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DE2917999A1 - SUBSTRATE FOR DETERMINING THE GAMA GLUTAMYL TRANSPEPTIDASE - Google Patents

SUBSTRATE FOR DETERMINING THE GAMA GLUTAMYL TRANSPEPTIDASE

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Publication number
DE2917999A1
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Germany
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acid
glutamyl
determining
solution
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Helmut Dipl Chem Dr Heber
Helmut Dipl Chem Dr Kohl
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Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
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Behringwerke AG
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    • C12Q1/48Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase

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Abstract

1. Process for quantitatively determining gamma-glutamyltranspeptidase by means of a lyophilized salt of gamma-glutamyl-p-nitranilide with an acid, which process comprises dissolving that salt in a buffer, adding the sample containing the gamma-glutamyltranspeptidase and determining the amount of p-nitraniline set free.

Description

29173992917399

BEHRINGWERKE AKTIEMGESEr1LSCfIAFT HOE 79/ B 005 - Ma 354BEHRINGWERKE AKTIEMGESEr 1 LSCfIAFT HOE 79 / B 005 - Ma 354

Dr.Hs/Bl.Dr Hs / Bl.

Substrat zur Bestimmung der γ-GlutamyltranspeptidaseSubstrate for the determination of γ-glutamyl transpeptidase

Die Erfindung betrifft ein Substrat zur Bestimmung der γ-Glutamyltranspeptidase in wässrigen Systemen, vor allem in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere in Blutserum. Es findet hauptsächlich Verwendung zur Erkennung und Verlaufsdiagnose von Lebererkrankungen.The invention relates primarily to a substrate for the determination of γ-glutamyl transpeptidase in aqueous systems in biological fluids, especially in blood serum. It is mainly used for detection and Diagnosis of the course of liver disease.

Die Bestimmung der γ-Glutamyltranspeptidase (γ-GT) Aktivität erfolgt nach dem bekannten Reaktionsschema:The determination of the γ-glutamyl transpeptidase (γ-GT) activity takes place according to the known reaction scheme:

γ-Glutamyl-p-Nitranilid + Glycylglycin ^ »p-Nitranilin +γ-glutamyl-p-nitroanilide + glycylglycine ^ » p -nitraniline +

Glutamylglycy!glycin.Glutamylglycy! Glycine.

Die Freisetzung des gelbgefärbten p-Nitranilins kann optisch verfolgt werden. Sie ist ein direktes Maß für die vorhandene γ-GT-Aktivität.The release of the yellow-colored p-nitroaniline can be optical to be tracked. It is a direct measure of the γ-GT activity present.

Der Vorzug des einfachen Nachweises des Nitranilins ist z. Zt. mit dem Nachteil verknüpft, daß das Substrat γ-Glutamyl-p-Nitranilid in wässrigen Lösungen mit pH-Werten,wie sie bei der Bestimmung der γ-GT eingehalten werden müssen, sehr schlecht löslich ist. Dies ist u.a. aus den Patentanmeldungen DE-OS 20 42 829 und DE-OS 22 59 512 bekannt. Man hat schon mehrfach versucht, dieses Problem zu lösen. So wurde das Substrat beispielsweise in verdünnter SaLzsäure oder in organischen Lösungsmitteln in hoher Konzentration vorgelöat und in dieser Form den Best imiruingsianontzen zugefügt, wodurch eine starke Verschiebung da;; pH-Wortes; vermieden wird. Zu dem Nachteil dieser wenig elticfariten Methode kommt noch die InstabilitätThe advantage of the simple detection of nitroaniline is z. Currently linked to the disadvantage that the substrate γ-glutamyl-p-nitranilide is very poorly soluble in aqueous solutions with pH values such as must be observed when determining the γ-GT. This is known from patent applications DE-OS 20 42 829 and DE-OS 22 59 512, among other things. Attempts have been made several times to solve this problem. For example, the substrate was pre-oiled in dilute hydrochloric acid or in organic solvents in high concentration and added in this form to the best imiruingsianontzen, whereby a strong shift there ;; pH word; is avoided. In addition to the disadvantage of this little elticfaritic method, there is also the instability

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des Substrates hinzu, die in stark saurem, wässrigen Milieu beobachtet wird. Daher sind solche Lösungen nur kurzfristig für Messungen einsetzbar.of the substrate, which is in strongly acidic, aqueous Environment is observed. Therefore, such solutions can only be used for measurements for a short time.

Gemäß einem anderen bekannten Verfahren wird das γ-Glutamyl-p-Nitranilid bei einer Temperatur zwischen 50 und 60°C aufgelöst und danach auf Zimmertemperatur abgekühlt. Auch hierbei besteht die Gefahr der spontanen Hydrolyse der chromophoren Gruppe. Weiterhin ist das Auflöseverfahren zeitraubend und häufig wegen der Rekristallisation des Substrates ohnehin nicht erfolgreich.According to another known method, the γ-glutamyl-p-nitroanilide is obtained dissolved at a temperature between 50 and 60 ° C and then cooled to room temperature. Here, too, there is a risk of spontaneous hydrolysis of the chromophoric group. Furthermore, there is the dissolution process time-consuming and often unsuccessful anyway because of the recrystallization of the substrate.

Solche Methoden sind für die routinemäßige Anwendung des Testes in klinischen Laboratorien unbefriedigend, so daß die Aufgabe bestand, die damit verbundenen Nachteile zu beseitigen. Das Substrat γ-Glutamyl-p-Nitranilid soll bei der für die Durchführung der Bestimmung einzuhaltenden Temperatur von etwa 25 C ausreichend gut löslich sein.Such methods are unsatisfactory for routine use of the test in clinical laboratories, so that the task was to eliminate the associated disadvantages. The substrate γ-glutamyl-p-nitranilide is said to be be sufficiently soluble at the temperature of around 25 C to be maintained for the determination.

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß sich trockenes γ-Glutamyl-p-Nitranilid, vorzugsweise als Lyophilisat, im Testpuffer bei 20 -bis 25°C nahezu augenblicklich auflöst, wenn das Substrat protonisiert, das heißt als Salz vorliegt. Dies bedeutet, daß das γ-Glutamyl-p-Nitranilid vor der Trocknung mit einer Säure im stöchiometrischen Verhältnis oder im Überschuß zu den Basenäquivalenten versetzt wird.According to the invention it has now been found that dry γ-Glutamyl-p-Nitranilide, preferably as a lyophilisate, dissolves almost instantly in the test buffer at 20-25 ° C, when the substrate is protonated, i.e. it is present as a salt. This means that the γ-glutamyl-p-nitroanilide before drying with an acid in the stoichiometric ratio or in excess of the base equivalents is moved.

Gegenstand der Erfindung ist demnach eine trockene Zubereitung des γ-Glutamyl-p-Nitranilids zur Verwendung als Substrat zur Bestimmung der γ-GT, gekennzeichnet durch den Gehalt einer Säure in mindestens molarem Verhältnis zu dessen Basenäquivalent.The invention accordingly relates to a dry preparation of γ-glutamyl-p-nitroanilide for use as a substrate for determining the γ-GT, characterized by the content of an acid in at least a molar ratio to its base equivalent.

Q30046/0275Q30046 / 0275

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Da zudem gefunden wurde, daß das Reagenz auch nach Wiederauflösung eine bessere Farbstabilität besitzt, wenn es mit einem quaternären Polykation versetzt wird, gehört es zum Gegenstand der Erfindung, daß die trockene Zubereitung gegebenenfalls mit einem solchen hochmolekularen Lösungsstabilisator versetzt ist.Since it was also found that the reagent has a better color stability even after redissolution, if a quaternary polycation is added to it, it belongs to the subject of the invention that the dry preparation optionally with such a high molecular weight Solution stabilizer is added.

Im engeren Sinne gehört es zum Gegenstand der Erfindung, daß als Substrat für die Bestimmung von γ-Glutamyltranspeptidase die Ammoniumsalze des γ-Glutamyl-p-Nitranilids gegebenenfalls mit einem Überschuß an Säure verwendet werden.In the narrower sense, the subject matter of the invention is that as a substrate for the determination of γ-glutamyl transpeptidase the ammonium salts of γ-glutamyl-p-nitroanilide optionally used with an excess of acid will.

Als Säuren, die hierfür in Frage kommen, sind praktisch alle organischen oder anorganischen Säuren zu nennen, die ein Ammoniumsalz des γ-Glutamyl-p-Nitranilids zu bilden vermögen, z.B. Schwefelsäure, die Phosphorsäuren, alle Halogenwasserstoff-Säuren, Oxyhalogenwasserstoff-Säuren, Essigsäure und Trifluoressigsäure. Bewährt ha-0 ben sich Kombinationen aus einer anorganischen und einer organischen Säure wie Di-, Tri-, Tetra-Carbonsäuren beziehungsweise -hydroxycarbonsäuren, beispielsweise Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäuren, Weinsäuren, Citronensäure, Ascorbinsäure, Glucuronsäure. Vorzugsweise wird eine anorganische Säure, z.B. Salzsäure, in Kombination mit einer organischen Säure, z.B. Weinsäure, verwendet. Bezogen auf ein Basenäquivalent des Nitranilids ist das Verhältnis von etwa 0,9 Äquivalenten dex* anorganischen Säure und etwa 0,1 Äquivalenten der organischen Säure besonders günstig.The acids that can be used for this purpose are practical to name all organic or inorganic acids that are an ammonium salt of γ-glutamyl-p-nitroanilide capable of forming, e.g. sulfuric acid, phosphoric acids, all hydrogen halide acids, oxyhalogen acid acids, Acetic acid and trifluoroacetic acid. Proven ha-0 ben are combinations of an inorganic and an organic acid such as di-, tri-, tetra-carboxylic acids respectively -hydroxycarboxylic acids, for example malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, Pimelic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acids, tartaric acids, citric acid, ascorbic acid, glucuronic acid. Preferably an inorganic acid, e.g. hydrochloric acid, is used in combination with an organic acid, e.g. Tartaric acid. Based on a base equivalent of the nitranilide, the ratio is about 0.9 equivalent dex * inorganic acid and about 0.1 equivalents of the organic Acid particularly cheap.

Zui Horst cY1 1'mg des .Substrates eignen sich alle gängigen Methoden, der orqnni .schon Chemie zur Herstellung vonZui Horst c Y 1 1'mg of the .Substrates are all common methods, orqnni .schon chemistry for the production of

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ORIGINAL [NSPECTEDORIGINAL [NSPECTED

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Ammoniumsalzen von primären Aminen. Ein Überschuß der Säuren ist so lange nicht schädlich, so lange das Substrat ohne Nachteile gefriergetrocknet werden kann und das wiederaufgelöste Substrat die Kapazität des Test— puffers nicht überschreitet. Am einfachsten geht man von einer wässrigen Lösung des γ-Glutamyl-p-Nitranilids aus, stellt das stöchiometrische Verhältnis des Anilids zu einer Säure fest, versetzt die Lösung mit der betreffenden Säure in dem gewünschten Verhältnis, gegebenenfalls mit einem Überschuß von ca. 2 0 % und trocknet das Produkt, vorzugsweise durch Gefriertrocknung.Ammonium salts of primary amines. An excess of the Acids are not harmful as long as the substrate can be freeze-dried without any disadvantages the redissolved substrate does not exceed the capacity of the test buffer. The easiest way is to go from an aqueous solution of γ-glutamyl-p-nitroanilide off, determines the stoichiometric ratio of the anilide to an acid, adds the relevant to the solution Acid in the desired ratio, if necessary with an excess of about 2 0% and dries it Product, preferably by freeze drying.

Ein anderer sehr einfacher Weg zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zubereitung ist * die wässrige Lösung des Nitranilids mit der gewünschten Säure anzusäuern, wonach die Trocknung durchgeführt werden kann.Another very simple way of making those of the present invention Preparation is * to acidify the aqueous solution of Nitranilids with the desired acid, after which drying can be carried out.

Der wesentliche Vorteil des erfindungsgemäßen Trockenproduktes besteht darin, daß es hierbei zu keiner nennenawerten Hxdrolyse vor dessen Verwendung im Test kommt und demgemäß eine Störung durch einen Leerwert hoher optischer Extinktion ausbleibt.The main advantage of the dry product according to the invention consists in the fact that there is no mentionable hydrolysis before it is used in the test and accordingly, interference from a blank value of high optical absorbance does not occur.

Eine Verbesserung der Substrateigenschaft wird, wie bereits erwähnt, dadurch erreicht, daß dem Substrat ein quaternares Polykation in einer Konzentration von 0,1 100 mg/ml Testlösung zugesetzt wird. Dieser Befund ist überraschend, da es bekannt ist, daß übliche kationische bzw. anionisehe Detergenzien die γ-Glutamyltranspeptidase-Aktivität hemmen bzw. vermindern. Demgegenüber beeinflussen quaternäre Polykationen auf Basis von Polyvinylpyrrolidon die Enzymaktivität nicht meßbar. Den gleichen Effekt zeigen äthoxylierte Alkylphenole oder äthoxylierte Phenole sowie Tetrafluoräthylen-Polymerisate mit verzwelgten Perfluorgruppen. Diese Polymeren.verzögern einzelnAn improvement in the substrate property will, as already mentioned, achieved by the fact that the substrate a quaternary polycation in a concentration of 0.1 100 mg / ml test solution is added. This finding is surprising since it is known that common cationic or anionic detergents the γ-glutamyl transpeptidase activity inhibit or reduce. In contrast, quaternary polycations based on polyvinylpyrrolidone have an effect the enzyme activity cannot be measured. Ethoxylated or ethoxylated alkylphenols have the same effect Phenols and tetrafluoroethylene polymers with branched perfluoro groups. These polymers delay individually

■Q300A-S/027-5■ Q300A-S / 027-5

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oder in Kombination die Rekristallisation des Ύ-Glutamyl-p-Nitrunilids bei Raumtemperatur.or in combination the recrystallization of the Ύ-glutamyl-p-nitrunilide at room temperature.

Das gegebenenfalls mit dem Polymeren versetzte Salz des γ-Glutamyl-p-Nitranilids wird in fester Form zur Verfügung gehalten. Dies kann in Trockenabfüllungen oder in Tabletten verpreßt geschehen.The salt of des, optionally mixed with the polymer γ-Glutamyl-p-Nitranilids is available in solid form held. This can be done in dry fillings or compressed into tablets.

Weitere Verbesserungen hinsichtlich der Stabilität des Produktes werden erreicht durch übliche Zuschläge bei der Gefriertrocknung von Produkten wie Gelatine oder Gelatine-Hydrolysaten, Zuckeralkoholen oder Kohlenhydraten, Pufferkomponenten, Konservierungsmitteln und/oder Lösungsvermittlern. In der bevorzugten Form wird Mannit verwendet in einem Konzentrationsbereich von 1 - 50 mg/ml. Als weiterer Stabilisator eignet sichFurther improvements in terms of the stability of the product are achieved through the usual surcharges the freeze-drying of products such as gelatine or gelatine hydrolysates, sugar alcohols or carbohydrates, Buffer components, preservatives and / or solubilizers. In the preferred form Mannitol used in a concentration range of 1 - 50 mg / ml. Another suitable stabilizer is

(R)(R)

Gelatinehydrolysat (Haemaccel , Behringwerke AG) in einem Konzentrationsbereich von 0,1 - 30 mg/ml. Die Stabilisatoren können einzeln verwendet werden. In der bevorzugten Ausführungsform des Tests werden beide Stabilisatoren in Kombination in den oben genannten Konzentrationsbereichen eingesetzt.Gelatin hydrolyzate (Haemaccel, Behringwerke AG) in a concentration range of 0.1 - 30 mg / ml. The stabilizers can be used individually. In the The preferred embodiment of the test are both stabilizers used in combination in the above concentration ranges.

Auch das in die Reaktion der Transpeptidase eingehende Glycylglycin kann in der trockenen Zubereitung bereits enthalten sein, so daß für den Test lediglich das Substratgemisch in Wasser aufgelöst werden muß, wonach das Enzym bestimmt werden kann.The glycylglycine, which goes into the reaction of the transpeptidase, can also already be present in the dry preparation be included, so that only the substrate mixture has to be dissolved in water for the test, after which the Enzyme can be determined.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern. The following example is intended to explain the invention in more detail.

030046/0275030046/0275

- JT- - JT-

BeipielExample

Das erfindungsgemäße Substrat wird wie folgt hergestellt: a) SubstratkomgonentenThe substrate according to the invention is produced as follows: a) Substrate components

1) 1/17 g γ-Glutamyl-p-nitranilid1) 1/17 g γ-glutamyl-p-nitroanilide

(1,176 g/1000 ml = 4,4 mti)(1.176 g / 1000 ml = 4.4 mti)

2) 8,7 g Glycylglycin
3) 16 g Mannit
2) 8.7 grams of glycylglycine
3) 16 g of mannitol

4) 10 g Kalium-Natrium Tartrat . 4 HO4) 10 g of potassium-sodium tartrate. 4 HO

5) 40 g Quarternäres Polyamin5) 40 grams of quaternary polyamine

6) 50 ml Gelatinehydrolysat (10 % g/v)6) 50 ml gelatin hydrolyzate (10% w / v)

nach DE-PS 11 18 7 92 und DE-PS 11 bb 134according to DE-PS 11 18 7 92 and DE-PS 11 bb 134

7) 2 η HCl bis pH 2-37) 2 η HCl up to pH 2-3

8) dest. Wasser * 1 Liter8) least. Water * 1 liter

Die Komponenten 1-6 werden in ca. 600 bis 700 ml dest. Wasser aufgenommen, auf etwa 40 C ei wärmt und mit der Komponenten 7 bis zu einem pH-Wert zwischen 3 und 4 versetzt. Nach vollständiger Auflösung aller Substratkoinponenten wird die Lösung auf etwa 200C abgekühlt und der pH-Wert mit 2 η HCl (7) auf 2 bis 3 eingestellt.. Die Lösung wird schließlich mit destilliertem Wasser (8) auf 1,0 Liter aufgefüllt.Components 1-6 are distilled in approx. 600 to 700 ml. Water taken up, heated to about 40 C egg and mixed with component 7 up to a pH value between 3 and 4. After all substrate components have completely dissolved, the solution is cooled to about 20 ° C. and the pH value is adjusted to 2 to 3 with 2η HCl (7). The solution is finally made up to 1.0 liter with distilled water (8).

Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die Bestimmung der γ-Glutamyltranspeptxdase mit 2 ml dieser Substratlösung durchzuführen, so daß man hierfür Abfüllungen von 2 ml herstellt und anschließend gefriertrocknet. Für die Durchführung des Testes wird das gefriergetrocknete Produkt mit der Pufferlösung b) wiedo.ra-ufgelöst.It has proven to be useful to determine the γ-glutamyltranspeptxdase with 2 ml of this substrate solution to carry out, so that one produces for this purpose fillings of 2 ml and then freeze-dried. For Conducting the test is the freeze-dried Product dissolved in buffer solution b) again.

Q 0-4 6/02 7 5Q 0-4 6/02 7 5

ar -ar -

9) 24 g Tris -(hydroxymethyl)-aminomethan
10) 5 g Natriumazid
5
9) 24 grams of tris (hydroxymethyl) aminomethane
10) 5 g sodium azide
5

werden in etwa 800 ml dest. Wassers gelöst, mit
2 η HCl auf pH 9,2 bis 9,5 eingestellt und mit dest. Wasser auf 1,0 Liter aufgefüllt. Wird das lyophilisierte Substratgemisch nach a) mit 2 ml Pufferlösung der erwähnten Zusammensetzung versetzt, stellt sich
ein pH-Wert von etwa 8,2 ein.
are in about 800 ml of dist. Dissolved in water, with
2 η HCl adjusted to pH 9.2 to 9.5 and with dist. Water made up to 1.0 liter. If the lyophilized substrate mixture according to a) is mixed with 2 ml of buffer solution of the above-mentioned composition, the result is
a pH of about 8.2.

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Claims (2)

Patentansprüche:Patent claims: 1. Trockene Zubereitung des γ-Glutamyl-Nitranilids zur Verwendung als Substrat zur Bestimmung d<3r γ-Glutamyltranspeptidase, gekennzeichnet dadurch, daß sie eine Säure in mindestens molarem Verhältnis zum Basenäquivalent des Nitranilids und gegebenenfalls einen Lösungsstabilisator enthält.1. Dry preparation of γ-glutamyl-nitranilide for use as a substrate for the determination of d <3r γ-glutamyl transpeptidase, characterized in that that they contain an acid in at least a molar ratio to the base equivalent of the nitranilide and optionally contains a solution stabilizer. 2. Zubereitung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösungsstabilisator ein quaternäres Polykation auf der Basis von Polyvinylpyrrolidon, einem äthoxylierten Alkylphenol, einem äthoxylierten Phenol oder einem Tetrafluoräthylen-Polymerisat mit verzweigten Perfluorgruppen ist.2. Preparation according to claim 1, characterized in that that the solution stabilizer is a quaternary polycation based on polyvinylpyrrolidone, an ethoxylated alkylphenol, an ethoxylated phenol or a tetrafluoroethylene polymer with branched perfluoro groups. 3» Zubereitung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösungsstabilisator in einer Konzentration von 0,1 - 100 mg/ml Testlösung vorliegt.3 »Preparation according to claim 1, characterized in that that the solution stabilizer is present in a concentration of 0.1-100 mg / ml test solution. 03004 6/027503004 6/0275 ORIGINAL INSPECTEDORIGINAL INSPECTED
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