt werden. Dazu kann auch eine Molekularsiebfiltration durch Wahl der entsprechenden mobilen Phase in üblicher Weise modifiziert angewendet werden. Bei den MolekularSiebfiltrationen wird der Proteinlösung vorzugsweise etwa 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat zugesetzt. Im Gegensatz zu höheren Konzentrationen hat das Ammoniumsulfat in dieser Konzentration einen starken Einsalzeffekt gegenüber Proteinen. Durch diese Maßnahmen werden demnach die Proteine während der Molekularsiebfiltration in Lösung gehalten. Ferner verhindert Ammoniumsulfat das bakterielle Wachstum und hemmt gewisse Enzyme. Dadurch trägt es zur Stabilisierung von LR bei, vor allem wenn die Chromatographie bei höheren Temperaturen (über etwa 20°C) und unter nicht sterilen Bedingungen durchgeführt wird. Zur Oxidationsverhinderung wird die Proteinlösung vorzugsweise ferner mit etwa 0,001 mol/1 Cystein versetzt.

Die Temperatur und pH-Bedingungen sind bei der Durchführung der Molekularsiebfiltration nicht besonders kritisch. Wenn die Erhaltung der nativen Konformation der Proteine beabsichtigt ist, empfiehlt sich die Einhaltung einer Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 8⁰C, vorzugsweise etwa 0 bis 4⁰C. Der bevorzugte pH-Bereich liegt dabei zwischen 6 und 9.

Durch Anwendung der vorstehend erläuterten Trennverfahren kann nach dieser besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Großteil der begleitenden Fremdproteine von LR bereits vor der Chromatographie an Hydroxylapatit abgetrennt werden. Beispielsweise kann durch fraktionierte Eluierung, zweimalige präparative und eine analytische Molekularsiebfiltration das Volumen der aufzutrennenden Proteine ausgehend von 100 Liter kontaktaktiviertes Serum =

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^ etwa 35 Liter Proteinfeuchtmasse (= 7 - 8 kg Proteintrockenmasse) vor dem ersten Trennschritt auf weniger als etwa 100 bis 200 ml verringert werden. Damit wird auch die Möglichkeit geschaffen, größere Mengen an LR zu gewinnen, da die an Hydroxylapatit zu chromatographierende Proteinmenge verhältnismäßig klein und bereits stark konzentriert an LR ist. Hydroxylapatitsäulen mit einer Gesamtadsorptionsapazität für das so erzielte Produkt aus bis zu 2000 Liter kontaktaktiviertera Serum sind im Laboratorium noch handhabbar.

C. Feinreinigung des Leukorekrutin zur molekularen Homogenität:

Gewinnung von LR durch Chromatographie an Hydroxylapatit, weitere Reinigung und Kristallisation des LR Nach der Durchführung eines oder einer Kombination der vorstehend unter B) beschriebenen Trennverfahren wird die erhaltene, LR bereits verhältnismäßig konzentriert enthaltende Proteinlösung zur Abtrennung verbliebener Fremdproteine und Gewinnung von LR an Hydroxylapatit chromatographiert.

Falls die konzentrierte Lösung des letzten vorangegangenen Trennschrittes Ammoniumsulfat und andere Salze, vor allem Phosphate enthält, werden diese, vorzugsweise durch Dialyse an einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Daltons, vor dem Aufbringen auf den Hydroxylapatit entfernt. Abgesehen von der Viskositätserhöhung durch Fremdzusätze ist aber für das Gelingen der Chromatographie an Hydroxylapatit lediglich die Phosphatkonzentration der Proteinlösung kritisch. Darüber hinaus begünstigt der Zusatz von NaCl, vorzugsweise 0,1 mol/1 NaCl, die Trennung der eluierten Proteine (R_f-Wert-Beeinflussung) ohne Veränderung ihrer Elutionscharakteristik. Die Eluierung von LR erfolgt durch einen Natriumkaliumphosphat-Konzentrationsgradienten, der vorzugsweise linear ist. Die LR enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und dann konzentriert, beispielsweise durch Einstellen auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3,7 mol/1 und Abtrennen der ausgefallenen Proteine in der beschriebenen Weise.

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Das nach der Chromatographie an Hydroxylapatit erhaltene, bei Verwendung von 100 Liter Serum noch etwa 900 mg Proteine enthaltende Leukorekrutinpräparat besitzt im allgemeinen einen Gehalt von etwa 5 bis 40 % der Proteine an LR,stellt also bereits ein verhältnismäßig reines Produkt dar. Es kann jedoch, wenn die vorgesehene Verwendung dies erfordert, durch Anwendung zusätzlicher Reinigungsschritte von den verbliebenen Verunreinigungen weiter gereinigt werden. Als zusätzliche Reinigungsschritte kommen Kreislauf- oder KaskadenmolekularsiebfiltO tration, Rechromatographie an Hydroxylapatit, ZonenpräzipitationsChromatographie, analytische Molekularsiebfiltration oder Kombinationen dieser Schritte in Frage.

Die Kreislauf- oder Kaskadenmolekularsiebfiltration kann ^ unter den Bedingungen durchgeführt werden, die vorstehend für die analytische Molekularsiebfiltration, welche vor der Chromatographie an Hydroxylapatit zur Abtrennung der Fremdproteine dient, beschrieben sind. Es können die gleichen Molekularsiebe und die gleichen Säulenbedingungen verwendet werden. Bevorzugt ist Sephadex G 50 bei einem Länge-Durchmesser-Verhältnis der Säule von mindestens etwa 50 : 1 und einer Beladung von höchstens etwa 3 % des Säuleninhalts. Als Lösungsmittel und zur Eluierung werden vorzugsweise die bei der analytischen Molekularsiebfiltration benutzten Lösungsmittel eingesetzt.

Bei der Kreislaufmolekularsiebfiltration wird das Eluat bei den festgelegten Separationsgrenzen im Kreislauf wieder in die gleiche Säule geleitet. Auf diese Weise wird die Laufstrecke der Proteine differentiell verlängert. Bei einer anderen Ausführungsform der Kaskadenmolekularsiebfiltration, wird das Eluat bei den festgelegten Separationsgrenzen auf eine neue Säule mit gleichen oder ähnlich definierten

Parametern geleitet.
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Zur Rechromatographie an Hydroxy!apatit wird das LR-Präparat, vorzugsweise durch Dialyse an einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Daltons, zunächst von gegebenenfalls enthaltenen Fremdsalzen und Ammoniumsulfat befreit.

Die erhaltene Lösung des LR-Präparates wird sodann auf den Hydroxylapatit aufgebracht und mit Hilfe eines Natriumkaliumphosphat-Konzentrationsgradienten eluiert. Die das LR enthaltenden Fraktionen werden in üblicher Weise gesammelt und

konzentriert.
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Bei der Zonenpräzipitationschromatographie (vgl. J. Porath, Nature, Bd. 196 (1962), S-. 47) werden restliche Proteinverunreinigungen des LR-Präparates durch Aussalzfraktionierung der Proteine mittels eines Salzkonzentrationsgradienten abgetrennt. Dabei können Temperatur und pH-Wert, Dimension der Säule, Art des Salzes, Form des Gradienten und Beladung der Säule in einem verhältnismäßig breiten Bereich variiert werden.

Die Temperatur bei der Zonenpräzipitationschromatographie kann etwa 0 bis 40°C betragen. Bevorzugt ist ein Temperaturbereich von etwa 0 bis 10°C, insbesondere etwa 4 bis 6°C. Der pH-Wert kann zwischen etwa 4 und 10 liegen; bevorzugt ist ein pH-Wert im Bereich von 6 bis 8, insbesondere etwa 7.

Das Verhältnis von Länge : Durchmesser der verwendeten Säule soll größer als etwa 10 : 1 sein, bevorzugt ist ein Verhältnis von 30 bis 100 : 1, insbesondere etwa 50 : 1. Als Salze kommen alle Proteine nicht schädigenden Salze mit Aussalzwirkung in Frage. Beispiele für solche Salze sind Natrium-

SQ kaliumphosphat, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat. Bevorzugt wird Ammoniumsulfat verwendet.

Der Salzkonzentrationsgradient kann jede beliebige Form haben, so lange die Aussalzpunkte der Proteine laufstreckenmäßig getrennt sind. Bevorzugt sind lineare Konzentrationsgradienten, insbesondere ein ansteigender linearer Konzentra-

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tionsgradient von 25 bis 80 % AmmoniumsulfatSättigung. Die Beladung der Säule beträgt höchstens etwa 5 %, vorzugsweise etwa 1 %.

Die analytische Molekularsiebfiltration zur zusätzlichen Reinigung des LR-Präparates kann in der gleichen Weise durchgeführt werden wie die analytische Molekularsiebfiltration, die vor der Chromatographie an Hydroxylapatit zur Abtrennung der Fremdproteine dient. Es eignen sich die gleichen Molekularsiebe und die gleichen Säulenbedingungen.

Bereits mit einem der genannten zusätzlichen Reinigungsschritte kann eine beträchtliche Abtrennung der neben LR noch in dem LR-Präparat enthaltenen Fremdproteine erreicht werden. Beispielsweise wird durch Rechromatographie an Hydroxylapatit ein LR-Präparat erhalten, dessen Proteingehalt zu etwa 50 bis 70 % aus LR besteht. Durch Zonenpräzipitationschromatographie wird der LR-Anteil der Proteine des LR-Präparates auf mehr als 98 % und durch analytische Molekularsiebfiltration auf etwa >99 % erhöht. Wenn nur ein einziger zusätzlicher Reinigungsschritt durchgeführt wird, ist die Zonenpräzipitationschromatographie bevorzugt.

Grundprinzip der Proteintrennung mittels der Zonenpräzipitationschromatographie sind unterschiedliche, strukturgegebene reversible Löslichkeitseigenschaften der Proteine. Sie gehören zu den empfindlichsten molekularen Trennparametern und wurden häufig als Kriterium für den Nachweis der molekularen Einheitlichkeit eines Proteins verwendet. Dies begründet die Bevorzugung der Zonenpräzipitationschromatographie vor den verschiedenen erwähnten Arten der Rechromatographiemethoden, bei welchen die Reinigungseffekte durch bessere Annäherung an ideale Gleichgewichte in nicht idealen Systemen erzielt werden.
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Für eine therapeutische Verwendung wird das LR vorzugsweise durch eine Kombination von mindestens zwei der genannten Reinigungsschritte praktisch vollständig von Fremdproteinen befreit. Bevorzugt ist insbesondere eine Ausführungsform, bei der das durch Chromatographie an Hydroxylapatit erhaltene LR-Präparat zunächst einer Kreislaufmolekularsiebfiltration unterzogen, dann an Hydroxylapatit rechromatographiert, danach einer Zonenpräzipitationschromatographie und abschließend einer analytischen Molekularsiebfiltration unterzogen und dann kristallisiert wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Rechromatographie an Hydroxylapatit auch nach der Zonenpräzipitationschromatographie durchgeführt werden. In diesen bevorzugten Ausführungsformen wird eir. LR-Präparat erhalten, dessen Proteingehalt zu mehr als 99 % aus LR-Protein besteht. Danach ist das Leukorekrutinpräparat in molekular einheitlichem Zustand nach allen zur Verfügung stehenden chromatographischen, elektrophoretischen und Lösungskriterien, welche durch Molekülgröße, -Stabilität, -ladung und Oberflächenbeschaffenheit charakterisiert sind, d.h. die Leukorekrutinlösung besteht aus einer homogenen monodispersen Proteinphase.

Die Temperatur- und pH-Bedingungen sind, wie vorstehend an verschiedenen Stellen bereits bemerkt wurde, in den meisten stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht besonders kritisch. Wenn die Gewinnung von LR in nativer Konformation gewünscht wird, müssen die Trenn- und Reinigungsstufen jedoch unter im wesentlichen physiologischen pH- und Salzbedingungen und vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen von höchstens etwa

^ou 10°C/ vorzugsweise höchstens etwa 6⁰C durchgeführt werden. Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Einhaltung dieser Bedingungen erstmals leicht möglich ist.

Das erhaltene LR kann in einer gepufferten physiologischen Salzlösung, beispielsweise in 0,0015 mol/1 Natriumkalium-

phosphatlösung, die 0,15 mol/1 (0,9 %) NaCl und 0,001 mol/1 Cyyteiri on thai t und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, nach üblicher Filtersterilisation (0,2 μΐη Porenweite) nativ und biologisch aktiv auch bei Raumtemperatur (für mindestens 200 Stunden) oder eingefroren bei -25⁰C (für mindestens 5 Jahre) aufbewahrt werden. Diese Stabilität des Proteins kann unter anderem als eines der Kriterien für die molekulare Einheitlichkeit angesehen werden. Die sichere Aufbewahrungsform bei Temperaturen zwischen -20 und +50⁰C ist die kristalline Form als Kristallsuspension, da sie infolge des hohen osmotischen Druckes gegen Infektion durch Mikroorganismen und deren Wachstum geschützt ist.

Zur Kristallisation des Leukorekrutins wird die steril fil- ^ trierte Proteinlösung, welche 0,2 mol/1 Natriumkaliumphosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5, 10 % Glycerin, 0,2 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein, 0,1 mol/1 KCl und 20 mg/ml Leukorekrutinproben enthält, so lange mit festem, feinpulverisiertem Ammoniumsulfat (Suprapur) bei 20°C versetzt, bis ein leichter Schleier einer Trübung durch Proteinaussalzpräzipitation erscheint. Diese geringe Proteinfällung wird durch rasches Zentrifugieren entfernt (10 000 χ g; 5 Minuten). Durch Zugabe einer sehr kleinen Menge Ammoniumsulfatlösung (gesättigt) wird in der klaren Proteinlösung ein seidenglänzendes Präzipitat doppelbrechender, optisch anisotroper Leukorekrutinkristalle erzeugt, welche innerhalb eines Monats beim Stehen bei 0 bis 20°C größer werden durch langsames Wachstum. Durch langsame Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration kann dieses Umfällwachstum begünstigt werden. Die Lösungen der

° Kristalle haben die gleichen molekularen Eigenschaften wie die zur Kristallisation eingesetzte Leukorekrutinlösung.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wird die Gewinnung von LR ausgehend von Schweineblut beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Ausführungsform beschränkt. Es kann auch Blut anderer Säuger verwendet werden.

Beispiele A. Herstellung von Leukorekrutin im Serum. Regulierte und limitierte Proteolyse des Serums durch Kontaktaktivierung und Abtrennen der Leukorekrutin enthaltenden Serumhauptproteinrohfraktion von den übrigen Bestand- teilen des Serums und Bereitung eines Leukorekrutin enthaltenden Serumhauptproteinrohkonzentrates

Es wird die Herstellung von LR im Serum durch Kontaktaktivierung, die Abtrennung der Serumhauptproteinrohfraktion von den übrigen Bestandteilen des Serums und die Bereitung eines Leukorekrutin enthaltenden Serumproteinrohkonzentrates erläutert. Sämtliche Arbeitsschritte werden bei 0 bis 8⁰C durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Zentrifugationen erfolgen wie beschrieben, entweder einstufig oder zweistufig (als Durchflußzentrifugation).

300 Liter Schweineblut werden ohne Zusätze bei Raumtemperatur koagulieren gelassen. Der Blutkuchen wird durch Filtrieren oder Dekantieren vom Rohserum getrennt. Das überstehende Serum wird durch Zentrifugieren von restlichen Blutkuchenrückständen abgetrennt. Hierauf wird das klare Serum sofort mit gekörntem, unlöslichem, gelguellbaren Dextran in einer Menge von 5 mg/ml Serum oder mit gekochter und gewaschener Bäckerhefe in einer Menge von 100 mg/ml Serum versetzt und 1 Stunde bei 37⁰C unter Rühren im Wasserbad inkubiert. Danach wird das Gemisch auf 4⁰C abgekühlt,und das Dextran bzw. die Bäckerhefe wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Anwesenheit von LR in den erhaltenen 120 Litern kontaktaktiviertes Serum, das etwa 9,2 kg Protein enthält, kann durch eines der beschriebenen Testverfahren nachgewiesen werden (biologisch: Leukozytosereaktion in vivo; Mobilisierung der Knochenmarkleukozyten in vitro; physikalisch-chemisch: durch Immunodiffusion und Immunelektrophorese mit anti-Leukorekrutin-Immunglobulinfraktionen).

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Folgende Reinigungsarbeiten werden dann in Gegenwart von 0,001 mol/1 Cystein bei Temperaturen von 0 bis 8°C ausgeführt, soweit nichts anderes angegeben ist:

120 Liter kontaktaktiviertes Serum werden mit 5 mol/1 Essigsäure auf den pH-Wert 4,5 eingestellt und mit 240 Liter 0,001 mol/1 Kaliumphosphat-Acetat-Pufferlösung versetzt, die 0,2 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 4,5 aufweist. Die erhaltene Lösung wird sodann unter Rühren mit einem gequollenen, regenerierten Kationenaustauscher (Na als mobiles Austauschion) auf der Basis einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextranmatrix (CM-Sephadex C-50) in einer Menge von 1 Volumenteil Ionenaustauscher pro 3 Volumenteile Proteinlösung versetzt. Der verwendete Ionenaustauscher wird mindestens 1 Tag zur Oberflächenaktivierung mit Schweineserum vorbehandelt, vor der Verwendung regeneriert und in der Phosphat-Acetat-Pufferlösung von pH-Wert 4,5 äquilibriert.

Das erhaltene Gemisch wird etwa 24 Stunden gerührt. Danach ²^ wird das Ionenaustauschergel absetzen gelassen und durch Absaugen im Büchnertrichter vom Überstand abgetrennt. Das Gel wird sodann dreimal mit je 120 Liter 0,001 mol/1 Kaliumhydrogenphosphat-Acetat-Pufferlösung, die 0,2 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, gewaschen, bis die Extinktion E des Filtrates bei 280 nm 5 1,0 ist.

Zur Eluierung der adsorbierten Proteine wird das beladene Ionenaustauschergel dreimal in einem dem Gelvolumen entsprechenden Volumen 0,5 mol/1 Kaliumphosphatpufferlösung , welche 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert 6,5 hat, suspendiert. Das Ionenaustauschergel wird von den Lösungen jeweils durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Die erhahltenen Proteinlösungen werden vereinigt (360 Liter) .

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Die vereinigten Eluate des Kationenaustauschergels werden durch Zugabe von 630 g Ammoniumsulfat pro Liter Eluatlösung auf eine Ammoniumsulfat-Sättigungskonzentration von 90 % eingestellt. Während der Zugabe wird der pH-Wert der Proteinlösung laufend kontrolliert und durch Zusatz von 2 η Ammoniak auf 6,5 bis 7,0 gehalten. LR fällt zusammen mit sämtlichen Serumproteinen aus der Lösung aus. Der Proteinniederschlag wird durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom nahezu proteinfreien überstand abgetrennt. Es werden 49 Liter Serumhauptproteinrohkonzentrat als ammoniumsulfathaltiger Proteinschlamm erhalten, der etwa 3,5 kg Protein enthält.

Beispiele B. Grobreinigung des Leukorekrutin:

^⁵ Abtrennung des überwiegenden Teils der begleitenden Fremdproteine von LR

Beispiel B1 49 Liter des vorstehend unter Beispiel A) erhaltenen Proteinniederschlags, der eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 3,7 mol/1 aufweist, werden zur fraktionierten Eluierung mit 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,1 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,3 hat, in einer Menge von 0,4 Volumenteilen pro VoIumenteil Proteinschlammkonzentrat versetzt und etwa 24 Stunden gerührt. Danach wird der ungelöst gebliebene Proteinniederschlag, der praktisch das gesamte LR enthält, durch Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom überstehenden Eluat getrennt. Es verbleiben etwa 70 % (2,7 kg Protein) des eingesetzten Proteinkonzentrates, das immer noch die Form eines Schlammes hat (Volumen etwa 14 Liter). Dieses wird gegen 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,1 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, an einer Membran mit der Ausschlußgrenze von 1000 Daltons dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen. Es werden 40 Liter ammoniumsulfatfreie Proteinlösung erhalten, die gemäß C) auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden.

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BeispielB2

49 Liter des vorstehend unter Beispiel A erhaltenen Proteinrohkonzentrates werden zur" fraktionierten Fällung in einem möglichst kleinen Volumen 0,01 mol/1 Ammoniumacetat-Pufferlösung, die 0,2 mol/1 NaCi und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 5,0 aufweist, gelöst. Sodann wird die erhaltene Lösung mit Eisessig unter leichtem Rühren auf den pH-Wert 4,0 eingestellt und bei einer Temperatur von O⁰C mit 0,2 Volumenteilen 96prozentigem Äthanol pro Volumenteil Proteinlösung versetzt. Während der Äthanolzugabe werden Temperatur und pH-Wert konstant gehalten. Das erhaltene Gemisch wird 1 Stunde bei O⁰C gerührt. Es fallen 70 % (2,45 kg) der Fremdproteine aus, die durch einstündiges Zentrifugieren bei mindestens 16 000 χ g vom LR enthaltenden überstand abgetrennt werden. Der abgetrennte Proteinniederschlag (10 Liter) wird viermal mit dem gleichen Volumen 0,01 mol/1 Ammoniumacetat-Pufferlösung, die 0,2 mol/1 NaCl , 0,001 mol/1 Cystein und 200 ml Äthanol pro Liter Puffer enthält und einen pH-Wert von 4,0 aufweist, bei einer Temperatur von O⁰C gewasehen. Die Waschlösungen werden mit dem Überstand der Zentrifugierung vereinigt und mit 2 mol/1 Ammoniak auf den pH-Wert 5,0 eingestellt. Anschließend wird das Äthanol durch Lyophilisierung, Molekularsiebfiltration, Ultrafiltration oder Dialyse (Ausschlußgrenze 1000 Daltons) gegen den Ammoniumacetatpuffer abgetrennt. Im Falle der Ultrafiltration, Dialyse und Molekularsiebfiltration werden aus der erhaltenen alkoholfreien Lösung die Proteine durch Zugabe vom Ammoniumsulfat (90 % Sättigung) gefällt und durch Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom proteinfreien Überstand abgetrennt. Der durch Lyophilisieren oder Fällung erhaltene Proteinrückstand (1,05 kg Protein) wird gemäß Beispiel 1 von Ammoniumsulfat durch Ultrafiltration oder Dialyse befreit und kann dann als ammoniumsulfatfreie Lösung (Volumen 16 Liter) gemäß C) auf die Hy-

droxylapatitsäule aufgebracht werden. 35

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BeispielB3

49 Liter des gemäß Beispiel A) erhaltenen Proteinniederschlags werden in 0,01 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,7 aufweist, in einer Menge von 2 Volumenteilen Pufferlösung pro Volumenteil Proteinkonzentrat gelöst und zur Abtrennung einer kleinen Menge ungelösten Rückstandes 30 Minuten bei 4⁰C und 10 000 χ g zentrifugiert. Sodann wird die klare Lösung (147 Liter) einer präparativen Molekularsiebfiltration unterzogen, indem sie auf eine mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex G-50; 50 bis 150 μΐη Teilchengröße) gefüllte Säule aufgetragen wird. Die Säule hat das 10-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge zu Durchmesser) von 10 : 1· Danach wird die Säule mit einem dem Säulenvolumen entsprechenden Volumen 0,01 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält und einen pH-Wert von 6,7 aufweist, bei aufwärts gerichtetem Fluß (3 cm/h) eluiert. Das Eluat wird in zwei Fraktionen mit einer Separationsgrenze von 20 000 aufgeteilt. Die Fraktion mit dem Molekulargewicht > 20 000 Daltons enthält . 85 % der eingesetzten Proteinmasse. Die LR enthaltende Fraktion (0,5 kg Protein) mit dem Molekulargewicht 4. 20 000 Daltons wird gesammelt. Die Proteine dieser Fraktion werden gemäß Beispiel B 2 lyophilisiert oder durch Fällen mit Ammoniumsulfat konzentriert und danach durch Dialyse oder Ultrafiltration an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Daltons vom Ammoniumsulfat befreit. Die erhaltene Lösung, die nur noch 15 % der ursprünglichen Proteinmasse (7,5 Liter) enthält und ein Volumen von 22,5 Liter aufweist, kann gemäß C) auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden.

Beispiel -B4

49 Liter des gemäß Beispiel A) erhaltenen Proteinniederschlags werden gemäß Beispiel B 1 fraktioniert eluiert. Die erhaltenen, LR enthaltenden 14 Liter Proteinschlamm werden ge-

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3 O 3 4 b 2 y

maß Beispiel B 3 in der dort genannten Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung gelöst und an Sephadex G-50 chromatographiert. Die Fraktion mit einem Molekulargewicht 20 000 Daltons wird gesammelt, lyophilisiert oder mit Ammoniumsulfat konzentriert und anschließend dialysiert oder ultrafiltriert an einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Dalton. Es werden 6,0 Liter ammoniumsulfatfreie Proteinlösung mit einem Gehalt von 0,4 kg Protein erhalten.

Beispiel B5 49 Liter des gemäß Beispiel A) erhaltenen Proteinniederschlags werden gemäß Beispiel B 2 mit Äthanol behandelt. Der erhaltene Proteinrückstand (1,05 kg Protein) wird danach gemäß Beispiel B 3 aufgelost und chromatographiert. Es werden 2,3 Liter ammoniumsulfatfreie Proteinlösung mit einem Gehalt von 160 g Protein erhalten.

Beispiel B6

49 Liter des gemäß Beispiel A) erhaltenen Proteinnieder-Schlags werden gemäß Beispiel B 4 fraktioniert eluiert und danach einer präparativen Molekularsiebfiltration unterzogen.

Nach dem Konzentrieren der Proteine der Fraktion mit einem Molekulargewicht 20 000 Daltons durch Lyophilisieren, Ultrafiltration an einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Daltons oder durch Fällen mit Ammoniumsulfat wird der erhaltene, LR enthaltende Proteinniederschlag in 0,01 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,7 aufweist, in einer Menge von 1,5 Volumenteile Pufferlösung pro Volumenteil Proteinniederschlag gelöst. Nach dem Abzentrifugieren von wenig ungelöst gebliebenem Rückstand wird die Lösung zur zweiten präparativen Molekularsiebfiltration auf eine mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex G-50; 50 bis 150 um Teilchengröße) gefüllte Säule aufgetragen, die das 10-fache Volumen

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der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 10:1 aufweist. Hierauf wird die Säule bei aufwärts gerichtetem Fluß (3 cm/h) mit 0,01 mol/1 Natriumkai lumphosphat-Puff er lösung, die 0,3 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält und einen pH-Wert von 6,7 aufweist, eluiert. Das erhaltene Eluat wird in drei Fraktionen mit den Separationsgrenzen 20 000 und 13 000 Daltons aufgetrennt. Die LR enthaltende Proteinfraktion mit einem Molekulargewicht 13 000 Daltons enthält 130 g Protein. Sie wird zur Proteinkonzentrierung lyophilisiert, ultrafiltriert an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Daltons oder auf eine Ammoniumsulfat-· konzentration von 3,7 mol/1 eingestellt. Der ausgefallene Proteinniederschlag wird durch Zentrifugieren vom überstand

15 abgetrennt.

Der erhaltene, LR enthaltende Proteinniederschlag wird in 1,5 Volumenteilen der in der vorangehenden Molekularsiebfiltration verwendeten Pufferlösung (ohne Ammoniumsulfat) gelöst und zur Entfernung von wenig ungelöstem Rückstand 1 Stunde bei 10 000 χ g zentrifugiert.

Die erhaltene klare Lösung wird zur analytischen Molekularsiebfiltration auf eine Säule aufgebracht, die mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex G-50) mit einer Teilchengröße von 20 bis 80 μπι gefüllt ist. Die verwendete Säule besitzt das 50-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 50:1. Zur Eluierung beim Aufwärtsfluß (3 cm/h) wird eine 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält, verwendet. Das Eluat wird in mehrere Fraktionen aufgeteil, in welchen die LR-Anwesenheit wie beschrieben, nachgewiesen wird. Die Fraktion mit dem Molekulargewichtsbereich von 11 000 bis 6 000 Daltons, die im wesentlichen das gesamte LR enthält, wird abgetrennt. Sodann wird diese

ORIGINAL INSPECTED

Fraktion auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3,7 mol/1 eingestellt und der ausgefallene Proteinniederschlag durch Zentrifugieren vom überstand getrennt. Ausbeute: 180 ml Proteinkonzentrat mit einem Gehalt von 9,0 g Protein.

In den Fig. 6 bis 8 ist der Verlauf der Abtrennung des LR von den Begleitproteinen durch Molekularsiebfiltration gemäß Beispiel B 6 in Form von Chromatogrammen wiedergegeben.

Beispiel B7 49 Liter des gemäß A) erhaltenen ProteinniederSchlags werden gemäß Beispiel B 1 fraktioniert eluiert. Die erhaltenen 14 Liter Proteinschlamm werden sodann gemäß Beispiel B 2 mit Äthanol behandelt. Der erhaltene Proteinrückstand (1,05 kg Protein) wird gemäß Beispiel B 6 der zweiten der dort beschriebenen präparativen Molekularsiebfiltration und anschließend der analytischen Molekularsiebfiltration ebenfalls gemäß Beispiel B 6 unterzogen. Es wird das gleiche Ergebnis wie in Beispiel B 6 erhalten.

Beispiel B8

49 Liter des gemäß A) erhaltenen Proteinniederschlags werden zunächst gemäß Beispiel B 5 mit Äthanol behandelt und einer präparativen Molekularsiebfiltration unterzögen. Danach wird der erhaltene Proteinrückstand (160 g Protein) gemäß Beispiel B 6 der zweiten präparativen und anschließend der analytischen Molekularsiebfiltration unterzogen. Es wird das gleiche Ergebnis wie in Beispiel B 6 erhalten.

BeispielB9

O,49 Liter des vorstehend unter A) erhaltenen Proteinniederschlags werden in einem möglichst kleinen Volumen 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,2 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält, und einen pH-Wert von 6,6 aufweist, gelöst und zur Abtrennung einer kleinen Menge ungelösten Rückstan-

des 30 Minuten bei 16 000 χ g zentrifugiert. Danach wird die Lösung 24 Stunden gegen 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,2 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,6 aufweist, an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Dalton dialysiert, bis keine Sulfationen mehr nachweisbar sind. Sodann werden 60 ml Calciumphosphatgel, äquilibriert mit der genannten Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, in die Proteinlösung eingerührt. Das erhaltene Gemisch wird 1 Stunde gerührt. Danach

10- wird das Gel zur Abtrennung 5 Minuten bei 10 000 χ g zentrifugiert und dreimal mit der genannten Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 6,6 gewaschen. Dazu wird das Gel in einer möglichst kleinen Menge der Pufferlösung suspendiert und durch Zentrifugieren wieder abgetrennt. Alle proteinhaltigen Lösungen werden sodann vereinigt und durch Zusatz von Ammoniumsulfat ausgefällt und konzentriert. Der erhaltene Proteinniederschlag (etwa 30 g Protein) wird gemäß Beispiel B 1 durch Dialyse von Ammoniumsulfat befreit und kann dann als ammoniumsulfatfreie Lösung gemäß C) auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden.

Beispiel B 10

0,49 Liter des vorstehend unter Beispiel A erhaltenen Proteinniederschlags werden in einem möglichst kleinen Volumen 0,01 mol/1 tris-HCl-Lösung, die 0,03 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 8,0 hat, gelöst. Die etwas trübe Lösung wird an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Daltons solange gegen den Lösungspuffer dialysiert, bis keine Sulfationen mehr nachweisbar

³^ sind. Sodann werden in ein Volumenteil dieser erhaltenen klaren Lösung unter Rühren 2 Volumenteile eines gequollenen regenerierten und im oben genannten Puffersystem äquilibrierten Anionenaustauschers (Cl als mobiles Austauschion) auf der Basis einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextranmatrix (DEAE-Sephadex-A 50) zugesetzt.

J ORfGINAL INSPECTED

Das erhaltene Gemisch wird 5 Stunden gerührt. Danach wird das Ionenaustauschergel absetzen gelassen und durch Absaugen im Büchner-Trichter vom Überstand abgetrennt. Das Gel wird sodann dreimal mit 4 Liter der oben genannten Absorptionspufferlösung gewaschen, bis die Extinktion des Filtrates bei 280 nm =1,0 ist.

Zur Elution des LR und der adsorbierten Proteine wird das beladene Ionenaustauschergel dreimal mit einem dem doppelten Gelvolumen entsprechenden Volumen 0,01 mol/1 Piperazin-HCl-Puffer, der 2,0 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,5 hat, unter Rühren suspendiert. Das Ionenaustauschergel wird von den Lösungen jeweils durch Dekantieren, Filtrieren (im Büchner-Trichter) oder Zentrifugieren abgetrennt. Die erhaltenen Proteinlösungen werden vereinigt (6 Liter) und das darin enthaltene LR und die anderen Proteine in üblicher, beschriebener Weise vorzugsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat konzentriert. Der erhaltene Proteinniederschlag (etwa 25 g Protein) wird gemäß Beispiel B 1 durch Dialyse von Ammoniumsulfat befreit und kann als ammoniumsulfatfreie Lösung gemäß Beispiel C auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden.

Beispiele C. Feinreinigung des Leukorekrutin zur molekularen Homogenität: Gewinnung von LR durch Chromatographie an Hydroxylapatit, weitere Reinigung und Kristallisation des LR

Beispiel C1 Der gemäß Beispiel B 6 erhaltene Proteinniederschlag wird in möglichst wenig O,OO15 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,15 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält, gelöst und gegen 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,1 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist durch Molekularslebfiltration, Ultrafiltration oder Dialyse entsalzt (Ausschlußgrenze 1000 Daltons), bis in der Dialysen-

L ^J

^0/5.29

Γ Π

- 61 -

Pufferlösung kein Sulfat mehr nachzuweisen ist. Sodann wird ein kleiner Anteil an unlöslichen Proteinen durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g entfernt.

Die erhaltene klare LR enthaltende Proteinlösung (200 ml; 9,0 g Proteingehalt) wird auf eine mit Hydroxylapatit gefüllte Säule aufgetragen. Die Säule besitzt ein Verhältnis Länge zu Durchmesser von 10 : 1 und das dreifache Volumen des aufzutragenden Proteinvolumens (4 5 mg Protein/ml). Die Säule wurde vorher mit dem fünffachen ihres Volumens

0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,001 mol/1 • Cystein enthält, äquilibriert (Fluß 3 cm/h).

Die negativ adsorbierten Proteine werden durch Eluieren mit der zum Äquilibrieren der Säule verwendeten Pufferlösung ausgewaschen. Sodann wird die Eluierung der LR enthaltenden Fraktion mit einem linearen Phosphatkonzentrationsgradienten von 0,001 mol/1 bis 0,5 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7,4 unter Konstanthaltung des angegebenen NaCl und Cysteinzusatzes über einen Zeitraum von 4 Tagen durchgeführt. LR wird bei einer mittleren Phosphatkonzentration von' 0,04 mol/1 eluiert und so auch von anderen Proteinen getrennt. Der Elutionsgradient wird mit Hilfe der Leitfähigkeitsmessung verfolgt und kontrolliert. Nach üblicher Konzentrierung der LR enthaltenden Fraktionen werden 20 ml mit 900 mg Produkt erhalten, das ein Leukorekrutinpräparat mit einem Gehalt von etwa 5 bis 40 % der Proteine an. LRdarstellt. Als Lösungspuffer wird zweckmäßigerweise 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, welche 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, verwendet. Dadurch wird es möglich, jede andere Salzkonzentration durch Hinzufügen eines kleinen Volumens einer konzentrierten Salzlösung einzustellen. Beispielsweise ergibt die Zugabe von 0,05 Volumenteilen einer 2 mol/1 NaCl-Lösung vom pH-Wert 7,2 bei Bedarf eine Pufferlösung mit 0,1 mol/1 NaCl.

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ORIGINAL (MSPECTED

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- 62 -

Die Gewinnung des Leukotaxinpräparates durch Chromatographie an Hydroxylapatit gemäß Beispiel C 1 zeigt das Chromatogramm der Fig. 9.

Beispiel C2 Beispiel C 1 wird mit dem gemäß Beispiel B 2 erhaltenen Proteinniederschlag wiederholt. Nach der Ultrafiltration oder Dialyse und der Entfernung eines kleinen Anteils unlöslicher Proteine werden 16 Liter klare Lösung erhalten, die auf eine mit Hydroxylapatit gefüllte Säule mit den in Beispiel C 1 angegebenen Säulencharakteristika (Volumen 3 χ 16 Liter, Verhältnis Länge zu Durchmesser 10:1) also einem Durchmesser von 18 cm und einer Länge von 180 cm aufgetragen wird. Nach der Eluierung werden etwa 1200 mg Produkt erhalten, das ein Leukorekrutinpräparat mit einem Gehalt von etwa 5 bis 10 % LR darstellt. .

Beispiel C 3 Das gemäß Beispiel C 1 erhaltene LR-Präparat wird in 0,1 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,1 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 1 mol/1 Ammoniumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, zu einer Proteinkonzentration von etwa 45 mg/ml gelöst. Die erhaltene Lösung (20 ml) wird bei einer Temperatur von 4⁰C auf eine Säule aufgebracht, die mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex G-50) gefüllt ist. Die Matrix befindet sich in einem ansteigenden linearen Ammoniumsulfat-Konzentrationsgradienten von 1,0 bis 3,2 mol/1 Ammoniumsulfat (25 bis 80 % Sättigung) . Die Steiguncfcles Gradienten beträgt + 2 % Ammoniumsulfatsättigung/cm Säulenhöhe (0,08 mol/1 (NH₄)₂SO₄/cm), wobei der Bereich des Gradienten über etwa die halbe Säulenlänge reicht.

Das Verhältnis Länge : Durchmesser der Säule beträgt 50 :1, das Säulenvolumen ist 100 mal größer als das Auftragsvolumen. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 2 cm/h.

L J

334

Die Eluierung erfolgt mit der vorstehend genannten Natriumkaliumphosphatlösung, die 1 mol/1 Ammoniumsulfat enthält. Die LR enthaltenden Fraktionen, welche bei 61 % Ammoniumsulfatsättigung eluieren, werden gesammelt und die Proteine in üblicher Weise konzentriert. Es werden 340 mg (8 ml) gereinigtes Leukorekrutinpräparat erhalten, das zu etwa 70 % aus ΛΤ und CT besteht.

Als Lösungspuffer wird zweckmäßigerweise wie in Beispiel C 1 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0/001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, verwendet.

Beispiele 4

Das gemäß Beispiel C 1 nach Proteinkonzentrierung durch Ammoniumsulfatfällung, Ultrafiltration oder Lyophilisieren erhaltene LR-Präparat (900 mg; etwa 20 ml) wird in 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, aufgelöst. Anschließend wird ein kleiner Anteil an unlöslichen Proteinen durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 48 000 χ g entfernt.

Hierauf wird die erhaltene klare Lösung einer analytischen Kreislaufmolekulargewichtsfiltrationschromatographie unterzogen. Dazu wird die Lösung bei einer Temperatur von 4⁰C auf eine mit Sephadex G-50 mit einer Teilchengröße von 20 bis 80 μπι gefüllte Säule aufgebracht, die das 50-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 50 : 1 besitzt. Die Eluierung erfolgt mit einer 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält. Die Eluate werden bei einer Separationsgrenze

von 9 000 Daltons dreimal im Kreislauf geführt. 35

' QPlGINAl

Nach üblicher Proteinkonzentrierung werden 810 mg LR enthal-" tendes Produkt mit einem Molekulargewicht von 85.00 Daltons erhalten, welche in einem kleinstmöglichen Volumen von 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung mit 0,001 mol/1 Cystein und einem pH-Wert von 7,20 aufgelöst werden.

Das vorstehend erhaltene Produkt wird anschließend an einer mit Hydroxylapatit gefüllten Säule, welche im angegebenen Puffersystem äquilibriert ist und ein Verhältnis Länge zu Durchmesser von 20 : 1 und mindestens das 5-fache Volumen des aufzutragenden Proteinlösungsvolumens (etwa 45 mg Protein/ml) hat, im obengenannten Puffersystem chromatographiert und mit einem Phosphatkonzentrationsgradienten, der unter Beibehaltung des pH-Wertes und der Cysteinkonzentration im Konzentrationsbereich von 0,001 bis 0,1 mol/1 Natriumkaliumphosphat flach linear ist, über 6 Tage eluiert. Es werden 405 mg gereinigtes Leukorekrutinpräparat erhalten, dessen Proteinanteil zu etwa 50 bis 70 % als LR besteht.

Das vorstehend erhaltene LR-Präparat wird nun gemäß Beispiel C 3 einer Zonenpräzipitationschromatographie unterzogen. Es werden 205 mg (5 ml) weiter gereinigtes Leukorekrutinpraparat erhalten, dessen Proteinanteil zu mehr als 98 % aus

LR besteht.
25

Abschließend wird das vorstehend durch Zonenpräzipitationschromatographie gereinigte LR-Präparat einer analytischen Molekularsiebfiltration unterzogen. Das LR-Präparat wird in 0,0015 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, zu einem Gesamtvolumen von 5 ml mit einer Proteinkonzentration von etwa 35 bis 45 mg/ml gelöst. Die erhaltene klare Lösung wird auf eine Säule aufgebracht, die mit Sephadex G-50 mit einer Teilchengröße von 20 bis 80 μΐη gefüllt ist. Die verwendete Säule besitzt mindestens das 50-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser)

L J.

C34529

von mindestens 50 : 1. Zur Eluierung wird eine 0,03 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl, 0,001 mol/1 Cystein und 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, verwendet (Fluß: 3 cm/h).

Nach üblicher Konzentrierung werden 200 mg (5 ml) Leukorekrutinpräparat erhalten, dessen Proteinanteil zu mehr als 99 % aus LR besteht (Ausbeute: etwa 10 %).

Die Endreinigung des Leukorekrutins gemäß Beispiel C 4 ist in den Chromatogrammen der Figuren 10 bis 13 dargestellt.

Nach Entsalzen durch Dialyse, Ultrafiltration oder Molekularsiebfiltration mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Daltons gegen eine pyrogenfreie physiologische Salzlösung (z.B.

0,0015 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, welche 0,15 mol/1 (= 0,9 %) NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist) kann das LR-Präparat nach Filtersterilisation (0,2 μΐη Porenweite) für biologische, physiologische, pharmakologische oder biochemische Zwecke direkt verwendet oder kristallisiert werden. Die Kristalle können umgekehrt durch. Dialyse gegen die genannte physiologische Kochsalzlösung an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 1000 Daltons wieder in eine verwendbare Lösungsform gebracht werden.

ORIGINAL INSPECTED

Claims (35)

2034529 VOSSIUS-VOSSIUS-TAUCHNER · M EUIÜEMAN N · RAUH PATENTAfJ WALTE -' ... SIEBERTSTRASSE A ■ 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O8 9) 474075 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN ■ TELEX 5-29 453 VOPAT D u.Z.: P 785 (Ra/kä) Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen, Bunsenstr. 10 Leukorekrutin: Ein Entzündungsmediatorprotein aus Säugerserum zur Induzierung einer Leukozytosereaktion, Herstellungsverfahren, Gewinnung in molekular einheitlicher, kristallisierbarer und biologisch spezifisch wirkender Form und Leukorekrutin enthaltendes Arzneimittel " Patentansprüche

1. Leukozytose induzierendes (Leukozyten rekrutierendes) Protein (Leukorekrutin), gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:
a) biologische Wirkungen in vivo und in vitro:

- positive Leukozytosereaktion und Leukozytenrekrutierung in das Blut in vivo;

- positive Leukozytenmobilisierung direkt aus dem Knochenmark in vitro;

- keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest;

- keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

- keine spasmogene Aktivität auf gestreifte Muskulatur;

- kein Endotoxingehalt und keine endotoxingleichen oder -ähnlichen Wirkungen;

- keine chemische Anlockung (Chemotaxis) von Leukozyten in vitro;

ORIGINAL INSPECTED

- keine positive oder negative chemokinetische Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

- keine signifikante pyrogene Wirkung in vivo;

- keine Lysewirkungen auf Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten in vitro;

- keine Entzündungswirkung in situ,

- positive biologische Aktivität (Leukozytosereaktion)

(vollständig hemmbar durch heterologe, spezifische anti-Leukorekrutin-Antikörper-Serumfraktionen (anti-Leukorekrutin-Immunoglobuline);

b) physikalisch-chemische Eigenschaften:

- Typische Proteineigenschaften und Proteinreaktionen (Folin- und Biuretreaktionen);

- Schmelzpunkt: etwa 2OO°C (Zers. unter Luft- und Sauerstoffausschluß);

- kein normaler freier und selbständiger Blut-, Blutplasma- oder Blutserumbestandteil;

- es entsteht durch regulierte, limitierte Proteolyse bei Kontaktreaktionen des Blutes, Blutplasmas oder Blutserums, auch in zellfreien in vitro Systemen als humoraler Mediator;

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 8500 Daltons;

- keine Proteinquartärstruktur in Form physikalisch gebundener Peptiduntereinheiten: natives Protein besteht nur aus einer I'eptideinheit;

- elektrophoretische Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamidmatrizen: anodisch;

- löslich in wäßrigen Medien einschließlich 20 % Äthanol bei einem pH-Wert von mindestens 4,0 bis 10;

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1 - unlöslich in (NH₄)_SO.-Lösung bei einer Sättigung über 61 % (2,50 mol (NH₄J₂SO₄/!);

- konstanter Temperaturkoeffizient der Löslichkeit in Ammoniumsulfatlösungen zwischen -10°C und +5O⁰C;

5 - es kristallisiert in doppelbrechenden optisch anisotropen Kristallen aus Ammoniumsulfatlösungen mit über 61 % Ammoniumsulfatsättigung;

- unlöslich in Chloroform, Benzol, Xylol und anderen apolaren, nicht wäßrigen und mit Wasser nicht mischba-

¹⁰ ren Lösungsmitteln;

- denaturiert in Chloroform, Benzol und Xylol; Zerstörung der Konformationsstruktur,(Sekundär- und Tertiärstruktur) und der biologischen Aktivität;

- es enthält unter anderem die Aminosäuren Tyrosin,

'5 Tryptophan, Phenylalanin, Alanin, Glycin, Lysin, Serin, . Valin, Glutaminsäure, Arginin, Leucin;

- Adsorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Figur 1;

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle I: 20

Tabelle I

0⁰C) ± ^6%

Tabelle I Wellenlänge, nm 1 mg, 1 cm (H„0 280 0,53 260 0,42 277 (max) 0,54 250 (min) 0,36 290 0,32 400 0 450 0 500 0 550 0 600 0 700 0 850 0 900 0 1000 0 ^E28O^/E26O 1 ,26

L *28O^/Ji2fiO ^Ί'^ -J

ORIGINAL INSPECTED

- es adsorbiert reversibel in Struktur und biologischer Aktivität an Anionen- und Kationenaustauschern, Calciumphosphatgel und Hydroxylapatit und kann nativ der Volumenverteilungschromatographie unterworfen werden.

2. Leukozytose induzierendes Protein, erhältlich durch regulierte und limitierte Proteolyse mittels Kontaktaktivierungsreaktion von Säugerserum oder Säugerplasma oder Säugerblut, Abtrennen des Proteins in Form eines Serumproteinrohkonzentrates von den anderen Bestandteilen und Fremdproteinen des Serums und/oder anschließende Chromatographie des Proteins aus dem kontaktaktivierten Serum oder dem Serumproteinrohkonzentrat an Hydroxylapatit.

3. Protein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es nach der Chromatographie an Hydroxylapatit weiter gereinigt worden ist.

4. Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des Leukozytose ²^ induzierenden Proteins nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Säugerserum einer regulierten und limitierten Proteolyse durch Kontaktaktivierung unterwirft, anschließend das Protein in Form eines Serumproteinrohkonzentrates von den anderen Bestandteilen und Fremdproteinen des Serums abtrennt und/oder das Protein durch Chromatographie an Hydroxylapatit von anderen Serumproteinen abtrennt und dadurch das Leukorekrutin gewinnt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daßman zur schnellen, kurzfristigen Herstellung von Leukorekrutin im Plasma, Serum oder Blut eine spezielle physikalische Form von Dextran (gekörntes, unlösliches, zum Gel quellbares Dextran) oder Bäckerhefe zur Kontaktaktivierungsreaktion

verwendet.
35

L J

Γ - ' ^:'--: - :": ^: 3 G 3 4 5 2 9π

6. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des Serumproteinrohkonzentrates das kontaktaktivierte, Leukorekrutin enthaltende Säugerserum einem Kationenaustauschereintopf- oder -chromatographieverfahren unterwirft und durch Positivadsorption eine Leukrorekrutin enthaltende Hauptproteinfraktion des kontaktaktiviertem Serums von anderen, negativ adsorbierenden Serumbestandteilen abtrennt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kationenaustauscherreaktion ohne Notwendigkeit der Dialyse, Ultrafiltration oder Lyophilisierung des kontaktaktivierten Serums bei hoher Ionenstärke im Bereich physiologischer Ionenstärke (äquivalent in 0,15 mol/1 NaCl) durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kationenaustauscherreaktion in Systemen mit 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Acetat, das 0,2 mol/1 enthält und einen pH-Wert von 4,5 hat, an CM-Sephadex C 50 als Kationenaustauscher durchführt.

9. Verfahren nach Anspruch 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das am Kationenaustauscher adsorbierte Leukorekrutin durch Puffersysteme eluiert, welche mehr als 0,2 mol/1 Natriumkaliuraphosphat und/oder mehr als 0,2 mol/1 NaCl enthalten und einen pH-Wert größer als 4,5 haben.

10. Verfahren nach Anspruch 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Chromatographie an Hydroxylapatit einen Teil

der Leukorekrutin begleitenden Premdproteine aus dem kontaktaktiviertem Serum oder aus dem erhaltenen Serumproteinrohkonzentrat durch Positivadsorption an Calciumphosphatgel abtrennt.
35

L -J

CRiGiNAL INSPECTED

^Γ -6-

11. Verfahren nach Anspruch 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Chromatographie an Hydroxy!apatit einen Teil der Leukorekrutin begleitenden Fremdproteine aus dem kontaktaktiviertem Serum oder dem erhaltenen Serumproteinrohkonzentrat durch Negativadsorption und/oder Ionenaustauscherchromatographie an einem Anionenaustauscher vom positiv adsorbierten Leukorekrutin abtrennt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Anionenaustauscher DEAE Sephadex A 50 verwendet, die Anionenaustauscherreaktion im Puffersystem 0,01 mol Tr is-HCl/1 durchführt, das höchstens 0,03 mol NaCl enthält und einen pH-Wert von mindestens 8,0 hat, und daß man das Leukorekrutin mit Puffersystemen eluiert, die einen NaCl-Gehalt über 0,1 mol/1 haben.

13. Verfahren nach Anspruch 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Chromatographie an Hydroxylapatit einen Großteil der^eukorekrutin begleitenden Fremdproteine aus ■ dem kontaktaktiviertem Serum oder aus dem erhaltenen Serumproteinrohkonzentrat durch fraktioniertes Eluieren und/oder Fällen mit einem wasserlöslichen Alkohol und/oder mindestens eine Molekularsiebfiltration abtrennt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekenzeichnet, daß man mindestens zwei der genannten Trennstufen nacheinander durchführt.

15. Verfahren nach Anspruch 13 und 14, dadurch gekennzeich- ^Q net, daß man das Serumproteinrohkonzentrat zunächst fraktioniert eluiert und danach den restlichen, das Leukozytose induzierende Protein enthaltenden Proteinniederschlag einer Molekularsiebfiltration unterwirft.

INSPECTED

>^ U w ! '-J t— O

^Γ -7-

16. Verfahren nach Anspruch 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serumproteinrohkonzentrat zunächst in einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit löst, aus der erhaltenen Lösung einen Teil der Fremdproteine mit einem wasserlöslichen Alkohol fällt und danach den dabei erhaltenden, das Leukozytose induzierende Protein enthaltenden Überstand einer Molekularsiebfiltration unterwirft.

17. Verfahren nach Anspruch 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serumproteinrohkonzentrat zunächst fraktioniert eluiert und danach den restlichen, das Leukozytose induzierende Protein enthaltenden Niederschlag in Wasser oder einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit zweimal einer präparativen und sodann einer analytischen Molekularsiebfiltration unterwirft.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man statt der ersten präparativen Molekularsiebfiltration eine Begleitproteinfällung mit einem wasserlöslichen Alkohol durchführt.

19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man den nach der Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol erhaltenen Überstand mindestens einmal einer präparativen uhd sodann einer analytischen Molekularsiebfiltration unterwirft.

20. Verfahren nach Anspruch 13 bis 15, 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serumproteinrohkonzentrat zur fraktionierten Eluierung mit einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 2,6 mol/1 einstellt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man als Proteine nicht schädigende Flüssigkeit eine 0,001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung verwendet, die etwa 0,1 mol/1 NaCl enthält und einen pH-Wert von etwa

6,3 aufweist.
L -J

ORIGINAL INSPECTED

22. Verfahren nach Anspruch 17 und 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste präparative Molekularsiebfiltration bei einer Temperatur von O bis 8⁰C und einem pH-Wert von 6 bis 8 an einem hydrophilen, in Wasser quellenden Molekularsieb bei einer Separationsgrenze von 20 000 Daltons durchführt.

23. Verfahren nach Anspruch 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die zweite präparative Molekularsiebfiltration bei einer Temperatur von 0 bis 8 C und einem pH-Wert von 6 bis 8 an einem hydrophilen, in Wasser quellenden Molekularsieb bei einer Separationsgrenze von 13 000 Daltons durchführt.

24. Verfahren nach Anspruch 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die analytische Molekularsiebfiltration bei

einer Temperatur von O bis 8⁰C und einem pH-Wert von 6 bis 8 an einem hydrophilen, in Wasser quellenden Molekularsieb bei Separationsgrenzen von 11 000 und 6 000 Daltons durchführt .
20

25. Verfahren nach Anspruch 16 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol ' bei einem pH-Wert von etwa 4,0 und einer Temperatur von höchstens etwa 5°C mit einer Menge von etwa 0,2 1 Alkohol pro Liter Proteinlösung durchführt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man als wasserlöslichen Alkohol Äthanol verwendet.

^O

27. Verfahren nach Anspruch 13 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß man die Molekularsiebfiltrationen in Anwesenheit von Ammoniumsulfat in einer Konzentration bis etwa 0,6 mol/1 durchführt.

L - . J

28. Verfahren nach Anspruch 13 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man das durch Chromatographie an Hydroxylapatit erhaltene Leukozytose induzierende Protein durch Kreislaufmolekularsiebfiltration und/oder Rechromatographie an Hydroxylapatit und/oder Zönenpräzipitationschromatographif¹ und/oder analytische {|oj.ekularsiebfil trat ion weiter rainigi .

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man das Leukozytose induzierende Protein zur weiteren Reinigung einer Zonenpräzipitationschromatographie unterwirft.

30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man das Leukozytose induzierende Protein zur weiteren Reinigung zunächst einer Kreislaufmolekularsiebfiltration unterwirft, dann an Hydroxylapatit rechromatograpiert, danach einer Zonenpräzipitationschromatographie und schließlich einer analytischen Molekularsiebfiltration unterwirft.

²^ 31. Verfahren nach Anspruch 4 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß man das Leukorekrutinprotein durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat bei einer Ammoniumsulfatsättigung von über 61 % (NH.) SO₄ konzentriert.

32. Arzneimittel zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes des Körpers von Säugern, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Leukozytose induzierenden Protein (Leukorekrutin) nach Anspruch 1 bis 3 und übliche Träger-,

Hilfs- und Zusatzstoffe.
30

33. Arzneimittel zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes des Körpers von Säugern und von Anomalien der Leukozytenkonzentration im Blut, gekennzeichnet durch einen Gehalt an anti-Leukorekrutin-Antikörperserum und dessen Fraktionen (anti-Leukorekrutin-Immunoglobuline).

ORIG/NAL INSPECTED

¹

34. Verwendung des Leukozytose induzierenden Proteins nach Anspruch 1 bis 3 zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes des Körpers von Säugern.

5

35. Verwendung von anti-Leukorekrutin-Antikörperseren und deren Fraktionen (anti-Leukorekrutin-Immunoglobuline) zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes des Körpers von Säugern.

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