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DE2552570A1 - Chromogenes enzymsubstrat - Google Patents

Chromogenes enzymsubstrat

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DE2552570A1
DE2552570A1 DE19752552570 DE2552570A DE2552570A1 DE 2552570 A1 DE2552570 A1 DE 2552570A1 DE 19752552570 DE19752552570 DE 19752552570 DE 2552570 A DE2552570 A DE 2552570A DE 2552570 A1 DE2552570 A1 DE 2552570A1
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gly
benzoyl
glu
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DE19752552570
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Leif Erik Aurell
Karl Goeran Claeson
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Saab Bofors AB
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Bofors AB
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Publication date
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Description

Die Erfindung betrifft ein chromogenes Substrat für Serinproteasen. Diese Substrate sind insbesondere für die Bestimmung des Faktors Xa (E.C. 3. 4. 21. 6) oder für die Untersuchung von Reaktionen, die die Bildung, Inhibierung oder den Verbrauch von Xa verursachen, oder selbst für die Bestimmung solcher Faktoren, die derartige Reaktionen beeinflussen oder an ihnen teilnehmen, geeignet.
Der Faktor X ist eine Schlüsselsubstanz in der Reaktionsreihe, die zur Blutkoagulation führt. Die Aktivierung des Faktors X bewirkt die Bildung des proteolytischen Enzyms, des Faktors Xa, welches direkt für die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin verantwortlich ist. Für Diagnosen wäre es besonders wertvoll, wenn ein einfaches Verfahren zur Bestimmung des
60
i 0 I 9
Faktors Xa zur Verfügung stünde.
Die bisher verwendeten Reagenzien zur Bestimmung des Faktors Xa bestehen gewöhnlich aus Estersubstraten sehr unspezifischen Charakters. Ein Beispiel hierfür ist p-Nitrophenyl-p'-guanxdinobenzoat (p-NPGB), das ein gutes Substrat für Thrombin, Trypsin und Plasmin ist. Seine Anwendbarkeit für den Faktor Xa ist auf die Verwendung für gereinigte Enzymzubereitungen begrenzt. Die bei der Verwendung von Blut erhaltenen Ergebnisse sind nicht verwertbar, und zwar infolge der Anwesenheit von anderen Esterasen mit einer Aktivität für p-NPGB (R. L. Smith, J. Biol. Chem. 248, 2418 (1972) .
In der schwedischen Patentanmeldung Nummer 5757/72 sind sehr gut wirkende chromogene Amidsubstrate für Thrombin-ähnliche Enzyme beschrieben worden. Eines dieser Substrate mit der Formel Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid (S-2160) arbeitet gut bei Thrombin, wird jedoch bei der Verwendung mit dem Faktor Xa lediglich geringfügig gespalten. Die Suszeptibilität eines Substrats bezüglich Thrombin soll vernachlässigbar sein, wenn es in diagnostischen Blutanalysen für den Faktor Xa verwendet werden soll.
Die Bereitstellung eines für den Faktor Xa spezifischeren Substrats, das somit gegenüber der Spaltung durch Thrombin weniger empfindlich ist, wäre daher erwünscht. Das Substrat sollte die biologischen Funktionen des Enzyms, d.h. die
6 0 ■■■-.; ο ι 9
• · · 3
Spaltung von Amidbindungen, messen. Weiterhin ist es erwünscht, daß das Substrat rasch in leicht bestimmbare Produkte gespalten werden kann, z.B. in chromophore Verbindungen, die in leichter Weibe spektrophotometrisch verfolgt werden
können.
Die Substrate der Erfindung sind vom Amidtyp und weisen eine hohe Empfindlichkeit für den Faktor Xa auf. Sie entsprechen der allgemeinen Formel
R-. - A1 - A2 - GIy - Arg - NH - R2
in der R, ein Wasserstoffatom, eine Alkanoylgruppe mit 1-12 Kohlenstoffatomen, eine Cyclohexylcarbonylgruppe, eine
Benzoylgruppe, die gegebenenfalls mit einer, zwei oder mehreren Gruppen, z.B. Halogenatomen, Methylgruppen, Aminogruppen oder Phenylgruppen, substituiert sein kann, eine Benzolsulfonyl- oder eine Toluolsulfonylgruppe bedeutet, sowie R2 eine
Nitrophenyl-, Naphthyl-, Methoxynaphthyl-, Chinolyl- oder
Nitrochinolylgruppe, A1 eine Einfachbindung oder die Aminosäuren GIy, Ala, VaI, Leu, Heu, Pro, Met, Phe oder Tyr und Ay die Aminosäuren GIu, Gin, Asp oder Asn darstellen. Die
Erfindung betrifft weiterhin Salze der Verbindungen der
obigen allgemeinen Formel.
* Nitronaphthyl-, 4
6 0" ; -■ 1 Ci 1 9
Das Substrat der Erfindung kann gemäß zwei prinzipiell unterschiedlichen Verfahren hergestellt werden.
1. Das erste Verfahren beruht auf der Kopplung der chromophoren Gruppe R2 mit Arginin, gefolgt von einem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur mittels einer fortschreitenden Kopplung der verbleibenden Aminosäuren. Die chromophore Gruppe wird hier als Blockierungsgruppe der C-terminalen Carboxylgruppe der ersten Aminosäure verwendet.
2. Das andere Verfahren beruht auf dem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur, wonach die verwendeten Blockierungsgruppen entfernt und die chromophore Gruppe R2 an die Peptidstruktur gekoppelt wird.
Während der Stufensynthese der Peptidstruktur gemäß den genannten zwei Verfahren ist es möglich, nach jedem Koppeln einer neuen Aminosäure eine geeignete Reinigung durch Gelfiltration zu bewirken.
Die in der Stufensynthese der Peptidderivate verwendeten Kopplungsmethoden sind an sich bekannt und in der Peptidchemie üblich. Als Schutzfunktion für Aminogruppen können bekannte und in der Peptidchemie übliche Schutzgruppen, e.B. Cbo (Carbobenzoxy), MeOCbo (p-Methoxycarbobenzoxy), NO3CbO (p-Nitrocarbobenzoxy) , MCbo (p-Methoxyphenylazocarbobenzoxy),
60:Λ: :·/: /1019
..5
BOC (tert.-Butyloxycarbonyl), TFA (Trifluoracetyl) oder Formyl verwendet werden. Die jC-Carboxylgruppe kann mittels einer Umwandlung in andere aktive, in der Peptidchemie bekannte und häufig verwendete Derivate aktiviert werden. Diese Derivate können entweder isoliert oder in situ hergestellt werden. Beispiele hierfür sind p-Nitrophenylester, Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, Säureazide und Säureanhydride, wobei die letzteren entweder symmetrisch oder unsymmetrisch sein können. Sie kann auch mit einem Carbodiimid aktiviert werden, z.B. mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid. Die C-terminale Carboxylgruppe in dem Aminopeptidderivat oder dem Aminosäurederivat kann durch Veresterung geschützt werden," und zwar z.B. durch Veresterung zum Methyl-, Äthyl- oder Isopropylester, oder mittels einer Umwandlung zu dem chromophoren Anilinderivat, das dabei als Schutzgruppe während des Aufbaus der Peptidkette wirkt. Diejenigen freien funktioneilen Gruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen, können während der Synthese der Peptide oder der Peptidderivate in der folgenden Weχ je geschützt werden:
Für den Schutz der verbleibenden Arginyl-</-guanidogruppe kann uian in der Peptidchemie übliche Aminoschutzgruppen verwenden, z.B. die bei der Protonierung erhaltene oder NO ~ oder Tos (p-Toluolsulphonyl). Als Schutz für die Carboxylgruppe der Glutamin- und Asparaginsäure kann man ebenfalls häufig in der Peptidchemie verwendete Schutzgruppen, z.B. die Benzyl- und
b u ; : i 1 9
tertiären Butylschutzgruppen,verwenden.
Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert, wobei auf die Beispiele bezug genommen wird. Die Beispiele erläutern die Herstellung verschiedener Substrate gemäß der Erfindung mittels der Stufensynthese.
Bei der dünnschichtchromatographischen Analyse von Eluaten und Produkten wurden als Absorptionsmedium mit Silicagel F254 (Merck) beschichtete Glasplatten verwendet. Die verwendeten Lösungsmittelsysteme sind gemäß der folgenden Tabelle bezeichnet:
A: n-Butanol Essigsäure :Wasser (3:1:1)
C: n-Propanol:Äthylacetat:Wasser (7:1:2)
D: n-Heptan:n-ButanolEssigsäure (3:2:1)
P1: Chloroform!Methanol (9:1)
Nach der Dünnschichtchromatographie wurden die Platten zunächst im UV-Licht (254 nm) und anschließend mittels eier Chlor/Toluidinreaktion als Entwicklungsverfahren untersucht (Lit.: G. Pataki: Dünnschichtchromatographie in der Aminosäure- und Peptidchemie, Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1966, S. 125) .
6 0 : ■ ' / 1 0 Ί 9
Die Bedeutungen der nachstehend verwendeten Abkürzungen sind die folgenden:
Aminosäuren:
Diese Abkürzungen beziehen sich auf Aminosäurereste. Die freie Aminosäure oder das freie Peptid werden mittels H- an der Aminogruppe und -OH an der Carboxylgruppe bezeichnet. Die Aminogruppe wird immer links, die Carboxylgruppe rechts angegeben.
Wenn nicht anders angegeben, weisen alle verwendeten Aminosäuren die L-Konfiguration auf.
AIa = Alanin Heu = Isoleucin
Arg = Arginin Leu = Leucin
Asn = Asparagin Met = Methionin
Asp = Asparaginsäure Phe = Phenylalanin
GIn = Glutamin Pro = Prolin
GIu = Glutaminsäure Tyr = Tyrosin
GIy = Glycin VaI = Valin
Weitere Abkürzungen:
Ac = Acetyl
Ac3O = Acetanhydrid
AcOH = Essigsäure
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Bz = Benzoyl
6 0 ■-."'■/ 1 0 1 9 B
BzI = Benzyl
Bz2O = Benzoesaureanhydrid
Cbo = Carbobenzoxy
DCCl = Dicyclohexylcarbodixmid
DMF = Dimethylformamid
Et3N = Triäthylamin
MCbo = p-Methoxyphenylazocarbobenzoxy
MeOH = Methanol
OtBu = tert.-Butyloxy
OEt = Äthyloxy
OMe = Methyloxy
OpNP = p-Nitrophenoxy
OisoPr = iso-Propyloxy
pNA = p-Nitroanilid
TFA Trifluoracetyl
Tos = p-Toluolsulfonyl
Wenn nicht anders angegeben beziehen sich die Temperaturangaben in den Beispielen auf 0C.
Beispiel 1: HCl.Bz-Ileu-GIu-GIy-Arq-pNA Ia: Cbo-Gly-Arq-(NO2)-pNA (M.W. 530.4)
5,0 g (10, 6 mMol) Cbo-Arg (NO3) -pNA wird in 21 ml AcOH und 22 ml 4N HBr in AcOH unter wasserfreien Bedingungen gelöst. Die Lösung wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und danach
6 0° ν'/1019
langsam in 200 ml Äther unter heftigem Rühren eingegossen. Die Ätherlösung wird dekantiert und der erhaltene granulatförmige Rückstand wird weitere zwei mal mit lOO ml Äther behandelt* Nach dem Trocknen im Vakuum über PpO1- und KOH-Plätzchen bei 3O° C erhält man eine nahezu quantitative Ausbeute (4, 95 g) des Hydrobromids des Aminosäurederivats. Das Produkt erweist sich in A als dunnschxchtchromatographisch homogen.
Das obige Produkt wird in 50 ml destilliertem DMF gelöst. Die Lösung wird auf -10° C gekühlt und mit Et3N versetzt, bis die Lösung neutral ist (2.1 ml). Ausgefallenes Et3N-HBr wird äbfiltriert und das Filtrat wird auf -10° C gekühlt. 3, 9 g
,8 mMoi) Cbo-Gly-OpNP werden zugegeben. Man läßt die Lösung langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach drei Stunden wird die Lösung erneut auf -10° C gekühlt und mit 0,45 g (5,3 mMolj Et3N gepuffert. Die Pufferprozedur wird ein weiteres Mal nach zwei bis drei Stünden wiederholt. Man laßt die Reäktionslösung über Nacht stehen und verdampft im Vakuum bei 4o° C. Das zurückbleibende schwere Öl wird soigfäitig mit lOO ml destilliertem vfasser gerührt. Das Wasser wird dekantiert, und das Waschverfahren wird weitere zwei Mal wiederholt. Das zurückbleibende Öl wird in warmem MeOH gelöst* Beim Kühlen fällt das Produkt in kristalliner Form aus. Ausbeutei 4,2 f (1S %) Ia.
,.40 Ö ? ό 2 '» / 1 0 1 9
Homogen gemäß Dünnschichtchromatographie (TLC) in P-. (Rf = 0,16)
24 -36° (c 0.50, MeOH).
Ib: t-Boc-älu- fof-OBzl) -Giy-Arg (NöJ -pNA (M.W. 715 . B)
2,65 g (5,0 riitioi) Ia wird decarbobenzoxyliert und mit 2,50 g (5,5 mMolj t-Böc-Glü( i-OBzI)-OpNP gemäß dem Verfahren in Beispiel fä gekoppelt. Das rohe Produkt wird durch Gelchromatographie an1 feiner ÖEPHÄÖfeX LH-20 in MeOH enthaltenen Kolonne gereinigtw
Ausbeute: 3%· Ϊ5 % ^i %) Ib
Homogen göffi#ß fte ift P| (r£ = o, 22)
ΓΗ24 -34° (c i.Öi MeCÖj i
D
Ic; Cbo-Xleur-Slu.( & -OBzI) -Gly-Arg (NO2) -pNA (M.W. 862. 9) 1^08 g (Ii § mMolj Ib werden in 10 ml TFA gelöst« Die Lösung wird eine Stünde bei Raumtemperatur gerührt und danach langsam in 75 inl heftig gerührten trockenen Äther gegossen. Die Ätherlösung wird dekantiert und der erhaltene granulatförmige Rückstand wird weitere zwei Mal mit 50 ml Äther behandelt. Nach dem Trocknen imu/väkuum über P2 0S unä KOH-Piätzchen bei 30° C erhält man das TFÄ-Salz des Tripeptidderivats in nahezu quantitativer ÄäsBeütö (1, 08 g) .
#0 ^-:.'■'■ 47 1019
Das Produkt ist gemäß TLC in A homogen. Das obige Produkt wird in 20 ml DMF gelöst. Die Lösung wird auf -10° C gekühlt und mit Et3N (O, 23 ml) neutralisiert. Danach fügt man 0,65 g (1,68 mMol) Cbo-Ileu-OpNP hinzu und läßt die Lösung langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach etwa drei Stunden wird die Lösung erneut auf -10° C gekühlt und mit 0,12 ml
oN gepuffert. Das Pufferverfahren wird ein weiteres Mal nach zwei bis drei Stunden wiederholt. Man läßt die Lösung über Nacht stehen. Der Überschuß an Cbo-Ileu-OpNP wird dann durch Zugabe von etwa 100 mg (ca. 1,4 mMol) n-Butylamin zu der Lösung zerstört. (Der Überschuß an aktivem Ester ist unerwünscht, da es schwierig ist, diesen bei der Gelfiltration von dem Tetrapeptid abzutrennen) . Nach etwa 30 Minuten wird die Lösung im Vakuum bei 40° C eingedampft. Das verbleibende schwere Öl wird mit drei Portionen destilliertem Wasser gewaschen. Das Öl wird in MeOH gelöst und durch GeIchromatographie an einer mit SEPHADEX LH-20 in Methanol gefüllten Kolonne gereinigt.
Ausbeute: 1,07 g (83 %) Ic, homogen gemäß TLC in P, (Rf=0, 35) 4 -32° (c 0,3, MeOH: DMF, 95:5)
Id: Bz-Ileu-Glu( T -OBzI)-Gly-Arg(NOj-pNA 260 mg (0, 30 mMol) Ic wird gemäß dem Verfahren des Beispiels Ia decarbobenzoxyliert. Das Produkt zeigt im TLC in A zwei Flecken (R f = 0,45 und O, 60) . Das IR-Spektrum zeigt, daß das
...12
6 0 ■' ': -' / 1 0 1 9
Produkt aus einem Gemisch von HBr.H-Ileu-Glu( ijf-OH)-GIy-Arg (NO2)-pNA und HBr .H-I leu-Glu {f -OBzI) -Gly-Arg (NO3) -pNA besteht. Dieses Gemisch wird mit 800 mg (0,35 mMol) Benzoesäureanhydrid gemäß dem Verfahren des Beispiels Ia umgesetzt. Das rohe benzoylierte Produkt wird an einer Kolonne mit SEPHADEX LH-20 in Methanol gereinigt. Man erhält zwei Fraktionen, und zwar ^ : 130 mg, |_/j 24 -15° (c 0,5, CH-,CN) , R =0,
D Jr
in P1 und β : 105 mg, Π] 24 -11° (c 0,5, CH CN) , R. = 0,06 in χ D Jr
P,. Das IR-Spektrum zeigt, daß die zwei Fraktionen aus Bz-Ileu-Glu(T -OBzI)-Gly-Arg(NO3)-pNA und Bz-Ileu-Glu-Gly-Arg(NO2)-pNA besteht. (Die Reaktion mit HF ergibt aus beiden Fraktionen das gleiche Endprodukt, Ie).
Ie; HC1.Bz-IIeu-GIu-GIy-Arq-pNA (M.W. 734.3) 100 mg (0,12 mMol) Id, Fraktion«, und 0,5 ml Anisol werden in das Reaktionsgefäß eines Sakakibara-Apparates gegeben. In das Gefäß werden etwa 5 ml trockener Flourwasserstoff eindestilliert. Man läßt 7 5 Minuten unter Rühren bei 0° C reagieren. Der Fluorwasserstoff wird dann unter vermindertem Druck abdestilliert und man löst den öligen Rückstand in Io ml AcOH (33 % in Wasser) sowie reinigt eta)matographisch an einer Kolonne mit SEPHADEX G-15 in 33 % AcOH in Wasser. Die das reine, von der Schutzgruppe befreite Tetrapeptidderivat enthaltende Fraktion des Eluats wird dann lyophilisiert. Die erhaltene Verbindung wird in MeOH!destilliertem Wasser (95:5) gelöst und an einem schwach basischen anionischen
6 0 ''luiä-, ... *·*13
Austauscher QAE-SEPHADEX A-25 in dessen Chlor idf orin, und zwar mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch als Eluant, chromatographiert. Das Methanol wird aus dem Eluat bei 30 C unter vermindertem Druck entfernt. Die verbleibende wässrige Lösung wird lyophilisiert.
Ausbeute: 7 5 mg (85 %) , homogen gemäß TLC in A (Rf = 0,48).
j\Z] -40° (c 0, 5, 5O % AcOH in dest. Wasser) D
Aminosäureanalyse: lieu: 0,98, GIu: 0,95, Arg: 0,98, GIy: 1,00.
Beispiel II: 2 HCLH-Ileu-Gly-Gly-Arg-pNA Ha: 2HCl -H-I leu-G Iu-G ly-Arg-pNA (M.W. 666.6)
lOO mg (O,116 mMol) Ic wird mit Fluorwasserstoff umgesetzt, gereinigt und an einem Ionenaustauscher behandelt, und zwar gemäß den Verfahren des Beispiels Ie.
AusbeuLe: 56 mg (73 %) , homogen gemäß TLC in A (Rf = 0,34)
-35° (c O,5, 5ö% AcOH in dest. Wasser)
24
Aminosäureanalyse: Ileu: 0,96, Glu: 0,94, Arg: 0,96, Gly:l,OO.
Die in den oben genannten Beispielen beschriebenen Substrate wurden in der folgenden Weise zur Bestimmung des Faktors Xa verwendets
Das Prinzip der Bestimmung beruht auf der Tatsache, daß das bei der enzyntatischen Hydrolyse gebildete Produkt ein UV-Spektrum aufweist, das von dem des Substrats völlig
...14 80> : .'-/1019
verschieden ist. Das Substrat des Beispiels I, Bz-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA-HCl, weist beispielsweise ein Absorptionsmaximum bei 315 nm mit einem molaren Ext_inktionskoeffizienten von 12000 auf. Die Absorption des Substrats bei 405 ruft ist unbedeutend. p-Nitroanilin (pNA), das während der enzymatischen Hydrolyse aus dem Substrat gebildet wird, weist ein Absorptionsmaximum bei 380 nm mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 13200 auf» der bei 405 nm auf lediglich 9620 abnimmt. Durch spektröphotometrische Messung bei 405 nni ist es daher möglich* in leichter Weise das Ausmaß der enzymatisehen Hydrolyse, das proportional zu der Menge des gebildeten p-Nitroanilins ist, zu Verfolgen. Der Überschuß des Substrats beeinflußt die Messung bei dieser Wellenlänge nicht. Diese Situation ist fast identisch für die anderen Substrate der Erfindung. Aus diesem Grunde wurden die spektrophotometrisehen Messungen durchweg bei 405 nm durchgeführt. Tabelle 1 zeigt einen relativen Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeiten für unterschiedliche Enzyme vom Typ der Serinproteasen (E.C. 3.4.21) zwischen dem zuvor genannten Substrat S-2160 und dem Substrat I gemäß der Erfindung. Die Reaktionsgeschwindigkeiten werden gemäß den oben beschriebenen Verfahren bestimmt.
...15
S C " ... ' 1 0 1 9
Tabelle 1 Substrat Relative I *eaktio nsgeschwi ndicjkeiten
Konz. Thrombin Xa TrYpsin Plasmin
S-2160
I		 100
2		 1
100		 100
500		 100
75
0,1 mM
0, 25 mM
Die Tabelle zeigt, daß der Faktor Xa das Substrat I 100 mal besser spaltet als dies bei S-2160 der Fall ist. Im Vergleich zu S-2160 wird es lediglich in einem unbedeutenden Ausmaß durch Thrombin beeinflußt. Es liegt somit auf der Hand, daß I entsprechend diesem Vergleich eindeutig das beste Substrat für Xa ist. Weiterhin zeigt die Tabelle, daß I erfolgreich auch als Substrat für Trypsin verwendet werden kann. Dieser positive Trypsineffekt stört jedoch nicht eine Bestimmung des Faktors Xa, da Trypsin normalerweise im Blut nicht zugegen ist.
ß G ' 'I Ci 1 9
...16

Claims (9)

  1. ^ Chromogenes Substrat für Serinproteasen, insbesondere für die diagnostische Bestimmung des Faktors Xa, der allgemeinen Formel
    R,-A,-A^Gly-Arg-NH-IU
    in der R, ein Wasserstoffatom, eine Alkanoylgruppe mit 1-12 Kohlenstoffatomen, eine Cyclohexylcarbonylgruppe, eine Benzoylgruppe, die gegebenenfalls mit einer, zwei oder mehreren Gruppen, z.B. Halogenatomen, Methylgruppen, Aminogruppen oder Phenylgruppen, substituiert sein kann, eine Benzolsulfonyl- oder eine Toluolsulfonylgruppe bedeutet, sowie R2 eine Nitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-, Methoxynaphthyl-, Chinolyl- oder NitrochinoIylgruppe, A. eine Einfachbindung oder die Aminosäuren GIy, Ala, VaI, Leu, Heu, Pro, Met, Phe oder Tyr und A die Aminosäuren GIy, Gin, Asp oder Asn darstellen, sowie Salze desselben.
  2. 2. Benzoyl-Ileu-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilin.
  3. 3. H-Phe-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilin.
  4. 4. Benzoyl-Leu-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilin.
  5. 5. Benzoyl-Val-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilin.
    6 0 ' ' 1 0 1.9 17
  6. 6. Benzoyl—Leu-Asp-Gly-Arg-p-nitroanilin.
  7. 7. Benzoyl-Ileu-Glu-Gly-Arg-2-naphthylamid.
  8. 8. Benzoyl-Ileu-Glu-Gly-Arg-^methoxy^-naphthylamid.
  9. 9. Benzoyl-Ileu-Gln-GIy-Arg-p-nitroanilid.
    6 0 π Ji ν Λ / 1 0 1 9 6 0 9 8 2 Λ/ 1 0 1 9
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