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DE2710264C3 - Verfahren zur Bestimmung und Analyse eines Immunkomplexes - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung und Analyse eines Immunkomplexes

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DE2710264C3
DE2710264C3 DE2710264A DE2710264A DE2710264C3 DE 2710264 C3 DE2710264 C3 DE 2710264C3 DE 2710264 A DE2710264 A DE 2710264A DE 2710264 A DE2710264 A DE 2710264A DE 2710264 C3 DE2710264 C3 DE 2710264C3
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DE
Germany
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complex
agglutination
igg
immune complex
igm
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DE2710264A
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DE2710264A1 (de
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Roland Jacob London Levinsky
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National Research Development Corp UK
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National Research Development Corp UK
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/821—Chemistry: analytical and immunological testing involving complement factors or complement systems

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Description

45
Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
In den vergangenen Jahren hat man immune Antigen-Antikörper-Komplexe in Verbindung mit der Pathogenese vieler menschlicher Krankheiten, wie beispielsweise systemischer Lupus erythematodes, rheumatischer Arthritis, bestimmter Formen von Glomerulonephritis und chronischen inflammatorischen Darmbzw. Eingeweidekrankheiten, gebracht Die Bestimmung und Bewertung von Immunkomplexen und ihren Bestandteilen ist für die Behandlung dieser Krankheiten von großer Bedeutung. Keine der zur Zeit verfügbaren Nachweis- und Bewertungsverfahren sind jedoch zufriedenstellend. Den physikalisch-chemischen Verfahren fehlt im allgemeinen die erforderliche Empfindlichkeit, wohingegen biologische Verfahren, obgleich sie empfindlicher sind, oft sehr komplex sind oder nur begrenzt verwendbar sind und oft. die Verwendung lebender Zellen oder menschlicher Reagentien erfordern. Dies bewirkt, daß diese Verfahren für eine breite Anwendung in Krankenhauslaboratorien ungeeignet sind. Beispielsweise wurde kürzlich die Bestimmung von IgG-Komplexen durch Inhibierung der Agglutination von IgG-beschichteten Latexteilchen durch den rheumatoidischen Faktor oder C Iq, der die Komplexe verursacht, vorgeschlagen (Lurhuma et al (1976) »Clin. Exp. ImmunGl.«, 25, 212). Dieses letztere Verfahren ist ungeeignet, da menschliche Reagentien, C Iq und rheumatische Faktoren verwendet werden müssen, von denen die rheumatischen Faktoren nur von kranken Patienten erhalten werden können. Es ist weiterhin auf den Nachweis der IgG-Komponente von IgG-Komplexen beschränkt
Es stellte sich daher die Aufgabe, ein einfaches und wirksames Verfahren für den Nachweis und die Bewertung von Immunkomplexen zu entwickeln, bei nicht-menschliche Reagentien verwendet werden und das zusätzlich die Analyse der Bestandteile der Komplexe ermöglicht
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 durch die im Kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmale gelöst
Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis δ beschrieben.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man irgendeinen Bestandteil des Immunkomplexes analysieren, vorausgesetzt daß der Bestandteil zur Bildung nicht-menschlicher IgM-Antikörper verwendet werden kann, und vorausgesetzt daß der Bestandteil fähig ist an Latexteilchen zu haften bzw. mit den Latexteilchen eine Bindung einzugehen. So kann der Antikörperbestandteil, beispielsweise IgM, IgG oder IgA oder komplementäre Komponenten, beispielsweise C3, eines Komplexes nach dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden. Das Verfahren kann ebenfalls zur Analyse von Antigenbestandteilen eines Komplexes verwendet werden, beispielsweise zur Analyse viraler, bakterieller oder anderer antigener Materialien, die eine Komplexbildung ergeben.
Es wird angenommen, daß Immunkomplexe Krankheitssymptome, insbesondere Gewebeschäden, verursachen und somit kann das Verfahren entweder als solches oder zusammen mit anderen klinischen Testverfahren für die Diagnose und den Nachweis von Krankheiten verwendet werden, die mit Immunkomplexen assoziiert sind. Beispielsweise kann das Verfahren zur Verfolgung der Behandlungswirkung, beispielsweise der Chemotherapie oder Plasmapherese,, auf die Gehalte an vorhandenem Immunkomplex, beispielsweise in dem Blutstrom eines Patienten, verwendet werden.
Die beschichteten Latexteiilchen können hergestellt werden, indem man den Komplexbestandteil, der analysiert werden soll, an Latexteilchen bindet, und charakteristischerweise liegen sie in einer für Latexteilchen-Agglutinationstests geeigneten Form vor. Einige Komplexbestandteile, bemerkenswerterweise IgG, können eine spontane Bindung bei dem Kontakt mit Latexteilchen eingehen und im einigen Fällen können beschichtete Latexteilchen aus solchen Bestandteilen durch direkte Zwischenwirkungen des Bestandteils und der Latexteilchen hergestellt «erden. Andere Bestandteile jedoch, einschließlich andere Immunoglobulinklassen, wie FgM und IgA, widerstehen einer spontanen Bindung bzw. Haftung und es kann somit wünschenswert sein, ein Kupplungsreagens zum Verbinden einiger Komplexbestandteile an die Latexteilchen zu verwenden. Man kann irgendein geeignetes Kupplungsreagens oder eine geeignete Aktivierungsbehandlung verwenden.
Die bei dem Verfahren verwendeten, nicht-menschli-
chen igM-Anükörper mil niedriger Affinität werden in Tieren gezüchtet, die für den Komplexbestandteil, der analysiert werden soll, geeignet sind. Für die Herstellung dieser Antikörper reichen für Laborzwecke kleine Tiere, wie Kaninchen und Meerschweinchen, aus. Für r, eine Produktion mit größerem Maßstab sind jedoch größere Tiere, wie Schafe, Kühe oder Pferde, geeigneter. Im allgemeinen wird der Immunkomplexbestandteil, bevorzugt in gereiniger Form, in das Tier injiziert Das Tier wird anschließend ausgeblutet bzw. dem Tier wird in Blut entnommen und aus dem Antiserum wird der IgM-Bestandteil mit niedriger Affinität abgetrennt Bevorzugt wird die Ausbeute an IgM mit niedriger Affinität im Hinblick auf verschiedene Faktoren optimiert, was dem Fachmann geläufig ist Beispielsweise können die Konzentration der den Tieren injizierten Immunkomplexbestandteils, die Verwendung von Adjuvantien und der Ort der Injektion Einfluß auf die anschließende Ausbeute an Antikörper besitzen. Insbesondere kann ebenfalls die Zeit, die man nach der Injektion und vor der Blutentnahme an den Tieren vergehen läßt, die verschiedenen in dem Antiserum vorhandenen Antikörperkomponenten beeirfflussen. Es wurde gefunden, daß für eine zufriedenstellende Bildung an IgM mit niedriger Affinität eine Zeit von etwa 10 Tagen bei Kaninchen nach der Injektion mit gereinigtem Menschen-Immunoglobulin Klassen IgA und IgG in Freund's vollständigem Adjuvans geeignet ist. Im allgemeinen wird angenommen, daß ähnliche Zeiten geeignet sind, eine ausreichende IgM-Büdung mit niedriger Affinität bei anderen menschlichen Immunoglobulinen, beispielsweise IgM und IgE, zu erhalten.
Charakteristischerweise wirken die nicht-menschlichen IgM-Antikörper mit niedriger Affinität spezifisch ein auf den Komplexbestandteil, gegenüber dem sie gezüchtet wurden, und diese Einwirkung bzw. Zwischenwirkung ist typischerweise leicht reversibel, sofern nicht der Bestandteil in einer aggregierten Form, beispielsweise als Komponente eines Immunkompiexes oder als Oberzug auf Latexteilchen, vorliegt Bei der Inkubieruiig wirken die IgM-Antikörper stark ein sowohl auf die Latexteilchen, die mit dem entsprechenden Komplexbestandteil überzogen sind, und bewirken eine Latexteilchenagglutination, und ebenfalls auf irgendeinen Immunkomplex, enthaltend den besonderen Bestandteil, der in dem Inkubat vorhanden ist Immunkomplexe können so bestimmt und auf ihre Bestandteile analysiert werden durch Inhibierung der Agglutination, die sie verursachen. Je größer die Konzentration an Immunkomplex ist, umso weniger an IgM ist für die Agglutination der Latexteilchen vorhanden. Beispielsweise kann eine Immunkomplex enthaltende Probe mit beschichteten Latexteilchen und IgM-Antikörpern vermischt werden, die bevorzugt in solchen Verhältnissen vorhanden sind, daß sie in Abwesenheit der Probe einen bekannten Agglutinationswert ergeben, und inkubiert werden. So kann anschließend die Inhibierung der Agglutination nach einem geeigneten Verfahren gemessen werden.
Im allgemeinen ist es wünschenswert, Immunkomple- &o xe als Komponenten des Blutstroms eines Patienten zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls zur Bestimmung von Immunkomplexen in anderen Medien, beispielsweise anderer physiologischer fluider Materialien, wie Urin, verwendet werden. Die Proben stammen so im allgemeinen aus Serum oder anderen physiologischen fluiden Materialien und werden, bevor sie bei dem Immunkon/plextest eingesetzt werden, auf geeignete Weise vorbehandelt Beispielsweise wird Serum vorteilhafterweise vor dem Test entkomplementiert (d.h. das Komplement wird entfernt), da freie Ci-Komplementkomponenten, die in dem Serum vorhanden sein können, bei dem Versuch stören können und flasche Ergebnisse verursachen können. Die Sera können durch Wärmebehandlung entkomplementiert werden. Dies ist im allgemeinen jedoch nicht zufriedenstellend, da die Wärmebehandlung üblicherweise eine unerwünschte Aggregation von Protein ergibt, was falsche positive Ergebenisse bei dem Versuch bewirken kann. Ein bevorzugtes Entkompiementierungsverfahren für Sera besteht in der Behandlung mit EDTA zur Freisetzung von C lq, das dann durch ein Immunoabsorbens, beispielsweise Sigma-Zell-IgG, entfernt wird.
Nach der Entkomplementierung und/oder anderer erforderlicher Vorbehandlungen werden die Proben, beispielsweise die Serumproben, mit beschichteten Latexteilchen und nicht-menschlichen IgM-Antikörpern niedriger Affinität vermischt Das Inkubat ist im allgemeinen wäßrig und die Inkur iiion wird vorzugsweise unter Rühren bzw. Bewegen während einer Zeit durchgeführt die ausreicht die Umsetzung zu beenden.
Anschließend nach der Inkubation kann die Inhibierung der Agglutination der Latexteilchen auf irgendeine geeignete Weise gemessen bzw. überwacht werden. Beispielsweise kann ein einfacher Objektträger-Agglutinationstest verwendet werden, d. h. man verläßt sich direkt auf einen visuellen Vergleich. Bevorzugt wird jedoch eine elektronische Teilchenzählvorrichtung, wie ein Coulter-Zähler verwendet Beispielsweise kann diese Vorrichtung bevorzugt so programmiert sein, daß sie nur nicht-agglutinierte Teilchen zählt
Bei dieser letzteren Art kann die Wahl der LatexteilchengröSe wichtig sein. Beispielsweise wurde in der Praxis gefunden, daß Latexteilchen mit einer Größe entsprechend einem Durchmesser von etwa 1,15 μπι bevorzugt sind, wenn ein Coulter-Zähler verwendet wird, der so programmiert ist daß er nur nicht-agglutinierte Teilchen zählt Kleinere Teilchen, beispielsweise mit einem Durchmesser unter 0,8 μπι, oder größere Teilchen, beispielsweise mit einem Durchmesser über 1,5 μπι, können durch andere Teilchen, beispielsweise Plättchen oder Aggregate, die in den Proben vorhanden sind, beeinflußt werden bzw. Interferenzerscheinungen können auftreten.
Die Reagentien, die bei der erfindungsgemäßen Immunkomplexanalyse bzw. dem erfindungsgemäßen Immunkomplexassay verwendet werden, können dem Verbraucher in Form von Kits bzw. Bestecken geliefert werden. Beispielsweise umfaßt ein Besteck für die Bestimmung eines Immunkomplexes und die Analyse der Bestandteile des Komplexes typischerweise nichtmenschliche IgM-Antikörper mit niedriger Affinität für den Bestandteil des Komplexes, Latexteilchen, die mit dem Bestandteil ,^schichtet sind, und zweckdienlicherweise ebenfalls ein Immunoabsorbens (Immunoabsorptionsmittel), beispielsweise Sigma-Zell-IgG, und EDTA für die Entkomplementierung der Probe.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Zeichnungen näher erläutert
F i g. 1 ist eine Standardkurve für die Inhibicrung von Latexteilchenagglutination gegenüber der IgG-Konzentration;
Fig.2 ist eine graphische Darstellung in Punktform und stellt die Inhibierung der Latexteilchenagglutination dar, die durch Sera von Patienten verursacht wird, die an systemischer Lupus erythematosus (SLE) leiden;
F i g. 3 ist eine Reihe von graphischen Darstellungen, die die klinische Geschichte von Patienten darstellen, die an Lupus nephritis leiden, und
Fig.4 ist die graphische Darstellung der IgA- und IgG-Komplexaktivitäten abgetrennter Fraktionen aus Serum von einem Patienten, der an Henoch-Schonlein-Purpura nephritis leidet.
Beispiel I
Antikörper-Herstellung:
IgM-Antikörper mit niedriger Affinität gegenüber menschlichen Immunoglobiilinklassen IgA, IgM und IgG, die bei dem erfindungsgemäßen Immunkomplexversuch verwendet werden, werden getrennt folgendermaßen hergestellt. Hochreines IgA und hochreines IgM werden aus Myelom-Sera und IgG aus gesammeltem frisch gefrorenem Plasma durch DEAE-/»-Ionenaustauschchromatographie gewonnen. 1OmK von jedem der gereinigten Immunoglobuline in vollständigem Freund's Adjuvans werden dann subkutan an vier verschiedenen Stellen in Kaninchen injiziert, denen 10 Tage nach der ersten Injektion Blut entnommen wird.
Die erhaltenen Sera werden an einer Sephadex-G200-Säule getrennt und die IgM-Peaks werden gesammelt und auf das Ausgangsvolumen durch Ultrafiltration konzentriert. Eine in dem so gebildeten IgM-Antiserum vorhandene Leichtkettenspezifität wird durch Sepharose (Fab')2-Immunoabsorbenssäulen herausabsorbiert, wobei man ein monospezifisches Antiserum erhält. Es wurde gefunden, daß eine Zeitdauer von 10 Tagen zwischen der Injektion und der Blutentnahme reproduzierbare Ausbeuten mit hohem Titer, aber IgM-Antikörper mit niedriger Affinität ergibt, die keine nennenswerten Ausfällungsantikörper oder Antikörper mit hoher Affinität enthalten.
Beispiel 2
Beschichten der Latexteilchen:
IgA:
10 mg gereinigtes menschliches IgA in 1 ml Salzpuffer werden 3 h bei 37°C gegenüber 10% Gew^V Natriumbicarbonat dialysiert. 3 μΙ Monofluor-2,4-dinitrophenol werden zugegeben, und die Reaktionsteilnehmer werden bei 37°C konstant vermischt, bis eine hellgelbe Farbe erreicht wird. Zu diesem Zeitpunkt wird die Umsetzung durch Zugabe eines gleichen Volumens Benzol, wodurch überschüssiges MonofIuor-2,4-dinitrophenol extrahiert wird, beendet. Die entstehende Monofluor-2,4-dinitrophenol-IgA-Lösung wird dann durch Dialyse während 24 h gegenüber 1/4 konzentrierter 0.27M-GIycinsalzlösung, pH 8,2, gereinigt.
800 μ I einer 10%igen Gew/Vol. Latexsuspension (durchschnittlicher Teilchendurchmesser 1,15 μιη), hergestellt von Coulter Electronics, werden zweimal in 1A konzentrierter O^M-Glycinsalzlösung, pH 8,2, gewaschen. Die Latexteilchen werden von der Waschflüssigkeit zwischen und nach dem Waschen durch Zentrifugieren bei 10 000 Upm abgetrennt Schließlich werden sie in 20 ml '/s konzentriertem Puffer resuspendiert 40 μg der wie oben hergestellten Monofluor-2,4-dinitrophenol-IgA-Lösung werden dann pro mg Trockengewicht Latex zugegeben. Das gesamte Reaktionsgemisch wird 30 bis 60 min bei Zimmertemperatur vermischt Das entstehende, mit IgA beschichtete Latexprodukt wird zweimal mit Ά konzentriertem Puffer gewaschen und in 20 ml konzentrierter 0,27M-GIycinsalzlösung, enthaltend 0,1% Menschenserumalbumin (HSA), wodurch irgendwelche freien Stellen, die an den Latexteilchen verbleiben, blockiert werden, wieder suspendiert. Die so erhaltene Suspension aus mit IgA beschichteten -, Latexteilchen ist für die Bestimmung von Immunkomplexen, die einen IgA-Bestandteil enthalten, geeignet.
Außer IgA können auch andere Materialien, die einer spontanen Bindung an Latexteilchen widerstehen, nach dem Monofluor-2,4-dinitrophenol-Verfahren im we-
j,, sentlichen, wie oben ausgeführt, gebunden werden, wobei das besondere Material anstelle von IgA bei dem Reaktionsschema verwendet wird. Beispiele für Materialien, die nach dem Monofluor-2,4-dinitrophenolVerfahren gebunden werden können, sind andere Immuno-
i, globulinklassen, wie IgM oder IgE, oder andere Typen von Materialien, wie Ovalbumin, Rindermilchbestandteile oder lösliche virale oder bakterielle Antigene.
Allgemein wird ein ähnliches Verfahren, wie oben beschrieben, zum Beschichten von Latexteilcheri mit
ι. Materialien wie IgG und HSA, die eine spontane Bindung eingehen, verwendet, ausgenommen, daß die Monofluor-2,4-dinitrophenol-Aktivierung weggelassen wird.
Beispiel 3 Immunkomplextest:
Seraproben aus Patienten werden zuerst folgender-
(o maßen entkomplementiert: 50 μ 1 aliquote Teile von Sera werden während 10 min bei Zimmertemperatur mit 50μl-Mengen von 0,2M-EDTA, pH 7,6, zur Freigabe von CIq inkubiert Das CIq wird dann aus den Proben durch Zugabe geeigneter Mengen aus Sigma-
r, Zell-IgG-Immunoabsorbens, suspendiert mit 5,5-Diäthylbarbitursäure gepufferter Salzlösung, pH 7,4, entfernt. Anschließend werden die Proben während weiterer 20 min bei Zimmertemperatur inkubiert und dann wird das Sigma-Zell-IgG durch Zentrifugieren entfernt. Andere Verfahren zur Entkomplementierung der Sera einschließlich der Verwendung ähnlicher Immunoabsorbentien können verwendet werden, obgleich normalerweise die Entkomplementierung durch Wärmebehandlung ungeeignet ist da eine Aggregation
Ji von Proteinen auftritt, die falsche positive Ergebnisse bei dem Versuch ergeben kann.
Der nicht-menschliche IgM-Antikörper mit niedriger Affinität (hergestellt wie im Beispiel 1) wird mit den entsprechenden beschichteten Latexteilchen (herge-
stellt wie im Beispiel 2), beispielsweise mit menschlichem IgA beschichteten Latexteikhen, titric* bzw. bestimmt und die Konzentration, die eine 70%ige Agglutination des Latex ergibt, wird bestimmt Eine ΙΟΟ-μ-1-Probe an entkomplementiertem Testserum, verdünnt auf 1:10, wird mit 100 μ I Antikörper mit niedriger Affinität geeigneter Konzentration zusammen mit ΙΟΟμΙ beschichteten, beispielsweise mit IgA beschichteten, Latexteilchen vermischt Das gesamte Reaktionsgemisch wird dann in einem Plastikrohr auf einer Rotationsmischvorrichtung 30 min bewegt Danach werden die Latexteikhen 1 :500 in Isoton (Coulter Electronics) verdünnt Die Anzahl der nJcht-agghitmierten Teilchen wird in einem Coulter-Zähler Modell B gezählt der so programmiert ist, daß er nur die
einzelnen Teilchen und keine Aggregate zählt
Der Antikörper mit niedriger Affinität reagiert stark sowohl mit beschichteten Latexteikhen als auch dem Komplex und somit wird durch die Anwesenheit des
Komplexes die Agglutination von Latexteilchen inhibiert.
Beispiel 4
Herstellung einer Standardvergleichskurve
Der oben beschrebene Immunkomplextest wird durchgeführt, indem man anstelle von Sera Testlösungen verwendet, die bekannte Konzentrationen zusammengeballtes IgG enthalten. Die erhaltenen Ergebnisse sind in dem beigefügten Diagramm von F ι g. I dargestellt. Ii g. I zeigt eine St.indardkurve A der Pro/ent-Agglutination (vertikale log-Probit-Skala) gegenüber der Konzentration an zusammengeballten· Ig(I im Glvcinsalzpuffcr in mg/u I (horizontale logarithmische Skala) und zeigt ebenfalls die Ergebnisse, die bei der Kurve B für monomeres IgG erhalten werden, die keine bemerkenswerte Inhibicning der Agglutination
Die .Standardkurve A kann als semi-quaniitativer Vergleich verwendet werden, aus der die Imrmmkomplexkonzentrationen von ilen AgglutmationsinhibierungMTgebnissen extrapoliert werden können. Die Ing-Probit-Skala der vertikalen Achse der F i g. 1 ist eint· statistisch angeordnete Skala, die zuvor für die Darstellung von quantitativen Hämagglutinationsergebnissen verwendet wurde.
Beispiel 5
Der Immunkomplextest von Beispiel 3 fur die Bei immung der IgG-Komplexe wir.: an dem von Komplement befreiten Serum von 24 Pain, ten, die an systemischer Lupus erythematosus (SLK) leiden, angewendet, wobei IgM-Antimenschen-lgG-Antikörpo mit niedriger Affinität von Kaninchen und IgGbeschichtete Latexteilchen verwendet werden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Spalte X 1 von F i g. 2 aufgeführt, wo der Prozenigehalt der Inhibierung der Agglutination für jeden Patienten dargestellt ist. in der Spalte X 2 sind die entsprechenden Ergebnisse für 12 Kontrollsera dargestellt. Zum Vergleich werden die Sera von 21 der ursprünglichen Gruppe von SLE-Patienten ebenfalls nach dem Clq-Latexteilchen-Agglutinationstest. wie es von Lurhuma et al (Clin. Exp. Immunol.. 25, 212 — 1976) beschrieben wird, getestet, der so angepaßt wird, daß mit einem Coulter-Zähler, wie bei dem Verfahren von Beispiel 3. durchgeführt werden kann. Die Ergebnisse, die bei dem Clq-Test erhalten werden, sind in der Sapite Y1 von F i g. 2 aufgeführt, zusammen mit den entsprechenden Vergleichsversuchen in der Sapite Y2. Man stellt eine gute Übereinstimmung zwischen dem erfindungsgemäßen Test und dem angepaßten Lurhuma Test fest.
Beispiel 6
Der Immunkomplextest von Beispiel 3 für die Bestimmung von IgG-Komplexen wird zur Bestimmung des Verlaufes von Lupus nephritis bei einer 18 Jahre alten Frau verwendet, die diese Krankheit kurz nach der Geburt ihres ersten Kindes bekam. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Zeile 1 der Fig.3 (f) zusammen r-.n den in Zeile 2 erhaltenen Ergebnissen aufgeführt wc ;ei
der modifizierte Lurhuma-Test wie in den vorherigen Beispielen verwendet wurde. Die Patientin zeigte zuerst Nierenversagen, Ausschlag, Fieber. Mocarditis und Krämpfe. Die DNA-Bindung war hoch, die Serum-Ci.C« und Clq-Gehalte wurden vermindert und die Nierenbiopsie zeigte starke diffuse proliferative Glomerulonephritis. Die Patientin wurde mit Azathioprin. Prednisolon, Dipyridamol. Antikoagulationsmittel ;md Methylprcdnisolon-Pulsthcrapie (1 g/Tag i/v während 3 Tagen) behandelt. In der F i g. 3 sind ebenfalls die Informationen bei der Medikamentverabreichung (i.i). der Melhvlprednisolonthcrapie und gesonderten Nicrenzeichcn (Jb). GFR und der klinischen Aktivität (3c/ DNA-Bindung (3</J und Serum CIq und Ci-Kompiementgclialten (3(.1^ während des Verlaufs der Krankheit aufgeführt.
Aus I i g. i ist erkennbar, daß die Serumimmunkomplexgfhalte anfangs sehr hoch sind und stark nach der Metlivipredmsolontherapie abfallen, was einer Verbesserung des Zustandes der Patientin entspricht. Die Serumkompkwgeh.ill·· steigen jedoch erneut und ergeben ein Warnsignal für einen Rückfall der Patientin am folgenden Tag mit Myocarditis und Krämpfen Die Patientin wird erneut mit der Mcihylprcdnisolonthera· pie behandelt, ihr Zustand verbessert sich und die Serumkomplexgehalte fallen erneut Der vorübergehende Anstieg in den Gehalten der Immunkomplexe im |uni tritt zusammen mit einem kleinen Rückfall an Fieber und Ausschlag auf.
Aus diesem Beispiel geht eindeutig hervor, wie der erfindungsgemäße Test die Prüfung des Immunkomplexes, der mit der Krankheit assoziiert ist. erleichtert bzw. ermöglicht.
Beispiel 7
2 ml Serum von einem 11 Jahre alten Jungen, der an Henoch-Schonlein-Purpura nephritis leidet, werden an einer kalibrierten Sepharose C. L6B-Säule (90 χ 3.2 cm) getrennt.
Alle erhaltenen Fraktionen werden auf IgA- und IgG-Komplexe nach dem Immunkomplextest. wie er im weseniliehen im Beispiel 3 beschrieben wurde, geprüft. Die IgA-Komplexe werden durch die Inhibiening der Agglutination von IgA-Latex durch Kaninchen-lgM-Antimenschen-IgA bewertet, die sie verursachen, und IgG-Komplexe durch die Inhibierung der Agglutination von IgG-Latex durch Kaninchen-lgM-Antimenschen-IgG. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. A aufgeführt, die in Form einer graphischen Darstellung >' des Elutionsmusters der Fraktionen in Γ rm der optischen Dichte bei 280 um (links y-Achse o. d.) lusammen mit vertikalen Linien, die der Größe der !nhibierung entsprechen (rechts y-Achse % Inhibierung) dargestellt ist Nur die Ergebnisse, die eine Inhibierung, die über 3% liegt ergeben, sind graphisch dargestellt.
F i g. 4 zeigt, daß das Serum zwei Populationen an IgA enthaltenden Komplexen enthält, entsprechend 25 bis 4 χ Wund 4 bis 8 χ 105 Molekulargewichtsbereichen, und ebenfalls eine geringe Menge an IgG enthaltenden Komplexen im Bereich von 33 bis 4 χ 10* m. w.
Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (8)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung und Analyse eines Immunkomplexes mit einem Latexteilchen-Aggluti- ■> nationstest, bei dem die den Immunkomplex enthaltende Probe mit mit einem Komplexbestandteil beschichteten Latexteilchen und IgM-Antikörpern inkubiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die IgM-Antikörper nicht-menschliche iu Antikörper niedriger Affinität gegenüber dem Komplexbestandteil sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplexbestandteil ein Antikörperbestandteil des Komplexes ist '
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplexbestandteil ein antigener Bestandteil des Komplexes ist
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kornplement ans der Probe vor der Inkubierung entfernt wird
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet daß man die Probe durch Behandlung mit EDTA zur Freigabe von C Iq, das dann durch Kontakt mit einem Immunoabsorbens entfernt wird, entkomplementiert
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß anschließend an die Inkubierung die Inhibierung der Agglutination durch ein Objekt-Träger-Agglutinationsverfahren bestimmt wird.
7. Verfahren nach einem, der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß anschließend an die Inkubierung die Inhibierung -Her Agglutination mit einer elektronischen Teilchenzählvorrichtung bestimmt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung so programmiert ist, daß nur nicht-zusammengeballte Teilchen gezählt »0 werden.
DE2710264A 1976-11-24 1977-03-09 Verfahren zur Bestimmung und Analyse eines Immunkomplexes Expired DE2710264C3 (de)

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