DE3045430A1

DE3045430A1 - (alpha)-hydroxy-tripeptid-substrate

Info

Publication number: DE3045430A1
Application number: DE19803045430
Authority: DE
Inventors: Akhtar 60061 Vernon Hills Ill. Ali; Robert Glen 60031 Gurnee Ill. Hiltibran
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1979-12-03
Filing date: 1980-12-02
Publication date: 1981-09-03
Also published as: FR2471411A1; FR2471411B1; DE3045430C2; JPS585674B2; US4244865A; JPS56121499A

Description

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Die Erfindung betrifft neue <X-Hydroxy-tripeptid-Substrate und deren Herstellung. Diese Substrate eignen sich zur quantitativen Bestimmung von proteolytischen Enzymen, wie Thrombin und Trypsin. Diese Substrate werden durch ein proteolytisches Enzym hydrolysiert und ergeben ein Produkt, das spektrophotometrisch bestimmt werden kann und somit die vorhandene Enzymmenge anzeigt.

Die erfindungsgemässen Substrate eignen sich als Reagentien zum Nachweis und zur Bestimmung von proteolytischen Enzymen, die Amidbindungen in Peptidketten am Carboxylende von Arginin- und Lysinresten spalten.

Strukturell verwandte chromogene und fluoreszierende Substrate sind in den US-PSen 3 886 136, 4 028 318, 4 061 625 und 4 070 245 beschrieben. Bei keinem dieser bekannten Substrate ist eine <X-Aminogruppe am terminalen Rest durch eine o(-Hydroxidgruppe ersetzt.

Erfindungsgemäss wurde festgestellt, dass zumindest 3 spezielle Vorteile erzielt werden können, wenn am N-terminalen Ende bzw. an der P -Stelle eines Tripeptid-Substrats eine analoge CX-Hydroxysäure verwendet wird. Besonders bemerkenswert ist, dass die Löslichkeit in wässrigen Puffern bei Vorliegen der o<Hydroxylgruppe grosser ist als bei benzoylblockierten Aminosäuresubstraten. Ferner zeigen <X-Hydroxysubstrate keine Empfindlichkeit gegenüber einer Aminopeptidase-Wirkung, so dass keine blockierenden Gruppen an den N-Endgruppen erforderlich sind und es nicht notwendig ist, die D-Form anstelle der (natürlichen) L-Form der N-endständigen Aminosäure zu verwenden. Die oc-Hydroxyanalogen erleichtern auch die Synthese, da es nicht erforderlich ist, die Hydroxylsubstituenten während der Synthese mit Schutzgruppen zu versehen und diese wieder zu entfernen. Die o(-Hydroxysubstrate zeigen ähnliche enzymatische Reaktivitäten, wobei die Kinetik mit denen der entsprechenden o(-Aminosäureprodukte sehr ähnlich ist.

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Gegenstand der Erfindung sind spektrophotoraetrisch nachweisbare Substrate, nämlich oi-Hydroxy-tripeptide der allgemeinen Formel

HO-CH-CO-A₁-A₂-R₂
^R1

in der

R₁ Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes niederes Alkyl (C₁-C₁.) oder Benzyl bedeutet,

R₂ p-Nitroanilid, Nitrophenyl, Methylnitrophenyl, Dinitrophenyl, Naphthyl, Nitronaphthyl, JJ-Methyl-T-cumarylamid, i-Methoxy-3-naphthylamid oder Thiobenzylester bedeutet, A₁ einen Rest einer L-Aminosäure aus der Gruppe Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Prolin, Isoleucin, Serin, Threonin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Lysin, Hydroglycin, Histidin, Arginin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Cystein, Methionin und Pipecolinsäure bedeutet und Ap den Rest von L-Arginin oder L-Lysin bedeutet.

Bevorzugt sind Substrate der allgemeinen Formel

HO-CH-CO-A₁-Ap-Rp

» XtLtL

^R1

in der

R₁ Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes niederes Alkyl (C₁-Ci,) oder' Benzyl bedeutet,

Rp p-Nitroanilid, Nitrophenyl oder Thiobenzylester bedeutet, A₁ einen Rest einer L-Aminosäure aus der Gruppe Glycin, Alanin, Valin, Prolin, Isoleucin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Phenylalanin bedeutet und
A₀ den Rest von L-Arginin oder L-Lysin bedeutet.

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Die zur Herstellung der erfindungsgemässen Substrate verwendeten (X-Hydroxysäuren lassen sich alle gemäss dem Verfahren von M. Winitz et al., J. Am. Chem. Soc, Bd. 78 (1956), S. 2423 herstellen. Ausgehend von oc-Hydroxy-ß-pHenylpropionsäure und oC-Hydroxyisocapronsäure lassen sich die erfindungsgemässen Substrate gemäss folgendem grundlegenden Kupplungsverfahren herstellen:

Carbobenzoxy (CBZ)-Arg-OH wird mit p-Nitrophenylisocyanat gekuppelt. Das erhaltene R wird mit HBr/Essig-

CBZ-Ärg-pNA

säure behandelt, wobei man erhält.

HBr-Ärg-pNA

R t CBZ-Pro-Succinimidylester wird mit HBr-Arg-pNA gekuppelt,

wodurch man geschütztes R erhält.

CBZ-Pro-Arg-pNA

Das geschützte Dipeptid wird mit HBr/Essigsäure behandelt. Das gebildete R wird weiter an eine rt-Hydroxy-

HBr-Pro-Arg-pNA

säure unter Verwendung von 1-Hydroxybenzotriazol und Dicyclohexylcarbodiimid gekuppelt.

Das ouHydroxysäure-Pro-Arg-pNA kann ferner mit HF oder Methansulfonsäure umgesetzt werden, um die Guanidinschutzgruppe R vom Arginin zu entfernen.

Geeignete R-Gruppen sind Methoxybenzolsulfonyl, Nitro und Tosyl.

Die CBZ-Gruppe zum Schutz der <X-Aminogruppe von Aminosäuren kann durch andere Reste ersetzt werden; beispielsweise durch tert.-Butyloxycarbonyl oder O-Nitrophenylsulfonyl.

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Ira vorstehend erläuterten Reaktionsschema können mit Erfolg auch andere Aminosäuren eingesetzt werden. Beispielsweise kann als Aminosäure, die direkt an die nachweisbare austretende Gruppe gebunden ist, auch Arginin oder Lysin vorliegen. Als Aminosäure im Zentrum des Tripeptidrests können beliebige der vorstehend für A₁ genannten Reste vorliegen.

Der· N-endständige ot-Hydroxylsubstituent leitet sich im allgemeinen durch Substitution der Amingruppe von Glycin, Alanin oder Phenylalanin durch eine (^-Hydroxylgruppe ab. Dieser oc-Hydroxylsubstituent kann sich aber auch von Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Lysin, Hydroxylysin, Histidin, Arginin, Tyrosin, Tryptophan, Cystein oder Methionin ableiten.

Eine bevorzugte chromophore Gruppe ist p-Nitroanilid. Es können aber auch andere bekannte chromophore Reste verwendet werden, wie Methylnitrophenyl, Nitrophenyl, Dinitrophenyl, Naphthyl und Nitrophenyl; vgl. Plapinger et al., J. Organic Chem., Bd. 30 (1965), S. 1781.

Ferner können auch an sich bekannte, fluorimetrisch bestimmbare austretende Gruppen verwendet werden, wie 4-Methyl-7-cumarylamid (vgl. Morika et al., J. Biochem., Bd. 82 (1977), S. 1495), i-Methoxy-3-naphthylamid (vgl. Elarin et al., Anal. Biochem., Bd. 80 (1977), S. 355) und Thiobenzylester.

Die Beispiele erläutern die Herstellung von bevorzugten Cf--Hydroxysubstraten.

Beispiel 1

Herstellung von N^-Methoxybenzolsulfonyl-L-arginyl-p-Nitroanilid . HBR

23 g Ν^Λ-Carbobenzoxy-N^-iil-methoxybenzolsulfonyD-L-Arginin,

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hergestellt geraäss Nishimura et al., Chem. Pharm. Bull., Bd. 24 (1976), S. 1568, werden in 100 ml Hexamethylphosphoramid gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 6,7 ml Triäthylamin und 15,8 g p-Nitrophenylisocyanat versetzt. Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und sodann in 1300 ml einer 5-prozentigen Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und nacheinander 2 mal mit je ¹IOO ml 5-prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung, 1 mal mit 300 ml Wasser, 3 mal mit je 300 ml 1 η Salzsäure und 2 mal mit 200 ml VJasser gewaschen. Der Niederschlag wird auf dem Filter durch Absaugen getrocknet und sodann 3 mal mit je 300 ml siedendem Methanol extrahiert. Die Methanolextrakte werden vereinigt. Der nach dem Abdampfen des Methanols unter vermindertem Druck bei 35 C erhaltene halbfeste Rückstand wird an einer mit Kieselgel gepackten Säule unter Verwendung eines Gemisches von 1 bis 5 Prozent Methanol in Chloroform als Elutionsmittel weiter gereinigt. Man erhält N^-Carbobenzoxy-N& -(4-methoxybenzolsulfonyl)-L-Arginin-p-nitroanilid.

6.0 g dieses Produkts werden in 30-prozentiger Bromwasserstoffsäure in Eisessig gelöst. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird 45 Minuten bei Raumtemperatur belassen und sodann in 400 ml trockenen Ä'ther gegossen. Das ausgefällte Salz wird abfiltriert und 2 mal mit je 100 ml trockenem Äther gewaschen. Man erhält N^ω-Methoxybenzolsulfonyl-L-Arginyl-p-nitroanilid-hydrobromid.

Beispiel 2

Herstellung von N* -CBZ-Pro-N -MBS-Arg-pNA

0,7 g (2 mMol) Carbobenzoxy-L-prolin-succinimidylester und

1.1 g (2 mMol) N^ -MBS-L-Arg-pNA-HBr werden in 10 ml Tetrahydrofuran und 2 ml Dimethylformamid gelöst. Das Reaktionsgemisch wird mit 0,24 ml (2 mMol) N-Methylmorpholin versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das

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Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 300 ml Methylenchlorid suspendiert. Die Lösung wird mit 1 η Salzsäure (1 χ 60 ml) Kochsalzlösung (1 χ 60 ml), gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (1 χ 60 ml) und Kochsalzlösung (1 χ 60 ml) gewaschen. Sodann wird die Lösung über wasserfreiem MgSO^ getrocknet und auf ein Volumen von 2 bis 3 ml eingeengt. Die erhaltene Lösung wird mit wasserfreiem Äther versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert. Die Ausbeute beträgt 0,64 g.

Beispiel 3 Herstellung von L-Pro-N^-MBS-Arg-pNA.HBr

0,64 g N -CBZ-L-Pro-N^-MBS-Arg-pNA werden in 10 ml 30% HBr/ Essigsäure gelöst. Die Lösung wird 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen und sodann in 50 bis 60 ml wasserfreien Äther gegossen. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert und in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Die Ausbeute beträgt 0,45 g.

Beispiel4 Herstellung von Qt.-Hydroxysäure-Pro-N"-MBS-Arg-pNA

437 mg (0,68 mMol) Pro-N^-MBS-Arg-pNA.HBr, 0,68 mMolcX-Hydroxysäure und 92 rag (0,68 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol werden in 10 ml Tetrahydrofuran und 2 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0⁰C gekühlt und unter Rühren mit einem Magnetrührer mit 0,1 ml (0,68 mMol) N-Methylmorpholin und 140 mg (0,68 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Der Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das FiI-trat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform oder Methanol suspendiert oder gelöst und mit Äther gefällt. Der Feststoff wird abfiltriert. Gemäss diesem Verfahren werden die nachstehend aufgeführten blockierten Verbindungen hergestellt:

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(1) L-<>.-Hydroxy-ß-phenylpropionyl-L-Pro-N -MBS-L-Arg-pNA

(2) D-oc-Hydroxy-ß-phenylpropionyl-L-Pro-N^-MBS-L-Arg-pNA

(3) L-cUHydroxyisocaproyl -L-Pro-N*-MBS-L-Arg-pNA

(4) D-oC-Hydroxyisocaproyl-L-Pro-N^-MBS-L-Arg-pNA

(5) Glykoloyl-L-Pro-I^-MBS-L-Arg-pNA

Beispiel 5

<*- Hydroxysäure-L-Pro-L-Arg-pNA

0,5 mMol <*-Hydroxysäure-L-Pro-L-N -MBS-Arg-pNA werden in Methansulfonsäure (35 ) ) gelöst. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch in wasserfreien Äther gegossen. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert. Das Produkt wird weiter aus Methanol/fither und Tetrahydrofuran/A'ther gefällt. Bei der dünnschichtchromatographischen Analyse mit n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:1 ergibt sich ein einziger Flecken.

Gemäss diesem Verfahren werden die nachstehenden, als Enzymsubstrate verwendbaren Verbindungen synthetisiert:

(1) L-tt-Hydroxy-ß-phenylpropionyl-L-Pro-L-Arg-pNA

(2) D-of-Hydroxy-ß-phenylpropionyl-L-Pro-L-Arg-pNA

(3) L-of-Hydroxyisocaproyl-L-Pro-L-Arg-pNA

(4) D-of-Hydroxyisocaproyl-L-Pro-L-Arg-pNA

(5) Glykoü oyl-L-Pro-L-Arg-pNA

Klinisch lassen sich die erfindungsgemässen Substrate beispielsweise zur Messung von Antithrombin III (AT III) verwenden.

Antithrombin III ist der Hauptbestandteil des menschlichen Antikoagulationssystems. Es hemmt eine Reihe von Serinproteasen durch Bildung eines 1:1-Komplexes mit Serin, dem aktiven Zentrum derartiger Enzyme. Durch Anwesenheit von Heparin wird die Reaktionsgeschwindigkeit von AT III mit derartigen Proteasen etwa auf das 100-fache erhöht.

) ausreichende Menge

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Die Reaktionsweise von AT III lässt sich durch folgende Gleichungen wiedergeben:

Heparin
Thrombin + AT III > (Thrombin: AT III)

+ Thrombin-Überschuss

Thrombin-Überschuss _{Peptid + chrornophor}

Da die Anwesenheit von Heparin die Aktivität von AT III erhöht, ist es möglich, die Hemmung aufgrund von AT III von der Hemmung durch andere Plasmaproteine, die ebenfalls Thrombin hemmen, abzugrenzen. Dabei misst man die gesamte AT III-Aktivi· tat als eine von der "progressiven Antithrombinaktivität", die in Abwesenheit von Heparin gemessen wird, unterschiedliche Grosse. Als Ergebnis dessen lässt sich klar feststellen, dass ein Defekt im Antikoagulationssystem in Verbindung mit AT III und nicht mit einem anderen Proteinheramechanismus vorliegt.

Der Test beruht auf der Tatsache, dass menschliches AT III in einer Probe menschliches -^-Thrombin in einem Molverhältnis von 1:1 hemmt, überschüssiges Thrombin steht zur Hydrolyse eines farblosen Substrats zur Verfügung. Wird dieses Substrat gespalten, setzt es eine spektrophotometrisch nachweisbare austretende Gruppe frei, die eine deutliche Verschiebung im Absorptionsspektrum ergibt, was sich in der Entwicklung einer nachweisbaren Färbung oder Fluoreszenz bemerkbar macht. Diese Substratspaltung ist analog der Spaltung der Arginyl-Glycin-Bindung in Fibrinogen, die zur Bildung von Fibrin führt. Durch Feststellung der Fluoreszenzentwicklung im Reaktionsgemisch lässt sich der Verlauf der Umsetzung des Substrats durch Thrombin verfolgen. Da die Menge an AT III und die gebildete Fluoreszenz oder Färbung umgekehrt propo.rtional sind, kann der Gehalt an AT III leicht ermittelt werden.

Ende der Beschreibung

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Claims

DR.-ING. WALTER A3ITZ DR. DIETER F. MORF
DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER Patentanwälte

München,
2. Dezer.ber 1980

Postanschrift / Postal Address Postfach 8ΘΟ1Ο9, 80O0 München 86

FienzenauerstraQe 28

Telefon ΘΒ 32 23

Telegramme: Chemindus München

Telex: (O) B 23ΘΘ2

3727

ABBOTT LABORATORIES North Chicago, Illinois 60064

(X -Hydroxy-tripeptid-Substrate

Patentansprüche

\1.yChromogenes oder fluoreszierendes Substrat zur quantitativen Bestimmung von proteolytischen Enzymen, die Peptidbindungen am Carboxylende von Arginin und Lysin spalten, der allgemeinen Formel

HO-CH-CO-A₁-A₂-R₂

in der

R₁ Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes niederes

Alkyl (C₁-C₁J) oder Benzyl bedeutet,

R₂ p-Nitroanilid,Nitrophenyl, Methylnitrophenyl, Dinitrophenyl, Naphthyl, Nitronaphthyl, 4-Methyl-7-cumarylamid, 1-Methoxy-3-naphthylamid oder Thiobenzylester bedeutet,

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ORtGlNAL INSPECTED

A. einen Rest einer L-Aminosäure aus der Gruppe Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Prolin, Isoleucin, Serin,Threonin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Lysin, Hydroglycin, Histidin, Arginin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Cystein, Pipecolinsäure und Methionin bedeutet

Ap den Rest von L-Arginin oder L-Lysin bedeutet.

2. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ Viasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes niederes Alkyl (C₁-C₁.) oder Benzyl bedeutet, Rp p-Nitroanilid, Nitrophenyl, Methylnitrophenyl, Dinitrophenyl, Naphthyl, Nitronaphthyl oder Thiobenzylester bedeutet,

A. einen Rest einer L-Aminosäure aus der Gruppe Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Prolin, Isoleucin, Threonin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Phenylalanin und Methionin bedeutet und
Ap den Rest von L-Arginin oder L-Lysin bedeutet.
3. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes niederes Alkyl (C₁-Cj₁) oder Benzyl bedeutet, Rp p-Nitroanilid, Nitrophenyl oder Thiobenzylester bedeutet,

A₁ einen Rest einer L-Aminosäure aus der Gruppe Glycin, Alanin, Valin, Prolin, Isoleucin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Phenylalanin bedeutet und Ap den Rest von L-Arginin oder L-Lysin bedeutet.
4. Chromogenes Substrat nach Anspruch 3, nämlich Glykoloyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilid.
5. Chromogenes Substrat nach Anspruch 3, nämlich L-CK-Hydroxyisocaproyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilid.

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³⁷²⁷ " ³ " 30A5430
6. Chromogenes Substrat nach Anspruch 3, nämlich D-o<-Hydroxyisocaproyl-L-prolyl-L-Arginyl-p-nitroanilid.
7- Chroraogenes Substrat nach Anspruch 3, nämlich L-o(-Hydroxyß-phenylpropionyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilid.
8. Chromogenes Substrat nach Anspruch 3, nämlich D-o(-Hydroxyß-phenylpropionyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilid.

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