DE2633085C3

DE2633085C3 - Vorrichtung zum automatischen Züchten lebender Gewebe oder Zellen

Info

Publication number: DE2633085C3
Application number: DE2633085A
Authority: DE
Inventors: Nagahiro Gocho; Atsuo Tachikawa Goto; Shin-Ichiro Toshima Hattori; Masao Izawa; Shin-Ichi Hino Kamachi; Yoshio Nakajima; Ichiro Sawamura; Toshio Choufu Shinohara; Shinroku Sogi; Makoto Hachiouji Yoshinaga
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1975-07-22
Filing date: 1976-07-22
Publication date: 1980-07-10
Also published as: JPS5724112B2; JPS5212982A; US4090921A; DE2633085A1; DE2633085B2

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum auto-(,, matischen Züchten lebender Gewebe oder Zellen die zusammen mit einer Nährlösung in einem Züchtgefäß eingesetzt sind.

Die Züchtung von Geweben, insbesondere von

Zellen eines lebenden Körpers oder lebenden Organismus hat gegenwärtig eine besondere Bedeutung auf vielen Gebieten, z. B. auf dem Gebiete der Medizin, der Biologie und angrenzenden Gebieten gefunden.

Auf Grund der technischen Schwierigkeiten der Herstellung derartiger Gewebe oder Zellen des lebenden Körpers in Subkultur, insbesondere der Herstellung von menschlichen Geweben oder Zellen, konnten Massenzüchtungen derartiger Gewebe oder Zellen solange nicht vorgenommen werden, bis die to Technik der Kultivierung bzw. Züchtung solcher Gewebe oder Zellen in einem gasdichten Inkubator entwickelt worden ist. Im gasdichten Inkubator werden Zellen oder Gewebe in einer vorgegebenen Gasatmosphäre gezüchtet. Auf Grund dieser Züchttechnik wurde es möglich, selbst besondere Zellen des menschlichen Körpers, z. B. Leberzellen, Nervenzellen und Hypophyse-Zellen zu züchten.

Die Gewinnung einer Kultur (Subkultur) aus einer bestehenden Gewebe- oder Zellenkultur eines lebenden Körpers wurde in herkömmlicher Weise wie folgt durchgeführt. Die Zellen werden zunächst mit einer Nährmittellösung soweit verdünnt, daß sie in der Nährmittellösung schwimmen. Eine vorgegebene Anzahl von Zellen wird sodann zusammen mit der Nähr- .'5 mittellösung in ein Gefäß, z. B. in eine Petrischale geschüttet. Das die vorgegebene Zellenanz-hl und die Nährmittellösung enthaltende Gefäß wird in einen Inkubator eingesetzt, in dessen Innenraum eine vorgegebene Gasatmosphäre eingestellt wird. Um Jen Vermehrungs- bzw. Vervielfachungszustand der Zellen im Gefäß prüfen zu können, wird das Gefäß in bestimmten Zeitabständen aus dem Inkubator herausgenommen und der Vervielfachungszustand der Zellen mit Hilfe eines Mikroskops untersucht. Wenn bei js einer derartigen Untersuchung festgestellt wird, daß die im Gefäß befindlichen Zellen sich ausreichend stark vermehrt haben, so daß das Gefäß mit vervielfachten Zellen gefüllt ist, so wird das Gefäß auf einen Reinigungstisch gestellt, um die vervielfachten Zellen in Stücke für die weitere Subkultur zu zerteilen. Aus dem in der Reinigungsbank befindlichen Gefäß wird die Nährmittellösung mit Hilfe einer Pipette abgesaugt. Die vervielfachten Zellen, die im Gefäß zurückbleiben, werden sodann mit Hilfe einer Pufferlö- ■»■> sung gespült und die Pufferlösung schließlich nach der Spülung aus dem Gefäß auspipettiert. Nach dem Reinigen der Zellen wird eine Enzymlösung, z. B. Trypsin in das Gefäß injiziert, um die vervielfachten Zellen, welche an der Innen- oder Bodciifläche des Gefäßes >o haften, abzulösen und die Zellen in Stücke zu zerteilen. Danach werden die Zellen von der Enzymlösung mit Hilfe einer Zentrifuge getrennt und gesammelt. Mit anderen Worten, die Zellen und die Enzymlösung im Gefäß werden in ein Rohr der Zentrifuge eingcführt und voneinander getrennt, und sodann wird die im Rohr befindliche Enzymlösung, die über den Zellen schwimmt, aus dem Rohr abgesaugt. Bei einigen Zellcnarten kann es überflüssig sein, eine Zentrifuge zum Trennen der Zellen von der Enzymlösung zu ver- to wenden. In diesem Falle wird die Enzymlösung aus dem Gefäß abgesaugt, und zwar unmittelbar bevor die haftenden Zellen von der Enzymlösung befreit und die Zellen dem nächsten Verarbeitungsschritt unterworfen werden.

Nach dem Absaugen der Enzymlösung aus dem Rohr der Zentrifuge wird eine frische Nährmittellösung in das Rohr eingeführt, so daß die Zellen im Rohr auf die vorgegebene Dichte verdünnt werden. Diese Nährmittellösung, in der die zu Stücken zerteilten Zellen schwimmen, wird in vorgegebener Menge in Leergefäße verteilt. Das eine vorgegebene Anzahl von Zellen und Nährmittellösung enthaltende Gefäß wird sodann wieder in den Inkubator eingesetzt und unter vorgegebener Atmosphäre gehalten, so daß wiederum Zellen im Behälter kultiviert bzw. gezüchtet werden. Die zuvor beschriebene herkömmliche Züchtungsmethode hat jedoch die folgenden Nachteile. Ein Nachteil besteht darin, daß der Zuchtbehälter bzw. das Zuchtgefäß häufiger aus dem Inkubator herausgenommen und der Luftatmosphäre ausgesetzt werden muß, um den Vermehrungszustand der Gewebe oder Zellen unter Verwendung eines Mikroskops prüfen zu können. Die Umgebung der Kultur, d. h. die gasförmige Atmosphäre, die Temperatur und die Feuchtigkeit werden dadurch jedesmal beim Herausnehmen des Gefäßes aus dem Innenraum des Inkubators stark geändert, und diese Umgebungsänderang bewirkt auch feine Änderungen oder Vari«:ionen in den im Gefäß befindlichen Zellen oder Gewesen. Darüber hinaus besteht die Gefahr, daß die im Gefäß befindlichen Zellen oder Gewebe durch in der Luft enthaltene Bakterien oder Keime verunreinigt werden.

Da überdies die erforderlichen Arbeiten zum Subkultivieren, d. h. Trennen der Zellen von der Enzymlösung, Sammeln der Zellen, Verdünnen der Zellen durch die Nährmittellösung, Einfüllen der Zellen und der Nährmittellösung in Leergefäße usw. durch erfahrene Fachleute manuell durchgeführt werden müssen, und zwar entsprechend den mikroskopischen Untersuchungsergebnissen, werden auch die Eigenschaften und Charakteristiken der gezüchteten Zellen direkt von den Handarbeiten der Techniker bzw. Fachleute beeinflußt. Das heißt, die Qualität und Eigenschaften der gezüchteten Gewebe oder Zellen hängen von der Erfahrung und Geschicklichkeit der durch Handarbeit beteiligten Techniker und Mediziner ab.

Es ist daher mit den herkömmlichen Züchtungsmethoden unmöglich, das Züchten von lebenden Zellen oder Geweben zu vereinheitlichen oder zu standardisieren.

Auf Grund der Tatsache, daß die Standardisierung unter Vereinheitlichung der Zellzüchtung aus den obengenannten Gründen außerordentlich schwierig ist, werden von verschiedenen, an dem gleichen Thema arbeitenden Wissenschaftlern häufig genau entgegengesetzte Schlußfolgerungen gezogen.

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe die Züchtung bzw. Kultivierung lebender Gewebe oder Zellen auto matisiert, vereinheitlich) und standardisiert werden k?nn, ohne daß eine Verunreinigung der gezüchteten Zellen oder Gewebe durch Bakterien oder Keime zu befürchten ist.

Diese Aufgabe wird bei der eingangs genannten Vorrichtung erfiiidungsgemäß mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Der Anspruch 2 nennt eine Ausgestaltung der Erfindung.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand eines Ausführungsbeispicls näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 schematisch ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zum automatischen Züchten lebender Gewebe oder Zellen,

Fig. 2 einen Teilschnitt entlang den Linien II-II der Fig. 1,

Fig. 3 schematisch eine Anordnung mit einer Vor-

richtung zur Durchführung der erforderlichen Arbeiten zum Herstellen einer Kultur aus einer bereits bestehenden Kultur, nämlich der Zelltrennung, der Zellsammlung und der Transfusion der Zellen zusammen mit einer Nährmitteiläsung in ein leeres Gefäß, ■>

Fig. 4 schematisch eine Schnittansicht durch eine Gefäßzuführvorrichtung zur Verwendung in der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung,

Fig. 5A schematisch eine Frontansicht einer Deckelabzugsvorrichtung zur Entfernung eines Dek- m kels von einem in der in F-ig. 1 dargestellten Vorrichtung befindlichen Züchtgefäß,

Fig. 5 B eine Teildraufsicht auf einen Deckelabzugsschieber, der zur Dcckelabzugsvnrrichtung in Fig. 5 A gehört, und ι ί

fig. 5 C eine Seitenansicht des Deckelabzugsschiebers gemäß Fig. 5 B.

Im fnlsenclrn wird auf dir· Fi ο I iinrl ?. Rr7iio oc iiommen. Dort bezeichnet das Bezugszeichen 10 ein Hauptgehäsue der Ziichtvorrichtung und das Bezugs- :» zeichen 11 einen Deckel für das Gehäuse 10. Mit 12 ist ein Züchtgefäß, z. B. eine Petrischale bezeichnet, welche einen Hauptteil 12a und einen Gefäßdeckel 12fr umfaßt. Der Innenraum des Hauptgehäuses 10 ist vollständig luftdicht abgeschlossen und wird unter der zur Subkultivierung von Geweben oder Zellen eines lebenden Körpers erforderlichen Atmosphäre gehalten. In dem Hauptgehäuse 10 sind eine Betätigungsvorrichtung 20 zur Durchführung der erforderlichen Arbeiten bei der Zellzüchtung, z. B. des )'> Trennens der vermehrten Zellen, des Sammelns der Zellen, des Verdünnens der Zellen und der Injektion der Zellen zusammen mit einer Nährmittellösung in die leeren Züchtgefäße 12, ferner eine Untersuchungseinrichtung 40, eine Gefäß-Zuführvorrichtung r> 60 und eine Gasatmosphären-Steuereinrichtung 70 angeordnet. Eine Gesamtsteuereinrichtung 80 steuert die Funktionen der Betätigungsvorrichtung 20, der Untersuchungsvorrichtung 40, der Gefäß-Zuführvorrichtung 60 und der Gasatmosphären-Steuereinrich- ·»< > tung 70. Die Gesamtsteuereinrichtung 80 wird durch einen Ventiisteuerteii ei, einen inspeKtions- und Steuerteil 82. einen Antriebssteuerteil 83 und einen Atmosphären-Steuerteil 84 gebildet und jeder dieser Steuerteile 81 bis 84 ist elektrisch mit der zugehörigen π Vorrichtung im Hauplgehäuse 10 verbunden.

Die Betätigungsvorrichtung 20 wird durch einen scheibenförmigen Gefäßträger 21 und einen Betätigungsteil 22 gebildet, der die erforderlichen Tätigkeiten zum Züchten der Gewebe oder Zellen aus bereits w bestehenden Geweben oder Zellen durchführt. Wie aus Fig. 2 zu erkennen ist, sind in dem scheibenförmigen Träger 21 mehrere kreisförmige Löcher 21a an solchen Stellen ausgebildet, an denen die Züchtgefäße anzubringen sind. Der Umfang des scheibenförmigen Gefäßträgers 21 ist als Zahnrad 21b ausgebildet. Ein beipsielsweise mit einem Motor verbundenes Triebrad 23 ist im Gehäuse 10 derart gelagert, daß es mit dem Zahnrad 21 b kämmt. Auf diese Weise kann der scheibenförmige Gefäßträger 21 mittels des Triebrades 23 in Umlauf versetzt werden, wenn letzteres durch eine geeignete Antriebsvorrichtung gedreht wird.

Der Betätigungsteil 22 ist in Fig. 3 genauer dargestellt. In F i g. 3 bezeichnet das Bezugszeichen 24 einen Entnahmebehälter, der über ein Ventil 24a, ein Rohrstück 24d, eine Pumpe 24b und ein Dreiwegeventil 24c mit einer Entnahmedüse 25 verbunden ist. Ein die Nährmitteliösung enthaltender Behälter 26 ist in ähnlicher Weise über ein Ventil 26a, ein Dreiwegeventil 26b, eine Pumpe 26c, ein weiteres Dreiwegeventil 26d und ein Rohr 26e mit einer ersten Nährlösungsabgabedüse 27 verbunden. Ein Pufferlösungstrog 28 ist über ein Rohr 28c, ein Ventil 28a und eine Pumpe 28b mit einer Pufferlösungsabgabedüse 29 verbunden. Ein Enzymlösungsbehälter 30 ist über ein Rohr 30c, ein Ventil 30a und eine Pumpe 30b mit einer Enzymlösungsabgabedüse 31 verbunden. Eine Bewegungs- bzw. Verwirbelungsdüse 32 ist über ein Rohr 32r, eine Bewegungsvorrichtung 33. eine Pumpe 32a und ein Ventil 32/; mit einer ZeII-Schwimmlösungs-Entnahmedüse 34 verbunden. Hei diesem Ausführungsbeispiel ist das Rohr 32c ein elastischer Schlauch, und die Bewegungsvorrichtung 33 kann als hin- und hergehende Stange ausgebildet sein, an deren einem Ende eine gegenüber einem stationären Bauteil bewegliche Druckplatte angebracht ist. mit tieren Hilfe der elastische Schlauch oder das elastische Rohr 32c zwischen dem stationären Bauteil und der Druckplatte plattgedrückt und geöffnet werden kann. Auf Grund der Elastizität des Schlauch¹· 32c kehrt dieser nach der Deformation wieder in die ursprüngliche Form zurück, wenn die Stange zurückgezogen wird. Das Bezugszeichen 35 bezeichnet eine zweite Fntnahmcdüse, die über ein Rohr 35η mit einem Dreiwegeventil 24c verbunden ist. Eine Saugdüse 36 ist über ein Rohr 36a mit einem Dreiwegeventil 26/j verbunden. Eine zweite Nährlösungs-Abgabedüse 37 ist über ein Rohr 37a mit dem Dreiwegeventil 26d verbunden, so daß die zweite Nährlösungs-Abgabedüse 37 mit dem Nährlösungstrog 26 kommunizieren kann. Diese vier Düsen, d. h. die Zell-Schwimmlösungs-Entnahmedüse 34, die zweite Entnahmedüse 35, die Saugdüse 36 und die zweite Nährlösungs-Abgabedüse 37 sind beweglich über einer Zentrifuge 38 angeordnet, welche zum Trennen und Sammeln der Gewebe oder Zellen dient. Um eine Schwingungsübertragung von der Zentrifuge 38 auf die verschiedenen Teile des Apparats zu vermeiden, ist ein geeigneter Puffermechanismus, z. B. eine in aer Zeichnung mehl dargestellte Pufferfeder zur Absorption derartiger Schwingungen zwischen dem Hauptgehäuse 10 und der Zentrifuge 38 angeordnet.

Die Betätigungsvorrichtung20 führt mit dem Betätigungsteil 22 die erforderlichen Arbeiten für die Subkulturbzw. Weiterzüchtung, z. B. Trennen der Zellen, Sammeln der Zellen, Verdünnen der Zellen und Übertragen der Zellen zusammen mit der Nähr'risung in leere Züchtgefäße in der zuvor beschriebenen Weise aus.

Die zu züchtenden Gewebe oder Zellen werden zusammen mit der Nährlösung in ein Züchtgefäß 12 gegeben. Das Züchtgefäß 12 wird sodann auf den Gefäßträger an einer mit einem kreisförmigen Loch 21a versehenen Stelle aufgesetzt. Das Hauptgehäuse wird durch Schließen des Deckels 11 hermetich abgeschlossen und sodann auf die vorgegebene Gasatmosphäre gebracht, bei der sich die Gewebe oder Zellen im Gefäß 12 graduell mit der Zeit vervielfachen. Nach gewissen Zeitabschnitten und nach Feststellung durch ein Mikroskop, daß die Zellenvermehrung den vorgegebenen Werterreicht hat, wird die erste Abgabedüse 25 nach unten in das die vermehrten Gewebe oder Zellen mit der Nährlösung enthaltende Gefäß 12 bewegt und die Nährlösung aus dem Gefäß 12 durch öffnen des Ventils 24a und Betätigung der Pumpe

24b in den Entnahmebehälter 24 überführt. Nachdem die Nährlösung vollständig aus dem Gefäß 12 entfernt worden ist, wird die erste Entnahmedüse 25 aus dem Gefäß 12 nach oben herausgehoben, das Ventil 24a geschlossen und die Pumpe 24b abgestellt. Danach ■> wird die Pufferlösungs-Abgabedüse 29 nach unten in das Gefäß 12 bewegt und die im Pufferlösungstrog 28 tiithaltene Pufferlösung durch die Düse 29 in das Gefäß mit der vorgegebenen Menge durch öffnen des Ventils 28a und Betätigung der Pumpe 286 übertra- in gen. so daß die Oberfläche der vermehrten Zellen gespült und gereinigt werden. Nach diesem Spülvorgang wird die Pufferlösungs-Abgabedüse 29 nach oben aus dom Behälter 12 bewegt, das Ventil 28a geschlossen und die Pumpe 28/' abgeschaltet. Die zum Spülenoder ι -, Reinigen der gezüchteten Zellen verwendete Pufferlösung wird sodann aus dem Gefäß 12 in den Entnahmebehälter 24 durch Betätigung des Ventils 24a, der Pumpe 24b und des ersten hntnahmestutzens 25 in der zuvor bereits beschriebenen Weise entnommen. ;n Nach der Entnahme der Pufferlösung wird die Enzymlösungs-Ahgabedüse 31 nach unten in das Gefäß 12 bewegt und die Enzymlösung aus dem Enzymlösungsvorratstrog 30 durch die Düse 31 unter Offnen des Ventils 30a und Betätigung der Pumpe 30fr über- y, tragen. Die Enzymlösungs-Abgabedüse 31 wird sodann aus dem Gefäß 12 gehoben, nachdem eine vorgegebene Enzymlösungsmengc in das Gefäß 12 abgegeben worden ist. Nach dem Herausziehen der Enzymlösungs-Abgabedüse 31 wird die Bewegungs- "' bzw. Verwirhelungsdüse 32 in das Gefäß abgesenkt und die Pumpe 32a bei geschlossenem Ventil 32fr betätigt, so daß die aus dem Gefäß 12 abgesaugte Enzymlösung das elastische Rohr 32c zwischen der Düse 32 und dem Ventil 326 füllt. Wenn das elastische Rohr »> bzw. der elastische Schlauch 32c zwischen der Düse 32 und dem Ventil 326 mit Enzymlösung gefüllt ist, wird die Pumpe 32a stillgesetzt und gleichzeitig die Bewegungsvorrichtung 33 betätigt. Durch die Vorwärtsbewegung der kolbenartigen Stange der Bewe- -»n gungsvorrichtung wird die im elastischen Schlauch 32c hpfindlirhp Pn7wm!ncnnn ctnfiirtin in «Ίο.· Clntan 11

zurückgedrückt und sodann bei Rückkehr der zur Bewegungsvorrichtung gehörigen Kolbenstange wieder in den elastischen Schlauch 32c eingesaugt. Diese Operation wird bei Betrieb der Bewegungsvorrichtung 33 fortgesetzt, wobei die Enzymlösung im Gefäß 12 bewegt bzw. gerührt und verwirbelt wird. Die Bewegungsvorrichtung wird angehalten, wenn die Zellen in Stücke geteilt worden sind, und die die unterteilten Zellen enthaltende Enzymlösung als Zellschwimmlösung durch die Bewegungsdüse 32 in den elastischen Schlauch 32 c eingesaugt und durch die Zellenschwimmlösungs-Entladungsdüse 34 in die Zentrifuge durch öffnen des Ventils 326 und Betätigung der Pumpe 32e überführt wird. Durch Betätigung der Zentrifuge 38 werden die Zellen von der Enzymlösung getrennt und im unteren Teil des Zentrifugenrohrs gesammelt. Die Enzymlösung aus der die Zellen extrahiert werden und die über den Zellen im Zentrifugenrohr schwimmt, wird aus dem Zentrifugenrohr durch öffnen des Ventils 24a und Betätigung der Pumpe 24 b sowie durch Umschalten des Dreiwegeventils 24c unter Verbindung des Rohrs 35e und der zweiten Entnahmedüse 35 mit dem Rohr 246 in den Entnahmebehälter 24 überführt. Nach der Entnahme der Enzymlösung aus dem Zentrifugenrohr wird das Ventil 24a geschlossen und die Pumpe 246 stillgesetzt. Danach wird frische Nährlösung aus dem Nährlösungsbehälter 26 durch die zweite Nährlösungsabgabedüse 37 unter Betätigung der Pumpe 26c nach öffnen des Ventils 26a überführt, wobei das Dreiwegeventil 26a*derart umgeschaltet ist, daß der Nährlösungsbehälter 26 mit der zweiten Nährlösungs-Abgabedüse 37 kommuniziert. Daher werden die Zellen mit der Nährlösung bereits im Zentrifugenrohr gemischt. Die Zellen und die Nährlösung werden sodann zur weiteren Zellenzüchtung in bestimmten Mengen aus dem Zentrifugenrohr in mehrere leere Zucht behälter eingesetzt, die nacheinander unter das erste Niihrlösungs-Abgabeventil 27 geschoben werden. Dabei wird das Dreiwegeventil 26b umgeschaltet, so daß die Saugdüse bzw. der Saugstutzen 36 mit der ersten Nährlösungs-Abgabedüse 27 kommuniziert, und die Pumpe 26c betätigt. Die verschiedenen Funktionen der Betätigungsvorrichtung 20 und des Betätigungsteils 22 werden unter der vollständigen Steuerung durch die Steuervorrichtung 80 durchgeführt. D. h., das öffnen und Schließen der Ventile und das Umschalten der Dreiwegeventile werden vom Ventilsteuerteil 81 und die Betätigung jedes Teils der Betätigungsvorrichtung 20 und des Betätigungsteils 22, ζ. B. die Drehung des scheibenförmigen Gefäßträgers, durch den Antriebssteuerteil 83 der Steuervorrichtung 80 gesteuert.

Wie aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich ist, muß die Düse in das Zuchtgefäß 12 eingesetzt werden, wenn beispielsweise die Pufferlösung aus dem Pufferlösungsbehälter 28 in das Gefäß überführt werden soll oder wenn die gebrauchte Nährlösung und die Pufferlösung aus dem Gefäß 12 in den zugehörigen Entnahmebehälter 24 abgezogen werden soll. Andererseits werden die zugehörigen Düsen bzw. Stutzen vorzugsweise in ihren Ruhezeiten über dem Gefäß 12 gehalten, damit das Gefäß aus der Stellung unter den Düsen bzw. Stutzen herausbewegt werden kann und auch der Behälterdeckel während der Züchtung selbst aufgesetzt werden kann. Zu diesem Zweck ist jede Düse bzw. jeder Stutzen mit einem geeigneten Anti-;·»^. 2 η ons eimern Zah"star:~cr;~ctr:cbc oder einem Nockengetriebe ausgestattet, mit dessen Hilfe nur die jeweils betätigte Düse unabhängig aufwärts- und abwärtsbewegt werden kann. Es ist jedoch in der Regel nicht ratsam, die Düsen mit einem gemeinsamen Axialantrieb auszustatten, durch den alle Düsen gleichzeitig gesenkt oder gehoben werden können. In diesem Falle könnten nämlich Rückstände an den Außenenden der Düsen mit den Zellen in Berührung kommen. Im Prinzip die gleichen Überlegungen gelten für die oberhalb der Zentrifuge 38 angeordneten Düsen.

Vorzugsweise werden die Düsen nach jedem Betätigungszyklus gereinigt, um eine Verschmutzung und die Mischung der Lösungen zu vermeiden.

Selbstverständlich können auch gegenüber der Ausfühningsform nach Fig. 3 abgewandelte Bewegungs- bzw. Verwirbelungsvorrichtungen eingesetzt werden.

Im folgenden wird auf die Untersuchungseinrichtung 40 Bezug genommen. In Fig. 1 bezeichnen 41 eine als Lichtquelle dienende Lampe, 42 eine Sammellinse, 43 eine Helligkeitssteuereinrichtung, 44 einen reflektierenden Spiegel, 45 einen Kondensor. 46 ein Objektiv, 47 einen anderen reflektierenden Spiegel, 48 eine Relaislinse, 49 einen Halbspiegel (teildurchlässigen Spiegel), 50 eine Augenlinse und 51

eine Untersuehungseinriehtung. In der Wand des Hauptgehäuses 10 sind Glasplatten 52 und 53 angeordnet. Der Kondensor 45 und die Objektivlinse 46 der Untersuehungseinriehtung 40 sind jeweils über und unter dem scheibenförmigen Gefäßträger 21 derart angeordnet, daß ihre gemeinsame optische Achse durch jedes kreisförmige Loch 21a durchtreten kann, wenn der Gefä<Mräger bzw. -halter 21 gedreht wird. Wenn die Zellen daher im Züchtgefäß 12 beobachtet werden sollen, so wird der Gefäßträger 21 in eine solche Stellung gedreht, in der die optische Achse der Untersuehungseinriehtung 40 den entsprechenden Züchtbehälter 12 durchdringt, worauf sowohl eine Beobachtung durch die Augenlinse mit dem normalen Auge als auch die Untersuchung durch die Inspektionsvorrichtung 51 erfolgen kann. Obwohl die Beleuchtungslampe 41 und die Sammellinse 42 außerhalb des Hauptgehäuses 10 im Ausführungsbeispiel gemäß den Fig. 1 und 2 angeordnet sind, können sie in abgewandelter Ausführungsform auch im Hauptgehäuse 10 angeordnet werden. Die Gefäß-Zuführvorrichtung 60 ist entsprechend Fig. 4 ausgebildet. Sie weist eine Gefäß-Speicherkammer 61 mit einem Kammerdeckel 62 und einem Gefäß-Zuführteil 53 auf, welch letzteres mit einer Zahnstange 64 versehen ist. Der Zuführteil 63 ist in der Kammer 61 so gelagert, daß er horizontale Bewegungen ausführen kann. Mit der Zahnstange 64 steht ein Zahnrad 65 in Eingriff, das ebenfalls zum Gefäß-Zuführteil 63 gehört. Das Zahnrad 65 ist mit einem in der Zeichnung nicht dargestellten geeigneten motorischen Antrieb versehen. Die Gefäß-Speicherkammer 61 ist ebenfalls luftdicht abgeschlossen und steht mit dem Innenraum des Hauptgehäuses durch ein in der Wand des Hauptgehäuses 10 ausgebildetes Fenster 10a in Verbindung. Die in der Gefäß-Speicherkammer 61 gestapelten Züchtbehälter werden einzeln aus der Kammer 61 dem Gefäßträger mit Hilfe des Zuführteils 63 zugeführt. Der Behälter-Zuführteil 63 wird dabei von dem Zahnrad 65 nach rechts geschoben, wodurch der unterste Behälter aus der Kammer 61 durch das Fenster 10a in den Innenraum des Hauptgehäuses 10 überlüiiit WIlU. UCl IJlCSCMl AuMuill UllgMlClbpici (Flg. i bis 3) sind langgestreckte, von der Peripherie des scheibenförmigen Gefäßträgers 21 ausgehende radiale Schlitze 21c vorgesehen, welche die zugehörigen kreisförmigen Löcher 21a durchlaufen. Es sind ferner geneigte Flächen 21 d zwischen den entsprechenden kreisförmigen Löchern 21a und der Peripherie des scheibenförmigen Gefäßträgers 21 vorgesehen. Die einzeln durch das Fenster 10a in das Hauptgebäude 10 eingeschobenen Züchtbehälter 12 werden daher von dem Gefäß-Zuführteil 63 über die geneigten Flächen 21d des scheibenförmigen Trägers 21 eingeführt, wenn der Gefäßträger 21 jeweils mit einem der Schlitze 21c mit dem Gefäß-Zuführteil 63 in Ausrichtung kommt. In diesem Falle greift das Gefäß-Zuführteil 63 in den radialen Schlitz 21c ein. Wenn daher der Zuführschieber 63 durch umgekehrte Drehung des Zahnrads 65 in seine in Fig. 4 dargestellte Ursprungslage zurückgestellt wird, bleibt das Gefäß 12 an einer vorgegebenen Stelle auf dem Gefäßträger 21 oberhalb des kreisförmigen Lochs 21a abgesetzt. Wenn der Gefäß-Zuführschieber 63 in seine Ausgangslage zurückgekehrt ist, wird auf ihn das jetzt unterste Gefäß 12 abgesetzt. Auf diese Weise werden die gestapelten Züchtgefäße 12 nacheinander durch Wiederholung der zuvor beschriebenen Operation auf den Gefäßträger 21 transportiert bz%v. überführt.

Um die Zellei. und Nährlösung in den mit Hilfe des Zuführschiebers 63 auf den Gefäßträger 21 aufgesetzten Züchtbchälter 12 zu injizieren, muß zunächst ■> der Behälterdeckel 126 des Züchtbehälters 12 abgenommen werden. Zu diesem Zweck ist eine Deckelabzugsvorrichtung in dem Hauptgehäuse vorgesehen. Die Deckelabzugsvorrichtung ist in Fig. 5 A gezeigt und weist einen Deckelabzugsschieber 66 auf. Wie aus

ίο den Fig. 5 B und 5 C zu erkennen ist, ist das eine Ende des Deckelabzugsschiebers 66 gabelförmig ausgebildet und mit einem gestuften Abschnitt 666 an der Innenseite jeder Gabelzinke versehen. Der Abstand Z₁ zwischen den beiden gestuften Abschnitten der Zin-. ken ist etwa gleich dem Außendurchmesser des Gefäßdeckels 126 des Züchtgefäßes 12, und der Abstand I₁ /wischen den beiden Innenflächen der Zinken ist angenähert gleich dem Außendurchmesser des Hauptteils 12a des Gefäßes 12. Wenn der Deckclab-

jii zugsschieber 66 horizontal auf das Züchtgefäß 12 zubewegt wird und die Schultern der gestuften Abschnitte 666 die Unterseite untergreifen, kann der Züchtbehälter 12 zwischen die beiden Zinken bzw. Schenkel des dort gabelförmigen Deckelabzugsschie-

J-. bers 66 gebracht werden. Wenn in diesem Zustand der Deckelabzugsschieber 66 angehoben wird, wird der Gefäßdeckel 126 vom Gefäßhauptteil 12a abgehoben. Wie in Fig. 5 A gezeigt ist, ist der Deckelabzugsschieber 66 an einer Halterung 67 so gelagert,

in daß er sich bezüglich der Halterung 67 nur horizontal verschieben läßt. Ein Zahnrad 69a, das mit einem geeigneten, in der Zeichnung nicht dargestellten Antrieb verbunden ist, ist in der Halterung 67 so gelagert, daß es mit einer an der Unterseite des Deckelabzugsschie-

n bers 66 ausgebildeten Zahnstange 66a kämmt. Die Halterung 67 weist außerdem eine vertikale Zahnstange 67a auf und ist selbst am Hauptgehäuse durch geeignete Träger derart abgestützt, daß es nur in Vcrtikalrichtung bewegt werden kann. Ein anderes Trägerbauteil 68 ist unter der ersten Halterung 67 angeordnet. Ein weiteres Zahnrad 696, das mit einem geeignetem Antrieb (nicht dargestellt) verbunden ist, ist im Siüizbauieii όβ derart geiagen, daß es mit der vertikalen Zahnstange 67a an der ersten Halterung

4Ί 67 in formschlüssigen Eingriff tritt. Auf diese Weise läßt sich das Deckelabzugsbauteil 66 durch Drehung des Zahnrads 69a horizontal und durch Drehung des Zahnrads 696 vertikal bewegen.

Die in Fig. 5 A dargestellte Deckelabzugsvorrich-

>o tung ist, wie in den Fig. 1 und 2 zu erkennen ist, im Hauptgehäuse 10 gegenüber der Gefäß-Zuführvorrichtung 60 angeordnet. Beispielsweise beim Einfüllen der Zellen und der Nährlösung in das leere Zuchtgefäß 12 wird letzteres zunächst in eine vorgegebene

is Stellung auf dem Gefäßträger 21 durch Betätigung des Zuführscbiebers 63gebracht. In diesem Falle muß sich der Deckelabzugsschieber 66 zunächst in seiner untersten Stellung befinden, in der die Schultern der gestuften Abschnitte 666 tiefer als die Ebene der Un-

bo terseite des Deckels 126 liegt. Sodann wird der Deckelabzugsschieber 66 durch Drehung des Zahnrads 69a soweit in Fig. 1 horizontal nach links geschoben, bis das Zuchtgefäß zwischen den Zinken des gabelförmigen Deckelabzugsschiebers 66 liegt. Sodann wird das Zahnrad 696 gedreht, wodurch die Halterung 67 zusammen mit dem Deckelabzugsschieber 66 aufwärts verschoben wird. Auf Grund dieser Aufwärtsbewegung des Deckelabzugsschiebers 66

wird der Gefäßdeckel 12b urcier Auflage auf den Schultern des Deckelabzugsschiebers 66 angehoben und von d.:m Hauptgefäß 12a abgehoben. Danach wird der Deckelabzugsschieber wieder durch Drehungsumkehr des Zahnrads 69a in die erste Lage gebracht, damit die erste Nährlösungs-Abgabediise 27 in den Hauptteil 12a des Gefäßes 12 eingeführt werden kann. Der abgezogene Gefäßdeckel 126 kann auf das zugehörige Gefäß 12a durch umgekehrte Bewegung des Deckelabzugsschiebers wieder aufgesetzt werden. Diese Operationen der Gefäß-Zuführvorrichtung 60 und der Deckelabzugsvorrichtung gemäß Fig. 5 A sowie die Drehbewegung des Gefäßtriigcrs 21 stehen unter der Steuerung des Antriebssteuei teils 83.

Die in Fig. 1 gezeigte Gasatmosphären-Steuereinrichtung 70 weist einen CO,-Detektor 71«, eine COj-Bestimmungs- und Steuerungseinrichtung 71/'. einen CO,-Gasbehälter 71 c. einen Temnrrntiirdi-tektor 72a und :u\ Temperaturstellglied 72/> auf. Mit diesen Teiler der Gasatmosphären-Steuereinrichuing 70 kann die Atmosphäre im Hauptgehäuse 10 unter Steuerung des Atmosphären-Steuerteils 84 der Gesamtsteuereinrichtung 80 auf den für clic Züchtung besten Bedingungen gehalten werden. Obwohl nur die Temperatur- und die CO,-Steuereinrichtungen in Fig. 1 dargestellt sind, ist natürlich klar, daß auch Feuchtigkeits-, N^- und Oj-Steucreinrichtungcn in einem vollständigen Züchtappamt vorhanden sind, die dann mit dem Atmosphären-Steuerteil 84 verbunden sind, da der Innenraum des Hauptgehäuses 10 standig unter konstanter Temperatur. Feuchtigkeit und Gasatmosphäre gehalten werden muß, wobei CO,, N, und O, in geeignetem Verhältnis gemischt sind.

Fs ist auch möglieh, die Steuereinrichtung 80 als reine Folgesteuereinrichtung auszubilden und anzuordnen. Wenn die Gesamtsteucreinrichtung 80 jedoch über eine geeignete Schnittstellenelektronik mit einem Computer verbunden wird, können alle Operationen der Züchtvorrichtung entsprechend einem vorgegebenen Programm gesteuert werden.

Die heschricbene Zugvorrichtung arbeitet in der folgenden Weise:

Zunächst werden die Gewebe oder Zellen zur Weiterzucht bzw. Vermehrung zusammen mit einer Nährlösung in ein leeres Züchtgefäß 12 eingeführt. Das die Gewebe oder Zellen sowie die Nährlösung enthaltende Züchtgefäß 12 wird sodann in die vorgegebene Lage auf dem Gefäßträger 21 im Hauptgehäuse 10 gebracht, wobei der Innenraum des Hauptgehäuses für gewisse Zeitabschnitte bis zur ausreichenden Vermehrung der Gewebe oder Zellen unter der gewünschten Atmosphäre gehalten wird. Wenn der Vervielfaehungs- bzw. Vermehrungszustand während der Züchtung untersucht oder beobachtet werden soll, so wird der scheibenförmige Gefäßträger soweit gedreht, bis das Gefäß 12 zwischen dem Kondensor 45 ι und der Objektivlinse 46 der Untersuchungseinrichtung 40 ausgerichtet ist. Die Untersuchung oder Beobachtung der Gewebe oder Zellen kann mit bloßem Auge oder mit Hilfe der Untersuchungseinrichtung 51 erfolgen. Wenn durch eine derartige Untersuchung

ίο oder Beobachtung festgestellt wird, daß das Gefäß 12 mit vermehrten Zellen angefüllt ist, so wird der scheibenförmige Gefäßträger 21 solange gedreht, bis das Gefäß in die Stellung zwischen der Gefäß-Speicher-Kimmer 61 und der Deckelabzugsvorrichtung mit

r, dsm Deckelabzugsschicber 66 kommt. Der Deckel 12/} des Gefäßes 12 wird sodann durch Betätigung der Deckelabzugsvorrichtung entfernt. Danach werden die erforderlichen Arbeiten zur Herstellung der SiihL'iiitiir ν R F"iitniihiTis der Nährlösung, Spule"

jo der Zellen mit der Pufferlösung, Trennen und Befreiender Zellen vom Gefäß 12 und Trennen der Zellen von der Enzymlösung in der Zentrifuge durchgeführt, und zwar in der an Hand Fig. 3 beschriebenen Weise. Nach der Beendigung dieser Tätigkeiten vird

r, die Gefäß-Trägerscheibe 21 soweit gedreht, daß das nachfolgende runde Loch 21a in die Lage im Bereich zwischen der Gefäß-Speicherkammer 61 und der Deckelabzugsvorrichtung gelangt, in der der zugehörige Schlitz 21c mit dem Gefäß-Zuführteil 63 ausgc-

K) richtet ist. Sodann wird ein leeres Züchtgefäß 12 auf die entsprechende Ausnehmung in der Gefäß-Trägerscheibe 21 unter Betätigung des Gefäß-Zuführteils 63 aufgesetzt. Der Gefäßdeckel 12/) des leeren Gefäßes 12 wird sodann mit Hilfe der Deckelabzugsvorrich-

r. tung entfernt, und die getrennten Zellen sowie frische Nährlösung wreden in das leere Gefäß 12 zur Herstellung einer weiteren Subkultur von Zellen eingeführt. Auf diese Weise werden mehrere Züchtgefäße nacheinander aus der Gefäß-Speieherkammer 61 entfernt.

•in auf die Gefäß-Trägerscheibe 21 aufgesetzt, und schließlich werden die Zellen und die zugehörige Nährlösung in jedes der nacheinander zugeführten Gefäße eingefüllt. Die mit Hilfe der beschriebenen Vorrichtung gezüchteten und vermehrten Zellen wer-

J-. den geteilt und in neue Leergefäße zusammen mit frischer Nährlösung zur Herstellung einer Subkultur dieser Zellen eingeführt.

Als Untersuchungsmethode zur Feststellung des Vermehrungszustandes der Zellen im Gefäß 12 mit

■>ii Hilfe der Untersuchungseinrichtung 51 sind verschiedene Methoden geeignet, so z. B. ein Spektralmuster. Untersuchung mit einem Ionendetektor sowie Untersuchungen durch Änderung des elektrischen Widerstandes.

Hierzu 4BIaU Zeichnun&en

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zum automatischen Züchten lebender Gewebe oder Zellen, die zusammen mit einer Nährlösung in einem Züchtgefäß eingesetzt sind, gekennzeichnet durch

a) ein gasdicht abschließbares Hauptgehäuse (10) zur Aufnahme des Züchtgefäßes (12) mit den Geweben oder Zeilen und der Nährlösung sowie leerer Gefäße,

b) einen im Hauptgehäuse (10) angeordneten scheibenförmigen Gefäßträger (21) mit mehreren kreisförmigen Löchern (21a) für die Züchtgefäße,

c) eine Untersuchungseinrichtung (40) aus einer als Lichtquelle dienenden Lampe (41), einer Sammellinse (42), einer Helligkeitssteuereinrichtung (43), einem reflektierenden Spiegel (44), einem Kondensor (45), einem Objektiv (46), einem anderen reflektierenden Spiege! (47), einer Relaislinse (48), einem teildurchlässigen Spiegel (49), einer Augenlinse (50) und einer weiteren Untersuchungseinrichtung (51), wobei der Kondensor (45) und das Objektiv (46) jeweils über und unter dem scheibenförmigen Gefäßträger (21) derart angeordnet sind, daß ihre gemeinsame optische Achse durch jedes kreisförmige Loch (21a) durchtreten kann,

d) einen Entnahmebehälter (24), der über ein Ventil (14a), ein Rohrstück (24d), eine Pumpe (24b) und ein Dreiwegeventil (24c) mit einer Entnahmedüse (25) verbunden ist, einen die Nährmitteilösi-.g enthaltenden Behälter (26), der über ein Ventil (26a), ein Dreiwegeventil (26b), eine Pumpe (26c), ein weiteres Dreiwegeventil (26d) und ein Rohr (26e) mit einer ersten Nährlösungsabgabedüse (27) verbunden ist, einen Pufferlösungstrog (28), der über ein Rohr (28c), ein Ventil (28a) und eine Pumpe {28b) mit einer Pufferlösungsabgabedüse (29) verbunden ist, einen Enzymlösungsbehälter (30), der über ein Rohr (30c), ein Ventil (30a) und eine Pumpe (30b) mit einer Enzymlösungsabgabedüse (31) verbunden ist, eine Bewegungsund Verwirbelungsdüse (32), die über ein Rohr (32c), eine Bewegungsvorrichtung (33), eine Pumpe (32a) und ein Ventil (32/j) mit einer Zellschwimmlösungs-Entnahmedüse (34) verbunden ist, eine zweite Entnahmedüse (35), die über ein Rohr (35a) mit einem Dreiwegeventil (24c) verbunden ist, eine Saugdüse (36), die über ein Rohr (36a) mit einem Dreiwegeventil {26b) verbunden ist, eine zweite Nährlösungs-Abgabcdüsc (37), die über ein Rohr (37α) mit einem Dreiwegeventil (26d) so verbunden ist, daß die zweite Nährlösungs-Abgabedüse (37) mit dem die Nährmittellösung enthaltenden Behälter (26) kommunizieren kann, und die Zellschwimmlösungs-Entnahmedüse (34), die zweite Entnahmedüse (35), die Saugdüse

(36) und die zweite Nährlösungsabgabedüse

(37) beweglich über einer zum Trennen und Sammeln der Gewebe oder Zellen dienenden Zentrifuge (38) angeordnet sind,

e) einer Gasatmosphären-Steuereinrichtung (70) aus einem CO₂-Detektor (71a), einer CO^BestJmmungs- und Steuereinrichtung (7l2>), einem CO₂-Gasbehälter (71c), einem Temperaturdetektor (72a) und einem Temperatureinstellglied (72b) zur Steuerung der Atmosphäre im Hauptgehäuse (10) unter Steuerung eines Atmosphären-Steuerteils (84) einer Gesamtsteuereinrichtung (80), Feuchtigkeits-, N₂- und O₂-Steuereinrichtungen, die ebenfalls mit dem Atmosphären-Steuerteil (84) verbunden sind,

f) eine Gefäß-Zuführvorrichtung (60) mit einer Gefäß-Speicherkammer (61) mit einem Kammerdeckel (62) und einem Gefäß-Zuführteil (63), welch letzteres mit einer Zahnstange (64) versehen ist, der Gefäß-Zuführteil (63) in der Gefäß-Speicherkammer (61) so gelagert ist, daß er horizontale Bewegungen ausführen kann, mit der Zahnstange (64) ein Zahnrad (65) in Eingriff steht, das ebenfalls zum Gefäß-Zuführteil (63) gehört, das Zahnrad (65) mit einem geeigneten motorischen Antrieb versehen ist, die Gefäß-Speicherkammer (61) luftdicht abgeschlossen ist und mit dem Innenraum des Hauptgehäuses (10) durch ein in der Wand des Hauptgehäuses (10) ausgebildetes Fenster (10a) in Verbindung steht und in der Gefäß-Speicherkammer (61) gestapelte Züchtgefäße dem Gefäßträger (21) mit Hilfe des Gefäß-Zuführteils (63) zuführbar sind, und

g) eine Gesamtsteuereinrichtung (80) für die Funktionen der Betätigungsvorrichtung (20), der Untersuchungseinrichtung (40), der Gefäß-Zuführvorrichtung (60) und der Gasatmosphären-Steuereinrichtung (70), wobei die Gesamtsteuereinrichtung (80) durch ein Ventilsteuerteil (81), einen Inspections- und Steuerteil (82), einen Antriet/ssteuerteil (83) und einen Atmosphären-Steuerteil (84) gebildet ist und jeder dieser Steuerteile elektrisch mit der zugehörigen Vorrichtung im Hauptgehäuse (10) verbunden ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine in dem Hauptgehäuse (10) vorgesehene Deckelabzugvorrichtung, die einen Deckelabzugsschieber (66) aufweist, wobei das eine Ende des Deckelabzugsschiebers (66) gabelförmig ausgebildet ist und mit einem gestuften Abschnitt (66b) an der Innenseite jeder Gabelzinke versehen ist, der Abstand ((,) zwischen den beiden gestuften Abschnitten der Zinken etwa gleich dem Außendurchmesser des Gefüßdeckcls (12b) des Züchtgefäßes (12) und der Abstand (I₂) zwischen den beiden Innenflächen der Zinken angenähert gleich dem Außendurchmesser des Hauptteils (12a) des Züchtgefäßes (12) ist.