DE2628006A1

DE2628006A1 - Tridecapeptid mit gastrinwirkung

Info

Publication number: DE2628006A1
Application number: DE19762628006
Authority: DE
Inventors: Erich Prof Dr Wuensch
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 1976-06-23
Filing date: 1976-06-23
Publication date: 1977-12-29
Also published as: US4117117A; FR2355805A1; JPS6228800B2; JPS5318563A; CH636343A5; FR2355805B1; DE2628006C2

Description

Patentanwälte-

Or. Franz Lederer
Dip!--!ng. Reiner F. Meyer

8000 München 80

Lucile-Grahn-Str. 22, Tel. (0S9) 472947

MP 4105/21

Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.v._r Göttingen/Bundesrepublik Deutschland

Tridecapeptid mit Gastrinwirkung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Tridecapeptid mit Gastrinwirkung der Formel L-Leucyl-L-glütamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-alanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-L-phenylalaninamid, seine Salze und geschützten Derivate , sowie Verfahren zu seiner Herstellung.

Weiter betrifft die vorliegende Erfindung therapeutische und diagnostische Mittel, welche dieses neue Tridecapeptid und/

oder seine Salze enthalten.

Das erfindungsgemässe Tridecapeptid bewirkt wie das natürlich vorkommende Gastrin eine Anregung der Sekretionstätigkeit des Magens und des Pankreas. Es kann - wie Gastrinsowohl als Therapeutikum zur Stimulierung der HCl-Sekretion des Magens als auch als Diagnostikum zur Bestimmung des HCl-SekretionsVermögens oder zur immunologischen Gastrinbestimmung verwendet werden.

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Hen/ 4.6.1976 ORIGINALiNSPECTED

Wie bei allen Naturstoffen besteht bei Gastrin das Problem, dass seine Isolierung aus beispielsweise tierischen Organen sehr zeit - und kostenaufwendig ist und nur in minimalen Ausbeuten gelingt. Auch die Synthese von Gastrin (siehe Beacham,Nature 2Oj) ; p. 585,1966) ist wegen der relativ hohen Anzahl von Aminosäuren ,welche dieses Peptid enthält, relativ aufwendig.

Aus diesem Grund wurde versucht Gastrin durch Gastrinanaloga mit weniger Aminosäuren (Pentapeptide, Heptapeptide) zu ersetzen. Derartige Peptide haben jedoch den Nachteil, dass sie im Verhältnis zu Gastrin eine relativ geringe Aktivität aufweisen und durch die Leber sehr schnell inaktiviert werden (siehe U.T. Strunz et al, Gastroenterology, 7O₇ A-83/ 941; 1976).

Gemäss vorliegender Erfindung ist es nun gelungen ein neues Polypeptid zu synthetisieren, welches nur 13 Aminosäuren enthält und dennoch eine befriedigende Gastrin-Aktivität besitzt

und nur langsam durch die Leber inaktiviert wird.

Das erfindungsgemässe Tridecapeptid unterscheidet sich von dem gemäss Gregory et al, Gut, 13, 683-685^,1974 in der Natur neben Gastrin vorkommenden Tridecapeptid Minigastrin, dadurch, dass der in 11-Stellung bei dem natürlichen Minigastrin vorhandene Methioninrest durch den Leucinrest ersetzt ist. Das erfindungsgemässe Tridecapeptid (nachstehend als 11-Leucin-Minigastrin bezeichnet) besitzt gegenüber dem natürlichen Minigastrin den Vorteil einer besseren Stabilität und einer leichteren Zugänglichkeit.

Genauer gesagt, betrifft - wie anfangs erwähnt - die vorliegende Erfindung ein Tridecapeptid der Formel L-Leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-alanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-L- phenylalaninamid sowie seine Salze und seine geschützten Derivate.

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Der Ausdruck. "Salze" umfasst die in der Peptidchemie üblichen Salze wie z.B. Salze mit anorganischen Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Perchlorsäure und dgl. oder mit organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Malein-, Aepfel-, Wein- oder Citronensäure und dgl.

Der Ausdruck "geschützte Derivate" umfasst die mit den in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen versehenen Derivaten.

Beispiele für Aminoschutzgruppen sind solche vom Acyl-Typ (wie Formyl, Phthalyl, Trifluoracetyl, p-Tosyl, Aryl- und Alkylphosphoryl, Phenyl- und Benzylsulfonyl, Tritylsulfenyl, o-Nitrophenylsulfenyl, γ-Chlorbutyryl oder o-Nitrophenoxyacetyl), vom Alkyl-Typ (wie Trityl, Benzyl, Alkyliden) oder vom Urethan-Typ (wie Carbobenzoxy, p-Brom-, p-Chlor- oder p-Methoxycarbobenzoxy, ToIyloxy-, Allyloxy-, Cyclopentyloxy-, Cyclohexyloxy-, t-Butyloxy- oder 1,1-Dimethylpropyloxy-, 2-(p-Biphenylyl)-2-propyloxy-carbonyl oder Benzylthiocarbonyl , oder 1-Adamantyloxycarbonyl), usw.

Beispiele für Amidschutzgruppen sind Xanthenyl, 2,4-Dimethoxybenzyl, 2,4,6-Trimethoxybenzyl und 4,4'-Dimethoxybenzhydryl und dgl.

Beispiele für CarboxyIschutzgruppen sind O- und S-Ester (wie Methyl-, Aethyl-, t-Butyl-, Benzyl-, Cyanomethyl-, Phthalimidomethyl-, 4-Picolyl-, 2-p-Tosyläthyl-, Phenyl-, p-Nitrophenyl-, Thiophenyl- oder p-Nitrobenzy!ester), Amide oder Hydrazide (wie Trityl-, Phenyl-, Carbobenzoxy- oder t-Butoxycarbonylhydrazide). Ferner kann die Carboxylgruppe durch Salzbildung geschützt werden.

Auch der Rest eines polymeren Trägers kann als Carboxyl- oder als Amidschutζgruppe betrachtet werden.

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Die Herstellung des erfindungsgemässen Tridecapeptids sowie seiner Salze oder geschützten Derivate kann auf eine in der Peptidchemie üblichen Weise erfolgen.

Im wesentlichen beruhen jedoch alle Herstellungsmethoden auf der aufeinanderfolgenden Kondensierung von Aminosäuren oder geschützten Polypeptiden, wobei diese Kondensierung nach an sich bekannten Methoden durchgeführt wird.

Das erfindungsgemässe Tridecapeptid kann dadurch hergestellt werden, dass man

a) eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer anderen Aminosäure oder Peptid kondensiert, wobei die Aminogruppe und Carboxylgruppen, die nicht an der Bildung der Peptidbindung beteiligt sind, gegebenenfalls durch eine geeignete Schutzgruppe blockiert sind, so dass das Tridecapeptid mit der gewünschten Folge von Aminosäuren erhalten wird; und

b)' gegebenenfalls die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet und/oder

c) erwünschtenfalls das erhaltene Tridecapeptid in ein Salz überführt.

Zum Beispiel kann die Kondensation zwischen der freien Aminogruppe eines Moleküls und der freien Carboxylgruppe eines anderen Moleküls in der Anwesenheit eines geeigneten Kondensationsmittels, wie z.B. eines Carbodiimids aus den Gruppen: Dicyclohexy!carbodiimide, l-Cyclo-hexyl-S-morpholinyl-carbodiimide und anderen aus der Literatur bekannten Kondensationsmitteln,

direkt durchgeführt werden. Mit Vorzug erfolgt die Kondensation in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid unter Zusatz von die

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Racemisierung unterdrückenden 1,2-Dinucleophilen, wie z.B. N-Hydroxybenzotriazol oder N-Hydroxysuccinimid.

Weiter kann die Kondensierung auch über ein geeignetes aktiviertes Acylderivat wie z.B. gemischte Anhydride, Azide, p-Nitrophenyl-ester, 2,4,5-Trichlorphenylester, oder N-Hydroxysuccinimidylester, erfolgen.

Zweckmässig erfolgen die Umsetzungen in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in einem polaren organischen Lösungsmittel, wie etwa Dimethylformamid, Dimethylsulf- IQ oxyd, Acetonitril, halogenierten Kohlenwasserstoffen, wie Dichlormethan, Chloroform und dgl. Die Umsetzung erfolgt auch zweckmässig bei einer Temperatur unterhalb Raumtemperatur.

Die Schutzgruppen werden mittels bekannter Reaktionen entfernt, wie durch Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak, Hydrierung (z.B. in Gegenwart eines Palladium/Aktivkohle-Katalysators) , Behandlung mit Halogenwasserstoffen, wie Bromwasserstoff oder Chlorwasserstoff, in Essigsäure oder Behandlung mit Trifluoressigsäure,Trifluormethylsulfosäure, Borsäure-trifluoressigsäure-tris-anhydrid, gegebenenfalls unter Zusatz von Kationenfängern, wie beispielsweise Anisol und Thiolen.

Zur Herstellung der freien Amine aus deren Salzen z.B. nach einer Behandlung mit Halogenwasserstoff in Essigsäure wird beispielsweise das Hydrobromidsalz entweder mit einem Ionenaustauscher behandelt oder mit einer anorganischen oder organischen Base wie z.B. einem tert.-Amin, wie Triäthylamin, neutralisiert.

Die Art der Reinigung des erhaltenenen Tridecapeptids ist nicht kritisch. Mit Vorteil erfolgt jedoch die Reinigung durch Chromatographie, beispielsweise an Sephadex,oder durch multiplikative Verteilung.

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Mit Vorzug wird jedoch das erfindungsgemässe Tridecapeptid hergestellt indem man

a) tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucy1-L-glutamy1-(γ-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutaminsäure- (y-tert.-butylester) mit

L-Alanyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-glycyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl (/3-tert.-butylester) -L-phenylalaninamid verknüpft;

b) die vorhandenen Schutzgruppen durch Behandlung mit Trxfluoressxgsäure abspaltet

c) anschliessend reinigt und das erhaltene Produkt in sein Ammoniumsalz überführt.

Wie anfangs erwähnt kann das erfindungsgemässe 11-Leucin-Minigastrin in vivo sowohl zur Stimulierung als zur Bestimmung des HCl-Sekretionsvermögens im Magen nach der von R. Ottenjann/ Klinische Gastroenterologie,Editor L. Demling, Thieme Verlag 1973,geoffenbarten Methode verwendet werden.

Die vorliegende Anmeldung betrifft somit ein Mittel mit Gastrinwirkung enthaltend 11-Leucin-Minigastrin und/oder seine pharmazeutisch verwendbaren Salze als wirksame Komponente.

Die Dosierung soll nach dem individuellen Bedarf geregelt

werden und kann zwischen 5 μg bis 500 μg vorzugsweise 50 bis 300 \iq pro Einzeldosis, ein- bis mehrmals pro Tag verabreicht, variieren.

11-Leucin-Minigastrin sowie dessen pharmazeutisch verwendbaren Salze können als Heilmittel oder als Diagnostikum in Form von Präparaten Verwendung finden, welche diese Produkte in Mischung mit einem für die enterale oder

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parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen inerten Trägermaterial, wie z.B. Wasser, Gelatine, Gummi arabicum, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche OeIe, Polyalkylenglykol, Vaseline usw. enthalten. Die Präparate können in fester Form, z.B. als Tabletten, Dragees, Suppositorien, Kapseln? oder in flüssiger Form, z.B. als Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Emulsionen, vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder XO Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes oder Puffer. Bevorzugte Verabreichungsformen sind Lösungen (Ampullen), Tabletten und intranasale Sprühlösungen.

Weiter besitzt das erfindungsgemässe 11-Leucin-Minigastrin eine starke Immunreaktivität und kann in immunologischen Methoden zum in vitro Nachweis von Gastrin und/oder Minigastrin in Flüssigkeiten eingesetzt werden.

Die folgenden Beispielen sollen die Erfindung näher erläutern. In diesen Beispielen werden die folgenden, in der Peptidchemie üblichen Abkürzungen und Symbole verwendet:

Aminosäureabkürzungen, gebildet aus 3 Buchstaben, bei denen es sich in der Regel um die 3 Anfangsbuchstaben handelt.

Zahlenangaben in Klammern, die die Stellung innerhalb der Polypeptidkette wiedergegeben, und die keinen weiteren Zusatz erhalten, wenn die betreffende Verbindung nicht in Form eines weiteren Derivats nochmals auftritt, die jedoch fortlaufend mit dem Zusatz a, b, c usw. versehen werden,wenn von a ausgegangen wird und weitere Derivate hergestellt werden,

L als Angabe der Konfiguration, Z für den Benzyloxycarbonylrest (verwiesen sei z.B. auf Bergmann et al. in "Berichte d. Dtsch. Chem.

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Ges.", Bd. 65, 1932, 1192 ff.), SU für den N-Hydroxysuccinimidrest, tBu für den tert.-Butylrest,
BOC für den tert.-Butyloxycarbonylrest (vgl. z.B.

McKay et al in "J. Am. Chem.Soc." Bd. 79, 1957,

S. 4686 und Anderson et al. in "J.Am.Chem.Soc." Bd. 79, 1957, S. 6180).

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Beispiel 1

Herstellung des Fragments I (Teilsequenz 1-6) Die experimentelle Durchführung war wie folgt.

a) Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutaminsäure(y-tert.-butylester)-methylester (5-6a).

71,0 g (280 mMol) H-GIu(OtBu)-OMe χ HCl und 39,2 ml (280 mMol) Triäthylamin in 1 1 Dioxan werden bei 10°C mit 121,5 g (280 mMol) Z-GIu(OtBu)-OSU versetzt. Die Reaktionsmischung wird nach 12stdg. Rühren im Vak. eingedampft, der verbleibende Rückstand zwischen Essigester und Wasser verteilt, die abgetrennte Essigesterphase nacheinander mit 10% Kaliumhydrcgencarbonat-, 5% Kaliumhydrogensulfat-Lösung und Wasser gewaschen. Nach dem Troc kien über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel im Vak. eingedampft und der Rückstand aus Essig-

ester/Diisopropylather umgefällt. Schmp. 48-5O°C? [cc]^⁰ = -18,1° bzw. [a]5°₆ = -21,5° (c = 1, in Methanol).

b) Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutaminsäure(y-tert.-butylester) (5-6b).

125 g (233 mMol) Z-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-OMe (5-6a) in 20' 750 ml Dioxan/Wasser (9:1) werden unter Rühren mit 233 ml In Natriumhydroxid-Lösung titrimetrisch bei 20°C verseift. Nach Ansäuern der Lösung mit der äquiv. Menge In Salzsäure dampft man das Dioxan in Vak. weitgehend ab, nimmt den erhaltenen Rückstand in Essigester auf, extrahiert die organische Phase erschöpfend mit verd. Kaliumhvdroqencarbonat-Lösung und führt schliesslich nach dem Ansäuern der vereinigten Extrakte erneut in Essigester über. Die organische Phase wird mit Wasser säure frei gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und dann im Vak.

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eingedampft; Ausbeute 115,0 g (94% d.Th.).

Eine analytische Probe wird aus Diäthyläther als Dicyclohexylamin-Salz gefällt und aus Methanol/Diäthyläther umkristallisiert. Schmp. 145-147°C; Ca]J⁰ = -2,2° bzw. Ca]^₆ = -2,6° (c = 2, in Methanol); Ausbeute 88% d.Th.

c) L-GIutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutaminsäure(γ-tert.-butylester) (5-6c).

115 g (220 mMol) Z-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-OH(5-6b) in 2 95% Methanol werden in Gegenwart von Palladiumschwarz hydriert. Nach beendeter Reaktion wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vak. zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird aus Methanol/Diäthyläther umkristallisiert. Schmp. 194-195°C; Ca]J⁰ = +25,2° bzw. Ca]?⁰,- = +29,2° (c = 1, in Methanol).

d) Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutaminsäure(γ-tert.-butylester) (4-6a)

Zu 77,7 g (200 mMol) H-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-OH (5-6c) in 1 1 Dimethylformamid werden bei 0°C 28 ml (200 mMol) Triäthylamin, 86,9 g (200 mMol) Z-GIu(OtBu)-OSU und anschliessend 16,2 ml (200 mMol) Pyridin gegeben. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden bei O⁰C und anschliessend 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und im Vak. eingedampft. Der feste Rückstand wird zwischen Essigester und verd. Kaliumhydrogensulfat-Lösung verteilt, die abgetrennte Essigesterphase mit Wasser sulfat-frei gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird im Vak. zur Trockene gebracht und der Rückstand aus Essigester/ Diisopropyläther kristallisiert.
Schmp. 1O7-1O9°C; Ca]J⁰ = -8,5° bzw. Ca] j?°₆ = -9,7° (c = 1, in Dimethylformamid); Ausbeute 129,0 g (91% d.Th.).

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e) L-Glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutamyl(γ-tert.-butylester )-L-glutaminsäure(γ-tert.-butylester) (4-6b).

120 g (170 mMol) Z-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-OH (4-6a) in 2 1 80% Essigsäure werden in Gegenwart von Palladiumschwarz wie üblich katalytisch hydriert. Nach beendeter Reaktion wird das Filtrat im Vak. eingeengt und das Produkt mit Wasser gefällt, abfiltriert,mit Wasser gewaschen und zum Schluss im Vak. bei 40⁰C über KOH getrocknet. Schmp. 149-151°C; [a]p° = +9,3° bzw. [Cc]^₆ = +11,6° (c = 1, in 80% Essigsäure)? Ausbeute 95,0 g (98% d.Th.).

f) Benzyloxycarbony1-L-glutamy1(γ-tert.-butylester)-L-glutamyl (γ-tert.-butylester)-L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutaminsäure(γ-tert.-buty!ester) (3-6a).

90,0 g (157 mMol) H-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-OH (4-6b) in 1,5 1 Dimethylformamid werden nacheinander unter Rühren mit 22,0 ml (157 mMol) Triäthylamin, 68,2 g (157 mMol) Z-GIu(OtBu)-OSU und nach 2-stündigem Rühren bei 0°C mit 12,7 ml Pyridin versetzt. Nach weiteren 12 Stunden Reaktionsdauer bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel weitgehend abgedampft und der Rückstand zwischen Essigester und verd. Kaliumhydrogensulfat-Lösung verteilt. Die abgetrennte organische Phase wird anschliessend mit verd. Kaliumhydrogencarbonat-, Kaliumhydrogensulfat-Lösung und Wasser gut gewascher, und letztlich über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird im Vak. eingedampft und der Rückstand aus Essigester/Diisopropylather

umgefällt. Schmp. 128-13O°C; [cc]^⁰ =10,1° bzw. Ca]^₆ = -11,9° (c = 1, in Dimethylformamid); Ausbeute 123,0 g (88% d.Th.).

g) L-Glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutamyl(γ-tert.-butylester) -L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutaminsäure-(γ-tert.-butylester) (3-6b).

110 g (123 mMol) Z-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-GIu(OtBu) OH (3-6a) in 5 1 95% Methanol werden in Gegenwart von Palladium-

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schwarz als Katalysator hydriert. Nach beendeter Reaktion wird das Filtrat im Vak. eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Essigester gefällt. Schmp. 175-177°C; [a]^⁰ = -8,5° bzw. [a] C₄C- = -9,9 (c = 1, in Dimethylformamid); Ausbeute 92,0 g (98% d.Th.).

h) Benzyloxycarbonyl-L-glutamy1(γ-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-buty1-ester)-L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutaminsäure-(Y-tert.-butylester) (2-6a).

85,0 g (112 mMol) H-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-GIu(OtBu) GIu(OtBu)-OH (3-6b) und 15,7 ml (112 mMol) Triäthylamin in 3 1 Dimethylformamid werden unter Rühren bei 0°C mit 48,7 g Z-GIu(OtBu)-OSU und nach 2 Stunden mit 9,1 ml Pyridin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden bei 0°C und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vak. wird der erhaltene ölige Rückstand wie für (3-6a) beschrieben aufgearbeitet. Schmp. 169-171°C; ° = -10,6° bzw. Ca]^₆ = -12,6° (c = 1, in Dimethylformamid) j Ausbeute 109,0 g (90% d.Th.).

i) L-Glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-buty1-ester)-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutaminsäure(y-tert.-butylester) (2-6b).

35,Og (32,5 mMol) Z-GIU(OtBU)-GIu(OtBU)-GIu(OtBu)-GIu-(OtBu)-GIu(OtBu)-OH (2-6a) in 4 1 95% Methanol werden wie üblich in Gegenwart von Palladiumschwarz als Katalysator hydrogenolytisch entacyliert. Nach beendeter Reaktion wird das bei der Hydrierung zum Teil ausgefallene Produkt durch Erwärmen gelöst und die Lösung vom Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird im.Vak. zur Trockene gebracht und das Produkt aus

Methanol/Essigester gefällt. Schmp. 194-195°? [a]^⁰ = -7,2° bzw. Ca]54₆ = -8,2° (c = 1, in 80% Essigsäure); Ausbeute 28,7 g (93,5% d.Th.).

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j) tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-glutamyl(γ-tert.-

butylester)-L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutamyl-(γ-tert.-butylester) -L-glutamyl(γ-tert.-butylester) -L-glutarainsäure(y-tert.-butylester) (l-6a).

2,83 g (3,0 iriMol) H-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-

GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-OH (2-6b) in 100 ml Dimethylformamid werden mit 0,42 ml (3,0 mMol) Triäthylamin, 1,08 g (3,3 mMol) BOC-Leu-OSü und anschliessend mit Triäthylamin und 0.24 ml (3,3 mMol) Pyridin versetzt. Die Reaktionsmischung wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und letztlich wie für (3-6a) beschrieben, aufgearbeitet. Schmp. 225-227°C (Zers.)j ° = -23,4° bzw. la]fl₆ = -27,9° (c = 1, in Methanol).

Ausbeute 3,0 g (86% d.Th.).

Beispiel 2 Herstellung des Fragments II (Teilsequenz 7-13)

a) Benzyloxycarbonyl-L-alanyl-O-tert.-butyl-L-tyrosylglycyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl (ß-tert.-butylester)-L-phenylalaninamid (7-13a).

37,Og (55 mMol) H-Trp-Leu-Asp(OtBu)-Phe-NH₂ χ HCl (I0-I3b-Hydrochlorid) [hergestellt auf üblichem Wege aus Z-Trp-Leu-Asp(OtBu)-Phe-NH₂ nach hydrogenolytischer Decarbobenzoxylierung und Umfallen aus Methanol/Aether; siehe E. Wünsch et al.,Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 353, 1246, 1972)] und 27,5g (55 mMol) Z-Ala-Tyr(OtBu)-GIy-OH (7-9a) in 1 1 Dimethylformamid werden nach dem Abkühlen auf -1O°C nacheinander mit 6,05 ml (55 mMol) N-Methylmorpholin, 6,9 g (60 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 12,4 g (60 mMol) Dxcyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung wird noch 12 Stunden bei 0⁰C und anschliessend weitere 36 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.Nach dem Abkühlen wird vom Harnstoff abfiltriert und das Filtrat im Vak. eingedampft. Der Rückstand wird in 90% Methanol aufgeschlämmt und die Suspension bei 60⁰C 15min. gerührt. Das Produkt wird abge-

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saugt, mit warmen Methanol und letztlich mit Diäthylather gut gewaschen. Schmp. 223°C (Zers.); [c0_D = -29,8° bzw. [Ot]₅₄₆ = -35,6° (c = 1, in Dimethylformamid). Ausbeute 51,0 g (83% d.Th.).

b) L-Alanyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-glycyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl(ß-tert.-butylester)-L-phenylalaninamid (7-13b).

23,0 g (20,6 mMol) Z-Ala-Tyr(tBu)-Gly-Trp-Leu-Asp(OtBu)-Phe-NH2 (7-13a) in 1 1 Dimethylformamid werden wie üblich in Gegenwart von Palladiumschwarz als Katalysator unter gleichzeitigem Titrieren mit 0,27 η methanolischer Salzsäure bei pH 5,0 hydriert. Nach beendeter Reaktion wird das Filtrat im Vak. eingedampft und der feste Rückstand mit Diäthylather verrieben. Das Produkt wird abfiltriert, im Vak. über KOH getrocknet und anschliessend in 250 ml Dimethylformamid gelöst, mit 2,9 ml (20,6 mMol) Triäthylamin und 1 1 Wasser versetzt. Der dabei gebildete Niederschlag wird abgesaugt, gut mit Wasser und Diäthyläther gewaschen und schliesslich im Vak. getrocknet. Schmp. 2O3-2O4°C. Ausbeute= 19,8 g.

[oJn ⁼ ~²¹f°° bzw. [α] ς _&(. = -25,1° (c = 1, in Dimethylformamid), (98% d.Th.).

Beispiel 3 Kondensation der Fragmente I und II

tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-glutamyl(γ-tert.-butyl ester)-L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutamyl(γ-tert.-butyl ester)-L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-butyl ester)-L-alanyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-glycyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl(0-tert.-butylester)-L-phenylalaninamid

0,6 g (0,61 mMol) H-Ala-Tyr(tBu)-Gly-Trp-Leu-Asp(OtBu) Phe-NH₂ (7-13b) und 1,06 g (0,92 mMol) BOC-Leu-Glu(OtBu)-GIu-

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4t

(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH (l-6a) in 10 ml Dimethylacetamid und 3 ml Hexamethylphosphorsäuretrisamid werden nach Abkühlen auf -10⁰C nacheinander mit 0,116 g (1,01 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 0,190 g (0,92 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung wird Stunden bei 4°C und anschliessend 43 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und letztlich in 90 ml Methanol gegossen. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und in 200 ml Methanol auf geschlämmt. Die Suspension wird 5 min. bei 60 C und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das abfiltrierte Produkt wird mit Methanol und Diäthylather gewaschen und im Vak. getrocknet. Schmp. 255°C; [α]^° = -13,5° bzw. Ca]^₆ = "16/2° (c = 1, in Hexamethylphosphorsäuretrisamid)y Ausb. 1,07 g (83% d.Th.).

0,99 g (0,466 mMol) BOC-LeU-GIU(OtBu)-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-GIu (OtBu)-GIu(OtBu)-Ala-Tyr(tBu)-Gly-Trp-Leu-Asp(OtBu)-Phe-NH₂ (l-13a) werden unter Argonatmosphäre mit 50 ml Trifluoressigsäure und 5 ml Anisol übergössen und 90 min. bei Raumtemperatur stehengelassen; hierbei tritt Lösung ein. Anschliessend wird die Reaktionsmischung mit viel Diäthylather Übergossen und der dabei gebildete Niederschlag abfiltriert, gut mit Diäthyläther gewaschen und im Vak. über KOH getrocknet. Man erhält L-Leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-alanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-L-phenylalaninamid (l-13b) in Form eines farbloses amorphen Pulvers welches in 0,5 η Ammoniumhydroxidlösung aufgenommen und lyophylisiert wird. Ausb. 0,763 g (96% d.Th. ber. für 5 X Ammoniumsalz).

Beispiel 4

Reinigung von 11-Leucin-Minigastrin a) Ionenaustauscherchromatographie an DEAE-Sephadex A-25:

In eine Chromatographiesäule von 28 cm Länge und 3 cm Durchmesser wird ein wie üblich mit Startpuffer (0,5 m Ammonium-

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acetat-Lösung, p„ 8,5) äquilibrierter Ionenaustauscher DEAE-Sephadex A-25 (Acetat-Form) gefüllt. Man bringt eine Lösung von 720 mg des rohen 11-Leucin-Minigastrins (Peptidgehalt: 83,5 %; ermittelt durch quantitative Aminosäureanalyse) in 12 ml 0,5 m Ammoniak-Lösung auf die Säule und eluiert mit dem Startpuffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 166 ml/Std.. Das Eluat fängt man in Portionen von je 125 ml in den Zellen eines Fraktionssammlers (Serva-Linear II) auf, wobei die Peptidverteilung durch kontinuierliche Registrierung der , Extinktion der Lösung bei 278 nm (LKB-Uvicord III) ermittelt wird. Durch dreimaliges Lyophilisieren (zweimal aus 0,5 %-igem Ammoniak) werden aus den Fraktionen 48-82 577 mg vorgereinigtes Il-Leucin-Minigastrin isoliert.

b) Verteilungschromatographie an Sephadex G-25; Lösungsmittelsystem;

Zu einer Mischung von 2 1 speziell gereinigtem [vgl. E. Wünsch et al., Hoppe Seyler's Z.Physiol.Chem. 353, 1716-1720 (1972)] sec.-Butanol, 100 ml abs. Aethanol und 2 0,1 m Ammoniumacetat-Lösung (hergestellt aus 0,1 m Essigsäure durch Zugabe von Ammoniak, bis ρ₀ 5,4 erreicht ist) wird solange Essigsäure gegeben, bis die Unterphase nach Schütteln einen p„-Wert von 6,0 aufweist.

Durchführung der Trennung:

In eine Säule von 143 cm Länge und 3 cm Durchmesser werden 200 g in der Unterphase des obigen Zweiphasensystems mehrere Stunden gequollenes Sephadex G-25 (fine) gefüllt? nach Aequilibrieren mit 160 ml Oberphase bringt man eine Lösung von 200 mg des vorgereinigten (siehe unter a) 11-Leucin-Minigastrins in einer Mischung von 10 ml Oberphase und 0,5 ml 3%-igem Ammoniak auf die Säule (geringe Mengen unlöslicher Anteile trennt man vorher durch Zentrifugieren ab) und eluiert dann mit Oberphase bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 50 ml/Std.,

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XO

Das Eluat fängt man in Portionen von je 50 ml in den Zellen eines FraktionsSammlers auf (Serva-Linear II), wobei die Peptidverteilung durch kontinuierliche Registrierung der Extinktion • der Lösung bei 254 nm (LKB-Üvicord I) ermittelt wird. Nach Vereinigen der Fraktionen 18-24 dampft man die Lösungsmittel in Vak. ab,löst danach den verbleibenden Rückstand in 20 ml 5%-igem Ammoniak und isoliert das Peptidmaterial durch Lyophilisieren. Nach zweimaligem Wiederholen des Gefriertrocknens aus 5%-igem Ammoniak (unlösliche Anteile werden vorher jeweils mittels Filtration durch eine G-4-Fritte abgetrennt) erhält man 110 mg reines, wasserhaltiges 11-Leucin-Minigastrin.

Beispiel 5

Es wurden in üblicher Weise Ampullenlösungen folgender Zusammensetzung hergestellt:

a) 11-Leucin-Minigastrin (Ammoniumsalz) 0,10 mg Mannit . 0,1 g

Wasser zu Injektionszwecken ad 2,0 ml

b) 11-Leucin-Minigastrin (Ammoniumsalz) 0,20 mg

Mannit 0,1 g

Wasser zu Injektionszwecken ad 2,0 ml

Beispiel 6

Es wurden in üblicher Weise Wirkstofftrockenampullen hergestellt, enthaltend das Lyophilisat aus

11-Leucin-Minigastrin (Ammoniumsalz) 0,22 mg

D-Mannit pyrogenfrei 10 mg

Wasser zu Injektionszwecken ad 1,0 ml

Zum Auflösung werden Solvensampullen mit folgendem Inhalt hergestellt:

D-Mannit pyrogenfrei 113 mg

Wasser zu Injektionszwecken ad 2,4 ml

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Claims

Patentansprüche

1. / Verfahren zur Herstellung eines Tridecapeptids der allgemeinen Formel L-Leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-alanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-L-phenylalaninamid, seine Salze und geschützten Derivate, dadurch gekennzeichnet, dass man

b) gegebenenfalls die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet und/oder

c) erwünschtenfalls das erhaltene Tridecapeptid in ein Salz überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-glutamyl-(γ-tert.-butylester) -L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutamyl(γ-tert.-butylester)-L-glutaminsäure- (γ-tert.-butylester) mit

L-Alanyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-glycyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl (/3-fcert.-butylester) -L-phenylalaninamid verknüpft;

b) die vorhandenen Schutzgruppen durch Behandlung mit Trifluoressigsäure abspaltet

⁰RiGINAL /NSPECTED

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3. Tridecapeptid der allgemeinen Formel L-Leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl—L-alanyl-L-tyrosyl- glycyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-L-phenylalaninamid, seine Salze und seine geschützten Derivate.

4. Tridecapeptid nach Anspruch 3 in ungeschützter Form.

5. Tridecapeptid nach Anspruch 3 oder 4 in Form eines Salzes.

6. Tridecapeptid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz ein Ammoniumsalz ist.

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7. Mittel mit Gastrinwirkung enthaltend L-Leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-alanyl-L-tyrosylglycyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-asparagyl-L-phenylalaninamid -. ^und/oder seine pharmazeutisch verwendbaren Salze.

/ '¹BiJ" 8 r*=·—»~Zür £'c'rf/ ^caf.c-.

9. Verwendung eines Mittels gemäss Anspruch 7, zur Bestimmung des HCl-Sekretionsvermögens des Magens.

10. Verwendung von L-Leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-alanyl-L-tyrosyl-glycyl-L-tryptophyl-L- leucyl-L-asparagyl-L-phenylalaninamid zum immunologischen Nachweis von Gastrin bzw. Minigastrin.

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