DE2841782C2

DE2841782C2 -

Info

Publication number: DE2841782C2
Application number: DE19782841782
Authority: DE
Inventors: Clive Christopher Maidstone Kent Gb Dawes; John Ormand Crawley Sussex Gb Crookall-Greening; Jacqueline S. London Gb Gardner
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1977-09-28
Filing date: 1978-09-26
Publication date: 1988-07-21
Also published as: AU4022278A; DE2841782A1; BE870834A; CA1112161A; AU532849B2; JPS631546B2; CH648127A5; JPS5490883A

Description

Die Erfindung betrifft ein teilchenförmiges Reagenz zur Verwendung bei Immunanalysen.

Bekanntlich kann man Antigene und Antikörper (sowie andere bindende Proteine) mit Hilfe einer kompetitiven Bindungsreaktion unter Verwendung eines markierten Reagen zes bestimmen, wobei die Bestimmung durch Messung der Menge an entweder zu einem Komplex gebundener oder ungebunden in Lösung verbleibender Markierungssubstanz durchgeführt wird. Ein Beispiel für ein derartiges Verfahren ist die bekannte Radioimmunassay-Technik, bei der eine radioaktive Markie rung verwendet wird. Analoge Techniken unter Verwendung anderer Markierungssubstanzen, wie beispielsweise von En zymen und Fluorophoren, sind ebenfalls bekannt.

Bei diesen Verfahren ist es entweder erforderlich, die gebildeten Komplexe oder den freien, ungebundenen, markierten Reaktionsteilnehmer von dem Rest des Umsetzungs gemisches abzutrennen, um die Menge an markierter Substanz in einem der Anteile zu messen. Dieser Abtrennungsschritt läßt sich selten leicht durchführen und stellt in derarti gen Bestimmungen eine Irrtumsquelle dar.

Um diese Schwierigkeit zu vermeiden oder zumindest zu verringern, wurde in der älteren Patent anmeldung DE-OS 27 10 438 die Verwendung von magnetisch anziehbaren Teilchen bei Immunoanalysen vorgeschlagen, die an ihrer peripheren Oberfläche einen an sie kovalent gebun denen Reaktionsteilnehmer aufweisen. Die Teilchen können (zusammen mit dem Umsetzungsprodukt zwischen dem Reak tionsteilnehmer und einer markierten Verbindung des Um setzungsgemisches) klar und einfach von dem Rest des Umsetzungsgemisches abgetrennt und die markierte Substanz in diesem Rest oder auf den Teilchen anschließend bestimmt werden.

Aus der Literaturstelle Clinica Chimica Acta 63 (1975) 69 bis 72 ist auch schon die Herstellung anziehbarer Teil chen für Immunanalysen bekannt, indem man Magnetitteilchen mit einem Aminogruppen enthaltenden Silan überzieht, an das durch Diazokupplung Antidigoxin-Serum gebunden wird.

Aus der älteren Patentanmeldung DE-OS 26 44 249 ist schließlich die Verwendung magnetisch anziehbarer Teilchen in einer wasserunlöslichen polymeren Matrix aus Polystyrol bei Immunanalysen bekannt, wobei das biologisch aktive Material an das Polystyrol adsorbiert ist.

Eine Beschränkung dieser Verfahren besteht darin, daß Voraussetzung für die Reagenzien, die an die magnetischen Teilchen gekuppelt werden sollen, ist, daß sie an die Poly merisatmatrix der Teilchen kovalent gebunden oder adsor biert werden können. Es ist daher nicht möglich gewesen, Reagenzien zu verwenden, die nicht auf diese Weise an die magnetischen Teilchen gebunden sind. Unter den Reagenzien, die auf diese Weise nicht verwendet werden konnten, befin den sich gegenüber der Matrix inerte, feste Adsorbentien, wie beispielsweise Aktivkohle und dgl.; diese Materialien sind jedoch für Immunanalysen äußerst nützlich, da sie zur Adsorption freier, ungebundener markierter Substanz aus dem Umsetzungsgemisch verwendet und in Form von Feststoffen aus dem Umsetzungsgemisch anschließend abgetrennt werden können.

Es wurde nun gefunden, daß man die Verwendung von magnetisch anziehbaren Teilchen (mit den ihnen innewohnen den Vorteilen bei der Abtrennung) mit der Verwendung von Adsorbentien, wie Aktivkohle und dgl. (mit den ihnen inne wohnenden Vorteil bei der selektiven Adsorption von Reak tionsteilnehmern) kombinieren kann. Im einzelnen wurde ge funden, daß diese Adsorbentien in Form von diskreten, festen Teilchen in eine Polymerisatmatrix eingebettet werden können, die ebenfalls magnetisch anziehbare Teilchen enthält, so daß ein magnetisch anziehbares, teilchenförmiges Reagenz zur Verwendung bei Immunanalysen gebildet wird. Im folgenden werden die magnetisch anziehbaren teilchenförmigen Mate rialien gemäß der Erfindung, die aus diskreten, magnetisch anziehbaren Teilchen sowie diskreten Teilchen aus Adsorp tionsmittel, die in einer Polymerisatmatrix verteilt sind, bestehen, einfach als "Teilchen gemäß der Erfindung" be zeichnet.

Gegenstand der Erfindung ist ein teilchenförmiges Reagenz zur Verwendung für eine Immunanalyse einer flüssigen Probe zur selektiven Adsorption einer oder mehrerer in der Flüssigkeit enthaltener Komponenten, das dadurch gekenn zeichnet ist, daß jedes Teilchen aus einer kontinuierlichen Phase aus einer wasserunlöslichen polymeren Matrix besteht, in die ein magnetisch anziehbares Material und diskrete, feste, gegenüber der Matrix inerte Teilchen aus einem adsor bierenden Material eingebettet sind, wobei die adsorbierenden Teilchen aus Aktivkohle, Talkum, Ionenaustauscherharzen, Bleicherde, Siliciumdioxid, Oxiden von Zirkon oder Aluminium oder Titan, porösem Glas, Zeolithen, natürlichen oder syn thetischen Polymerisaten, unspezifischen polymerisierten ersten oder zweiten Antikörpern oder Enzymen, unspezifischen Zelloberflächenantigenen oder -rezeptoren, subzellularen Teilchen, Viren oder Bakterienzellen bestehen.

In den Teilchen gemäß der Erfindung ist das Adsorp tionsmittel im Gegensatz zu den bekannten Reagenzien, in denen ein Material an eine polymere Matrix kovalent gebunden oder adsorbiert ist, in die polymere Matrix eingebettet.

Das Teilchen gemäß der Erfindung bestehen aus einer kontinuierlichen Phase aus einer wasserunlöslichen polyme ren Matrix, die die magnetisch anziehbaren sowie die Ad sorptionsmittelteilchen eingebettet enthält. Die Matrix kann aus einer großen Anzahl unterschiedlicher Materialien bestehen, wie beispielsweise natürliche und synthetische Polymerisate, wie Polyacrylamid, Cellulose, Celluloseester, Polyamid, Polycarbonat, Polyvinylharze, Methylmethacrylate, Polystyrol, Polystyrl-Acrynitril, Epoxidharze, Melamin- Formaldehyd, Phenol-Formaldehyd, Harnstoff-Formaldehyd, Polyester, Polyacrylnitril, Polyacrolein, Polyacetal, vernetzte Proteine und dgl.

Die Matrix dient dazu, die magnetischen und ab sorbierenden Teilchen in gleichmäßiger Teilchenform zu halten, ohne daß eine der Komponenten chemisch an die Matrix gebunden wird. Da einige, wenn nicht die meisten der adsorbierenden Teilchen völlig innerhalb der Matrix eingeschlossen und nicht an der Matrixoberfläche teil weise exponiert sind, ist die Matrix vorzugsweise in einem solchen Ausmaß porös, das ausreicht, um das Eintreten des Umsetzungsgemisches zu ermöglichen. Die Porosität der Matrix kann vorteilhafterweise gesteuert werden, um nur ausgewählte gelöste Bestandteile eintreten zu lassen, bei spielsweise kleine Antigene, jedoch nicht große Antikörper; dieser sog. Gelfiltrationseffekt ist selbst bekannt. Poly acrylamid ist ein besonders geeignetes Polymerisat zur Herstellung von Matrices mit ausgewählter Porengröße.

Geeignete magnetisch anziehbare Materialien sind sol che, die in der obenerwähnten DE-OS 27 10 438 beschrieben sind.

Die Art des Adsorptionsmittels kann je nach dem Endzweck der Teilchen gemäß der Erfindung in weiten Grenzen variieren. Aktivkohle wird am meisten bevorzugt, jedoch können auch andere Materialien, wie beispielsweise Talkum, Ionenaustauscherharze, Bleicherde, Siliciumdioxid, Dioxide von Zirkon, Aluminium und Titan, poröses Glas, Zeolithe, feinverteilte natürliche und synthetische Polymerisate, un spezifische polymerisierte erste oder zweite Antikörper oder Enzyme, unspezifische Zelloberflächenantigene und -rezeptoren, subzellulare Teilchen, Viren und Bakterienzellen verwendet werden.

Die Wirkungsweise des Adsorptionsmittels besteht darin, einen Teil des für die Immunanalyse verwendeten Umsetzungsgemisches zu adsorbieren oder sich an ihn che misch zu binden, so daß dieser Teil des Gemisches mit den Teilchen der Erfindung entfernt wird. Beispielsweise wird bei der Analyse eines bestimmten Antigens ein Umsetzungs gemisch gebildet, das die Probe, eine Menge an markiertem Antigen und einen Antikörper enthält. In dem Gemisch wer den Komplexe zwischen dem Antikörper und dem Antigen sowie zwischen dem Antikörper und dem markierten Antigen gebil det. Dem Gemisch werden dann Teilchen gemäß der Erfindung zugesetzt, und diese können beispielsweise das freie, nicht gebundene Antigen (sowohl markiert als auch unmar kiert) selektiv adsorbieren. Abtrennung der Teilchen durch eine magnetische Falle bewirkt, daß lediglich die Komplexe in Lösung zurückbleiben, wonach entweder die Lösung oder die abgetrennten Teilchen auf ihren Gehalt an markiertem Antigen hin untersucht werden können.

Es ist ein beträchtlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß die Teilchen gemäß der Erfindung unspezifisch und nicht immunospezifisch sind und daher einen weiten An wendungsbereich besitzen. Beispielsweise adsorbiert ein Teilchen gemäß der Erfindung, das Aktivkohle als Adsorp tionsmittel enthält, viele unterschiedliche kleine Antigene. Auf diese Weise können die Teilchen gemäß der Erfindung für Immunanalysen vieler unterschiedlicher Antigene verwendet werden. Dies ist von großem Vorteil, da durch die Not wendigkeit vermieden wird, für jede unterschiedliche Immun analyse ein anderes Reagenz auf den magnetischen Teilchen vorzusehen, wie es bisher erforderlich war. Der Anwendungs bereich der Teilchen gemäß der Erfindung variiert natürlich mit dem verwendeten Adsorptionsmittel, jedoch bei Materia lien, wie Aktivkohle und anderen ähnlichen festen Adsor bentien, kann er hochsignifikant sein.

Die Teilchen gemäß der Erfindung eignen sich ins besondere für Radioimmunoassays. Das für eine bestimmte Immunanalyse oder andere Analyse geeignete teilchenförmige Adsorptionsmittel ist dem Fachmann entweder bekannt oder kann durch routinemäßige Versuche bestimmt werden. Einige Beispiele für bestimmte Verwendungen sind die folgenden:

Aktivkohle für die Analyse von Steroiden, Thyroidhormonen T₄ und T₃, ACTH, Agiotensin-II, Insulin und Glucagon, menschlichem Wachstumshormon, Vitamin B₁₂, Folat und anderen; Talkum oder Siliciumdioxid in Analysen von ACTH, Wachstumshormon, Parathroidhormon, Insulin und Calcitonin sowie Vitamin B₁₂; Anionaustauscherharze bei der Analyse von Insulin und Wachstumshormon, Dogoxin, cyclischem AMP, cyclischem GMP, Insulin, Angiotensin-I und Thyroxin(T₄); unspezifische polymerisierte erste oder zweite Antikörper zur Adsorption von Antigenen bzw. ersten Antikörpern oder zur Herstellung von von Thyroxin und Cortisol usw. freien Sera; unspezifischen Zelloberflächenantigene und -rezeptoren sowie subzellulare Teilchen zu Abtrennungszwecken und Bak terienzellen sowie Viren zum Ermitteln von antibakteriellen und antiviralen Antikörpern in einer Probe.

Die Teilchen gemäß der Erfindung können zu einzelnen (manuellen) Analysen oder in automatisierten Systemen nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip verwendet werden, wie sie beispielsweise in der obenerwähnten DE-OS 27 10 438 be schrieben sind. Insbesondere bei den Systemen des konti nuierlichen Durchflußprinzips muß das spezifische Gewicht der Teilchen gemäß der Erfindung demjenigen des Umsetzungsgemischs verhältnismäßig nahekommen, so daß kein unzulässiges Auf schwimmen oder Absetzen erfolgt und die Teilchen in dem Um setzungsgemisch in Suspension gehalten werden können. Im all gemeinen sind spezifische Gewichte von etwa 1,4 bis 3,2 zufriedenstellend.

Die Teilchen gemäß der Erfindung können hergestellt werden, indem man das teilchenförmige Adsorptionsmittel und das teilchenförmige, magnetisch anziehbare Material in einem Polymerisat oder in einem Gemisch, das ein Poly merisat bildet, dispergiert. Im Falle einer Polyacrylamid- Matrix können die beiden teilchenförmigen Materialien bei spielsweise mit einem oder mehreren flüssigen Acrylamid- Monomeren und einer ausgewählten Menge eines Vernetzungs mittels, wie beispielsweise von Methylen-bis-(acrylamid), vermischt werden. Die Polymerisation wird unter Verwendung von Ammoniumpersulfat initiiert und die erhaltene feste Masse getrocknet, vermahlen und zu der gewünschten Teilchen größe gesiebt. Diese kann in weiten Grenzen variieren, je doch ist für die meisten Immunanalysen eine Teilchengröße im Bereich von 1-20 µm im allgemeinen zufriedenstellen.

Das Gewichtsverhältnis des teilchenförmigen Materials in der Matrix kann in weiten Grenzen wie gewünscht variieren.

Beispiel 1 Herstellung von Teilchen gemäß der Erfindung, die Aktivkohle enthalten

Es wurde eine Stammsuspension aus 5 g Aktivkohle in 200 ml eines Analysenverdünnungsmittels (0,05 m Phosphat puffer vom pH 7,4) hergestellt. 152 ml der Stammsuspen sion wurden mit 3,8 g Acrylamid, 0,2 g N,N-methylenbis acrylamid, 3,8 g Eisen(II, III)-oxid (Fe₃O₄) und 1 ml N,N,N′,N′-Tetramethyldiamin versetzt.

1,2 g Ammoniumpersulphat wurden daraufhin in 2 ml des Analysenverdünnungsmittels unter heftigem Rühren zugesetzt. Es folgt eine exotherme Umsetzung, die zur Bildung von 13,2 g eines homogenen Gels (Trockenausbeute) führte.

Das Geld wurde in schmale Stücke von etwa 0,25 cm³ zerschnitten und 24 h in einem Vakuumexikator getrocknet, wonach die erhaltenen harten, trockenen Granula in einer Kaffeemühle zerkleinert und zu je 2,0 g in 30 ml Wasser dispergiert wurden. Danach wurde die Suspension 20 min in einer Feinstmahleinrichtung von McCrone ver mahlen und das Gel nach viermaligem Waschen mit Analysen verdünnungsmittel erneut zu je 2 g in 30 ml suspendiert. 0,4 ml dieser Suspension je Proberöhrchen wurden für die Abtrennungsstufe verwendet.

Beispiel 2 Antikörper-Verdünnungskurven (Fig. 1)

Es wurde eine Verdünnungsreihe von Antiserum unter Verdopplung der jeweils vorhergehenden Verdünnung herge stellt, und aliquote Teile von 50 µl wurden mit Verdünnun gen von 1 : 400 bis 1 25 600 in Doppelversuchen in Röhrchen gegeben. Eine Lösung von mit ¹²⁵I-markiertem Digoxin wurde durch Verdünnung einer Stammlösung in Analysenverdünnungs mittel im Verhältnis 1 : 8 hergestellt. In jedes Röhrchen wurden 100 µl des mit ¹²⁵I-markierten Digoxins eingebracht. Danach wurden 200 µl digoxinfreies Plasma in jedes Röhrchen eingebracht, wonach die Röhrchen über Nacht bebrütet werden.

Danach wurden 400 µl der gemäß Beispiel 1 hergestell ten Teilchensuspension jedem Röhrchen zugesetzt. Nach zehnminütigem Bebrüten wurden 2 ml Analysenverdünnungsmit tel zugegeben und die Teilchen rasch absetzen gelassen, in dem man die Röhrchen auf einen multipolaren Ferritplatten magneten setzte. Die überstehen de Flüssigkeit wurde abgesaugt und die Teilchen einmal mit 2 ml Analysenverdünnungsmittel gewaschen und danach die ¹²⁵I Aktivität in einem Gammazähler gemessen. Die erhaltene Verdünnungskurve ist zusammen mit derjenigen, die unter An wendung des herkömmlichen Verfahrens mit freier Aktivkohle erhalten worden war, in Fig. 1 dargestellt. Daraus geht her vor, daß das neue Material gemäß der Erfindung ähnliche Adsorptionseigenschaften besitzt wie freie Aktivkohle.

Beispiel 3 Standardkurven

Antiserum wurde mit Analysenverdünnungsmittel (1 : 6400) verdünnt. Standards von Digoxin (0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 und 6,0 ng/ml "gepoolten" Serums) wurden zu je 200 µl in Versuchsröhrchen eingebracht, wonach in jedes Röhrchen 100 µl mit ¹²⁵I-markiertes Digoxin zugegeben wur den. Das Ganze wurde mit 50 µl Antiserumlösung versetzt. Die Röhrchen wurden 30 min bei Raumtemperatur bebrütet, wonach 400 µl der gemäß Beispiel 1 hergestellten Teilchen suspension zugesetzt wurden. Nach 10 min wurde das teilchen förmige Material in einem Magnetfeld, wie in Beispiel 2 be schrieben, abgetrennt. Die erhaltene Standardkurve ist zu sammen mit derjenigen, die unter Anwendung der herkömmlichen Abtrennungstechnik mit freier Aktivkohle erhalten worden war, in Fig. 2 dargestellt, und es ergibt sich, daß das neue Ma terial analoge Adsorptionseigenschaften wie das alte be sitzt.

Beispiel 4

Die Nützlichkeit des teilchenförmigen Materials ge mäß der Erfindung wurde durch den folgenden Versuch be stätigt.

Sera von 25 Patienten wurden doppelt sowohl nach der herkömmlichen Methode als auch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert. Eine annehmbare Korrelation wurde zwischen beiden Methoden erzielt (r = 0,959, Fig. 3). Sta tistisch war die Neigung der Linie nicht signifikant von 1,0 und der Achsenabschnitt nicht signifikant von 0,0 verschieden.

Claims

1. Teilchenförmiges Reagenz zur Verwendung für eine Immunanalyse einer flüssigen Probe zur selektiven Adsorption einer oder mehrerer in der Flüssigkeit ent haltener Komponenten, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Teilchen aus einer kontinuierlichen Phase aus einer wasserunlöslichen polymeren Matrix besteht, in die ein magnetisch anziehbares Material und diskrete, feste, gegenüber der Matrix inerte Teilchen aus einem adsorbie renden Material eingebettet sind, wobei die adsorbierenden Teilchen aus Aktivkohle, Talkum, Ionenaustauscherharzen, Bleicherde, Siliciumdioxid, Oxiden von Zircon, Aluminium oder Titan, porösem Glas, Zeolithen, natürlichen oder synthetischen Polymerisaten, unspezifischen polymerisierten ersten oder zweiten Antikörpern oder Enzymen, unspezifi schen Zelloberflächenantigenen oder -rezeptoren, sub zellularen Teilchen, Viren oder Bakterienzellen bestehen.

2. Teilchenförmiges Reagenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polymere Matrix aus einem Acrylpolymerisat be steht.

3. Teilchenförmiges Reagenz gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein spezifisches Gewicht von 1,4 bis 3,2 besitzt.

4. Teilchenförmiges Reagenz gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen eine Größe von 1 bis 20 µ besitzen.

5. Wäßrige Suspension eines teilchenförmigen Reagenzes gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.

6. Verwendung eines Reagenzes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer Suspension gemäß Anspruch 5 zur Bestimmung eines Bestandteiles einer flüssigen Probe, insbesondere in Immunanalysen.