DE3005495C2 - Production of fragments of viruses with lipid envelopes and pharmaceutical preparations containing them - Google Patents
Production of fragments of viruses with lipid envelopes and pharmaceutical preparations containing themInfo
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Description
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Erfindungsgegenstand Ist das im Patentanspruch 1 genannte Verfahren sowie die durch den Patentanspruch 9 definierten Arznelniittelzubereitungen. Die PatentansDrüche 2 bis 8 nennen Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist besonders zweckmäßig für die Behandlung von Viren, insbesondere Grippeviren, die die Gewinnung von Impfstoffen auf Basis von Grippevirusfragmenten ermöglichen.The subject matter of the invention is the method named in claim 1 and the method specified in the claim 9 defined pharmaceutical preparations. The patent claims 2 to 8 name embodiments of the method according to the invention. The method according to the invention is particularly useful for treatment of viruses, in particular influenza viruses, which require the production of vaccines based on influenza virus fragments enable.
Ein Grippeviruspartikel besteht aus einem Ribonucleinsäurekern, der mit einem Nucleoprotein assoziiert ist, das die Typspezifität des Virus bestimmt. Der Kern ist einerseits von einem inneren Proteinmantel und andererseits von einer äußeren Lipidhülle umgeben, die mit Glykoproteinvorsprüngen (oder Spießen) besetzt ist. Der Innenmantel wird gewöhnlich als Proteinmatrix (oder auch Protein M) bezeichnet. Die Lipidhülle wird als Mantel bezeichnet, und die Vorsprünge, die zu zwei verschiedenen Klassen von Glykoprotelnen gehören, werden als Neuraminidase (NA) bzw. Hämagglutlnin (HA) bezeichnet.A flu virus particle consists of a ribonucleic acid core that associates with a nucleoprotein which determines the type specificity of the virus. The core is on the one hand by an inner protein coat and on the other hand surrounded by an outer lipid shell, which is covered with glycoprotein protrusions (or skewers). Of the The inner jacket is usually referred to as the protein matrix (also known as protein M). The lipid envelope is called Coat denotes, and the protrusions, which become two different Classes of glycoproteins are called neuraminidase (NA) or hemagglutinin (HA) designated.
Es ist allgemein bekannt, daß die Neuraminidase und das Hfmagglutlnin Antigene des Grippevirus und notwendig sind, um gute Immunität beim Menschen gegen Krankheit auszulösen. Demzufolge muß jeder Grippeimpfstoff diese beiden Antlgentypen In genügenden Mengen enthalten.It is well known that neuraminidase and hfmagglutinin are antigens of the flu virus and necessary are to induce good immunity in humans against disease. As a result, everyone must have a flu vaccine Contain sufficient quantities of these two types of application.
Es Ist davon auszugehen, daß es zur Zelt drei Typen von Impfstoffen auf Basis von Inaktivierten Aniigenen gibt. Der erste Typ besteht aus Antlgenen von ganzen Viria. Dieser Impfstofftyp erzeugt bekanntlich nach der Injektion beim Menschen unerwünschte Reaktionen, die an das komplette Viruspartikel gebunden sind.It can be assumed that there are three types of vaccines based on inactivated aniigenes gives. The first type consists of genes from whole viria. This type of vaccine is known to produce after Injection in humans adverse reactions that are bound to the complete virus particle.
Ein zweiter Impfstofflyp besteht aus zersprengten und teilweise llpidfrelen Viria: Die Lipidhülle der vorher gereinigten VIrIa wird durch gleichzeitige Einwirkung eines Lösungsmittels der Lipide, z. B. Äther, und eines Detergens zerrissen. In der Praxis erfolgt die Extraktion der Lipide Im Zweiphasensystem aus Lösungsmittel und Probe. Sie erfordert die Verwendung von 1 bis 2 Raumteilen Äther pro Raumteil Viruspräparat, und diese Maßnahme kann zwei- bis dreimal wiederholt werden. Das In dieser Welse erhaltene Präparat enthält die Antigene HA und NA sowie alle Bestandteile Im Innern der Hülle, und es enthält außerdem das verwendete Detergens. Obwohl ein solches Präparat somit alle Bestandteile des Vlrlons mit Ausnahme eines Teils seiner Lipide enthält, gilt dieser zweite Impfstofftyp als weniger reaktogen als der erste TypA second vaccine glyph consists of shattered and partially llpidfrelen Viria: The lipid envelope of the previously Purified VIrIa is by simultaneous action of a solvent of the lipids, z. B. ether, and one Shredded detergent. In practice, the lipids are extracted in a two-phase system from solvent and Sample. It requires the use of 1 to 2 parts of the room Ether per room part of the virus preparation, and this measure can be repeated two or three times. This in The preparation obtained from this catfish contains the antigens HA and NA as well as all ingredients inside the casing, and it also contains the detergent used. Even though such a preparation thus contains all components of the Vlrlons with the exception of a part of its lipids, applies this second type of vaccine is less reactive than the first type
Schließlich besteht ein dritter Impfstofftyp allein aus den Glykoproteinen HA und NA. In der Praxis werden die vorher gereinigten Viria mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt, so daß lediglich JIe Vorsprünge vom Viruskern entfernt werden, der durch die Lipidhülle, die alle Inneren Bestandteile des Vlrlons umschließt, gebildet wird, und dieses Präparat wird anschließend einer Zonenfraktlonlerung unterworfen, die durch Ultrazentrlfugierung der Probe mit Dichtegradient erfolgt, wobei die leichte Fraktion des Gradienten die Antigene HA und NA und die schwere Fraktion die Kerne enthält. Aus der Tatsache, daß die Antigene HA und NA sich In der leichten Fraktion des Gradienten wiederfinden, Ist festzustellen, daß die evtl. verunreinigenden Elerelwelße sowie das Detergens In dieser Fraktion zurückgewonnen werden. Dies stellt ein Handicap für diesen Impfstofftyp dar. Schließlich Ist sein Immunisierungsvermögen bei gleichen Dosen der Antigene HA und NA bekanntlich schwächer als das des Impfstoffs auf Basis von kompletten Viria, bedingt wahrscheinlich dadurch, daß die genannten Antigene Ihre ursprüngliche Anordnung auf der Lipidhülle des Vlrlons verloren haben.Finally, a third type of vaccine consists of alone the glycoproteins HA and NA. In practice, the previously cleaned Viria are made with a surface-active Agents treated so that only any protrusions are removed from the virus core, which is covered by the lipid envelope, which encloses all internal components of the Vlrlons, is formed, and this preparation is then subjected to zone fracturing, which is achieved by ultracentrifugation of the sample with a density gradient takes place, with the light fraction of the gradient the Antigens HA and NA and the heavy fraction contains the nuclei. From the fact that the antigens HA and NA are found in the light fraction of the gradient, it can be established that the possibly contaminating Elerelwelße as well as the detergent are recovered in this fraction. This is a handicap for this type of vaccine. Lastly, is its immunization capacity known to be weaker than that of the vaccine at the same doses of the antigens HA and NA on the basis of complete viria, probably due to the fact that the antigens mentioned are their original Have lost their arrangement on the lipid envelope of the Vlrlons.
2020th
Die vorstehenden Ausführungen, die nur eine kurze Zusammenfassung darstellen, haben den Zweck, den Stand der Technik auf dem Gebiet der Erfindung darzulegen. Um diesen Stand der Technik zu veranschaulichen, wird außerdem eine Reihe von Literaturstellen genannt, die den Stand der Technik abgrenzen. Eine neuere Arbeit von Peter A. Gross und Francis A. Ennis in »The New England Journal of Medicine« vom 10. 3. 1977, Band 296, Nr. 10, Seite 567 bis 568, stellt einen Vergleich an zwischen Grippe-Impfstoffen, die aus dem ganzen Virus und aus zersprengten Viria hergestellt worden sind. Die in dieser Arbeit genannten Literaturstellen befassen sich ebenfalls mit der Technik der Herstellung von Grippe-Impfstoffen.The above statements, which are only a brief summary, have the purpose of State of the art in the field of the invention. To illustrate this state of the art, a number of literature references are also cited which delimit the state of the art. One recent work by Peter A. Gross and Francis A. Ennis in "The New England Journal of Medicine" from 10.3. 1977, vol. 296, no. 10, pages 567-568 compares flu vaccines obtained from the whole virus and from shattered viria. The references mentioned in this work also deal with the technique of making flu vaccines.
Als weitere spezialisierte Arbeiten sind insbesondere die folgenden zu nennen:The following are to be mentioned as further specialized work:
R. G. Webster und W. G. Laver »The Journal of Immunology« 96, Nr. 4 Π966) 596 ff.; »InP.uenza virus subunit vaccines; imniunogenicity and lack of toxicity or rabbits of ether- and detergent disrupted virus«.R. G. Webster and W. G. Laver "The Journal of Immunology" 96, No. 4 1966) 596 ff .; »InP.uenza virus subunit vaccines; immunogenicity and lack of toxicity or rabbits of ether and detergent disrupted virus «.
Diese Arbeit befaßt sich mit der Untersuchung von Impfstoffen, die Untereinheiten des Virus enthalten, die durch Zerreissen mit Äther und oberflächenaktiven Mitteln erhalten wurden. Es wird festgestellt, daß die Behandlung von Mlxoviren mit Äther die Beseitigung ihrer pyrogenen Aktivität ermöglicht, obwohl das erhaltene Produkt sein Immunisierungsvermögen bei Tier und Mensch bewahrt. Es wird festgestellt, daß die Detergentien außerdem die Virionen zerteilen und die hämagglutlnierenden Untereinheiten freisetzen. Der Umgang mit den Detergentien gilt als weniger gefährlich als die Handhabung des Äthers bei der Herstellung der Impfstoffe. Die Verfasser haben insbesondere Arbeiten mit dem Ziel durchgeführt, zu ermitteln, ob die durch Detergentien zerrissenen oder zerteilten Grippeviren bei Kaninchen toxisch sind, und sie verglichen quantitativ das Immunisierungsvermögen der Vlrus-Unterelnheiten mit ganzen intakten Viren und den mit Äther behandelten Viren. Als Detergentien wurden Natrlumdodocylsulfat und Natriumdesoxycholat verwendet.This work deals with the study of vaccines containing subunits of the virus by tearing with ether and surfactants. It is found that the Treatment of mlxoviruses with ether allows the elimination of their pyrogenic activity, although that is preserved Product retains its immunizing power in animals and humans. It is noted that the detergents in addition, the virions split and the hemagglutinating ones Release subunits. Handling the detergents is considered to be less dangerous than handling of the ether in the manufacture of the vaccines. The writers specifically aim to work conducted to determine whether the detergent-disrupted or disrupted flu viruses in rabbits are toxic, and they quantitatively compared immunity the Vlrus inferiorities with whole intact viruses and the viruses treated with ether. Sodium dodocyl sulfate and sodium deoxycholate were used as detergents used.
In der Arbelt von B. A. Rubin, W. A. Plerzchala und A. R. Neurath »Ellcltation of antibody response against influenza viruses by different viral subunit preparations« In »Archiv für Virusforschung«, Band 20H2, Seite 268 ff., untersuchen die Verfasser Viruspräparate, die durch Behandlung des Virus mit Kombinationen des oberflächenaktiven Mittels »Tween« und Äther sowie Natrlumdesoxycholat und anschließende Reinigung der HA-Antigene durch Adsorption-Desorption an roten Blutkörperchen erhalten worden waren. Die Verfasser stellen fest, daß die durch Behandlung mit Natriumdesoxycholat erhaltenen Präparate von HA-Antigenen ein geringeres Immunisierungsvermögen haben als die durch Behandlung mit Tween-Äther erhaltenen Präparate.In the work by B. A. Rubin, W. A. Plerzchala and A. R. Neurath, "Ellcltation of antibody response against Influenza viruses by different viral subunit preparations "In" Archive for Virus Research ", Volume 20H2, page 268 ff., The authors examine virus preparations that are produced by treating the virus with combinations of the Surface-active agent »Tween« and ether as well as sodium deoxycholate and subsequent cleaning of the HA antigens were obtained by adsorption-desorption on red blood cells. The writers note that the preparations of HA antigens obtained by treatment with sodium deoxycholate have a lower immunizing power than the preparations obtained by treatment with Tween ether.
Die Arbelt von A. R. Neurath et al in »Microbios« (1970) 7-8, 209-224, Band 2, mit dem Titel »The effect of non aqueous solvents on the quaternary structure of viruses: properties of haemagglutinins obtained by disruption of influenza viruses with trl(n-butyl)-phosphate« bo beschreibt das Zerteilen von Grippeviren mit Tri(nbutyD-phosphat (TNBP) in Gegenwart des oberflächenaktiven Mittels »Tween 80«. Die Verfasser untersuchen die Eigenschaften der nach dem Zerteilen erhaltenen Hämagglutinine und stellen fest, daß diese HA-Hämag- b5 glutinine den durch Behandlung mit Diätliyläther erhaltenen Hämagglutlninen ähneln. Indessen lsi TNBP beim Virustyp B/Mass. viel weniger schädlich für die Neuraminidase als Äther.The work by A. R. Neurath et al in "Microbios" (1970) 7-8, 209-224, Volume 2, with the title "The effect of non aqueous solvents on the quaternary structure of viruses: properties of haemagglutinins obtained by disruption of influenza viruses with trl (n-butyl) phosphate "bo describes the division of influenza viruses with tri (nbutyD-phosphate (TNBP) in the presence of the surfactant "Tween 80". Investigate the writers the properties of the haemagglutinins obtained after the division and establish that these HA-haemag- b5 glutinins are similar to hemagglutinins obtained by treatment with dietary ether. Meanwhile lsi TNBP with virus type B / Mass. much less harmful to that Neuraminidase as ether.
Der Artikel von Frederik L. Ruben und George Gee Jackson in »The Journal of Infectious diseases« Band 125, Nr. 6, Juni 1972, Seite 556 bis 664, mit dem Titel »A new subunit influenza vaccine: Acceptability compared with standard vaccines and effect of dose on antigenicity« befaßt sich mit Arbeiten über das mit Tri(n-butyl)phosphat zerteilte Grippevirus. Die Verfasser stellen die gute Impfwirkung der erhaltenen Präparate und die Verminderung der pyrogenen Reaktionen bei der Verabreichung fest.The article by Frederik L. Ruben and George Gee Jackson in "The Journal of Infectious Diseases" Volume 125, No. 6, June 1972, pages 556 to 664, with the Title »A new subunit influenza vaccine: Acceptability compared with standard vaccines and effect of dose on antigenicity "deals with work on the influenza virus divided with tri (n-butyl) phosphate. The writers represent the good vaccination effect of the preparations obtained and the reduction in pyrogenic reactions in the Administration firmly.
Die Arbeit von H. Fukumi in dem Bericht über das »International Symposium on Influenza Vaccines for Men and Horses«, London 1972; Symp. Series Immunoblol. Standard Band 20, Seite 99 bis 105 (Karger, Basel/München/Paris/London/New York/Sydney 1973), mit dem Titel »Production and Potency standardization of hemagglutinin sub-unit influenza vaccine« untersucht die durch Behandlung des ganzen Grippevirus mit Äther erhaltenen Untereinheiten.The work of H. Fukumi in the report on the "International Symposium on Influenza Vaccines for Men and Horses', London 1972; Symp. Series Immunoblol. Standard Volume 20, pages 99 to 105 (Karger, Basel / Munich / Paris / London / New York / Sydney 1973), with the title »Production and Potency standardization of hemagglutinin sub-unit influenza vaccine« the subunits obtained by treating the whole flu virus with ether.
Der Artikel von W. G. Laver und R. G. Webster in »Virology« 69 (1976) 511 bis 522 mit dem Titel »Preparation and Immunogenicity of an influenza virus hemagglutinin and neuraminidase subunit vaccine« befaßt sich mit der Herstellung des Grippevirus-Präparats durch Behandlung mit Ammoniumdesoxycholat. Andere Tenside, z. B. Natriumdodecylsulfat und das Produkt der Handelsbezeichnung »Triton X-100« werden ebenfalls genannt. Die Verfasser stellen fest, daß das Ammoniumdesoxycholat zu einem Impfstoff aus zerteilten Virla führt, in dem das Hämagglutinin und die Neuraminidase ebenso wirksam sind wie im Impfstoff auf Basis des inaktivierten ganzen Virions.The article by W. G. Laver and R. G. Webster in "Virology" 69 (1976) 511-522 entitled "Preparation and Immunogenicity of an influenza virus hemagglutinin and neuraminidase subunit vaccine "deals with with the manufacture of the flu virus preparation by treatment with ammonium deoxycholate. Other surfactants, z. B. sodium dodecyl sulfate and the product of the trade name "Triton X-100" are also called. The authors note that the ammonium deoxycholate was part of a vaccine made from Virla in which the hemagglutinin and neuraminidase are just as effective as in the vaccine based on the inactivated whole virions.
Der Artikel von H. Bachmayer et al in »Postgraduate Medical Journal« (Band 52, Juni 1976, Seite 360 bis 367) mit dem Titel »Preparation and properties of a novel influenza subunit vaccine« beschreibt die selektive Lösllchmachung von Hämagglutinin und Neuraminidase aus ganzen Grippeviren durch Einwirkung eines kationaktiven Tensids, nämlich CTAB (Ammoniumcetyltrimethylbromid). Die Verfasser stellen fest, daß die Technik der Lösllchmachung die immunisierenden Eigenschaften der beiden Antigene HA und NA nicht ungünstig beeinflußt. Diese Arbeiten werden bestätigt und ergänzt von M. Just et al in »Medical Microbiology und Immunology« 164 (1978) 277 bis 284 mit dem Titel »A New Jersey/76 Influenza Vaccine Trial in Seronegative School children: Comparison of a subunit vaccine with a whole-virus Vaccine«. Dieser Artikel vergleicht die Eigenschaften der Vaccine aus dem ganzen Virus und der Vaccine aus Untereinheiten, die nach dem Verfahren von H. Bachmayer et al erhalten worden sind.The article by H. Bachmayer et al in "Postgraduate Medical Journal" (Volume 52, June 1976, pages 360 to 367) with the title "Preparation and properties of a novel influenza subunit vaccine" describes the selective removal of hemagglutinin and neuraminidase from whole influenza viruses by the action of a cation-active one Surfactant, namely CTAB (ammonium cetyl trimethyl bromide). The authors note that the technique of Solubilization does not adversely affect the immunizing properties of the two antigens HA and NA. This work is confirmed and supplemented by M. Just et al in "Medical Microbiology and Immunology" 164 (1978) 277-284, entitled A New Jersey / 76 Influenza Vaccine Trial in Seronegative School children: Comparison of a subunit vaccine with a whole virus vaccine ". This article compares the properties of the Vaccine from the whole virus and the vaccine from subunits produced by the method of H. Bachmayer et al.
Der Artikel von M. Leigh Hammond et al in Med. J. Aust. 1 (1978) 301 bis 303 »Effective protection against influenza after vaccination with subunit vaccine« berichtet über eine klinische Untersuchung der Ergebnisse von Impfungen gegen Grippe.The article by M. Leigh Hammond et al in Med. J. Aust. 1 (1978) 301-303 “Effective protection against influenza after vaccination with subunit vaccine «reports on a clinical investigation of the results of Influenza vaccinations.
In den vorstehend genannten Veröffentlichungen sind ferner zahlreiche Literaturstellen genannt, auf die der Fachmann nach Bedarf zurückgreifen kann. Diese Einzelheiten des Standes der Technik lassen eine praktisch universelle Übereinstimmung hinsichtlich des Nutzens und der Vorteile von Impfstoffen auf Basis von zerteilten Viria oder HA- und NA-Untereinheiten erkennen. Alle Forscher bemühen sich jedoch, die in allgemeiner Weise bekannte Technik der Zerteilung der Viria zu verbessern und insbesondere Zerleilungsreagenlien zu finden, die einfacher und bequemer zu handhaben sind und Weiter-In the publications mentioned above, numerous references are also cited to which the Expert can fall back on as needed. These prior art details leave one practical universal consensus on the benefits and advantages of vaccines based on divided Recognize viria or HA and NA subunits. However, all researchers endeavor to do that in a general way to improve known technique of fragmentation of the viria and in particular to find fragmentation reagents which are easier and more convenient to use and
Verarbeitungsbedingungen ermöglichen, die zu einer wirksameren Entfernung der Nebenprodukte führen, die häufig für unerwünschte Nebenreaktionen bei der Verabreichung des Impfstoffs verantwortlich sind.Allow processing conditions that result in more effective removal of the by-products that are often responsible for undesirable side reactions when administering the vaccine.
Die Erfindung ist im Prinzip auf ein Verfahren zur s gelenkten Zerteilung von Viria gerichtet, das zur Freisetzung der schweren Fragmente ^er die HA- und NA-Glykoproteinvorsprünge tragende Virushülle führt, mit anschließender Anreicherung dieser Glykoproteine nach üblichen Fraktioniermethoden, die an die Verbindungen ,„ mit sehr hohem Molekulargewicht angepaßt sind. Es ist zu bemerken, daß im Rahmen der Erfindung die Gewinnung der Antigene in schweren Fragmenten ihre Abtrennung von den leichten Bestandteilen, insbesondere vom verwendeten Detergens und vom verwendeten Lösungs- ,; mittel und von den Eiereiweißen, falls diese in der in dieser Weise behandelten ursprünglichen Probe vorhanden sind, und von einem Teil der das Virion bildenden, nicht-immunogenen Bestandteile ermöglicht. Ferner können diese Fragmente auf Grund ihrer im Vergleich zum ganzen Virion geringeren Teilchengröße und ihrer geringeren Starrheit mit Hilfe sterilisierender Membranen, beispielsweise Membranen mit Poren von 0,22 μίτι, filtriert werden, wodurch es möglich ist, praktisch absolute Sterilität der nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Antigenpräparate zu gewährleisten.The invention is directed, in principle, to a method of s steered fragmentation of Viria that the release of the heavy fragments he ^ the HA and NA Glykoproteinvorsprünge bearing viral envelope leads, with subsequent accumulation of these glycoproteins by conventional fractionation methods, applied to the compounds, " are adapted to be of very high molecular weight. It should be noted that in the context of the invention, the recovery of the antigens in heavy fragments, their separation from the light components, in particular from the detergent used and from the solution used ; medium and from the egg proteins, if these are present in the original sample treated in this way, and from some of the non-immunogenic constituents which form the virion. Furthermore, these fragments can be filtered due to their smaller particle size compared to the whole virion and their lower rigidity with the aid of sterilizing membranes, for example membranes with pores of 0.22 μίτι, which makes it possible to achieve practically absolute sterility of the after the method according to the Invention to ensure antigen preparations obtained.
Die Erfindung schließt alle Formen von unbedenklichen Arzneimittelzubereitungen, insbesondere wäßrige und gefriergetrocknete Zubereitungen, und Injektionslösungen ein, welche die erfindungsgemäß erhaltenen jo schweren Fragmente enthalten.The invention includes all forms of safe pharmaceutical preparations, especially aqueous ones and freeze-dried preparations and injection solutions which contain the jo obtained according to the invention heavy fragments included.
Zur exakten Definition der Erfindung wire auf die Patentansprüche 1 und 9 verwiesen.For an exact definition of the invention, reference is made to claims 1 and 9.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung erfolgt die Zerteilung der Viria in einem einphasigen Reaktionssystem bei einem pH-Wert im neutralen oder basischen Bereich durch Verwendung eines nichtionogenen Tensids und von Chloroform, das in einer Konzentration, die bei oder in der Nähe seiner Lösllchkeltsgrenze in Wasser liegt, verwendet wird.In the process according to the invention, the viria is divided up in a single-phase reaction system at a pH in the neutral or basic range by using a nonionic surfactant and of chloroform, which in a concentration which is at or near its solubility limit in water, is used.
Von der Anmeldern wurde gefunden, daß durch die gleichzeitige Einwirkung eines nichtionogenen Tensids, beispielsweise Polyoxyäthylen (20)-sorbitanmonooleat und Chloroform, letzteres in einer Konzentration, die seiner Löslichkeitsgrenze in Wasser entspricht oder dicht bei dieser Grenze liegt, genügt, um die Lipidhülle zu spalten und zu zerteilen und einen geringen Teil dieser Hülle löslich zu machen, damit praktisch die Gesamtmenge der HA- und NA-Antigene durch die schweren Fragmente der Lipidhülle aufgenommen wird und hierdurch ihre quantitative Abtrennung durch eine entsprechende Fraktionierstufe ermöglicht wird. Es ist zu bemerken, daß das angewandte System ein Einphasensystem ist, das nicht die Trennung von zwei nicht mischbaren Phasen aus Lösungsmittel und Wasser erfordert. Das zerteilte Antlgenpräparat ist in dieser Welse für die anschließende Fraktionierstufe direkt verwendbar.The applicants have found that the simultaneous action of a nonionic surfactant, for example polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate and chloroform, the latter in a concentration that corresponds to its Solubility limit in water corresponds to or is close to this limit, is sufficient to cover the lipid envelope split and split and dissolve a small part of this shell, practically the total amount the HA and NA antigens are taken up by the heavy fragments of the lipid envelope and thereby their quantitative separation is made possible by an appropriate fractionation stage. It's closed note that the system applied is a single phase system, not the separation of two immiscible ones Requires phases of solvent and water. The cut up preparation is in this catfish for the subsequent fractionation stage can be used directly.
Das Verfahren gernüß der Erfindung wird bei einem pH-Wert im neutralen oder basischen Bereich, beispielsweise bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,5 und 8,7, bo durchgeführt. Im allgemeinen wird der pH-Wert des Reaktionsmediums nach der Auflösung des Chloroforms eingestellt. Es ist jedoch auch möglich, zuerst den pH-Wert der Ausgangssuspension des Virus einzustellen. Diese pH-Einstellung erfolgt nach beliebigen geeigneten hs bekannten Methoden.The method according to the invention is carried out at a pH in the neutral or basic range, for example carried out at a pH between about 7.5 and 8.7, bo. In general, the pH of the Reaction medium adjusted after the dissolution of the chloroform. However, it is also possible to first check the pH adjust the initial suspension of the virus. This pH adjustment is carried out according to any suitable hs known methods.
Man kann eine Ergänzungsmenge des Chloroforms nach dem Zusatz des richilonogenen Tensids zugeben, wenn der pH-Wert des Reaktionsmediums im basischen Bereich liegt.You can add a supplementary amount of chloroform after adding the richilonogenic surfactant, when the pH of the reaction medium is in the basic range.
Es ist zu bemerken, daß die Reihenfolge der Stufen des Verfahrens gemäß der Erfindung entscheidend wichtig ist, um ein einphasiges Reaktionssystem auszubilden, und daß es unerläßlich ist, das Chloroform in der Virussuspension löslich zu machen, bevor das nichtionogene Tensid zugesetzt wird. Es wurde gefunden, daß durch Zusatz von Chloroform zu einer Lösung Polyoxyäthylen(20)sorbitanmonooleat das Tensid ausgefällt wird, so daß kein einphasiges Reaktionssystem ausgebildet werden kann.It should be noted that the order of the steps in the process according to the invention is critically important is to form a single-phase reaction system, and that it is essential to make the chloroform soluble in the virus suspension before the nonionic Surfactant is added. It has been found that by adding chloroform to a solution of polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate the surfactant is precipitated so that a single phase reaction system cannot be formed can.
Wie bereits erwähnt, kann das Chloroform im Überschuß zugesetzt werden, jedoch kann dieser ergänzende Zusatz nur vorgenommen werden, wenn der pH-Wert im basischen Bereich liegt. Wenn unter diesen Bedingungen gearbeitet wird, bleibt das Reaktionssystem einphasig, so daß keine Ausfällung des Tensids stattfindet. Die Sättigung mit Chloroform kann somit sichergestellt werden, ohne die Konzentration des Detergens zu verändern.As already mentioned, the chloroform can be added in excess, but this can be supplementary Addition can only be made if the pH value is in the basic range. If under these conditions is carried out, the reaction system remains single-phase, so that no precipitation of the surfactant takes place. The saturation with chloroform can thus be ensured without changing the concentration of the detergent.
Wie bereits erwähnt, eignet sich das Verfahren gemäß der Erfindung zur Behandlung von Viren mit Lipidhülle, insbesondere zur Behandlung des Grippevirus. Von den Viren, die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung behandelt werden können, sind insbesondere die Viren zu nennen, die Impfstoffe auf Basis von Fragmenten zu bilden vermögen und Oberflächenantlgene enthalten, die von Fragmenten der Lipidhülle getragen werden, beispielsweise die folgenden Viren: Togavirus, Rhabdovirus, Leukovirus, Coronavirus, Adenovlrus, Herpes-Virus, Vacciniavirus und Hepatitis-Virus des Typs B (DANE-Partikel). Alle diese Viren sind dem Fachmann zugänglich. As already mentioned, the method according to the invention is suitable for treating viruses with a lipid envelope, especially for the treatment of the flu virus. Of the viruses produced by the method according to the invention The viruses that can be treated are to be mentioned in particular, the vaccines on the basis of fragments too form capacity and contain surface antlgene which are carried by fragments of the lipid envelope, for example the following viruses: togavirus, rhabdovirus, leukovirus, coronavirus, adenovirus, herpes virus, Vaccinia virus and type B hepatitis virus (DANE particles). All of these viruses are accessible to those skilled in the art.
Das beim Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzte Ausgangsmaterial besteht aus einer Suspension eines der vorstehend genannten Viren, die nach klassischen Methoden erhalten worden Ist unter der einzigen Voraussetzung, daß die Verunreinigung mit Lipiden, die keine Bestandteile des Virions sind, so weit herabgesetzt wird, daß das Chloroform nicht übermäßig stark durch diese Lipide verbraucht wird. Geeignet ist beispielsweise eine Suspension des Grippevirus, das nach klassischen Methoden auf Bruteiern vermehrt, konzentriert und/oder gereinigt worden ist.The starting material used in the method according to the invention consists of a suspension of one of the the aforementioned viruses that have been obtained by classical methods, provided that that the contamination with lipids, which are not part of the virion, is reduced so much, that the chloroform is not consumed excessively by these lipids. For example, one is suitable Suspension of the flu virus, which reproduces, concentrates and / or purified on hatching eggs using traditional methods has been.
Für die Zwecke der Erfindung können beliebige nichtionogene Tenside verwendet werden. Als geeignete nichtionogene Tenside werden vorzugsweise oberflächenaktive Mittel auf Basis von Polyoxyäthylenderivaten von Teilestern von Fettsäuren und von Sorbit abgeleiteten Hexitanhydriden, insbesondere das Monooleat von PoIyoxyäthylen(20)-sorbltan. Any nonionic surfactants can be used for the purposes of the invention. As suitable nonionic surfactants are preferably surface-active agents based on polyoxyethylene derivatives of Partial esters of fatty acids and hexitol anhydrides derived from sorbitol, in particular the monooleate of polyoxyethylene (20) sorbltan.
Als Beispiele anderer nlchtionogener Tenside, die für die Zwecke der Erfindung besonders geeignet sind, seien genannt:Examples of other non-ionogenic surfactants which are particularly suitable for the purposes of the invention may be called:
1) Kondensate von Alkylphenolen und Äthylenoxid.1) Condensates of alkylphenols and ethylene oxide.
2) Additionsprodukte von aliphatischen Äthern und Äthylenoxid.2) Addition products of aliphatic ethers and ethylene oxide.
3) Additionsprodukte von Estern und Äthylenoxid.3) Addition products of esters and ethylene oxide.
4) Additionsprodukte von Aminen und Äthylenoxid.4) Addition products of amines and ethylene oxide.
5) Additionsprodukte von Alkanolamiden und Äthylenoxid. In dieser Hinsicht wird auf die FR-PS 74 35 179 verwiesen, in der Beispiele solcher geeigneter nlchtionogener Mittel genannt sind.5) Addition products of alkanolamides and ethylene oxide. In this regard, reference is made to FR-PS 74 35 179 in which examples of such suitable non-toxic agents are given.
Wie bereits erwähnt, wird das nichtionogene Tensid In der kleinsten wirksamen Konzentration verwendet, um die Zerteilung der Vlrla zu schweren Fragmenten zu erreichen. Der Fachmann kann durch RoutineversucheAs already mentioned, the non-ionic surfactant In the smallest effective concentration used to break up the vlrla into heavy fragments reach. The person skilled in the art can through routine experimentation
die einzusetzende Konzentration für ein gegebenes nichtlonogenes Tensld leicht ermitteln. Wenn als nlchtionogenes Tensld das Polyoxyäthylen(20)-sorbltanmonooleat verwendet wird, liegt seine kleinste wirksame Konzentration zwischen 0,02 und 0,2%.the concentration to use for a given non-ionogenic Easily determine tensld. If polyoxyethylene (20) sorbltan monooleate is used as a non-ionogenic surfactant is used, its smallest effective concentration is between 0.02 and 0.2%.
Die Kontaktzeit der mit Chloroform versetzten Virussuspension mit dem nichtionogenen Tensid muß genügen, um die Zerteilung der Viria zu ermöglichen. Im allgemeinen Hegt diese Kontaktzelt zwischen 1 und 20 Stunden. Die Temperatur des Reaktionsmllleus ist nicht entscheidend wichtig, jedoch darf sie nicht zu einer Denaturierung des zu behandelnden Virions führen. Im allgemeinen wird aus Zweckmäßlgketlsgründen bei +4° C gearbeitet.The contact time of the virus suspension mixed with chloroform with the non-ionic surfactant must be sufficient to enable the viria to be broken up. In general, this contact tent is between 1 and 20 hours. The temperature of the reaction waste is not critically important, but it should not be too high Lead denaturation of the virion to be treated. In general, for reasons of convenience, the temperature is + 4 ° C worked.
Wie bereits erwähnt, wird das Chloroform In einer Konzentration verwende!, die seiner maximalen Löslichkeit im wäßrigen Medium entspricht oder dicht bei dieser Konzentration liegt. Zweckmäßig beträgt diese Konzentration etwa 0,4 bis 0,7 Vol.-H,.As mentioned earlier, the chloroform comes in a Use concentration! That corresponds to or close to its maximum solubility in the aqueous medium Concentration lies. This concentration is expediently about 0.4 to 0.7 vol .- H ,.
Zweckmäßig kann das Chloroform der Virussuspension durch Ausschließungschromatographle in 0,5%lgem Chloroformpuffer zugesetzt werden. Die Ausschließungschromatographie kann beispielsweise nach der in der FR-PS 77 12 518 beschriebenen Methode durchgeführt werden. In dieser Weise wird gleichzeitig mit dem Zusatz des Chloroforms zum Ausgangsmaterial eine sehr weitgehende Vorreinigung des Ausgangsmaterials erreicht.Appropriately, the chloroform of the virus suspension by exclusion chromatography in 0.5% lgem Chloroform buffer can be added. The exclusion chromatography can, for example, according to the method described in FR-PS 77 12 518 must be carried out. In this way it becomes simultaneous with the addition of the chloroform to the starting material, a very extensive pre-purification of the starting material is achieved.
Wie bereits erwähnt, eignet sich das Verfahren gemäß der Erfindung besonders gut für die Behandlung des Grippevirus mit dem Ziel, Virusfragmente für die Her- Jo stellung von Grippe-Impfstoffen zu gewinnen. Als Detergens wird in diesem Fall das Polyoxyäthylc ■ (20)-sorbltanmonooleat bevorzugt.As already mentioned, the method according to the invention is particularly suitable for the treatment of the Influenza virus with the aim of extracting virus fragments for the production of influenza vaccines. As a detergent is in this case the Polyoxyäthylc ■ (20) -sorbltanmonooleate preferred.
Gemäß einer bevorzugten Variante des Verfahrens gemäß der Erfindung wird dem Reaktionsmedium zu Ji einem beliebigen Zeitpunkt des Verfahrens ein Inaktlvlerungsmittel, z. B. Formaldehyd oder /5-Propiolacton, zugesetzt, wobei jedoch darauf geachtet wird, daß das Reaktionsmedium bei einem pH-Wert im neutralen oder basischen Bereich gehalten wird. Zweckmäßig wird das *n Inaktivierungsmittel nach dem nichtionogenen Tensid zugesetzt. Im Falle der Verwendung von /3-Proplolacion als Inaktivierungsmittel wird der pH-Wert des Reaktionsmediums durch Zusatz einer Base nach beliebigen geeigneten Methoden reguliert, um einen Abfall des pH- ->'> Werts durch Autohydrolyse des Inaktivierungsmittels zu verhindern. Das Inaktivierungsmittel, z. B. Formaldehyd oder /J-Propiolacton, wird in üblichen Konzentrationen verwendet, um den Inaktlvierungseffekt zu erzielen. Im allgemeinen wird das /J-Propiolacton oder der Formal- > <> dehyd in einer Konzentration von etwa 0.02% verwendet. Das nach der Stufe (b) des Verfahrens der Erfindung erhaltene Reaktionsmedium wird anschließend einer Fraktionierstufe unterworfen, um die schweren Fragwerden in den dichten Fraktionen des Gradienten wiedergefunden, während in den leichten Schichten sowie im Ablauf das Chloroform und das »Polyoxyäthylen(20)-sorbltanmonooleat« sowie die nlcht-antigenen Bestandteile, die aus der Zerteilung der Vlria und der gegebenenfalls in der behandeilen Probe vorhandenen Eierelweiße stammen, wiedergefunden werden. According to a preferred variant of the process according to the invention, the reaction medium becomes Ji an inactivation agent at any point during the procedure, z. B. formaldehyde or / 5-propiolactone, added, but care should be taken that the Reaction medium is kept at a pH in the neutral or basic range. The * n Inactivating agent added after the nonionic surfactant. In the case of using / 3-propolacion as an inactivating agent, the pH of the reaction medium is adjusted to any desired value by adding a base Suitable methods are regulated to prevent a drop in the pH value through autohydrolysis of the inactivating agent impede. The inactivating agent, e.g. B. formaldehyde or / I-propiolactone is used in usual concentrations used to achieve the deactivation effect. In general, the / J-propiolactone or the formal-> <> dehydrated at a concentration of about 0.02%. That after step (b) of the process of the invention The reaction medium obtained is then subjected to a fractionation step in order to remove the heavy fragility found in the dense fractions of the gradient, while in the light layers and in the process the chloroform and the "polyoxyethylene (20) sorbltan monooleate" as well as the non-antigens Components resulting from the fragmentation of the Vlria and any existing sample in the treated sample Egg white originate to be found again.
Die die Antigene enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, und das Gemisch wird in physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Durch sterilisierende Filtration durch eine Membran mit Poren von 0,22 μηι wird das Antigenpräparat erhalten. 2) Die zweite Trennmethode beruht auf dem Prinzip, das der Reinigung des Grippevirus zu Grunde liegt, und !n der FR-PS 77 !2 518 und dem Zusatzpaten! FR 78 10 769 zu diesem Patent beschrieben wird. Das Prinzip dieser Trennmethode ist eine Ausschließungschromatographie in der Flüssigphase an porösen Siliciumdioxidkugeln, die zweckmäßig einen mittleren Porendurchmesser von 60 nm und eine Größe von 100 bis 200 μπι haben. Die Adsorptionsstellen des Siliciumdioxids werden vorher blockiert, indem eine wäßrige Lösung eines polyäthoxylierten Mittels, z. B. Polyäthylenglykol-20 000, durchgeleitet wird. Es ist zu bemerken, daß diese Passivierung des Siliciumdioxids durch wiederholtes Durchleiten der zu fraktionierenden Probe nicht verändert wird. Die Probe führt vielmehr bei jeder Einspritzung eine ergänzende Charge des polyäthoxylierten Mittels zu, das durch das darin enthaltene Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonooleat dargestellt wird, wodurch die ursprüngliche Passivierung nur verstärkt werden kann. Als Puffer für die Chromatographie dient eine zweckmäßig bei pH 8,0 bis 8,2 gepufferte Salzlösung, die 0,5% Chloroform enthält und hier als aseptisches Mittel verwendet wird, das absolute Sterilität im Verlauf der Operationen gewährleistet. Die Chromatographie-Apparatur ist mit automatischen Vorrichtungen versehen, die kontinuierliches Arbeiten ermöglichen. Das zu fraktionierende Antigenpräparat wird in regelmäßigen Zeitabständen eingesprilzl, und die ausgeschlossenen bzw. am Kolonnenaustritt verzögerten Phasen werden durch Elektroventile, die durch eine Programmlervorrichtung gesteuert werden, auf verschiedene Gefäße verteilt.The fractions containing the antigens are pooled and the mixture becomes physiological Saline solution diluted. By sterilizing filtration through a membrane with pores of 0.22 μm the antigen preparation is obtained. 2) The second separation method is based on the principle that the cleaning of the flu virus is the basis, and! n FR-PS 77! 2 518 and the additional sponsor! FR 78 10 769 of this patent is described. The principle of this separation method is an exclusion chromatography in the liquid phase on porous silica spheres, which expediently have a mean pore diameter of 60 nm and a size of 100 to 200 μm. The adsorption sites of the silicon dioxide are blocked beforehand, by an aqueous solution of a polyethoxylated agent, e.g. B. polyethylene glycol 20,000 passed through will. It should be noted that this passivation of the silica by repeatedly passing through the sample to be fractionated is not changed. Rather, the sample performs one with each injection supplementary charge of the polyethoxylated agent, which is due to the polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate it contains is shown, whereby the original passivation can only be reinforced. One serves as a buffer for the chromatography saline solution containing 0.5% chloroform, buffered at pH 8.0 to 8.2, and here as an aseptic solution Means are used that guarantee absolute sterility in the course of the operations. The chromatography apparatus is provided with automatic devices that operate continuously enable. The antigen preparation to be fractionated is injected at regular intervals, and the Phases that are excluded or delayed at the column exit are controlled by electrovalves, which are controlled by a programmer controlled, distributed to different vessels.
Die ausgeschlossene Phase enthält die Antigene mit hämagglutlnierender Aktivität und Neuraminidase-Aktivität in Chloroformpuffer, während die verzögerte Phase das Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonooleat sowie die n!cht-antigenen Bestandteile enthält, die aus der Zerteiiung der Viria und der gegebenenfalls in der behandelten Probe vorhandenen Eierelweiße stammen. Das in dieser Weise gereinigte Antigenpräparat wirdThe excluded phase contains the antigens with hemagglutinating activity and neuraminidase activity in chloroform buffer, while the delayed phase is the polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate and the Contains non-antigenic components resulting from the division the viria and any egg whites that may be present in the treated sample. The antigen preparation purified in this way becomes
mente des Mediums abzutrennen. Diese Stufe ist eine an 55 durch Eindampfen unter Teilvakuum vom Chloroformto separate elements of the medium. This stage is one at 55 by evaporation under partial vacuum of the chloroform
die Reinigung der hochmolekularen Verbindungen angepaßte Fraktionierstufe. Gemäß der Erfindung können zwei für die Großherstellung geeignete Reinigungsmethoden angewandt werden:the fractionation stage adapted to the purification of the high molecular weight compounds. According to the invention can two cleaning methods suitable for large-scale production are used:
1) Die erste Methode besteht aus einer Trennung durch Zonen-Ultrazentrifugieren unter Ausbildung des Dichtegradienten. Zweckmäßig wird ein Saccharose-Gradient gewählt, der dynamisch von selbst in einem Reorientierungsrotor des Typs K2 (ElectronuclSonlcs), dem die Probe kontinuierlich In gleichbleibender Menge zugeführt wird, ausgebildet wird. Die hämagglutmierende Aktivität und Neuraminidase-Aktivität befreit, anschließend durch Diafiltration mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung dialysiert und schließlich durch Sterüisationsmembranen mit Poren von 0,22 μηι Durchmesser filtriert.1) The first method consists of a separation through Zone ultracentrifugation with formation of the density gradient. A sucrose gradient is useful chosen, which dynamically by itself in a reorientation rotor of the type K2 (ElectronuclSonlcs), to which the sample is continuously fed in a constant amount. The hemagglutant Activity and neuraminidase activity freed, then by diafiltration with buffered dialyzed physiological saline solution and finally μηι through sterilization membranes with pores of 0.22 Diameter filtered.
ω In allen Fällen führt das Verfahren gemäß der Erfindung zur Gewinnung von Lipoglykopeptidstrukturen von hohem Molekulargewicht, deren Zusammensetzung und Struktur denen der Hülle des Virons sehr analog sind. Das Immunisierungsvermögen ist somit demjenigen des kompletten Virions ähnlich oder gleich.ω In all cases, the method according to the invention leads for obtaining lipoglycopeptide structures of high molecular weight, their composition and Structure are very similar to those of the envelope of the viron. The immunization capacity is thus that of the complete virions similar or identical.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht nach der Reinigung des Präparats der zerteilten Viria die Gewinnung eines Präparats mit einer Proteinkonzentra-The method according to the invention enables, after the preparation of the divided viria to be purified Obtaining a preparation with a protein concentration
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tion, das bis zu zweimal weniger Proteine und Lipide als das ursprüngliche Präparat bei gleicher Größe der Antigenaktivitüt enthalten kann.tion that contains up to twice less proteins and lipids than the original preparation with the same level of antigen activity may contain.
Die Erfindung hat zahlreiche Vorteile für die Herstellung von als Impfstoffe geeigneten gereinigten Antigenen, insbesondere in Ihrer Anwendung auf Grippe-lmpfsloff. Hinsichtlich der Bedingungen der Zerteilungsreaktion wird beim Verfahren gemäß der Erfindung vor allem ein einphasiges Reaktionssystem verwendet, weil das Chloroform In einer Menge verwendet wird, die in der Nähe seiner maximalen Löslichkeitskonzentration in Wasser liegt.The invention has numerous advantages for the production of purified antigens suitable as vaccines, especially in your application to flu vaccines. With regard to the conditions of the fragmentation reaction, in the method according to the invention, above all a single phase reaction system is used because the chloroform is used in an amount specified in the Is close to its maximum solubility concentration in water.
Be' den klassischen Systemen des Standes der Technik, beispielsweise bei den Tween-Äther-Systemen, ist das Reaktionsgemisch zweiphasig, und die freigesetzten Fragmente sind nicht sämtlich hochmolekular, so daß eine quantitative Abtrennung der Antigene in einer einzigen Fraktionierstufe nicht möglich ist.Be 'the classic systems of the state of the art, For example, in the Tween-ether systems, the reaction mixture is two-phase, and the released ones Fragments are not all high molecular weight, so that a quantitative separation of the antigens in a single Fractionation stage is not possible.
Im Gegensatz hierzu ist es gemäß der Erfindung möglich, die Virussuspension anschließend auf Grund der verhältnismäßig großen Teilchengröße des erhaltenen Antigens einfach zu reinigen. In dieser Weise können Verunreinigungen, nämlich »Tween«, Chloroform, verunreinigende Proteine des Systems, Lipide sowie ein Teil der Zerteilungsprodukte des Virus entfernt werden. Bei den Verfahren des Standes der Technik bleiben das verwendete Tensid sowie die Zerteilungsprodukte des Virus im Viruspräparat. Beim Verfahren gemäß der Erfindung gelingt eine viel stärkere Entfernung der Proteine, während es beim bekannten Verfahren nicht möglich war, jo die zerteilten Antigene mit befriedigender Ausbeute zu reinigen.In contrast to this, according to the invention it is possible the virus suspension then due to the relatively large particle size of the obtained Antigens easy to clean. In this way, impurities, namely "Tween", chloroform, can become contaminating Proteins of the system, lipids as well as some of the breakdown products of the virus are removed. at the methods of the state of the art are left with the surfactant used and the products of the virus in the virus preparation. In the method according to the invention, a much greater removal of the proteins succeeds during it was not possible with the known method to jo the divided antigens with a satisfactory yield clean.
Ferner kann die Sterilität des zerteilten Antigens durch Filtration mit Sterilisationsmembran erreicht werden. Es findet somit eine Entfernung von evtl. abgetöteten Bak- J5 terien statt, die in ein Kulturmedium des Grippevirus gelangt sein können. Hierdurch ist es möglich, die Gefahr von unerwünschten Nebenreaktionen beispielsweise bei der Verabreichung des Impfstoffs auszuschließen. Bei Impfstoffen mit kompletten Viren wird die Virussuspension in den meisten Fällen durch Einwirkung von UV-Strahlung sterilisiert. Die Bakterien, die gegebenenfalls in den in dieser Weise sterilisierten Suspensionen vorhanden sind, können bei der Impfung unerwünschte Reaktionen auslösen.Furthermore, the sterility of the divided antigen can be achieved by filtration with a sterilization membrane. It there is thus a removal of any bacteria that may have been killed and which are in a culture medium of the flu virus may have reached. This makes it possible to reduce the risk of undesirable side reactions, for example to be excluded when administering the vaccine. In the case of vaccines with complete viruses, the Virus suspension in most cases sterilized by exposure to UV radiation. The bacteria that possibly present in the suspensions sterilized in this way can be used during vaccination trigger unwanted reactions.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Das Verfahren ist insbesondere auf das Grippevirus anwendbar, das nach bekannten Methoden auf Bruteiern vermehrt, konzentriert und/oder gereinigt worden Ist. Die Methoden der Titration der Antigene In vitro sind die Hämagglutination oder auch die radiale Immonodiffusion in Agar, das ein reines Antihämagglutininserum enthält (Schild et al.. Journal of General Virology 16 [1972] 231 bis 236), für den Nachweis des Hämaggsutlnins und die Methode nach Warren (J. Biol. Chcm. 234 [1959] 1971) für den Nachweis der Neuramtnidase. The invention is further illustrated by the following examples. The procedure is specific to that Influenza virus can be used, which reproduces, concentrates and / or purified on hatching eggs according to known methods has been. The methods of titration of the antigens In Vitro are hemagglutination or radial immunodiffusion in agar, which is a pure antihemagglutin serum contains (Schild et al. Journal of General Virology 16 [1972] 231 to 236), for the detection of the Hämaggsutlinins and the Warren method (J. Biol. Chcm. 234 [1959] 1971) for the detection of neuramtnidase.
Influenzavirus wurde auf bebrüteten Hühnereiern ω durch Bebrütung bei 34,5° C für 2 bis 3 Tage vermehrt. Die Eier wurden während einer Nacht auf +4° C gekühlt. Die infizierten Flüssigkeiten der Allantoishöhle wurden vereinigt und durch Zentrifugation geklärt. Die Viria der Flüssigkeit der Allantoishöhle wurden anschließend nach bekannten Verfahren an roten Blutkörperchen von Hühnern absorbiert und dann desorbiert, und die hierbei erhaltene virulente Flüssigkeit wurde abschließend durch Ultrafiltration konzentriert. Diesem virulenten Konzentrat wurden 0,5% Chloroform zugesetzt, und nach Auflösung des Lösungsmittels wurde der pH-Wert auf 8,2 eingestellt. Anschließend wurde 0,1% Polyoxyäthylen(20)-sorbltanmonooleat zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Nacht bei + 4° C gerührt, dann durch Zentrifugation geklärt und anschließend in einer Menge von 12 1/Std. in einen K2-Rolor ( Electronucleonics) eingespritzt, der mit 35 000 U/Minute drehte und einen Saccharose-Gradienten enthielt (2 bis 55%). Nach Durchgang der gesamten Probe wurde der Rotor unter den bekannten Bedingungen, die eine angemessene Reorientierung des Gradienten ermöglichen, verlangsamt. Nach dem Stillstand des Rotors wurde sein Inhalt von unten abgehebert, wobei Fraktionen von je 100 ml entnommen wurden. Die Fraktionen des Gradienten, im allgemeinen mit 20 bis 45% Saccharose, die die HA- und NA-Antigene enthielten, wurden vereinigt. Das Gemisch wurde durch Diafiltration mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung dialysiert, und abschließend wurde die Suspension der Antigene durch sterilisierende Membranen mit Poren von 0,22 μηι filtriert.Influenza virus was ω on incubated chicken eggs increased by incubation at 34.5 ° C for 2 to 3 days. The eggs were chilled to + 4 ° C for one night. The infected allantoic cavity fluids were pooled and clarified by centrifugation. The Viria of Allantoic cavity fluid was then obtained from chicken red blood cells by known methods absorbed and then desorbed, and the resulting virulent liquid was finally through Ultrafiltration concentrated. To this virulent concentrate was added 0.5% chloroform, and after dissolution the solvent was adjusted to pH 8.2. Then 0.1% polyoxyethylene (20) sorbltan monooleate added. The mixture was stirred overnight at + 4 ° C, then by centrifugation clarified and then in an amount of 12 1 / hour. in injected a K2 Rolor (Electronucleonics) rotating at 35,000 rpm and a sucrose gradient contained (2 to 55%). After passing through the entire sample, the rotor was under the known conditions, which allow adequate reorientation of the gradient. After the Rotors was siphoned off from below, whereby Fractions of 100 ml each were taken. The fractions of the gradient, generally with 20 to 45% Sucrose containing the HA and NA antigens were combined. The mixture was filtered through diafiltration dialyzed with buffered physiological saline solution, and finally the suspension was the Antigens filtered through sterilizing membranes with pores of 0.22 μm.
Der Versuch wurde unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch nach der Zugabe des Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonooleats ß-Propiolacton In einer Konzentration von 0,02% zugesetzt und der pH-Wert durch Zusatz einer Base bei 8,2 gehalten wurde.The experiment was carried out under the conditions mentioned in Example 1, but after the addition of the polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate, ß- propiolactone was added in a concentration of 0.02% and the pH was kept at 8.2 by adding a base became.
Der Versuch wurde unter den In Beispiel ! beschriebenen Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch der pH-Wert des Chloroform enthaltenden virulenten Konzentrats auf 8,7 eingestellt und das /J-Propiolacton nach Zugabe des Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonooleats in einer Konzentration von 0,02% zugesetzt wurde. Im Verlauf der Autohydrolyse des /3-Propiolactons sank der pH-Wert allmählich auf 7,6 bis 7,7. Vor der Reinigungsstufe wurde er durch Zusatz einer Base wieder auf 8,2 eingestellt. The experiment was carried out under the In Example! described Conditions carried out, however, the pH of the chloroform-containing virulent concentrate adjusted to 8.7 and the / J-propiolactone after Addition of the polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate was added in a concentration of 0.02%. In the course the autohydrolysis of / 3-propiolactone dropped the pH gradually to 7.6 to 7.7. Before the purification stage, it was adjusted back to 8.2 by adding a base.
Der Versuch wurde unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch der Formaldehyd nach der Zugabe des Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonooleats in einer Konzentration von 0,02% zugesetzt wurde.The experiment was carried out under the conditions described in Example 1, but with the Formaldehyde after adding the polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate in a concentration of 0.02% was added.
Dem auf die In Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltenen virulenten Konzentrat wurden 0,5% Chloroform zugesetzt. Nach der Auflösung des Chloroforms wurde der pH-Wert auf 8.2 eingestellt und dann Polyoxyäthylen(20)-sorbltanmonooleat In einer Konzentration von 0,196 zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Nacht mit einem Magnetrührer gerührt und dann nacheinander durch Zentrifugation und durch Filtration durch Membranen mit Poren von 0,45 μπι Durchmesser geklärt. Das in dieser Weise erhaltene Antigenpräparat wurde einer Fraktionierung durch Ausschließungschromatographie an porösen Siliciumdioxidkugeln in 0,5%lgem Chloroformpuffer von pH 8,2 unterworfen. Die ausgeschlossene Fraktion, die die HA- und NA-Antigene enthielt, wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck vom Chloroform befreit, durch Diafiltration mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung dialysiert und schließlichThe one obtained in the manner described in Example 1 virulent concentrate was added to 0.5% chloroform. After dissolving the chloroform it was the pH is adjusted to 8.2 and then polyoxyethylene (20) sorbltan monooleate in a concentration of 0.196 added. The mixture was stirred with a magnetic stirrer for one night and then sequentially by centrifugation and by filtration through membranes Clarified with pores of 0.45 μm diameter. The antigen preparation thus obtained became one Fractionation by exclusion chromatography on porous silica spheres in 0.5% chloroform buffer subjected to pH 8.2. The excluded fraction containing the HA and NA antigens was freed from chloroform by evaporation under reduced pressure, by diafiltration with buffered dialyzed physiological saline solution and finally
durch sterilisierende Membranen mit Poren von 0,22 μηι Durchmesser filtriert.by sterilizing membranes with pores of 0.22 μm Diameter filtered.
Der in Beispiel 5 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch /J-Propiolacton in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise zugesetzt wurde.The experiment described in Example 5 was repeated, except that / J-propiolactone was used in Example 2 was added in the manner described.
Der in Beispiel 5 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch /J-Propiolacton auf die in Beispiel 3 beschriebene Welse zugesetzt wurde.The experiment described in Example 5 was repeated, except that / J-propiolactone was based on that in Example 3 catfish described was added.
1515th
2020th
Der in Beispiel 5 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch der Formaldehyd auf die in Beispiel 4 angegebene Weise zugesetzt wurde.The experiment described in Example 5 was repeated, however, the formaldehyde was added in the manner indicated in Example 4.
Ein Impfstoff wurde durch Mischen der in der beschriebenen Weise hergestellten Antigenpräparate jedes von der O.M.S. empfohlenen Virusstamms, der der derzeitigen epidemischen Situation entsprach, und Einstellen ihrer Konzentration entweder in internationalen Hämagglutinineinheiten oder In μg Hämagglutinin in einem Volumen von 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung, die bei pH 7,3 gepuffert wurde und Natriumäthylquecksilberthiosalicylat in einer Konzentration von 1/10 000 oder weniger enthielt, hergestellt. Die Wirksamkeit dieses Impfstofftyps wurde an Menschen nachgewiesen. A vaccine was made by mixing the antigen preparations prepared in the manner described each from the O.M.S. recommended virus strain that the current epidemic situation, and adjusting their concentration either in international Hemagglutinin units or In μg hemagglutinin in a volume of 0.5 ml of physiological saline solution which has been buffered at pH 7.3 and sodium ethylmercury thiosalicylate at a concentration of 1/10 000 or less. The effectiveness this type of vaccine has been demonstrated in humans.
Beispielsweise wurde in dieser Weise ein dreiwertiger Impfstoff aus erfindungsgemäß zerteilten und gereinigten einwertigen Antigenen durch Mischen und Verdünnen mit dem Verdünnungspuffer des Impfstoffs in einer solchen Weise hergestellt, daß in 0,5 ml EndgemischFor example, a trivalent vaccine was prepared in this way from divided and purified according to the invention monovalent antigens by mixing and diluting with the dilution buffer of the vaccine in such Way prepared that in 0.5 ml of final mixture
300 I.E. des Typs A/URSS/Η,Ν,, 500 I.E. des Typs A/TEXAS/Η,Ν, und 400 I.E. des Typs B/HK300 I.U. of type A / URSS / Η, Ν ,, 500 I.U. of type A / TEXAS / Η, Ν, and 400 I.U. of type B / HK
erhalten wurden.were obtained.
56 Erwachsene, die zu einer Gruppe der tätigen Bevölkerungen gehörten, erhielten diesen Impfstoff subkutan In einer Dosis von 0,5 ml. Eine serologische Kontrolle wurde durch Blutentnahmen am Tage der Impfung und 30 Tage später durchgeführt. Eine Titration der das Hämagglutinin hemmenden Antikörper wurde gegenüber den drei Antigenen nach der vom O.M.S. empfohlenen Methode vorgenommen. Die Höhe der serologischen Umwandlung sowie das geometrische Mittel der Titer an Antikörpern vor urd nach der Impfung wurden berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt. Sie lassen eine gute Immunisierungswirkung dieses Impfstofftyps erkennen.Fifty-six adults belonging to an active population group received this vaccine subcutaneously In a dose of 0.5 ml. A serological control was performed by drawing blood on the day of vaccination and 30 days later. A titration of that Hemagglutinin-inhibiting antibodies were tested against the three antigens according to the method proposed by the O.M.S. recommended Method made. The level of serological conversion as well as the geometric mean of the titer Antibodies before and after vaccination were calculated. The results are given in the table below. They leave a good immunizing effect recognize this type of vaccine.
4040
A/URSS/ H1N,A / URSS / H 1 N,
A/TEXAS H3N2 A / TEXAS H 3 N 2
B/HKB / HK
Höhe der 92,8% 91,0% 89,3%Amount of 92.8% 91.0% 89.3%
serologischen Umwandlung serological conversion
Geometri- 4,4 3,9 6,0 vor derGeometri- 4.4 3.9 6.0 before the
sches Mittel Impfunga great means of vaccination
des Titersof the titer
Λ/URSS/ HiN1 Λ / URSS / HiN 1
A/TEXASA / TEXAS
H3N;H 3 N;
H/IlkH / Ilk
an Antikörpern of antibodies
183183
109 nach der Impfung109 after vaccination
..
Aus dieser Untersuchung ist auf die gute Veiiräglldikeit dieses Impfstoffs zu schließen, der lediglich einige seltene und bösartige postvakzinale Reaktionen auslöste.From this investigation is on the good veracity to close this vaccine, which caused only a few rare and malignant post-vaccinal reactions.
Beispiel 10Example 10
Um die Verbesserung und die Vorteile der nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erzielten Reinigung iu veranschaulichen, wurde die erste Stufe des Verfahrens gemäß der Erfindung durch Emulsionschromatographie eines virulenten Konzentrats, wie es in Beispiel I defi niert ist, in 0,5%igem (Vol./Vol.) Chloroformpuffer nach dem in der FR-PS 77 12 518 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Hierbei wurde ein hochgereinigies Viruspräparat (DO) erhalten, das 0,5% Chloroform enthielt. Anschließend wurde der pH-Wert dieses Präparats auf 8,7 eingestellt, worauf 0,1% Polyoxyäthyien(20)-sorbitanmonooleat (Polysorbat 80) und abschließend 0.02'». /J-Propiolacton zugesetzt wurden.In order to improve and the advantages of cleaning achieved by the method according to the invention iu illustrate, the first step of the process according to the invention by Emulsionschromatographie a virulent concentrate, as defi ned in Example I, in 0.5% (vol ./Vol.) Chloroform buffer carried out according to the method described in FR-PS 77 12 518. A highly purified virus preparation (DO) containing 0.5% chloroform was obtained. The pH of this preparation was then adjusted to 8.7, whereupon 0.1% polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (polysorbate 80) and finally 0.02%. / J-propiolactone were added.
Das erhaltene Gemisch wurde 18 Stunden gerührt und dann durch Zusatz einer geeigneten Base auf pH 8.2 eingestellt. Das hierbei erhaltene Präparat auf Basis der zerteilten Antigene wurde einer Fraktionierung durch Zonenzentrifugation mit Saccharosegradient unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen unterworfen.The mixture obtained was stirred for 18 hours and then adjusted to pH 8.2 by adding a suitable base. The preparation obtained in this way, based on the divided antigens, was fractionated Subjected to zone centrifugation with sucrose gradient under the conditions mentioned in Example 1.
Für die Gewinnung des Präparats von gereinigten zerteilten Antigenen (D) wurden die in Beispiel 1 beschriebenen aufeinanderfolgenden Maßnahmen durchgeführt. Dieser Behandlung wurden drei Grippevirusstämme unterworfen, die der epidemischen Situation in Europa während der Zelt 1978/1979 entsprachen:For the production of the preparation from the cleaned cut up Antigens (D), the sequential measures described in Example 1 were carried out. Three strains of influenza virus were subjected to this treatment, which were responsible for the epidemic situation in Europe during the 1978/1979 tents:
Virus A/URSS/H.N,
A/TEXAS/H,Ν,
B/HKVirus A / URSS / HN,
A / TEXAS / H, Ν,
B / HK
Für jedes gereinigte Viruspräparat (D.,) einerseits und für jedes nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene Präparat auf Basis gereinigter zerteilter Antigene (O) andererseits wurden die hämagglutinierende Aktivität (ausgedrückt in internationalen Einheilen I. E.) sowie die Konzentrationen an Proteinen und Phospholipiden bestimmt. Ferner wurden die spezifischen Aktivitäten in I. E./mg Proteine (Tabelle I) und I. E./nM der Phospholipide (Tabelle II) berechnet.For each purified virus preparation (D.,) on the one hand and for each according to the method according to the invention obtained preparation based on purified divided antigens (O), on the other hand, became hemagglutinating Activity (expressed in international units I.E.) as well as the concentrations of proteins and phospholipids certainly. Furthermore, the specific activities in I. E./mg proteins (Table I) and I. E./nM of Phospholipids (Table II) calculated.
Die Ergebnisse in den Tabellen I und II zeigen, daß die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Präparate auf Basis von gereinigten zerteilten Antigenen (O) eine hämagglutinierende Aktivität aufweisen, die derjenigen der Präparate auf Basis des hochgereinigten Virus (D0) bei gleichen Protein- oder Phospholipidmengen überlegen ist.The results in Tables I and II show that the preparations based on purified, divided antigens (O) obtained by the method according to the invention have a hemagglutinating activity that of that of the preparations based on the highly purified virus (D 0 ) with the same protein - or amounts of phospholipids are superior.
Spezifische Aktivität in I. E./mg Proteine Specific activity in I.E./mg proteins
A/URSS/ HiN1 A / URSS / HiN 1
A/TEXAS/ H3N2 A / TEXAS / H 3 N 2
B/HKB / HK
6565
Spezifische Aktivität in I. EVnM PhospholipideSpecific activity in I. EVnM phospholipids
A/URSS/ A/TEXAS/ B/HKA / URSS / A / TEXAS / B / HK
HiN1 H3N2 HiN 1 H 3 N 2
D0: Durch Ausschließungschromatographie erhaltenes Präparat des hochgereinigten Virus. D 0 : Preparation of the highly purified virus obtained by exclusion chromatography.
D: Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenes Präparat auf Basis gereinigter zerteilter Antigene. D: Preparation obtained by the method according to the invention on the basis of purified, divided antigens.
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