DE3003959C2

DE3003959C2 - Konjugate aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor und deren Verwendung zur Bestimmung von Liganden

Info

Publication number: DE3003959C2
Application number: DE3003959A
Authority: DE
Inventors: Thomas Raymond Waukegan Ill. Herrin; Jacob Libertyville Ill. Plattner; Houston Frederick Voss
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1979-02-05
Filing date: 1980-02-04
Publication date: 1982-12-23
Also published as: GB2043245B; US4273866A; AU5476380A; FR2447966A1; BE881557A; IT1130254B; ATA56080A; JPS55104896A; CH641569A5; GB2043245A; CA1137077A; SE8000843L; ES488263A0; SE448259B; FR2447966B1; DE3003959A1; AT365781B; ZA80371B; ES8101647A1; AU528592B2

Description

CH₃ 0 — C₄H,

24. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

J J

FSOf

HO

NH-C-CH₃ CH₃ O

A Il

CH₂-CH—C—NH-(CH₂)S-S—(CHj)₂S-P—CH₃

Il I

O 0-CH₂-CH₃

FSO₃-

Es sind eine Reihe von Enzymimmuntests bekannt. Hierzu gehören Verfahren, bei denen ein Enzym an einen nachzuweisenden Antikörper oder Antigen gebunden wird. Die Konkurrenz zwischen der enzymmarkierten und der unbekannten Spezies um den an einen festen Träger gebundenen, bindenden Partner wird gemessen. Das in der Lösung verbleibende Enzym wird durch Umsetzung mit einem entsprechenden Substrat gemessen.

Homogene Enzymimmuntests werden in der US-PS 40 43 872 (Hapten an Enzym gebunden) und in der US-PS 40 65 354 (Hapten an Lysozym gebunden) beschrieben. Mit Enzymkofaktoren markierte Liganden sind in Analytical Biochemistry, Bd. 72 (1976), S. 271 und 283 beschrieben. In Derwendt Abstract B4, Natural Products week A2te, S. 30 (DE-OS 27 54 086) sind reversibel bindende Enzymmodulatoren als markierende Substanzen für Antigene, Antikörper, Hormone, Vitamine oder Arzneistoffe beschrieben. Aus der BE-PS 8 64 856 sind Konjugate bekannt, bei denen Methotrexat als an Ligandenanaloge gebundener Enzyminhibitor dient.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die Reagentien zur Durchführung des Verfahrens unterscheiden sich vom Stand der Technik insbesondere dahingehend, daß an Ligandenanaloge konjugierte irreversible Enzyminhibitoren verwendet werden. Die erfindungsgemäß eingesetzten Inhibitoren reagieren mit den Enzymen unter Bildung von kovalenten Bindungen, wobei sich die Enzymstruktur verändert und die enzymatische Aktivität irreversibel gehemmt wird. Insbesondere werden erfindungsgemäß irreversible Organophosphor-Enzyminhibitoren, die mit einem Enzym unter Bildung von kovalenten Bindungen reagieren, mit Ligandenana-

logen konjugiert.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Liganden in biologischen Flüssigkeiten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

— die biologische Flüssigkeit mit einem aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor bestehenden Konjugat und einem bindenden Protein, das zur Bindung an den Liganden und das Konjugat aus Ligar.denanalogem und irreversiblem Enzymin-

hibitor in der Lage ist, vermischt, wobei die Menge des durch das bindende Protein gebundenen Konjugats aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor in Beziehung zur Menge des Liganden in der biologischen Flüssigkeit steht und

wobei das bindende Protein den irreversiblen Enzyminhibitor bei der Bindung mit dem Ligandenanalogem-Bestandteil des Konjugats inaktiviert

— ein Enzym, das durch das nicht an das bindende Protein gebundene Konjugat aus Ligandenanalo-

gern und irreversiblem Enzyminhibitor irreversibel gehemmt wird, zumischt und

— Substrat für das Enzym zumischt und die Enzym-Substrat-Reaktion bestimmt

14

Gegenstand der Erfindung sind ferner Konjugate aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor, die sich als Reagentien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen. Der irreversible Enzyminhibitor-Bestandteil des Konjugats reagiert mit dem Enzym unter Bildung von kovalenten Bindungen, wobei das Enzym inaktiviert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren und die entsprechenden Reagentien eignen sich insbesondere zur Bestimmung von Arzneistoffen, Hormonen und dergleichen.

Insbesondere werden das erfindungsgemäße Verfahren und die entsprechenden Reagentien zur Bestimmung von Liganden in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Plasma, Rückenmarkflüssigkeit, Amnionflüssigkeit und Urin, eingesetzt.

Unter dem Ausdruck »Ligand« sind erfindungsgemäß Haptene, Polypeptide, Proteine und Glycoproteine mit Molekulargewichten, die im allgemeinen unter 150 000 liegen, zu verstehen.

Haptene sind proteinfreie Körper, im allgemeinen von geringem Molekulargewicht, die bei Verabfolgung an Tiere durch Injektion keine Antikörperbildung induzieren, aber mit Antikörpern reagieren. Antikörper gegen Haptene werden erzeugt, indem man zunächst das Hapten mit einem Protein konjugiert und das Konjugat Tieren oder Menschen unjiziert. Die gebildeten Antikörper werden nach herkömmlichen Verfahren zur Isolierung von Antikörpern isoliert. Für die Zwecke der Erfindung sollen die Antikörper im wesentlichen frei von Serumproteinmaterial, wie beim Test verwendete Indikatorenzyme oder Inhibitoren für die Antikörperbindung, sein. Derartige Proteine werden zweckmäßigerweise durch lonenaustauschchromatographie an einer mit Anionenaustauscher gepackten Säule oder durch andere geeignete Verfahren zur Abtrennung von Proteinen entfernt.

Spezielle Beispiele für Liganden, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, sind Steroide, wie östron, östradiol, Cortisol, Testosteron, Progesteron, Cheno-desoxycholsäure, Digoxin, Cholsäure, Desoxycholsäure, Lithocholsäuren und Ester und Amide davon, Vitamine, wie Vitamin B12 und Folsäure, Thyroxin, Trijodthyronin, Histamin, Serotonin, Prostaglandine, wie PGE, PGF und PGA, Adrenalin, Noradrenalin, Arzneistoffe, wie Opiate, Theophyllin und Dilantin, Barbiturate, wie Phenobarbital und Derivate davon, Carbamazepine und Aminoglycosid-Antibiotika, wie Bentamycin und Tobramycin.

Beispiele für Polypeptide und Glycoproteine, die sich erfindungsgemäß bestimmen lassen, sind Insulin, Blutplättchenfaktor 4 und Polypeptid-Determinanten von großen Antigenen.

Bei Ligandenanaiogen handelt es sich um iünktionelle oder funktionalisierte Liganden, die sich zur Konjugation mit irreversiblen Enzyminhibitoren eignen. Entsprechende funktionell Gruppen sind Säure-, Ester-, Amid-, Amin-, Hydroxyl-, Isocyanat und Isothiocyanatgruppen.

In Tabelle I sind Beispiele für Enzyme und irreversible Enzyminhibitoren, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, aufgeführt.

Tabelle I

Irreversibler Inhibitor

Enzyme

Organophosphothioate

Irreversibler Inhibitor

Enzyme Alkylsulfonate
Alkylisocyanat

p-Chlormercuribenzoat-Derivate

Substrat-Epoxide

ö-Diazo-S-oxo-L-nor-

leucin-Derivat

Jodessigsäure-Derivate

N-Bromsuccinimid-Derivate

Butyrlcholinesterase

Chymotrypsin

Thrombin

Elastase

Adenosin-desaminase

Acetylcholinesterase

Elastase

Trypsin

Chymotrypsin

Papain

Alkohol-dehydrogenase

Chymopapam

Clostridiopeptidase B

Adenosin-desaminase

Lipase

jö-Amylase

Pepsin

Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase

Luciferase

Aspartat-aminotrans-

ferase

Alanin-aminotransferase

Hexokinase
Pepsin
Glutaminase A

saure Desoxyribonuclease II

Alkohol-dehydrogenase saure Desoxyribonuclease II
Dextranase

Organophosphat-triester
Organophosphat-diester

Trypsin
Acetylcholinesterase Irreversible Organophosphor-Enzyminhibitoren werden bevorzugt. In J. Am. Chem. Soc, Bd. 80 (1958), S. 456, J. Am. Chem. Soc, Bd. 82 (1960), S. 596 und Rec. Trav. CWm_n Bd. 86 (1967), S. 399 sind verschiedene Klassen von Organophosphor-Verbindungen beschrieben, die sich als irreversible Enzyminhibitoren eignen. Bevorzugte Organophosphor-Verbindungen, die sich zur Konjugation mit Liganden.analogen eignen weisen die folgende allgemeine Formel auf:

O
R₁-P-S- CH₂- CH₂- B—(CH₂),,- X

R₂

in der B ein Stickstoff- oder Schwefelatom oder deren alkylierte Salze bedeutet, π den Wert 1 bis 10 und vorzugsweise 2 bis 8 hat, X eine funktionell Gruppe, wie die Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl- oder α-Halogenmethylcarboxylgruppe mit ]od. Chlor oder Brom als Halogenatom bedeutet und Ri und R-> Alkylreste mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Alkoxyreste mit 1 bis 10

Kohlenstoffatomen darstellen. Die Alkylreste können durch Nitrogruppen, Halogenatome, Cyanogruppen, Benzylgruppen oder ähnliche Substituenten substituiert sein. Dem organischen Chemiker stehen eine Reihe von äquivalenten Strukturen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verfugung.

Weitere bevorzugte irreversible Enzyminhibitoren weisen die folgende allgemeine Formel auf:

Il

R₃-P-O-

in der R3 die vorstehend für Ri und R2 definierte Bedeutung hat und R4 eine übliche austretende organische Gruppe (»leaving group«), beispielsweise eine p-Nitrophenylgruppe oder eine gegebenenfalls durch Alkyl, Halogen oder Cyano substituierte Hydroxychinolylgruppe darstellt.

Irreversible Enzyminhibitoren werden an Ligandenanalogen durch übliche bifunktionelle Brückengruppen der allgemeinen Formel

X-A-Y

gebunden, wobei X und Y funktioneile Gruppen darstellen, wie -OH, -NH₂, CO₂H (Ester), oder -CO-CH₂Z bedeuten, wobei Z Jod, Chlor oder Brom ist. A bedeutet den Rest -(CH₂),* wobei π einen Wert von 3 bis 20 hat Die Alkylenkette kann durch einen ocwr mehrere zweiwertige Gruppen unterbrochen sein, beispielsweise durch. —O—, —CO—, —S—, —NH-, -CONH-, -CH = CH-, -C=C-, Phenylen und Sulfonium- und Ammoniumsalze. Die Alkylenkette kann durch herkömmliche Substituenten substituiert sein, beispielsweise durch Halogenatome, wie Jod, Brom, Chlor oder Fluor, Hydroxyl, Cyano, Phenyl, Amino, Carboxyl, organische Carboxylester, Alkyl mit 1 bis 7 η Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. X-A-Y kann kleine Polypeptid- oder Polysaccharidketten bedeuten. Somit wird Χ—Α—Υ nach herkömmlichen Verfahren mit einem irreversiblen Enzyminhibitor und einem Ligandenanalogen unter Bildung von Amid-, Ester-, Amin-, 1min·, Sulfonamid-, Thioester-, Phosphat-, Thiophosphatbindungen oder ähnlichen Bindungen zwischen der Brückengruppe und dem irreversiblen Enzyminhibitor und dem Ligandenanalogen gebunden.

Im allgemeinen wird eine Seitenkette an einem Liganden oder Ligandenanalogen gebildet und das Produkt mit einem irreversiblen Enzyminhibitor, der zur Umsetzung mit der Seitenkette am Ligandenanalogen mit entsprechenden funktionellen Gruppen versehen ist, umgesetzt Eine --ndere Möglichkeit besteht darin, eine Seitenkette am irreversiblen Enzyminhibitor zu bilden und mit einem entsprechenden Liganden oder Ligandenanalogen umzusetzen. Somit eignen sich Produkte der Formel

JlI

irreversibler Enzyminhibitor

Ligandenanaloges

als Reagentien.
Nachstehend sind Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare Konjugate angegeben.

Thyroxin

CH₃ C = O O NH

Il ₊ Il I

CH₃-P-S-CH₂-CH₂-S-(CHj)₆-NH-C-CH-CH₂

Uch, Ah.

CH₃OSOr

Cholsäure

CH,

Il Il Il Γ

CH₃-Ρ—SCH₂CH₂-S—CH₂-CH₂-NH-C—(CH₂J₃- NH-C—CH₂-CH₂-CH

OCH₂CH₃

HO H₃C

HO

OH

230 251/555

17 18

Dilantin

O OO

Il ₊ Il I

CH₃-P-S- CH₂CH₂-S—(CHz)₆- NH- C—CH₂NH- C — CH₂-N

AcH₁CH, CH,

CH₃OSOJ

Digoxin

CH₃-P—S—CH₂CH₂-S—(CHj)₆-NH-C—O

OCH₂CH₃

CH₃

Theophyllin

CH₃

CH₃-P-S-Ch₂CH₂-S-CH₂CH₂-NH-C—(CH₁I₅-N OCH₂CH₃

N NH

Cholsäure

CH₃

HO

CO—NH-(CH₂)S-CONH-(CH₂)S-O-P-O

Ο — CH₂- CH₃

CH₃

CH₃-OSO₃-

19

DIgoxin

\/ ^S-P-O-C₄H₉
CH₃ I

CH₃

Digoxjn

^N/ \S—P—0 — CH₂-CH₃ CH₃ I

C₂H₅

Folsäure	O
H₂N
\ HN

	^CH₂NH-

?
O
	<°>



COOH —CONHCH
(CH₂),

Methotrexat H₂N

NH₂

CH₃ COOH

CH₂N-^oN-CONHCH (CH₂),

-P-OC₂H₅ CH₃

Cortisol

CH₂O—N
CONH
(CH₂),

CH₂OH

-P-OC₂H₅ CH₃

22

Valoesäure
CO₂H

CH-CH₂CH₂Ch₂NHCO CH₂ CH₂

CH₂ CH₂

I I

CH₃ CONH

CH₂ CH₂

CH,

S-P

OC₂H₅

Sulfolithocholylglycin

NH

^NH

Il

S-P-OC₂H₅ CH₃

23

CH₃

X-NHCOCH₂^ C₂H₅

C₂H₅

CH₃-C-NH O O

O >— CH₂-CH-CNH(CHz)₆-S-(CHj)₂-S-P-CH₃

0-C₄H,

Gentamycin (Bindung an eine Aminograppe von Gentamycin)

-COCH₂CH₂CONHCH₂CH₂SCh₂CH₂-S-P-CH₃

Tobramycin (Aminogruppe von Tobramycin)

-CO CH,

CH₂ CONHCH₂CH₂SCh₂CH₂S—P—CH₃

OC₂H₅

12

(Vi

ii /\/

tamin B₁₂) —O—CNH-(CH₂)SS/ ^/

S—P—OC₂H₅

Il

GH₃-C-NH O O

Il ₊ Il

CH₂- CH- CNH(CH₂Ji-S—(CHj)₂—S-P-CH₃

CH₃ 0-C₄H₉

Bindende Proteine sind Antikörper oder andere spezifische bindende Proteine, wie thyroidbindendes Globulin, die zur Bindung an den zu bestimmenden Liganden und den Ligaridenanaiogen-Besiandieil des Konjugats aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor in der Lage sind. Bei Bindung des bindenden Proteins an das Ligandenanaloge wird der irreversible Enzyminhibitor inaktiviert. Die beim erfindungsgemäßen Verfahren ablaufenden Reaktionen lassen sich durch folgendes Schema wiedergeben:

FSO7

L = Ligand; )> = bindendes Protein; LAI =

Konjugat aus irreversiblem Enzyminhibitor und Ligandenanalogem; Enz = Enzym; Enz-I = inaktiviertes Enzym; X = Reaktionsnebenprodukt; k₁>fi₁, wobei in den meisten Fällen K₁ fast gleich 0 ist, was bedeutet, daß das bindende Protein das LAI-Konjugat inaktiviert.

Die Reaktion kann kinetisch oder durch Endpunktsmessung bestimmt werden. Bei kinetischen Verfahren wird die Umsetzung

:L+L

25 dEnz
dt

= Ic₁ [LAI] [Enz]

LAI + '

: LAI + LAI

LAI + Enz ——> Enz-I+ X

LAI

U₁
+ Enz ► Enz-I + X

verfolgt. Bei Verfahren mit Endpunktbestimmung wird ein Enzymüberschuß eingesetzt und die Reaktion zu 99 Prozent beendet.

Bevorzugte Konjugate in Verbindung mit Acetylcholinesterase (E.C.3.1.1.7) sind Verbindungen der allgemeinen Formel

R'—Ρ—S—CH₂- CH₂- Β'— (CH₂),,—NH-C-Hapten

Ο —R"

in der R' und R" Alkylresle mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeuten, η einen Wert von 2 bis 8 hat und B' den Rest — S— oder entsprechende Sulfoniumsalze darstellt. Beim Hapten handelt es sich um ein eine Carbonsäure enthaltendes Hapten oder ein so modifiziertes Hapten, das es eine Carbonsäure enthält Beide werden als Ligandenanaloge bezeichnet. Die Erfindung

umfaßt auch die entsprechenden Methylsulfoniumsaize. Besonders bevorzugte Konjugate sind solche, in denen R' und R" jeweils Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen und η den Wert 2 bis 6 hat, unter Einschluß der entsprechenden Sulfoniumsalze. Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel

CH₃—ν—S—UH₂—CJH₂—S—(UH₂Je—NH—C-Hapten

O—R"

in der R" eine Äthyl- oder n-Butylgruppe und die entsprechenden Sulfoniumsalze bedeutet, zum Beispiel O CH₃ O

Il I · Il

CH₃-P—S—CH₂-CH₂-S—(CH₂J_n-NH-C-Hapten

ι +

O—R"

wobei als Gegenion Jodid, Methylsulfat vorliegt Dem Fachmann sind eine Reihe von äquivalenten und damit austauschbaren Anionen geläufig. Verbindungen, in denen η den Wert 2 bis 6 aufweist, werden ebenfalls bevorzugt Weitere bevorzugte Verbindungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind:

Ο— Ρ—Ο— (CH₂),- NH- C-(Hapten) O Q

R'"

CH₃OSOr

in der R"' einen Alkylrest mit 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstofiatomen bedeutet und η einen Wert von 1 bis 12 hat, und

Ο—Ρ—Ο—(CHj)_n-NH-CO—(CHj)_n-NH-C-(Hapten)

I ii

O O

R'" L

in der R'" einen Alkylrest mit 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, η den Wert 2 bis 8 hat und L ein biologisch verträgliches Gegenion, wie Methylsulfat, Jodid oder dergleichen, darstellt.
Somit sind Gegenstand der Erfindung auch analytische Reagentien, die !Conjugate aus irreversiblen Enzyminhibitoren und Ligandenanalogen enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich durch folgendes Schema wiedergeben:

2L + 2LAI + 2

+ LAI + L + LAI

Somit konkurrieren der Ligand (L) und das Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Inhibitor (LAl) um das bindende Protein (>—). Das an LAl gebundene bindende Protein inaktiviert den Inhibitor, während freies LAl zur irreversiblen Hemmung des Enzyms zur Verfügung steht. Je größer die Menge an in der zu untersuchenden Probe vorhandenem Liganden ist, desto geringer ist die Menge des an das bindende Protein gebundenen LAl, so daß mehr Enzym durch freies LAI gehemmt wird. Das nicht gehemmte Enzym reagiert mit einem geeigneten Substrat. Die Enzym-Substrat-Reaktion wird aufgezeichnet.

Kolorimetrische Analysen werden zweckmäßigerweise mit einem bichromatischen Spektrophotometer gemäß den US-PS 37 48 044, 38 31618, 38 33 304, 39 00 289, 38 17 425 und 38 11 780 durchgeführt. Die zu untersuchenden Proben können vorbehandelt werden, um störende Proteine zu entfernen oder zu inaktivieren. Derartige störende Proteine können durch Fällung mit organischen Lösungsmitteln, wie Äthanol, Methanol entfernt werden. Auch eine Wärmebehandlung bei basischen pH-Werten kann eine Entfernung von störenden Proteinen bewirken. Häufig ist es erwünscht, die zu untersuchenden Proben mit starken Säuren oder Basen weiter zu behandeln, um das zu untersuchende Hapten vom Protein abzutrennen. In einigen Fällen ist es lediglich erforderlich, die störenden Proteine spezifisch zu inaktivieren. Beispielsweise wird Serumcholinesterase spezifisch durch spezifische Inhibitoren gehemmt, die eine selektive Aktivität gegen Pseudocholinesterase aufweisen. Beispiele für derartige Verbindungen sind Orphenadrin, N-Methyl-orphenadrin, Phenathiazine, Bis-ß-methylcholinester von Phthalsäure, Chinidin und Artan sowie dessen quaternäre Alkylsalze.

Typischerweise wird Digoxin in mit N-Methylorphe-

nadrin behandeltem Serum kinetisch bestimmt, wobei eine Verbindung der Formel

50

O CH₃

CH₁-I-S-CCH₁-L
Ο—CH₂-CH₃

—NH-C—O

als Konjugat aus irreversiblem Enzyminhibitor und Ligandenanalogem verwendet wird, das mit Digoxin in der zu untersuchenden Probe um Digoxin-Antikörper konkurriert. Nach einer kurzen Inkubationsdauer wird Acetylcholinesterase zugesetzt. Das nichtgehemmte Enzym wird durch Umsetzung mit Acetylthiocolin unter Freisetzung von Thiocholin gemessen. Das freigesetzte Thiocholin wird nach weiterer Umsetzung mit 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) kolorimetrisch gemessen. Die Umsetzung wird bei 412 nm aufgezeichnet. Zur Bestimmung der unbekannten Proben wird eine Eichkurve aufgestellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die entsprechenden Reagentien eignen sich auch zur Bestimmung von bindenden Proteinen, wie Antikörpern. Dabei wird das Ligandenanaloge, das den bindenden Partner für das zu bestimmende bindende Protein darstellt, mit einem irreversiblen Enzyminhibitor konjugiert. Die bindenden Proteine in den zu bestimmenden Proben werden ermittelt, indem man ein Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor zumischt, wobei das Ligandenanaloge des Konjugats spezifisch an das zu bestimmende Protein gebunden werden kann. Anschließend wird ein durch den irreversiblen Inhibitor des Konjugats irreversibel hemmbares Enzym und hierauf ein Substrat für das Enzym zugesetzt. Die Umsetzung wird aufgezeichnet. Da das bindende Protein den irreversiblen Enzyminhibitor inaktiviert, ist die Enzymaktivität um so größer, je größer die Menge an bindendem Protein ist.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Lösung von 7,8 g 6-Aminocapronsäure und 5,0 g Natriumhydrogencarbonat in 50 ml Wasser wird tropfenweise mit 16 g N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 60 ml Tetrahydrofuran versetzt Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt Anschließend wird das Tetrahydrofuran unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird auf den pH-Wert 3 angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert. Nach Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Entfernen des Magnesiumsulfats durch Abfiltrieren wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Durch Umkristallisation aus Essigsäureäthylester/Hexan erhält man N-Benzyloxycarbonyl-6-aminocapronsäure.

Eine Lösung von 4,09 g dieser Verbindung in 40 ml Dioxan wird mit 2,3 g N-Hydroxysuccinimid und 4,12 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Weitere 10 ml Dioxan werden zur Unterstützung der Reagensübertragung verwendet. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumiemepratur gerührt. Anschließend wird filtriert und das Filtrat mit 2,OC g 5-Aminopentanol in 5 ml Wasser versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde gerührt und unter vermindertem Druck eingedampft.

Der Rückstand wird mit Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden mit Wasser und konzentrierter Natriumchloridlösung gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Magnesiumsulfats durch Filtrieren wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird 2mal aus Essigsäureäthylcstcr kristallisiert. Man erhält N-(5-Hydroxypentyl)-6-benzyIoxycarbonylaminohexanamid vom F. 92,5 bis 94° C.

4,0 g dieses Produkts werden in Gegenwart von Palladium-auf-Kohlenstoff in Äthanol unter einem geringen Wasserstoffdruck reduziert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält N-(5-Hydroxypentyl)-6-aminohexanamid.

Eine Lösung des ^-Acetyloxy-S-chloroformyloxy-H-hydroxycard-20(22)-eno!id-Derivats von Digoxigenin (vgl. US-PS 39 81 982) in 40 ml Dioxan wird mit 575 mg N-Hydroxysuccinimid versetzt. Das Gemisch wird in einem kalten Wasserbad gekühlt und mit 0,695 ml Triäthylamin versetzt. Nach 3stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Gemisch abfiltriert. Das Filtrat wird mit einer Lösung von 973 mg N-(5-Hydroxypentyl)-6-aminohexanamid und 378 mg Natriumhy-

drogencarbonat in 20 ml Wasser und 10 ml Äthanol versetzt. Nach 1 Stunde wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wird abfiltriert. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird an 200 g Kieselgel Chromatographien.

Durch Elution mit 5 bis 15prozentigem Methanol in Methylenchlorid erhält man 12-Acetyloxy-3-[N-(12-hydroxy-6-oxo-7-azedodecyl)-carbamoyloxy]-14-hydroxy- card-20(22)-enolid der Formel

OH

2,70 g der vorstehenden Verbindung werden in 50 ml Methanol gelöst Hierauf werden 50 ml Wasser und sodann 10 ml Triäthylamin zugesetzt Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird an einer mit 150 g Kieselgel gepackten Säule chromatographiert und mit 2 Liter 1 Oprozen.tigem Methanol in Methylenchlorid eluiert Man erhält 3-[N-(12-Hydroxy-6-oxo-7-azadodecyl)-carbamoyloxy]-14-hydroxycard-

20{22)-enolid.

Eine Lösung von 170 mg Triäthylammoniumäthyl-7-chinolylphosphat in 10 ml Wabser wird über 15 ml Sulfonsäureharz in der Pyridiniumform gegeben. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt Das wasserfreie Pyridin wird vom erhaltenen Rückstand abgedampft. Der Rückstand wird mit 253 mg 3-[N-(12-

Hydroxy-ö-oxo^-azadodecylJ-carbamoyloxyl-H-hydroxycard-20(22)-enolid versetzt Vom Rückstand wird wasserfreies Pyridin 3mal abgedampft Der Rückstand wird in 1,0 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und mit 145 mg kristallisiertem Tris-isopropylbenzolsulfonylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 Stunden

10 bei Raumtemperatur gerührt Sodann wird Eis zugegeben. Nach 30 Minuten wird das Gemisch mit Methylenchiorid extrahiert Die Methylenchloridlösung wird mit Wasser, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet Das Lösungsmittel wird abgedampft Der Rückstand wird mehrmals mit Toluol versetzt, wobei das Toluol zur Entfernung des Pyridins jeweils abgedampft wird. Schließlich wird der Rückstand an Kieselgel unter Verwendung von 5- bis lOprozentigem Methanol in Methylenchiorid als Elutionsmittel chromatographiert Man erhält eine Verbindung der Formel

CH-

HO

H₃C

Il I I

0-P-O-(CH₂J₅-N-C-(CH₂)S-N-C-O

Il

_nw

^UH

OCH₂CH₃

Il

100 mg dieser Verbindung und 23 μΐ Dimethylsulfat werden in 0,50 ml Aceton gelöst. Nach 4 Stunden werden weiter 60 μΐ Dimethylsulfat in 2 ml Aceton zugesetzt. Sodann wird das Gemisch über Nacht stehengelassen. Die Acetonlösung wird zu Diäthyläther gegeben. Man erhält die Verbindung der Formel I in Form eines weißen Niederschlags.

CH₃

HO

H₃C

Einfluß von Antikörper auf die Hemmwirkung von Verbindung I

Eine Vorratslösung von Verbindung I (4,6 χ 10~³ m in Methanol) wird mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine auf das 200fache verdünnt. Digoxin-Antikörper wird gemäß den Angaben von Tabelle 1 in Phosphat-Gelatine-Puffer verdünnt. 50 μΙ Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0 mit der angegebenen Antikörperkonzentration werden in Probengefäße eines bichromatischen Spektrophotometers (Modell ABA-100, Abbott Laboratories) gegeben. Diese 50 μΐ werden jeweils mit 1 μΐ der Arbeitslösung von Verbindung I versetzt, so daß sich eine endgültige Konzentration von 4,5 χ 10~⁷ m ergibt. Antikörper und Verbindung I (Inhibitor) werden 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann werden die Proben jeweils mit 1 μΐ einer Enzymlösung (9,5xl0"⁹m Acetylcholinesterase aus E. electricus in Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0) versetzt. Die endgültige Enzymkonzentration beträgt 1,9 χ 10-^|0m. Die Proben werden im Verhältnis 1/26 mit Testpuffer verdünnt. Bei diesem Testpuffer handelt es sich um Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0 mit 5 χ 10-⁴In Acetylthiocholin als Substrat und 1,6 x 10~⁴ m 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure)

(DTNB). Die mit der Zeit eintretende Absorptionsänderung wird nach 5 Minuten im bichromatischen Analysengerät, das mit einem 415/550 nm-Filter ausgerüstet ist, bei 3O⁰C gemessen. Folgende Ergebnisse werden erhalten:

230 251/555

Tabelle Π

Enzym
(m)

Antikörper (m)

Verbindung I

(m)

Λ Ad/5 min	21'	ι	43'
	0,221	0,222
nach einer Inkubationszeit vod	0,137	0,107
10'	0,027	0,005
0,220	0,015	0,003
0,161
0,089
0,045

1,9 X 10"¹⁰
1,9 X KT¹⁰
1,9 X 10"¹⁰
1,9 X HT¹⁰

9 X 10"⁷

9 X 10"⁸

4,5 X 10~⁷ 4,5 X 10"⁷ 4,5 X 10"⁷

Der Versuch wird wiederholt, mit der Abänderung, daß Digoxin in einer Konzentration von 2,5 χ 10-⁵ m zu den Probengefäßen gegeben wird. Auf diese Weise wird der spezifische Einfluß demonstriert. 50 μΐ Phosphat-Gelatine-Puffer werden in ein Probengefäß gegeben. Entweder enthält die Pufferlösung 2,5 χ 10~⁵ m Digoxin oder stellt eine Kontrollprobe dar. Sodann wird das Probengefäß mit Digoxin-Antikörper in einer Endkonzentration von 9 χ ΙΟ-⁷ m und mit der Verbindung I in einer Konzentration von 4,5xlO-⁷m versetzt. Die Lösungen werden 15 Minuten inkubiert. Anschließend wird wie vorstehend erläutert Enzym zugesetzt und die Bestimmung vorgenommen. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt

Inkubationsgemisch

Λ Ad/5 min

nach einer Enzym-Inhibitor-Inkubationszeit von

0,3' 11' 19'

Enzym allein (Kontrolle)

Enzym + Verbindung I

Enzym + Verbindung I + Antikörper Enzym + Verbindung I + Antikörper + Digoxin

Gemäß den vorstehenden Verfahrensweisen werden unter der Abänderung, daß die endgültige Antikörperkonzentration 4,5 χ 10- ^J rn beträgt, verschiedene Phosphat-Gelatine-Pufferlösungen mit der angegebenen Digoxinkonzentration hergestellt. Diese Lösungen werden jeweils durch Zusatz von Antikörper und Verbindung I, wie vorstehend erläutert, analysiert, wobei die Inkubationszeit 2,5 Minuten beträgt und die restliche Enzymaktivität nach 21 Minuten bestimmt wird.

Mikromolar Digoxin

Enrvmaktivität

65% 65% 62% 57% 36%

Gemäß dem vorstehenden Verfahren werden menschliche Humanseren mit den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Digoxinkonzentrationen bestimmt.

N,N,N-Trimethyl-2-(o-methyl-iX-phenylbenzyloxy)-äthylammoniummethylsulfat (N-Methylorphenadrin) wird durch Umsetzung von N,N-Dimethyl-2-(o-methyl-Ä-phenylbenzyloxy)-äthylamin (Orphenadrin) mit Dimethylsulfat hergestellt. In einer Konzentration von 1 millimolar hemmt diese Verbindung menschliche Serumcholinesterase zu 99 Prozent beträgt.

N-Äthylmaleinimid wird zum Blockieren von im menschlichen Serum enthaltenen Sulfhydrylgruppen verwendet.

Somit wird 1 μΐ konzentrierte Digoxin-Antikörper-Lösung in Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0

0,174	0,169	0,167
0,162	0,037	0,013
0,160	0,129	0,115
0,160	0,068	0,038

35

40 mit einem Gehalt an 50 millimolar N-Methylorphenadrin zu jeweils 50 μΐ Serumstandard gegeben. Anschließend wird N-Äthylmaleinimid jedem Serumstandard zugemischt, so daß sich eine Arbeitskonzentration von 1,6 millimolar ergibt. Diese Serumproben werden ferner mit 1 μΙ einer Lösung der Verbindung 1 in 0,1 m Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0 versetzt. Die endgültige Antikörperkonzentration beträgt 8,0x10 ⁷m und die endgültige Konzentration an Verbindung I 4,5 χ 10~⁷ m. Diese Lösungen werden 12 Minuten inkubiert. Sodann wird, wie beim vorstehenden Versuch, Acetylcholinesterase zugesetzt. Nach 26 Minuten wird die Messung im bichromatischen Spektrophotomeler begonnen. Eine Probe aus jedem Gefäß wird 26fach mit Testpuffer mit einem Gehalt an 1,6xlO-⁵ m DTNB, 5xlO-⁴m Acetyl-0-methyIthiocholin-jodid und 1 millimolar N-Methylorphcnadrin in 0,1 m Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0 verdünnt. Die endgültige Enzymkonzentration beträgt etwa 2x10"m und die Küvettentemperatur 30⁰C. Nach 5 Minuten ergeben sich folgende Absorptionsänderungen:

Digoxinkonzentration im Serum
(mikromolar)

min

0,13

0,17

0,26

0,34

0,51

0,64

0,85

1,30

0,096
0,089
0,083
0,077
0,073
0,063
0,060
0,047
0,035

Beispiel 2

4,08 g Cholsäure werden in 10 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst Die Lösung wird mit 3,40 g Imidazol und sodann mit 3,60 g tert-Butyldimethylsilylchlorid versetzt Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtempratur stehengelassen. Sodann wird das Gemisch in Wasser gegossen und filtriert Der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und sodann in 30 ml Tetrahydrofuran und 3 ml Wasser gelöst Die Lösung wird mit 2 ml Essigsäure versetzt Nach 6V2 Stunden wird das Lösungsmittel abgedampft Der Rückstand wird an 200 g Kieselgel unter Verwendung von 5prozentigem Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel chromatographiert Man erhält 3a-(tert-

ButyldimethylsilyloxyJ^oc.^ix-dihydroxy-S/J-cholan-24-säure vom F. 145,5 bis 148° der Formel

CH₃ CH₃

I I «

CH₃-C Si—O^s

CO₂H

CH₃ CH₃

2,092 g der vorstehenden Verbindung, 1,728 g N-(5-Hydroxypentyl)-6-aminohexanamid und 1,87 g N-Äthoxycarbonyl^-äthoxy-i^-dihydrochinolin werden 24 Stunden in 175 ml Essigsäureäthylester unter Rückfluß erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei sich eine kristalline Verbindung abscheidet. Dieses Material wird aus Essigsäureäthylester umkristallisiert Man erhält 260 mg Sa-Ctert-ButyldimethylsilyloxyHa.^a-dihydroxy-N-[12-hydroxy-6-oxo-7-azadodecyl]-cholan-24-amid vom F. 145,5 bis 148⁰C der Formel

CH₃ CH₃

I I /

CH₃-C Si-O

CH₃ CH₃

CONH-(CH₂)S-CO-Nh-(CH₂)S-OH

Eine Lösung von 424 g Triäthylammonium-äthyl-7-chinolylphosphat in 10 ml Wasser wird über 15 ml Sulfonsäureharz in der Pyridiniumform gegeben. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingedampft und das wasserfreie Pyridin 2mal vom Rückstand abgedampft. Der Rückstand wird mit 721 mg des vorstehend erhaltenen Alkohols versetzt. Wasserfreies Pyridin wird vom Rückstand 3mal abgedampft. Sodann wird der Rückstand in 1,0 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und mit 364 mg kristallisiertem Tris-isopropylbenzylsulfonylchlorid versetzt.

Das Reaktionsgemisch wird 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird Eis zugegeben. Nach einer '/2 Stunde wird das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridlösung wird mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wird zur Entfernung von Pyridin mehrmals Toluol zugesetzt und abgedampft Der Rückstand wird auf eine mit 50 g Kieselgel gepackte Säure aufgesetzt. Die Säule wird mit 300 ml 5prozentigern Methanol in Methylenchlorid und 1000 ml lOprozentigem Methanol in Methylenchlorid behandelt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man die Verbindung der Formel:

HO

CH₃ CH₃

CH₃-C Si-O

CH₃ CH₃

CO-NH-(CH₂)J-CO

40 mg dieser Verbindung werden in 2 ml Aceton und Das Acetongemisch wird mit Diathyläther versetzt und

0,1OmI Dimethylformamid gelöst Die lösung wird mit ²⁰ zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit Diathyläther

40 μΐ Dimethylsulfat versetzt. Das Reaktionsgemisch behandelt Man erhält die Verbindung Il der Formel wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen.

CH₃ CH₃

I I .

CH₃-C Si-O

CH₃ CH₃

CO-NH-(CH₂)J-CO

OH

O — CH₂—CH₃

CH₃OSO₃-

Die Verbindung II wird zur Demonstration des Antikörpereinflusses auf Hemmung und Umkehrung durch Cholylglycerin (Glygocholsäure) verwendet. Antikörper gegen Konjugate aus Cholylglycerin und Rinderserumalbumin (BSA) werden in Kaninchen gebildet. Das Kaninchenserum wird nach üblichen Verfahren gewonnen. Die anti-Cholylglycin-IgG-Fraktion wird durch fraktionierende Fällung mit Ammoniumsulfat und Ionenaustauschchromatographie gewonnen. Die Antikörperkonzentration wird nicht ermittelt, wird aber in einer vereinigten Fraktion der Ionenaustauschsäule so eingestellt, daß sich die beste Modulation der Hemmung durch die Verbindung II ergibt. In einem Kontrollversuch zeigt IgG gegen Digoxin, das auf die gleiche Weise wie anti-Cholylglycin-IgG gereinigt ist, keinen Einfluß auf die hemmaktivität, was eine spezifische Bindung der Verbindung N anzeigt. Der Versuch wird mit einem bichromatischen Analysengerät (ABA-100, Abbott Laboratories) durchgeführt. Dabei wird folgende Einstellung verwendet:

Temp.:
Rate mode:
Null:

Eichung:
FRR:

30⁰C

0,000
0,500
An

(Skala): 1

(Karusseldrehung): 2
Analysenzeit: 5 Min.
1 /26-Verdünnungsplatte

Filter:

415/550 nm 2 Min. versetzt

Die Substratlösung und der Puffer werden in die erste Spritze der Verdünnungsplatte gegeben. Als Puffer wird

ss 0,1 m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine verwendet. Als Substrat dient eine 5,0 χ 10-⁴ m Lösung von Acetylthiocholin mit 1,6 χ 10-·» m DTNB als Indikator. In der nachstehenden Tabelle sind die im Probengefäß befindlichen Reaktanten angegeben. In sämtlichen Fällen beträgt die Konzentration an Acetylcholinesterase (T. californica) etwa 2 χ 10~¹⁰ m und an Verbindung II (Inhibitor) 10xl0-⁷m. Bei Zusatz von Cholylglycin beträgt dessen Konzentration im Probengefäß 10~³m.

Das Probengefäß enthält 0,1 m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine sowie die in der nachstehenden Tabelle angegebenen zusätzlichen Bestandteile.

39 40

Änderung von Ad in 5 min als Funktion der Zeit und der Reaktionsteilnehmer

Reaktionsteilnehmer

Enzym-Inhibitor-Inkubationszeit (min)

Γ=0 Ad 5 min

T =25

Γ =36

E allein

E + I

E + I + Ab

E + I + Ab + CG

E + Ab

E + Ab + CG

E+ CG

E + I + CG

Puffer allein

0,246
0,226
0,235
0,224
0,224
0,225
0,236
0,224
0,001 0,237
0,072
0,192
0,078
0,225
0,223
0,228
0,062
0,003

0,234
0,025
0,164
0,032
0,218
0,216
0,220
0,022
0,001

0,230 0,013 0,147 0,017 0,215 0,207 0,211 0,013 0,002

E = Acetylcholinesterase

I = Verbindung II

CG = Cholylglycin

AB = Antikörper gegen Cholylglycin konjugiert mit BSA

Beispiel 3

100 ml Tetrahydrofuran werden nacheinander mit 17,0 g N-(tert.-Butoxycarbonyl)-4-aminobuttersäure (hergestellt gemäß Moreder u. Mitarb., Z. Physiol. Chem., Bd. 357 (1976), S. 1651), 10,6 g N-Hydroxysuccinimid und 18,9 g Dicydohexylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt. Der gebildete Dicyclohexyiharnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird mit 11,1 g5-Amino-3-thia-l-pentanolin 150 mlTetrahy-

CH₃

drofuran versetzt. Nach 2¹/2stündigem Rühren wird das Tetrahydrofuran abgedampft. Der Rückstand wird zwischen MethylenchloriJ und Kochsalzlösung verteilt. Die Methylenchloridfraktion wird mit gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhält man 10-(tert.-Butoxycarbamoyl-7-oxo-6-aza-3)-thiadecanol der Formel

CH₃-C-O-C-NH-(CH₂)S-C-NH-CH₂-CH₂-S-Ch₂-CH₂-OH

CH₃

in Form eines Öls.

Unter inerter Atmosphäre werden 2,28 g dieser Verbindung, 1,45 g Diisopropyläthylamin und 1,8 g Methansulfonsäureanhydrid nacheinander bei 0⁰C zu 20 ml Methylenchlorid gegeben. Nach 30 Minuten werden 2,0 g O-Äthyl-methylphosphonothioat und 1,92 g Diisopropyläthylamin zugesetzt Sodann läßt man die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen und erwärmt dann IV2 Stunden auf 45⁰C Hierauf wird die Lösung zwischen Kochsalzlösung und Methylenchlorid verteilt und nacheinander mit 5prozentiger Salzsäure und gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat und Abfiltrieren des Magnesiumsulfats wird das Lösungsmittel abgedampft Man erhält O-Äthyl-S-[10-(tert-butoxycarbamoylj-e-aza-y-oxo-S-thiadecylj-methylphos- phonothioat der Formel

CH₃

CH₃—C — O — C—NH—(CH₂),— C—NH — CH₂—CH₂—S—CH₂—CH₂—S—P—CH₃

CH₃

in Form eines gelben Öls.

1,0 g dieser Verbindung werden bei Raumtemepratur in 4 ml 50prozentiger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid gelöst. Das Gemisch wird 10 Minuten gerührt Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird der Rückstand in einem Oberschuß an Benzol gelöst Das Benzol wird rasch abdestilliert so daß Spuren von Trifluoressigsäure entfernt werden. Das verbleibende Öl wird in 2 ml Dimethylformamid gelöst Nacheinander werden 1,08 g 0-CH₂-CH₃

aktiver Succinimidester von Cholsäure und 37 mg Hydroxybenzotriazol zugesetzt Der pH-Wert der Lösung wird mitTriäthylamin auf 7,5 eingestellt

Nach 6stündigem Rühren wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft Der Rückstand wird zwischen Kochsalzlösung und Methylenchlorid verteilt Die Methylenchlondfraktion wird mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Nach Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abfiltrieren des Magnesiumsulfats wird das Lösungs-

mittel abgedampft. Man erhält N-^-Aza-lO-äthoxymethylphosphinylthio^-oxo-S-thiadecylj-SÄya.^a-trihydroxy-S |3-cholan-24-amid der Formel III

HO

0-CH₂-CH₃

A. Die Geschwindigkeitskonstante für die Hemmung von Cholinesterase durch die Verbindung III wird folgendermaßen ermittelt:

20

Reagentien
Puffer

Die Arbeitslösungen sämtlicher Reagentien werden in 0,1 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine (Phosphat-Gelatine-Puffer) hergestellt. Lösung des Konjugats aus Ligandenanalogem und irreversiblem Inhibitor: Eine 6,7xlO-⁶m Arbeitslösung der Verbindung III in Phosphat-Gelatine-Puffer wird durch entsprechende Verdünnung aus einer 0,067 m Vorratslösung der Verbindung III in Methanol hergestellt.

Acetylcholinesterase

Eine Arbeitslösung mit 100 Einheiten Acetylcholinesterase pro 1 ml in Phosphat-Gelatine-Puffer wird hergestellt. 1 Einheit der Enzymaktivität ist als die Enzymmenge definiert, die pro 1 Minute bei 25°C die Hydrolyse von 1 Mikromol Acetylcholin katalysiert. Unter der Annahme einer Wechselzahl (turnover number) von SxlOSmin-' beträgt die Enzymkonzentration in dieser Lösung 2 χ 10~⁷ m.

Substrat

In jedem einzelnen FaI! wird die Enzymaktivität in Phosphat-Gelatine-Puffer mit einem Gehalt an 4,88 χ 10-" m Acetylthiocholin und 1,56 χ 10-" m DTNB gemessen.

Die Geschwindigkeitskonstante der pseudo-ersten Ordnung für die Hemmungsreaktion wird gemessen, indem man 10μ1 der Arbeitslösung des Konjugats mit 500 μΐ Phosphat-Gelatine-Puffer vermischt. Zum Zeitpunkt 0 werden 5 μΙ (0,5 hmheiten) der Acetylchoünesteraselösung zugesetzt. Nach gründlichem Vermischen wird bei Raumtemperatur inkubiert. In regelmäßigen Abständen wird die vergleibende Enzymaktivität gemessen, indem man 10 μΐ-Aliquotmengen entnimmt, mit 1,0 ml Substratlösung vermischt und die Geschwindigkeit der Absorptionszunahme bei 410 nm (AAIAt) in einem Spektrophotometer (Varian Super Scan 3) mißt Die geschätzte Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung (K\_iaL)) wird gemäß Gleichung 1 berechnet:

(AA/At)t₂ (AA/At)ti

65 wobei t₂ und fi die zeiten nach der tnzymzugabe, bei denen die restliche Aktivität (AAIAt) gemessen wird, bedeuten. Die geschätzte Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für die Hemmreaktion wird sodann berechnet, indem man K\(_QSt.) durch die Konzentration des Konjugats bei der Reaktion (1,3 χ 10-⁷ m) dividiert. Die nach dieser Berechnungsmethode erhaltenen Werte sind nachstehend zusammengestellt.

Zeit
(min)

Aktivität
(Absorptionseinheiten/min)

9,45 X 10"⁴
6,87 X 10"⁴
4,87 X 10"⁴

Durch Auftragung von —In Aktivität gegen ί erhält man eine Steigung von 0,147 min-¹ als Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung, mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,998. Die berechnete anscheinende (apparent) Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung beträgt sodann 1,1 χ 10⁶ Liter Mol-' min-'. Die Messung kann auch mit einem bichromatischen Spektrophotometer vorgenommen werden.

B. Nachstehend wird die Verwendung von Acetylcholinesterase und von Verbindung III als Reagentien zur Bestimmung der Konzentration von Cholylglycin erläutert.

Folgende Reagentien werden verwendet:

Cholylglycin-Eichlösungen (Puffer)

Lösungen von Cholylglycin in 0,1 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine werden hergestellt. Die Cholylglycin-Konzentrationen betragen 10~³, 10-⁴, 10"⁵, 10~⁶ und iö-'m. Die Eichiösungen werden aus einer Vorratslösung von 0,01 m Natriumglycocholat in Wasser hergestellt.

Anticholylglycin-Antikörper

Die IgG-Fraktion von Kaninchen-Antikörper wird erhalten, indem man gesättigte Ammoniumsulfatlösung und das entsprechende Serum in gleichen Teilen vermischt- Der entstandene Niederschlag wird abzentrifugiert und gegen 0,02 m Kaliumphosphat vom pH-Wert 8,0 dialysierL Das Dialysat wird filtriert und sodann an einer mit DEAE-Cellulose gepackten Säule, die mit 0,02 m Kaliumphosphat vom pH-Wert 8,0 äquilibriert worden ist, Chromatographien. Die Antikörper-Arbeitslösung wird erhalten, indem man die entsprechenden, durch das Elutionsprofil bestimmten

Fraktionen, vereinigt. Eine Scatchard-Analyse dieser Lösung ergibt zwei Klassen von Antikörpern mit Bindungskonstanten von IxIO⁷ und lxWm-¹ mit entsprechenden Bindekapazitäten von 2,2 χ 10-⁶ und 3,2xlO-⁵ m.

Die Lösungen von Verbindung III, Acetylcholinesterase und Substrat werden auf ähnliche Weise wie in Abschnitt A dieses Beispiels hergestellt.

Zur Messung der Konzentration an Cholylglycin in Phosphat-Gelatine-Puffer werden 96 μΐ Phosphat-Gela- ι ο tine-Puffer, 20 μΐ der entsprechenden Cholylglycinlösung, 4 μΐ einer 3,35 χ 10~⁶ m Lösung von Verbindung III und 16 μΐ der Anticholylglycin-Antikörperlösung im Probengefäß des bichromatischen, kinetischen Analysengeräts vereinigt. Die Reagentien werden in der !5 angegebenen Reihenfolge zugesetzt. Um eine Verdampfung zu verhindern werden sodann 10 μϊ Siiiconöi zugegeben. Nach 5minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird das bichromatische, kinetische Analysengerät angeschaltet, so daß sich das Karussel mit den Probengefäßen mit der normalen 5minütigen Umdrehung bewegt. Wenn die einzelnen Probengefäße in der Probenstellung ankommen, werden jeweils 4 μΐ (0,09 Einheiten) der Acetylcholinesteraselösung zugesetzt. Die endgültigen Konzentrationen betragen 9,6 χ 10~⁸ m für Verbindung III, 1,67 χ ΙΟ-⁴ bis l,67xlO-⁸m für Cholylglycin und 5,7 χ 10-'° m für Acetylcholinesterase. Nach einer Inkubationszeit von 12 Minuten wird die restliche Enzymaktivität gemessen, indem man eine 10 μϊ-Aliquotmenge in die Küvette (37° C) des bichromatischen, kinetischen Analysengeräts gibt und mit 250 μΐ Substratlösung vermischt. Die 26fache Verdünnung des Materials des Probengefäßes dient dazu, die Hemmreaktion zu stoppen und das Enzym auf einen Konzentrationsbereich, in dem die Aktivitätsmessung leicht durchgeführt werden kann, zu verdünnen. Die Enzymaktivität wird als die innerhalb von 5 Minuten entstehende Absorptionsdifferenz (Ad) angegeben. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

Cholylglycin
(m)

Ad*)/5 min

1,67 X 1(T⁸
1,67 X 10~⁷
1,67 X 1(T⁶
1,67 X 10~⁵
1,67 X 1(T⁴

0,499 ±0,013 0,453+0,025 0,300 ±0,011 0,143+0,002 0,103 ±0,001

40

45

50 Ausnahme, daß die Substratlösung 1,0 mMol N-Methylorphenadrin pro Liter zur Hemmung von Serum-Pseudocholinesterase enthält.

In die Probengefäße des bichromatischen Analysengeräts werden nacheinander 39 μΐ Phosphat-Gelatine-Puffer, 6 μΐ der entsprechenden Chlolylglycin-Eichlösung in normalem menschlichem Serum, 2 μΐ einer 3,35 χ 10-⁶ITi Lösung von Verbindung III, 8 μΐ der Anticholylglycin-Antikörperlösung und 10 μΙ Siliconöl gegeben. Nach 5minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden 5 μΐ (0,05 Einheiten) Acetylcholinesterase wie in Abschnitt B dieses Beispiels zugesetzt. Die endgültigen Konzentrationen betragen 1,1 χ 10-⁷ m für Verbindung III, 8,5 χ 10"⁸ bis l,0x 10~³ m für Chlolylglycin und l,7xlO-⁹m für Acetylcholinesterase. Nach einer Inkubationszeit von 12 Minuten bei Raumtemperatur wird die verbleibende Enzyrnaktivität in den einzelnen Probengefäßen gemäß Abschnitt B dieses Beispiels gemessen. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

Cholylglycin	Cholylglycin	Ad/5 min
im Serum	im Probengefäß
(m)	(m)
8,5 X ΙΟ"⁷	8,5 X ΙΟ"⁸	0,733 ±0,032
1,8 X ΙΟ"⁶	1,8 X ΙΟ"⁷	0,733 ±0,016
1,1 X ΙΟ"⁵	1,1 X ΙΟ"⁶	0,500 ±0,023
1,0 X ΙΟ"⁴	1,0 X ΙΟ"⁵	0,204 ±0,016
1,0 X ΙΟ"³	1,0 X ΙΟ"⁴	0,161 ±0,005

*) Die Werte sind Mittelwerte ± 1 Standardabweichung. Die einzelnen Werte geben jeweils die Ergebnisse eines Dreifachversuchs an.

55

Die Cholylglycinkonzentrationen im Serum werden auf ähnliche Weise wie in den vorstehenden Beispielen bestimmt Für diesen Versuch werden Cholylglycin-Eichserumlösungen hergestellt, indem man eine 0,01 m wäßrige Lösung von Natriumglycocholat mit normalem menschlichem Serum verdünnt. Dieses menschliche Serum weist eine endogene Cholylglycinkonzentration von 7,5 χ ΙΟ"⁷ m auf, was sich durch radioimmunologische Bestimmung ergibt (CGRIA-Testpackung, Abbott Laboratories). Die Gesamtkonzentrationen an Cholylglycin in den Serumlösungen sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt. Sämtliche andere Lösungen entsprechen den vorstehenden Abschnitten A und B, mit der

C. Die modulierende Wirkung von Anticholylglycin-Antikörper auf die Hemmwirkung der Verbindung III gegenüber Acetylcholinesterase wird folgendermaßen bestimmt. Die Arbeitslösungen von Phosphat-Gelatine-Puffer, Anticholylglycin-Antikörper, Verbindung III, Acetylcholinesterase und Substrat werden gemäß Abschnitt A dieses Beispiels hergestellt. In die Probengefäße des bichromatischen, kinetischen Analysengeräts werden in der angegebenen Reihenfolge verschiedene Mengen an Phosphat-Gelatine-Puffer, verschiedene Mengen an Antikörperlösung (vgi. nachstehende Tabelle), 2 μΐ der Lösung von Verbindung III und 10 μΐ Siliconöl zur Verhinderung von Verdampfung gegeben.

Nach 5minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden 6 μΐ (0,06 Einheiten) Acetylcholinesierase gemäß Abschnitt B dieses Beispiels zugegeben. Das Gesamtvolumen der Reagentien in den einzelnen Probengefäßen beträgt 60 μϊ. Die endgültigen Konzentrationen betragen 1,1 χ 10~⁷ m für Verbindung III und 2 χ 10-" rn für Acetylchoiinesterase. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt

Anticholyl-	AD/5 min	Prozentualer ·
glycin		■Anteil an nicht
Antikörper		gehemmtem
(μϊ)		Enzym
0	0,095 ±0,004	8,5
2	0,480 ±0,027	43
4	0,706 ±0,084	63
6	0,856 ±0,048	77
8	0,919 + 0,018	82
10	0,890 ±0,040	80
12	0,899 ±0,020	80

Beispiel 4

Eine Lösung von 5 g 6-Aminohexanol in 50 ml Methylenchlorid wird bei O⁰C tropfenweise mit 9,3 g Di-tert-butyldicarbonat versetzt. Man läßt die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen und rührt sie 17 Stunden lang. Anschließend wird die Lösung mit wäßriger Citronensäurelösung und wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und sodann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Eindampfen des Lösungsmittels erhaltene gelbe Öl wird an Kieselgel unter Verwendung von 3 Prozent Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel gereinigt. Man erhält N-tert.-Butoxycarbonyl-6-aminohexanol der Formel

CH,

CH₃-C-O-C-NH(CHj)₆-OH
CH₃

5,9 g dieser Verbindung und 3,0 g Triäthylamin in 50 ml Methylenchlorid werden mit 3,47 g Methansulfonylchlorid versetzt. Die Lösung wird 30 Minuten gerührt und mit wäßriger Citronensäurelösung und wäßriger Natriumhydrocarbonatlösung gewaschen und sodann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet Nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Eindampfen des Lösungsmittels erhält man N-tert-Butoxycarbonyl-6-aminohexyl-methansulfonat. 6,2 g dieses Produkts werden ohne weitere Reinigung in 10 ml Dimethylformamid zu einer Lösung von 2,5 g j3-Mercaptoäthanol in 60 ml wasserfreiem Dimethylformamid mit einem Gehalt an 3,5 g Kalium-tert.-butylat gegeben. Das Gemisch wird 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

10

20

25

30

35 Anschließend wird das Reaktionsgemisch in Wasser gegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Der organische Extrakt wird 3mal mit 100 ml Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wird abfiltriert und das Lösungsmittel abgedampft. Das verbleibende Öl wird chromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von 5 Prozent Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel gereinigt. Man erhält N-tert-Butoxycarbonyl-9-amino-3-thia-l-nonanol der Formel

15 ter.-Butyl-O - C-NH(CHj)₆-S-(CH^-OH

Eine Lösung von 2 g dieses Produkts und 1,4 g Diisopropyläthylamin in 20 ml Methylenchlorid wird auf 0⁰C gekühlt und mit 1,64 g Methansulfonsäureanhydrid versetzt. Nach 30 Minuten werden 1,86 g Diisopropyläthylamin und 2,0 g O-Äthyl-methylthiophosphonsäure zugesetzt, wobei das Reaktionsgemisch auf O⁰C gehalten wird. Anschließend läßt man die Lösung innerhalb von 30 Minuten auf Raumtemperatur kommen und erwärmt hierauf 2'/2 Stunden unter Rückfluß. Nach dem Abkühlen des Produkts in Methylenchlorid wird mit wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene rohe Produkt wird säulenchromatographisch unter Verwendung von 1 Prozent Methanol in Methyienchlorid als Elutionsmittel gereinigt. Man erhält O-Äthyl-S-(N-tert.-butoxycarbonyl-9-amino-3-thianonyl)-methylthiophosphonat der Formel

O

Il Il

tert.-Butoxy—C—NH-(CHj)₆-S- (CHj)₂-S-P- CH₃

250 mg dieser Verbindung werden in einem 2 :1 -Gemisch von Methylenchlorid und Trifluoressigsäure 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Salz wird in 6 ml Dioxan gelöst und mit 320 mg Diisopropyläthylamin versetzt. Anschließend werden 620 mg N-Hydroxysuccinimidester von N-Acetyl-L-thyroxin zugesetzt Das Gemisch wird 16 Stunden gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch in 50 ml Methylenchlorid gegossen und nacheinander mit wäßriger Citronensäurelösung und wäßriger Natrium-

OCH₂-CH₃

hydrogencarbonatlösung gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet Das nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Öl wird an Kieselgel unter Verwendung von 1 Prozent Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel chromatographiert Nach Umkristallisation aus Acetonitril erhält man 9-(Äthoxymethylphosphinylthio)-7-thianonvl-N-acetvl-thvroxinamid der Formel IV

Il

NH^C-CH₃ O

Il

CH₂-CH-C-NH-(CHj)₆-S-(CHj)₂-S-P-CH₃ (IV)

O . Q-CH₂-CH₃

Eine Lösung von 50 mg dieser Verbindung in 1,5 ml Methylenchlorid wird mit 10,7 rag Methylfluorsulfonat versetzt Innerhalb von 2V₂ Stunden bildet sich ein Feststoff. Das Lösungsmittel wird dekantiert rand der Niederschlag

47 48

mit wasserfreiem Diäthyläther verrieben. Man erhält das Sulfoniumsalz der Formel V

HO

Il

NH—C — CH₃ CH₃ O

A Il

CH₂- CH-C —NH-(CHj)₆-S—(CHj)₂-S—P— CH₃ (V)

Il I

O 0-CH₂-CH₃

Fsor

in Form eines Pulvers.

Die Konzentrationen in unbekannten Proben werden Die Geschwindigkeitskonstante für die Verbindung V 15 unter Verwendung der Eichkurve ermittelt wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 A ermittelt: Die Geschwindigkeitskonstante fur die Verbindung

IV wird gemäß Beispiel 3 A ermittelt.

Geschwindigkeit- Inhibitorkonstante zweiter konzentration
Ordnung,
Liter Mor'min"¹

Verbindung V 1,0 X 10⁸

5,0 X 10"' m

20

Geschwindigkeit- Inhibitorkonstante zweiter konzentration Ordnung,
Liter MoP'min'¹

Verbindung IV 3,5 X 10⁶

2,5 X 10~⁸ m

B.

C.

Thyroxin-Eichkurve unter Verwendung
der Verbindung V

Reagentien

Ein Reagens mit einem Gehalt an 0,1 Einheiten/ml (l,4xl0-^!0m) Acetylcholinesterase (E. electricus) und lxl0~⁸m Thyroxin-IgG-Antikörper (auf ähnliche Weise, wie vorstehend beschrieben, gereinigt) in 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine, l.Omillimolar N-Methylorphenadrin und 0,25 millimolar 8-Anilinonaphthalinsulfonsäure.
Substratreagens mit einem Gehalt an 1,0 millimolar Acetylthiocholin und 0,32 millimolar DTNB in 0,1 m Phosphatpuffer von pH-Wert 7,0.
Arbeitslösung mit einem Gehalt an 2,5xl0"⁷m Verbindung V in 0,1 m Phosphat-Gelatine-Puffer.

Die Bestimmung wird durchgeführt, indem man 5 μΐ Serum mit einem Gehalt an unterschiedlichen Mengen an Thyroxin mit 250 μ! Reagens A vermischt. Das Gemisch wird 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Diese Lösung wird mit 10 μΐ Reagens C und 250 μΐ Reagens B versetzt. Die Ablesungen werden in Abständen von 5 Minuten unter Verwendung eines bichromatischen Analysengeräts mit einer 415/550 nm Filtereinrichtung vorgenommen.

Serum-Eichkurve

Thyroxin-Eichkurven auf Serumbasis werden mit der Verbindung IV aufgestellt, wobei das für Verbindung V beschriebene Verfahren modifiziert wird.

Reagens A enthält 1 millimolar N-Methylorphenadrin und 7 mg/ml Natriumsalicylat in Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0. Die Cholinesterase-Aktivität beträgt 0,07 Einheiten/ml (7 χ 10" " m)und die Konzentration an Thyroxin-Antikörper l,4x10-⁸m, bezogen auf bindende Stellen.

Reagens B entspricht dem vorstehend erläuterten Reagens B.

Reagens C ist eine Arbeitslösung mit einem Gehalt an 5 χ 10~⁷ m Verbindung IV in 0,1 m Phosphat-Gelatine-Puffer.

Die Bestimmung wird durchgeführt, indem man 10 μΐ Serum mit 250 μΐ Reagens A und 10 μΐ Reagens C vermischt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach 250 μΙ Reagens B zugesetzt werden. Zur Bestimmung von unbekannten Proben wird folgende Eichkurve aufgestellt:

Ursprüngliche Thyroxinkonzentration im Serum

(m)

A Ad/5 min
415/550 nm

60

0,6 X 10"⁸
2,6 X 10~⁸
5,2 X 10~⁸

1.0 X ΙΟ"⁷

2.1 X 10"⁷
3,1 X 10"⁷

0,980
0,927
0,902
0,793
0,599
0,578

50

Ursprüngliche Thyroxinkonzentration im Serum

(m)

A Ad/5 min

5 X 10~⁸
1,5 X HT⁷
3,1 X 10"⁷
5 X 10~⁷
1 X 10"⁶

5 X 10"⁶

0,646
0,588
0,525
0,480
0,518
0,484
0,426

Beispiel 5

Man verfährt wie in Beispiel 4, ersetzt aber 6-Aminohexanol durch 4-Aminobutanol, 5-Amino-3-thiapentanol bzw. N-Glycyl-6-amino-i-hexanol. Man erhält:

230 251/555

49

N-tert-ButoxycarbonyM-arnino-1-butanol der Formel

Il

tert-Butyl— O—C—NH- (CHJ₄- OH;

50

1-hexanol der Formel

O O

Il Il

tert-Butyl-O-C-NH-CHi-CNHCCHJs-OH

N-tert.-Butoxycarbonyl-S-amino-S-thia-l-pentanol

der Formel Diese Alkohole werden mit Methylsulfonylchlorid,

O jß-Mercaptoäthanol, Methansulfonsäureanhydrid und

Il ίο O-Äthyl-methylthiophosphonsäure, sofern geeignet,

tert-Butyl-O—C—NH-(CHj)₂-S-(CHj)₂-OH umgesetzt, wodurch man Inhibitoranne zum Kuppeln

der folgenden Formeln erhält:

und NJN'-itert.-ButoxycarbonylJ-glycylj-o-amino-

O O

Il Il

tert-Butyl—O — C—NH-(CHj)₄-S-(CH₂)J-S-P-CH₃

0-CH₂-CH₃

O O

tert.-Butyl—0—C—NH-(CH₂)J-S-(CHj)₂-S-P-CH₃

0-CH₂-CH₃

OO O

Il Il Il

tert.-Butyl—0 — C—NH-CH₂-C-NH-(CHj)₆-S-(CHj)-S-P-CH₃

0-CH₂-CH₃

Bei Umsetzung mit O-Butyl-methylthiophosphonsäure erhält man z. B. eine Verbindung der Formel
O O

Il Il

tert-Butyl—O — C—NH-(CHj)₆-S-(CHj)₂.- S-P-CH₃

OCH₂-CHj-CH₂-CH₃

Diese Reagentien-Zwischenprodukte werden deblockiert und sodann mit dem N-Hydroxysuccinimidester von N-Acetyl-L-thyroxin umgesetzt, wodurch man beispielsweise das Konjugat N-[12-(Äthoxymethylphosphinylthio)-10-th3a-3-aza-2-oxododecyl]-N''-acetylthyroxinamid der Formel

CHj—CH-C—NH-CH₂-C—NH-(CH₂),

und das entsprechende Sulibnhimsalz der Formel VI

NH—C—CH₃ O CH₃

O—< O V-CH₂-CH-C-NH-CH₂-C-NH-(CHj)₆-S-

CH₃OSO₃-

erhält. Diese Verbindungen weisen Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung von 2,5 χ 10⁶ bzw. 1,7 χ ΙΟ⁹ Liter Mol-'min-' bei Inhibitorkonzentrationen von 5x 10-8mbzw.2,5x 10-" m auf.

Beispiel 6

Eine Lösung von 32 g N-Benzyloxycarbonyloxysuecinimid in 100 ml Tetrahydrofuran wird mit 15 g 6-Amino-l-hexal in 30 ml SOprozenligem Methanol in Tetrahydrofuran umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und sodann in Wasser gegossen. Das erhaltene Gemisch wird mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird mit Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Produkt wird aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält N-(Benzyloxycarbonyl)-6-amino-l-hexanoI der Formel

<i V-CH₂-O-C-NH-(CHJ₆-OH

vom F. 81,5 bis 83° C.

21 g dieser Verbindung werden in 100 ml wasserfreiem Pyridin bei 0 bis 5°C mit 10,53 g Methansulfonylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird in kaltes Wasser gegossen und mit Diäthyläther extrahiert. Die Ätherlösung wird gewaschen und getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhält man N-(Benzyloxycarbonyl)-6-aminohexyl-methansulfonat als wachsartigen Feststoff.

Eine Lösung von 7,8 g 0-MercaptoäthanoI in 50 ml Dimethylformamid wird unter Kühlung in einem Eisbad mit 5,15 g Natriummethylat versetzt. Das: gesamte, vorstehend erhaltene N-(Benzyloxycarbony!)-6-amtnohexylmethansulfonat wird in 150 ml Dimethylformamid bei O⁰C unter einer inerten Atmosphäre zu der Lösung von 0-Mercaptoäthanol gegpben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann in eine Natriumchloridlösung gegossen.

Nach Extraktion mit Methylenchlorid, Waschen und Trocknen der Methylenchloridphase und anschließendem Eindampfen des Methylenchlorids erhält man einen Feststoff. Nach Umkristallisation aus Essigsäureäthylester erhält man N-(BenzyIoxycarbonyl)-9-amino-3-thia-1-nonanol. Eine Lösung von 9,5 g dieser Verbindung in 160 ml Methanol mit einem Gehalt an 1,1 Äquivalenten

konzentrierter Salzsäure und 9,5 g Palladium-Mohr wird in eine Parr-Hydriervorrichtung gegeben. Nach 3 Stunden wird der Katalysator abfiltriert und das Methanol entfernt. Man erhält gnol-hydrochlorid vom F. 69 bis 72°C.

Eine Lösung von 3,49 mg

formyloxy-l4-hydroxycard-20(22)-enolid (vgl. US-PS 39 81 892) in 60 ml Tetrahydrofuran wird bei 0°C mit 829 mg N-Hydroxysuccinimid und 0,988 ml Triäthylamin versetzt. Nach 3stündigem Rühren bei 0⁰C wird das feste Triäthylamin-hydrochlorid abfiltriert. Das Filtrat wird mit einer Lösung von 1,5 g 9-Amino-3-thial-nonanol-hydrochlorid und 0,97 ml Triethylamin in 6,5 ml Methanol versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und sodann unter vermindertem Druck teilweise eingedampft. Der Rückwand wird mit wäßriger Natriumchloridlösung verdünnt und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird gewaschen und getrocknet. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels erhält man eine viskose Flüssigkeit. Nach Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von 2 bis 4prozentigem Methanol in Methylenchlorid erhält man 12-AcetyIoxy-3-[N-(9-hy-

droxy-7-thianonyl)-carbamoy!oxy]-14-hydroxycard-20(22)-enolid.

Eine Lösung von 2 g dieses Produkts in 15 ml Methanol wird mit 430 mg pulverisiertem, wasserfreiem Kal'umvarbonat versetzt. Nach 35minütigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit einem Überschuß Chloroform verdünnt und durch Kieselgur (Celite) filtriert. Der nach dem teilweisen Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst, nacheinander mit 0.1 η Salzsäure und Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rohprodukt wird an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Methanol und Methylenchlorid als Elutionsmittel Chromatographien. Man erhält 3-[N-(9-Hydroxy-7-thianonyl)-carbamoyloxy]-12,14-dihydroxycard-20(22)-enolid.

Eine Lösung von 0,725 g dieses Materials in 3 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wird bei -20⁰C nacheinander mit 0,265 ml Athyldiisopropylamin und 0,265 g Methansulfonsäureanhydrid versetzt. Nach 35minüttgem Rühren bei -10°C wird eine Lösung von 0,784 g Dicyclohexylammonium-O-äthyl-methylthiophosphonat in 2 ml Methylenchlorid zugesetzt. Nach 5stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch zwischen Methylenchlorid und verdünnter SaIz-

säure verteilt Die organische Phase wird mit Natriumchloridlösung gewaschen und getrocknet Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rohprodukt wird an Kieselgel unter Verwendung von 2,5- bis 5prozentigem Methanol in Methylenchlorid als EIutionsmittel chromatographiert Man erhält 3-[N-[9-(ÄthoxymethylphospninylthioJ^-thianonyrj-carbamoyloxy]-l 2,14-dihydroxycard-20(22)-enolid der Formel

O=C

NH-(CH₂)S-S- CH₂- CH₂-S-P- CH₃

0-CH₂-CH₃

Ein Gemisch aus 25 mg dieses Materials wird mit 0,5 ml Methyljodjd und einigen Tropfen Methylenchlorid behandelt. Nach 3tägigem Stehenlassen im Dunkeln wird das Lösungsmittel abgedampft. Man erhält das Methylsulfoniumjodid der Formel ΥΠ

(ΥΠ)

O = C

\ ♦ Il

NH-(CHj)₆-S-CH₂-CH₂-S-P-CH₃

CH₃

Gemäß Beispiel 3 wird für die Verbindung VlI eine Eichkurve aufgestellt. Dazu werden für Radioimmun-Testpackungen bestimmte handelsübliche Digoxin-Eichlösungen mit 0, 1, 2, 4 mg/ml Digoxin verwendet. Die endgültige Konzentration für Digoxin-Antikörper beträgt 0,2xl0-⁹m und für N-Methylurphenadrin 2,5xlO-³m bzw. lxlO~³m im Immunoreaktionsgemisch bzw. im Substratgemisch, um die Serum-Pseudocholinesterase zu blockieren. Folgende Ergebnisse werden erhalten:

Digoxin-Eichlösung Ad/5 min

0,5 ng/ml
1,0 ng/ml
2,0 ng/ml
4,0 ng/ml

0,639
0,614
0,583
0,527
0,462

0-CH₂-CH₃

Mit dieser Eichkurve lassen sich die Digoxin-Konzentrationen in unbekannten Serumproben ermitteln.

Beispiel 7

Eine Lösung von 31,5 g N-Hydroxjsuccinimidester von N-Benzyloxycarbonylglycin (vgl. J. Am. Chem. Soc.

Bd. 86 (1964), S. 1839) in 100 ml Tetrahydrofuran wird tropfenweise mit 12 g 6-Amino-l-hexanol in 50 ml 50prozentigem Methanol in Tetrahydrofuran versetzt.

Das Reaktionsgemisch wird 12 Stunden bei 23° C gerührt und sodann in Wasser gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird gründlich mit Wasser gewaschen, filtriert und getrocknet. Man erhält rohes N-(Benzyloxycarbonylglycyl)-6-amino-l-hexanol, das nach Umkristallisation aus Essigsäureäthylester einen F. von 104 bis 105° C aufweist.

Eine Lösung von 15 g dieser Verbindung in 70 ml Pyridin wird in einem Eisbad gekühlt und innerhalb von 5 Minuten mit 4,17 ml kaltem Methansulfonylchlorid

versetzt. Nach 2stündigem Rühren bei 0 bis 5°C wird das Reaktionsgemisch in eiskaltes Wasser gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert. Der Feststoff wird aus Essigsäureäthylester/Hexan umkristallisiert. Man erhält N-(Benzyloxycarbonylglycyl)-6-aminohexylmethansulfonat vom F. 82 bis 83° C.

Eine Lösung von 16,5 g dieser Verbindung in 75 ml Dimethylformamid wird unter inerter Atmosphäre zu einer kalten Lösung von 4,0 g /?-Mercaptoäthanol in 25 ml Dimethylformamid, das 2,65 g Natriummethylat enthält, gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann in eine Natriumchloridlösung gegossen. Nach Extraktion dieser Lösung mit Methylenchlorid und einer üblichen Aufarbeitung unter Waschen, Trocknen und Eindampfen erhält man N^BenzyioxycarbonylgiycyO-a-amino-S-thia-1-nonanol. Nach Umkristallisation aus Essigsäureäthylester erhält man die reine Verbindung vom F. 99 bis 100⁰C.

56

Eine Lösung von 1,15 g dieses Alkohols in 7 ml Chloroform wird mit 0,387 g Thionylchlorid versetzt. Das Gemisch wird D/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Bestandteile werden unter vermindertem Druck abgedampft. Eine Lösung von 1,04 g des restlichen Feststoffs in 3 ml Dimethylformamid wird zu einer Lösung aus Natrium-O-äthyl-methylthiophosphonat (hergestellt aus 2,59 mMol Natriumhydrid und 0,377 g O-Äthylmethylthiophosphonsäure) in 1 ml Dimethylformamid gegeben. Nach 16stündigem Rühren bei 60° C wird das Gemisch in eine Natriumchloridlösung gegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird gewaschen und getrocknet. Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Öl wird an Kieselgel unter Verwendung von 2- bis 4prczeniigern Methanol in Methylenchlorid Chromatographien. Man erhält O-ÄthyI-S-[N-(benzyloxycarbonylgIycyl)-9-amino-3-thianonyl]-methylthiophosphinat der Formel

O O

-CH₂-O-C-NH- CH₂-C—NH(CH₂),;- S— CH₂-CH₂-S-P-CH₃

0-CH₂-CH₃

Eine Lösung von 6 g N-Benzyloxycarbonylglycyl-P-amino-S-thia-l-nonanol in 100 ml Methanol mit einem Gehalt an 1,1 Äquivalenten konzentrierter Salzsäure und 6 g Palladium-Mohr wird 2 StunOen in einer Parr-Vörrichtung hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Eindampfen des Lösungsmittels erhält man N-Glycyl-9-amino-3-thia-l-nonanol-hydrochlorid der Formel

HCl · H₂N-CH₂-CO —NH-(CH₂)S-S—CH₂-CH₂-OK

Eine Suspension von 5 g Natrium-Diphenylhydantoin in 35 ml wasserfreiem Dimethylformamid wird unter Rühren mit 3.04 g Bromessigsäureäthylester versetzt. Das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der nach dem Eindampfen des Dimethylformamids unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird zwischen Methylenchlorid und einer Natriumchloridlösung verteilt. Die organische Phase wird gewaschen und getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man das N-alkylierte Diphenylhydantoinderivat vom F. 179 bis 180⁰C. 4,5 g dieser Verbindung werden in 50 ml Tetrahydrofuran mit 2,17 g Kaliumhydroxid in 15 ml Wasser versetzt. Das Gemisch wird 12 Stunden gerührt. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird mit 35 mi Wasser verdünnt. Die wäßrige Lösung wird mit Diäthyläther extrahiert Sodann wird die wäßrige Lösung mit 6 η Salzsäure angesäuert, um 2-(N-DiphenyIhydantoinyl)-essigsäure auszufällen.

Eine Lösung von 1,25 g dieser Verbindung und 0,500 g N-Hydroxysuccinimid in 5 ml 40prozentigem Tetrahydrofuran in Dimethylformamid wird mit 0,906 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird gekühlt. Nach 3stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wird mit 1,09 g N-Glycyl-9-amino-3-thia-1-nonanol-hydrochlorid und 0,41 g Triäthylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird sodann 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und hierauf zwischen Methylenchlorid und gesättigter Natriumchloridlösung verteilt. Die organische Phase wird gewasehen und getrocknet Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene öl wird an Kieselgel Chromatographie«. Man erhält 12-[2-(Dipheny!hydar.toinyl)-acetamido]-ll-oxo-10-aza-3-thia-l-dodecanol der Formel

55

CH₂-C-NH-CH₂-C-NH-(Ch₂)S-S-CH₂-OH

Diese Verbindung wird gemäß den vorstehenden Erläuterungen in diesem Beispiel mit Natriutn-O-äthyl-methylthiophosphonat umgesetzt. Man erhält O-Äthyl-S-tn-P-fN-aiphenylhydantoinyl^acetamidol-ll-oxo-lO-aza-S-thiadodecyl]-methyl-thiophosphonat der Formel (VUT)

CH₂-G-NH — CHj—C—NH-(CH^₆-S-(CH₂)₂—S—P—CH₃

OCH₂CH₃

(vm)

Eine Lösung von 0,512 g dieses Produkts und 0,119 g Dimethylsulfat in 1 ml Tetrahydrofuran wird 6 Stunden unter einer inerten Atmosphäre auf 65 bis 7O⁰C erwärmt. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird in

15

Chloroform aufgenommen. Durch Zusatz von Diäthyläther wird O-Athyl-S-[12-[2-(N-diphenylhydantoinyl)-ace tamido]-11 -oxo-10-aza-3-thiadodecyI]-methylthiophosphonatmethylsulfat der Formel Formel

CH₃

CK)

CHj-C-NH-CH^C-NH-CCH^-S-CHz-CHr-S-P-CHj

+ ι

CH₃OSOf

0-CH₂-CH₃

ausgefällt. bzw. 1,4χ 10⁹ Liter Mol-'min-' auf. Diese Hemmung

Die Verbindungen VIII und IX weisen Geschwindig- 30 wird durch Dilantin-Antikörper beeinflußt. Eine typi-

keitskonstanten zweiter Ordnung für die Hemmung von sehe Eichkurve in Puffer ist nachstehend für die

Acetylcholinesterase (bestimmt gemäß den vorstehend Verbindung IX angegeben:
erläuterten Verfahren) von 6,8xlO⁵ Liter Mol-'min-¹

Dilantin-Konzentration
Mol/Liter

BiAd/5 min

ΙΟ"⁷
10"⁶
ΙΟ"⁵

83,5
74,1
62,5
47,2

Beispiel 8

Gemäß Beispiel 7 wird unter Verwendung von 4-Brombuttersäureäthylester 4-(N-DiphenyIhydantoinyl)-buttersäure vom F. 147 bis 148° C hergestellt.

15,88 g N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicsrboxamidester von N-Carbobenzyloxy-0-aIanin (vgl. Chem.

Pharm. Bull, Bd. 22 (1974), S. 1857) werden gemäß den 50 der Formel

vorstehend beschriebenen Verfahren mit 5 g 5-Amino-3-thia-l-pentanol kondensiert. Man erhält 9-Benzyloxycarbamido-7-oxo-6-aza-3-thia-l-nonanol vom F. 99 bis 101°C. Durch Hydrierung dieses Materials erhält man 9- Amino- 7-oxo-6-aza-3-thia-1 -nonanol-hydrochlorid

HCl - NH₂ — CH₂—_{2 22Z}

Dieses Produkt wird gemäß den vorstehend erläuterten Verfahren mit 4-N-(N-Diphenylhydantoinyl)-buttersäure kondensiert. Das erhaltene Produkt wird mit O-Äthyl-methylthiophosphonat umgesetzt. Man erhält ein Konjugat der Formel X

OO O

Il Il Il

(CHj)₃-C-NH-(CHj)₂-C-NH-iCH^-S-iCHj^-S-P-CH₃

0-CH₂-CH₃

(X)

Das Konjugat X weist eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für die Hemmung von Acetylcholinesterase von 2,2 χ 10⁶ Liter Mol-'min-¹ auf. Diese Hemmung wird in Gegenwart von Dilantin-Antikörper beeinflußt. Zur Bestimmung von Dilantin in Serumproben läßt sich eine Eichkurve aufstellen.

Beispiel 9

204 mg O-Äthyl-S-rjJ^tert.-butoxycarbonylaminoJ-S-thiapentyl]-methyl-thiophosphonat werden mit 20 ml 50prozentigem Methylenchlorid in Trifluoressigsäure versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Lösungsmittel abgedampft und die restliche Trifluoressigsäure unter Verwendung eines Toluol-Azeotrops entfernt. Der Rückstand wird in 2,0 ml Dimethylformamid gelöst und mit 83 μΐ Triäthylamin, 140 mg 6-(3-Theophyllin)-hexansäure (hergestellt

gemäß W. Traube, Ber., Bd. 36 (1900), S. 3035), 140 mg Hydroxybenztriazol, 113 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 1 ml Dimethylformamid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

Anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst, mit Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Der nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird chromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von lOprozentigem Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel gereinigt. Man erhält

N-[2-[2-ÄthoxymethylthiophosphinyI)-äthylthio]-äthyI]-l-methyl-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahydro-7H-purin- 3-hexanamidvom F. 103 bis 106⁰C der Formel

(CH₂)S-C-NH-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-S-P-Ch₃

O ■ - Ο —CH₂-CH₃

Diese Verbindung weist eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für die Hemmung von Acetylcholinesterase von 5,5xlO⁶ Liter Mol-'min-¹ auf. Diese Hemmung wird durch Theophyllin-Antikörper beeinflußt. Diese Verbindung wird gemäß den vorstehend erläuterten Verfahren zur Bestimmung von Theophyllin in Blutserum verwendet.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Liganden in biologischen Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man

— die zu untersuchende biologische Flüssigkeit mit einem aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzymhibitor bestehenden Konjugat und einem bindenden Protein, das zur Bindung an den Liganden und das Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor in der Lage ist, vermischt, wobei die Menge des durch das bindende Protein gebundenen Konju- is gats aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor in Beziehung zur Menge des Liganden in der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit steht und wobei das bindende Protein den irreversiblen Enzyminhibitor bei

10 — der Bindung mit dem Ligandenanalogen-Bestandteil des Konjugats inaktiviert,
ein Enzym, das durch das nicht an das bindende Protein gebundene Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor irreversibel gehemmt wird, zumischt und
Substrat für das Enzym zumischt und die Enzym-Substrat-Reaktion bestimmt

Z Analytisches Reagens zur Bestimmung von Liganden in biologischen Flüssigkeiten, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor.

3. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

R'—P—S—CH₂-CH₂-B'—(CHj)_n-NH-C-Hapten O
R"

in der η den Wert 2 bis 8 hat und R' und R" Alkylreste mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und B'den Rest —S oder ein entsprechendes Sulfoniumsalz bedeutet.

4. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

O— P— O— (CHz)_n-NH-CO— (CH₂),,-NH-C-Hapten

I Il

CH₃ °-^R/" L

in der R'" einen Alkylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, η den Wert 2 bis 8 hat und L ein biologisch verträgliches Gegenion darstellt.

5. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

CH₃ C = O O NH

Il ₊ Il I

ch₃-p-s-ch₂-ch₂-s-(ch₁v- nh-c — ch-ch₂

L Ah₁

CH₃OSOr

3 4

6. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

O Ö O

I! Il . . ü I .

CH₁-P-SCH₂Ch₂-S-CH₂-GH₂-NH—G-(GHj)₃-NH—C-CH₂-CH₂-GH

OCH₂CH₃ * HG H₃C

H₃C

HO

7. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

CH₃-P-S-CH₂CH₂—S—(CH2)₆-—NH—C — GH₂NH-C-CH₂-N

OCH₂CH₃

CH₃

CH₃OSO₃-

8. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

O O

■ Il . .. ₊ .. . Il

CPI₃-P—S—CH₂CH₂-S—(CH₂)S-NH-C —O OCH₂CH₃ CH₃

J"

9. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

O O

Il Il

CH₃-P-S-CH₂CH₂-S-CH₂CH₂-Nh-C-(GH₂)S-N OCH₂CH₃

ο T"³

CH₃

N NH

10. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

CH₃

OH

CO-NH-(CHj)₅-CONH- (CHj)₅-Ο—Ρ—Ο 1^

Ο—CH₂-CH₃

CH₃—OSOr

11. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Fonnel O

\/\s—P—0 —C₄H₉

CH₃ I

12. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel O

—p_O — CH₂— CH₃

I
C₂H₅

13. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

H₂N

COOH

CH₂NH-< O ^CONHCH

(CH₂J₂

14. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel H₂N

CH₃

COOK

NH₂

(CH₂J₂

15. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

CH₂OH C = O

H₃C

HO

H₃C

OH

CH₂O-N CONH

,₄s/V^S

—Ρ—

CH₃

(CH₂J₄S

16. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel CO₂H
CH-CH₂CH₂Ch₂NHCO

CH₂ CH₂ CH₃

CH₂

CH₂

CONH CH₂ CH₂

S—P—CH₃ OC₂H₅

-P-OC₂H₅
CH₃

-P-OC₂H₅
CH₃

'Ss--

230 251/555

17. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

NH

NH

18. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

O /^CIi3 C₂H₅

HNCCH₂O-<^ V-NHCOCH₂N

CH,

C₂H

₂H₅

(CHj)₃

^{v X}S—P—OC,H

■2ⁿ5

CH₃

19. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

O ^J CH₃—C-NH O

S-P-OC₂H₅ CH₃

(CH₂)J-S-P-CH₃ 0-C₄H₉

20. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel (Aminogruppe von Gentamycin)

-COCH₂CH₂CONHCH₂CH₂SCH₂Ch₂-S-P-CH₃

21. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

(Aminogruppe von Tobramycin)
— CO

CH₂

CH₂ ■ O

CONHCH₂CH₂SCh₂CH₂S—P—CH₃

OC₂H₅

22. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

O

(Vitamin B₁₂) —Ο —CNH- (CHj)₆S /XZS-P

23. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Formel

CH₃-C-NH

Il

0H-< O V-O-< O V-CH₂-CH-CNH(CH₂)S-S—(CHj)₂-S-P-CH₃