DE2660114B1

DE2660114B1 - Verfahren zur Herstellung neuer 7alpha beta-Methylhexahydro-1,(5)-indan(di)on-Verbindungen unter Verwendung von Mikroorganismus-Mutanten

Info

Publication number: DE2660114B1
Application number: DE2660114A
Authority: DE
Inventors: Knight John Costain; Wovcha Merle Gene
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1975-11-17
Filing date: 1976-11-17
Publication date: 1980-03-20
Also published as: IE44670L; JPS55131395A; IL50894A0; US4039381A; GB1570621A; DD128789A5; NL169196C; PL106849B1; JPS561882A; NL7612755A; FR2333043A1; JPS5629996B2; DE2660114C2; CH634350A5; DE2652377C3; JPS5264489A; JPS5934353B2; US4098647A; DE2652377B2; DE2652377A1

Description

- H - 4* - [3' - Propanol] - 7ap' - methylhexahydro-1,5-indandion-Hemiketal

und 3a-x-H-4\-[3'-Propanol]-5\-hydroxy-7ap'-methylhexahydro-1 -indanon

(IV)

HO

anhäufen, erhält man nach den im folgenden näher erläuterten Mutationsmaßnahmen oder anderen Mutationsmaßnahmen aus Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, vorzugsweise Mycobacterium. Beispiele für Arten dieser Gattungen sind M. phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum, M. fortuitum und M. butyricum.

Beispiele für zum Abbau geeignete Steroide sind Sitosterine, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin und dergleichen mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-l,4-dien-3,l7-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron. Diese Steroidsubstrate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.

ORIGINAU INSPECTED

Für den Erfindungszweck wurde als ein von vielen möglichen Beispielen in der später beschriebenen Weise die Art Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 zu einer neuen Laboratoriumsmikroorganismusmutante mutiert. Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: »J. C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1 :1 (1936). Medium 90 37 C«. M. fortuitum ATCC 6842 baut Sterine nicht selektiv zu niedrigmolekularen Verbindungen, beispielsweise CO2+H2O, ab. Somit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau.

Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 mittels Nitrosoguanidin erhält man eine neue Mutante, die selektiv Steroide mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der Gärbrühe zu hauptsächlich Verbindungen der Formeln I und IV abzubauen vermag. Dieser Mikroorganismusmutante von M. fortuitum wurde durch die deutsche Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung, Göttingen, die Nummer DSM 775 zugeteilt.

Die Morphologie und die Chemikalien- bzw. Drogenempfindlichkeit von M. fortuitum DSM 775 sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsart M. fortuitum ATCC 6842 nicht zu unterscheiden. Beide M. fortuitum-Kukuren stellen säurefeste, unbewegliche, nicht-sporenbildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Nach der Runyon's Klassifizierung (vgl. E. H. Runyon »Med. Clin. North America«, 43, 273 [1959]) handelt es sich um ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendes Mycobycterium, d. h. es wächst rasch bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht-pigmentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien.

M. fortuitum ATCC 6842 und M. fortuitum DSM 775 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nicht-selektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum DSM 775 erfolgt dagegen ein selektiver Abbau der Steroide. Diese Eigenschaft von M. fortuitum DSM 775 stellt eine in hohem Maße wertvolle Eigenschaft dar.

Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 zu M. fortuitum DSM 775 erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmaßnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Mutationsmaßnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutations- und Umwandlungs- bzw. Transformationsmaßnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder äquivalente Maßnahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden.

Die erfindungsgemäß selektive Umwandlung läßt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum DSM 775 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem Nährmedium vor dem Beimpften bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/l. Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stick-Stoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Rohrzukker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maisquellflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Casein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochen-" > abfalle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt zu werden, da vor der Sterilisation des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.
Das Umwandlungsverfahren dauert etwa 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur während des Umwandlungsverfahrens reicht von etwa 25° bis etwa 37⁰C und beträgt vorzugsweise 30⁰C. Der Inhalt des Umwandlungsgefäßes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des Mikroorganismus bewegt. Auf diese Weise läßt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.

Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittel-

systems aus 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, wird das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert. So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschließlich der Gärbrühe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat, Benzol und dergleichen, vorzugsweise Methylenchlorid.

Andererseits können die Gär- bzw. Fermetationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, voneinander getrennt und dann getrennt mit geeigneten

so Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gär- oder Fermentationsbrühe läßt sich mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.

Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der die gewünschten umgewandelten Steroide enthaltende Rückstand kann dann in einem 10% Chloroform enthaltenden handelsüblichen Hexanisomerengemisch gelöst und auf Silikagel chromatographiert werden, wobei als Entwicklerlösungsmittel das handelsübliche Hexanisomerengemisch und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen an Äthylace-

tat verwendet werden. Hierbei läßt sich die Verbindung der Formel I eluieren. Die Verbindung der Formel IV läßt sich beispielsweise durch 5% Methanol enthaltendes Äthylacetat eluieren. Kristalline Produkte erhält

man bei Verwendung eines Lösungsmittels, beispielsweise von Äthylacetat. Die Lösung kann dann auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Entfernung des angefallenen Steroids filtriert werden. Die gewünschten umgewandelten Steroide lassen sich auch aus der überstehenden Flüssigkeit nach Verdampfen des darin enthaltenen Lösungsmittels gewinnen.

Die Verbindungen der Formeln I und IV eignen sich als Zwischenprodukte bei der chemischen Synthese wertvoller Steroide. So können sie beispielsweise in die bei dem aus der US-PS 38 80 884 bekannten Verfahren zur Totalsynthese wertvoller 19-Norsteroide verwendeten Ausgangssubstanzen umgewandelt werden. Diese Umwandlung in die a. a. O. genannten Ausgangssubstanzen läßt sich in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Oxidation mit Chromsäure in Essigsäure und anschließende Nachbehandlung mit Essigsäureanhydrid und Natriumacetat bewerkstelligen (vgl. »Biochem.« 2,1238 bis 1243 und »J. Am. Chem. Soc. 85,2135 bis 2137).

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben »Gewichtsprozente«. Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nichts anderes angegeben, »Volumina«.

Beispiel 1

Herstellung der Mutante M. fortuitum DSM 775 aus jo M. fortuitum ATCC 6842:

a) Nitrosoguanidin-Mutagenese

Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur von 28° C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen:

FeSO₄ · 7 H₂O

mit destilliertem Wasser

aufgefüllt auf

0,001 g/l
11

Nährbrühe (Difco)	8 g/l
Hefeextrakt	lg/1
Natriumpropionat	0,5 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf	11

Der pH-Wert des Mediums wird mit 1 n-NaOH vor einer 20minütigen Sterilisation bei 121 ° C auf 7,0 eingestellt.

Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa 5 χ 10⁸/ml wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1 m-Natriumcitrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d.h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schließlich wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugesetzt. Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 37⁰C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1 m-Kaliumphosphats eines pH-Wert von 7,0 gewaschen. Schließlich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:

NH4NO3
K₂HPO₄
MgSO₄ · 7 H₂O
NaCl

1,0 g/i

0,25 g/l
0,25 g/l
0,005 g/l

resuspendiert. Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20minütigen Sterilisieren bei 121 °C mit In-HCl auf 7,0 eingestellt. Endlich werden die Zellen zur Auswahl der Mutante ausgebreitet.

b) Auswahl und Isolierung der Mutante
M. fortuitum DSM 775

Die in der geschilderten Weise mutagenisierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiert nach Fräser und Jerrel, 1963 »J. Biol. Chem.«, 205,291 bis 295):

Glyzerin 10,0 g/l

Na₂HPO₄ 8,4 g/l

KH₂PO₄ 4,5 g/l

NH₄Cl 2,0 g/l

MgSO₄ · 7 H₂O 0,3 g/l

FeCl₃ · 6 H₂O 0,05 g/l
mit destilliertem Wasser

aufgefüllt auf 1 1

Nach Zugabe von 15 g/l Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoklav auf eine Temperatur von 121⁰C erhitzt und dann in sterile Petrischalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutageneseverfahren gebildeten Nährauxotrophe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7tätiger Inkubation bei einer Temperatur von 28⁰C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollblatt repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G. E. Peterson, H. L. Lewis und J. R. Davis »Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media«, J. Lipid Research 3, 275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/l Agar und 1,0 g/l eines geeigneten Kohlenstofflieferanten werden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 121° C im Autoklav erhitzt wird. Das sterile, heiße Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäß gegossen, mehrere min lang durchgemischt und schließlich in sterile Petrischalen gegossen. Bei diesen Maßnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch durch Durchmischen des heißen Gemischs und durch Abflammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleichmäßige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird.

Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden Testplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt. Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 28° C werden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter

40

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50

55

Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet. Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen Phenotypus aufweisen, werden dann in Schüttelflaschen ausgewertet.

c) Schüttelflaschenauswertung

Es werden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glyzerin	10,0 g/l
Na₂HPO₄	8,4 g g/l
KH₂PO₄	4,5 g/I
NH₄Cl	2,0 g/I
MgSO₄ · 7 H₂O	0,3 g/l
FeCl₃ ■ 6 H₂O	0,05 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf	11

Nährbrühe (Difco)	8 g/l
Hefeextrakt	lg/1
Glyzerin	5 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf	11

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Hierauf werden in das Medium 1 g/I Sojamehl und dann 10 g/l Sitosterin eingemischt. Nach 20minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklav auf 121⁰C werden sie auf 28° C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts beimpft:

Die vereinigten Isolate auf Stufe b) werden bei einer Temperatur von 28° C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatmediums der folgenden Zusammensetzung:

wird eine von einem geneigten Agar entnommene öse voll Zellen verwendet.

Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 20minütigen Erhitzen der Flaschen auf 121⁰C in einem Autoklav mit In-NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28° C inkubiert.

Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500-ml-FIaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 30° C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit 3 Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d. h. 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit von Verbindungen der Formeln I und IV bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch die neue Mutante aus dem Muttermycobacterium M. fortuitum ATCC 6842.

Beispiel 2

Umwandlung von Sitosterin zu Verbindungen der
Formeln I und IV

Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel Ic). Dieses Medium wird durch 30minütiges Erhitzen auf 121⁰C sterilisiert, dann auf 30⁰C abgekühlt und schließlich mit 10 Teilen einer Saatkultur der Mutante-Mycobacterium M. fortuitum DSM 775, die entsprechend Beispiel Ic) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegung 336 h lang bei einer Temperatur von 30⁰C zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wird durch Diatomeenerde filtriert, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der hierbei angefallene Destillationsrückstand wird in einem 10% Chloroform enthaltenden, handelsüblichen Hexanisomerengemisch aufgenommen und auf Silikagel Chromatographien, wobei als Entwicklerlösungsmittel das handelsübliche Hexanisomerengemisch und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen Äthylacetat verwendet werden. Hierbei kann man die Verbindung der Formel I eluieren. Die Verbindung der Formel IV läßt sich aus der Säule mit 5% Methanol enthaltendem Äthylacetat eluieren. Die Reihenfolge des Eluierens der Verbindungen ist I-»- IV. Die Rf-Werte der erhaltenen Verbindungen auf einem Dünnschichtchrqmatogramm unter Verwendung eines 3 :2-Cyclohexan/Äthylacetat-Gemischs betragen:

I =0,37
IV = 0,05

Auf dünnschichtchromatographischem Wege ermittelte geeignete Fraktionen werden gesammelt und zur Trockene eingedampft, wobei die Verbindungen der Formel I und IV in guten Ausbeuten erhalten werden.

Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat fällt die Verbindung der Formel I in Form eines 1 :1-Epimerengemischs eines Fp. von 100° bis 112° C an. Die Verbindung der Formel IV besitzt einen Fp. von 148° bis 15O⁰C.

Auf einem Dünnschichtchromatogramm zeigt sich, daß 3aa-H-4a-[3'-PropanaI]-5«-hydroxy-7aj8-methylhexahydro-1-indanon, Hemiacetal und 3a«-H-4a-[3' Propionsäure]-5a-hydroxy-7a|3-methylhexahydro-l-indanon-<5-lacton in Spuren anwesend sind.

Beispiel 3

Auch bei Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Cholesterin erhält man die Verbindungen der Formeln I und IV.

Beispiel 4

Auch bei Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Stigmasterin erhält man die Verbindungen der Formeln I und IV.

Beispiel 5

Auch bei Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Campesterin erhält man die Verbindungen der Formeln I und IV.

Beispiel 6

Bei Zusatz einer Kombination aus den Steroiden der Beispiele 2 bis 5 zu Sitosterin oder bei Verwendung einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 5 anstelle des Sitosterins in Beispiel 2 erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I und IV.

Beispiel 7

Durch Ersatz von Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 durch einen sterinabbauenden Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces in Beispiel 1 erhält man Mikroorga-

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nismenmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung von Verbindungen der Formeln I und IV in der Gärbrühe auszeichnen.

Beispiel 8

Durch Ersatz der Mutante M. fortuitum DSM 775 in · Beispielen 2 bis 6 durch die gemäß Beispiel 7 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls Verbindungen der Formeln I und IV.

Beispiel 9

15

Durch Ersatz des M. fortuitum ATCC 6842 in Beispiel 1 durch einen sterinabbauenden Mikroorganismus der Gruppe Mycobacterium phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum und M. butyricum erhält man Mikroorganismenmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung von Verbindungen der Formeln I und IV in der Gärbrühe auszeichnen.

Beispiel 10

Durch Ersatz der Mutante M. fortuitum DSM 775 in Beispielen 2 bis 6 durch die gemäß Beispiel 9

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hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls Verbindungen der Formeln I und IV.

Beispiel 11

Beim Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Androst^-eji-S.l/rdiorvj. .. Androsta-l,4-dien-3,17-dion, DehydroepiaöärÖs'teioh oder Testosteron erhält man ebenfaiis3/trt>indungen der Formeln I und IV.

Beispiel 12

Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch eine Kombination aus zwei oder mehreren Verbindungen, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-l,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, erhält man ebenfalls Verbindungen der Formeln I und IV.

Beispiel 13

Durch Ersatz der Mutante M. fortuitum DSM 775 in Beispielen 11 und 12 durch die gemäß Beispiel 7 erhaltenen Mutanten erhält man ebenfalls Verbindungen der Formeln I und IV.

Beispiel 14

Durch Ersatz der Mutante M. fortuitum DSM 775 in Beispielen 11 und 12 durch die gemäß Beispiel 9 erhaltenen Mutanten erhält man ebenfalls Verbindungen der Formeln I und IV.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formeln:

ίο

und

HO

20

HO

dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mikroorganismusmutante aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von hauptsächlich 3aoc-H-4a-[3'-Propanol]-7aj3-methylhexahydro-l,5-indandion-Hemiketal und 3aa-H-4«-[3'-Propanol]-5a-hydroxy-7aj8-methylhexahy- dro-1-indanon in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismusmutante in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,l7-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandroseron oder Testosteron verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,l7-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, verwendet.

Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht. Die früheste einschlägige Arbeit stammt offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937 »Berichte« 70, 470 und »Berichte« 70,2079. A.a.O. wird über die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17j3-Hydroxysteroiden mit Hilfe von Gärhefe berichtet. Im Jahre 1952 (vgl. US-PS 26 02 769) berichten Peterson und Murray über die 11 oc-Hydroxylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 36 84 657) berichten Kraychy und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Androst-4-en-3,17-dion, Androst-l,4-dien-3,l7-dion und 20a-Hydroxymethylpregna-l,4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS 37 59 791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3,l 7-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.

Die Ringöffnungsform der Verbindung der Formel I, nämlich 7a-Methylperhydroindandion-(l,5)-[j3-propanol-(4)], ist von Schubert und Mitarbeitern jn »Steroids« 4, 581-586 (1964) als Zwischenprodukt beim Abbau von Progesteron durch Mycobacterium smegmatis erwähnt.

Mutanten, die durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnet sind und in der Gärbrühe vornehmlich Verbindungen der beiden Formeln