DE2551208C3

DE2551208C3 - Verfahren zur Herstellung einer stabilen Erythrozyten-Präparation

Info

Publication number: DE2551208C3
Application number: DE2551208A
Authority: DE
Inventors: Günter 3551 Bürgeln Zülch
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1975-11-14
Filing date: 1975-11-14
Publication date: 1981-05-27
Also published as: ATA843476A; AT356812B; FR2331352B1; AU1958876A; DK146138C; GB1563839A; MX3937E; FR2331352A1; DE2551208B2; DK146138B; NL7612439A; CH626999A5; SE431800B; DK510976A; SE7612622L; LU76194A1; BE848377A; ES453136A1; AU511427B2; NL189133C

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen Erythrozyten-Präparation.

Seit langem werden Antikörper im passiven oder indirekten Hämagglutinationstest nachgewiesen. Dabei werden Blutkörperchen verschiedener Tierspezies, meist des Hammels, als Träger für gelöste Antigene benutzt. Da native Erythrozyten nur über eine kurze Zeitdauer stabil sind, hat man später eine Behandlung der Zellen mit Aldehyden (Formaldehyd, Pyruvaldehyd, Glutardialdehyd) oder Sulfosalizylsäure vorgenommen. So behandelte Zellen können längere Zeit konserviert werden. Sie werden erst vor Genauch mit dem entsprechenden Antigen beladen.

Derart mit Antigen beladcne Erythrozyten sind im allgemeinen nur in Kolloid wie z. B. Serum, Albumin, Gelatine enthaltenden Lösungen suspensionsstabil. Je nach der Menge der in dem gebrauchsfertigen Reagens vorhandenen Stabilisator-Substanzen kann das zu untersuchende Serum im Kochsalzmilieu oder in anderen geeigneten Medien eingesetzt werden. Die Verwendbarkeitsdauer beträgt je nach dem verwendeten Antigen Stunden bis Tage. Eine Verbesserung der Haltbarkeit kann durch lyophilc Tr«x-knung erreicht werden.

Aus der I)K-OS 2025 71« ist ein zur Lyophilisierung geeignetes Erythni/yten-Präparat bekannt, das mittels Aldehyd stabilisierte Erythrozyten und einen Zucker enthält. Die DE-PS 1 1^23^7 beschreibt ein Verfahren, in welchem rote Blutkörperchen mit einem Polyphenol oder C'hinon als Beizmittel, einem Aide hyd und einem Proteinantigen behandelt werden.

Fs ist auch schon beschrieben worden. Erythrozyten gleich/eilig mit ('hrnm(IH)chlorid und einem Antigen zu behandeln, wodurch das Antigen an die Erythrozyten gekoppelt wird

Die von verschiedenen Autoren vorgenommene Koppelung von Anligenen an native Hammel-Erythro/y'en bei gleichzeitiger Einwirkung von Antigen und ('hrom(lll)chlorid hat wesentliche Nachteile, da die C'hromsalz.c sowohl auf die Erythrozytenoberflächc hIs mich auf das Antigen einwirken und damit eine optimale Einstellung der Reagenzien erschweren.

Hei der Herstellung, Lagerung und Gebrauch von mit Antigene!! best hiehtelin Hrytlini/vtcn-Priipaialionen sind n.ich eine Reihe \mi Problemen nicht gelöst, beispielsweise die soeben erwähnte optimale Einstellung der Nachweisempfindlichkeit der Hämagglutinationsantigene. Auch hinsichtlich der Stabilität der Erythrozyten unter Lagerungsbedingungen und der Reproduzierbarkeit lassen die damit durchgeführten Hämagglutinationsuntersuchungen zuweilen zu wünschen übrig.

Es bestand deshalb die Aufgabe, für die Beschichtung mit Antigenen geeignete Erythrozyten-Präpai.i ■ tionen herzustellen, die bei der quantitativen Bestim-

lu mung in Hämagglutinationsuntersuchungen zuverlässige Resultate liefern, welche sich auch mit länger lagernden Präparationen reproduzieren lassen.

Es wurde nun gefunden, daß eine wesentliche Verbesserung von in den Hämagglutinationsttsten verwendbaren Reagenzien erreicht werden kann, wenn man auf in einer Pufferlösung suspendierte Erythrozyten gleichzeitig oder in beliebiger Reihenfolge nacheinander einen niederen aliphatischen Aldehyd und ein wasserlösliches Salz des 2- oder 3wertigen Chroms einwirken läßt, die Erythrozyten wäscht und gewünschtcnfalls lyophilisiert. Nach dem Waschen kann gewünschtenfalls ein diagnostisches Antigen auf die erhaltene Erythrozyten-Präparation aufgebracht werden.

Als Erythrozyten werden insbesondere kernhaltige Vogelerythrozyten verwendet. Durch Verwendung der zellkernhaltigen Vogelerythrozyten kommt es zu einer Beschleunigung der Sedimentation und gleichzeitig damit zu einfacher ablesbaren Sedimentationsmustern. Damit ist eine rasche und sichere Beurteilung der Reaktion gegeben.

Die Behandlung der Zellen mit einem Chromsalz verbessert vor allem wesentlich deren Lagertahigkcii bei ca. 37° C. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemaß behandelten Erythrozyten liegt in der geringen Tendenz zu unspezifisch positiven Reaktionen, womit in den meisten Fällen die Verwendung eines Kontroll-Reagenzes überflüssig wird. Insbesondere die behandelten Geflügelerythrozyten zeichnen sich durch rasche, empfindliche und spezifische Reaktionsfähigkeit in Hämagglutionstesten ebenso wie durch Stabilität in flüssiger oder lyophil getrockneter Form aus.

Die mit Aldehyden und C'hromsalzen vorbehandelten Geflügcl-Erythrozyten sind zur Adsorption der verschiedensten Bakterien-, Parasiten- und Virus-Antigene geeignet und ermöglichen auch eine Anlagerung von Antikörpern zum Nachweis von Antigenen.

5(i Der Gegenstand der Erfindung ist durch die Ansprüche I und 2 gekennzeichnet.

Dazu werden native Erythrozyten im Vollblut von verschiedenen Tieren sowie von Menschen, insbesondere jed(Kh kernhaltige wie die von Vögeln wie Huhu.

5i Taube und Truthahn gesammelt. Die Blutprobe wird mit herkömmlichen gerinnungshemmenden Substanzen versetzt, wonach die Erythrozyten beispielsweise durch Zentrifugieren gewonnen und mit verträglichen isotonisehen Pufferlösungen mehrfach gewaschen

mi werden, um die m dem Blut noch vorhandenen Antigene zu entfernen. Das gewaschene Erythrozytensctliment wird in nicht weniger als H Volumenteilen einer isotonisehen neutralen Pufferlösung oder einer isotonisehen Salzlösung suspendiert. Zu dieser Suspension

'.5 wird eine wäßrige Lösung eines niederen aliphatischen Aldehyds, insbesondere eines solchen mil einer Kettcnlänge von C₁ bis (',, wie Formaldehyd. Methylglydxal oder (ilutaraldehyd in einer Menge von (1,2 III

Gewichtsprozent des Aldehyds bezogen auf das vorhandene Volumen des Erythrozytensediments zugesetzt. Die Reaktionszeit für die Einwirkung des Aldehyds auf die Eiythrozyten hängt von der Reaktionstemperatur und der Konzentration des Aldehyds ab. Zweckmäßig werden diejenigen Reaktionsbedingungen eingehalten, die die Erythrozyten härten, ohne daß es zu Aggregaten kommt Die Aggregatbildung kann mikroskopisch beobachtet werden.

In diesem Sinne werden in der Regel Reaktionszeiten von 1-24 Stunden bei Temperaturen von etwa 5 bis 45° C eingehalten. Gemäß zweckmäßiger Bedingungen bei der Verwendung von Formaldehyd, das als ca. 35%ige Lösung handelsüblich ist, wird auf die Erythrozytensuspension eine auf etwa 10-15% vorverdünnte Formaldehydlösung einwirken gelassen. Im einzelnen kann nach dem Vorschlag von L. Csizmas, Proc. Exp. Biol. Med. 103, 157 ff. (1960), vorgegangen werden.

Beispiel 1 erläutett das Verfahrensprinzp. Im Anschluß an die Aldchydbchandlung werden die Erythrozyten mehrere Male gewaschen. Falls sie nicht unmittelbar weiterverarbeitet werden sollen, können die derartig vorbehandelten Erythrozyten mit einem antimikrobiell wirksamen Agens, beispielsweise Natriumtimerfonat in einer Konzentration von 0,01-0,05%, versetzt werden und als 10-3()%ige, insbesondere 25%ige, Suspension bei 4° C aufbewahrt werden.

Für die Behandlung mit einem Chrom-II- oder Chrom-III-Salz werd-Tidie mit Aldehyd behandelten Erythrozyten in einem wäßrigen Milieu suspendiert. Zweckmäßig wird hierfür Wasser verwendet. Die Konzentration der Erythrozyten beträgt 0,5-25%, insbesondere 1,25%. Dieser Erythrozy.jnsuspension wird eine wäßrige Chromsalz-Lösung in einer Konzentration von 0.0001-2,0%, insbesondere 0,001-2,0%. zugesetzt und nach dem Vermischen 5-30 Minuten bei 5-45° C belassen. Danach werden die Erythrozyten durch Sedimentation oder Zentrifugation abgetrennt. Zur Entfernung von überschüssigem Chromsalz wird mehrmals gewaschen.

Als Chromsalze im Sinne der Erfindung kommen alle wasserlöslichen Chrom-II- und Chrom-III-Salze in Frage wie Chrom-II- oder Chrom-III-chlorid, -sulfat, -nitrat, -phosphat oder -acetat. Bevorzugt wird Chrom(II)chlorid oder Chrom(III)chIorid eingesetzt.

Die Reihenfolge der Anwendung von Aldehyd und Chromsalz kann ohne nachteiligen Einfluß auf das Ergebnis vertauscht werden. Ebenso erfolgreich können Aldehyd und Chromsalz gleichzeitig angewendet werden.

Die auf diese Weise erhaltenen Formaldehyd- und Chromsalzbchandelien Erythrozyten sind geeignet, mil verschiedenen Antigencn beschichtet zu werden.

Im allgemeinen werden die stabilisierten Erythrozyten mit Antigencn in einer wäßrigen Uisung überzogen, die auf einen pH-Wert unter 7. zweckmäßig auf einen sihwaehsauren pH-Wert zwischen 5,5 und f>,5, eingestellt wird. Unter Antigencn sollen die verschicdcnsti'ii Substanzen verstanden werden, deren Nachweis im Blut oder Harn von Interesse ist. Zu den beispielhaft ausgewählten Antigencn, die erfolgreich /um Über ziehen der stabilisierten Erythro/.yten-Präpar.'iir verwendet werden können, gehören insbesondere Protcinantigi'nc. vor allein die Plasmaproteinanligcne menschlicher oder tierischer Herkunft, mikrobielle Antigene, beispielsweise Toxoplasma-Antigene, wie sie durch Ultraschall-Einwirkung erhalten werden können, oder Treponema-pallidum-Antigene, die aus infizierten Kaninchenhoden gewonnen s werden, und andere. Es ist ein besonderer Vorteil der Erythrozyten-Präparation der vorliegenden Erfindung, daß sie für das Überziehen von Substanzen mit unterschiedlichen chemischen Strukturen geeignet ist.

tu Die mit den Antigenen beschichteten stabilisierten Erythrozyten werden zweckmäßig in einer ein lyophiles Kolloid enthaltenden Lösung, beispielsweise einer 0,1-1 %igen Gummi arabicum-Lösung oder einer entsprechenden Lösung eines Gelatine-Abbau-Produkte^:. oder Polyvinylpyrrolidon zweckmäßig in Gegenwart weiterer stabilisierender Substanzen wie Aminosäuren, z. B. Natriumglutaminat, oder Glycin in einer Konzentration von 1—10% und/oder ei-.ies tierischen Serums in einer Konzentration von 0,5-20% suspendiert. In dieser Suspensionsflüssigkeit kann das Reagenz flüssig bei Kühlschranktemperatur, also etwa 4° C, gelagert oder aber nach dem Einfrieren lyophil getrocknet werden. Nach Auflösung des getrockneten Präparates in destilliertem Wasser steht das Reagenz für die Durchführung von Hämagglutinationstesten in der gleichen Qualität zur Verfügung, wie dies vor der Trockr.ang der Fall war.

Die Durchführung der Hämagglutinationsuntersuchungen ist dem Fachmann bekannt. Im allgemeinen wird dazu eine Serumprobe, welche den vermuteten Antikörper enthält, mit dem entsprechenden antigenbeschichteten Erythrozyten-Präparat in einem wäßrigen Milieu vermischt, um zu bestimmen, ob eine Agglutination auftritt. Die Agglutinationsreaktion wird vorteilhaft in Mikrotiterplatten durchgeführt. Dazu wird beispielsweise 0,05 ml Serum bzw. Serumverdünnung mit 0,025 ml der erfindungsgemäßen mit Antigen beschichteten Erythrozyten (1.25%ig) vermischt und 30 Sekunden bis 1 Minute ge chüttelt. Bei Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung der beschichteten Erythrozyten kann die Ablesung der Testergebnisse bereits nach 30 Minuten erfolgen.

Wie oben ausgeführt, können die erfindungsgemäß stabilisierten Erythro/\ten-Präparationen mit Proteinantigenen beschichtet werden. Dies bedeutet, daß sie auch mit einem spezifischen Antikörper überzogen werden können, so daß bei nachfolgender Hämagglutinationsuntersuchungdie Erythrozyten in Gegenwart

so des entsprechend spezifischen Antigens agglutinieren. Der passive Hämagglutinationstest kann dazu verwendet werden, um bakterielle Infektionen nachzuweisen, für die Entdeckung von Virusinfektionen, für die Bestimmung der Histokompatibilität, für die Entdcckung von Autoimmunitätserkrankungen und anderen vergleichbaren Phänomenen.

Die Überlegenheit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Erythro/yten-Präparation gegenüber denen der DE-OS 2O2571X und der

en DE-PS I 1^lJ2 V>7 geht aus dem nachstehenden Versuchsbericht hervor:

Für die Herstellung der Erythrozyten-Präparation wurden Hammelerythro/.ytcn eingesetzt. Diese wurden mit einem Antigen, gewonnen aus Trcponcma

f<5 pallidum (Stumm Nichols), durch Ultraschalldesintegration der gewaschenen Keime beschichtet. Die Suspension der Antigen-Präparation wurde durch Zcntrifugation bei 2MI00 X g während 10 Minuten von

25 5] 208

nicht aufgeschlossener! Keimen und groben Zelltrümmern befreit und für die Sensibilisierung der Erythrozyten zur Verfügung gehalten. Die Erythrazyten-Präparationen wurden hergestellt.

1. nach dem erfindungsgemäßen Verfahren [DE-OS 2551208, Beispiel Ib) 2.];

2. nach DE-OS 2025718, BeispieU;

3. nach DE-PS 1192367, Beispiel 1.

Die rmch 1 bis 3 erhältlichen Erythrnzyten-Präparationen wurden mit dem Antigen aus Treponema pallidum in mehreren Verdünnungsstufen des Antigens beschichtet (sensibilisiert). Die danach erhaltenen sensibilisierten stabilen Erythrozyten wurden mit einem Treponema pallidum- Antikörper enthaltenden Humanserum nach einem identisch durchgeführten Hämagglutinationsverfahren geprüft. Dabei wurden als Versuchsergebnis die in der folgenden Tabelle zusammengestellten Endwerte der Hämagglutination als Mittelwert von jeweils zwei Versuchsansätzen erhallen.

Antigen- Reziprok. Titerendpunkt der Hämagverdünnung glutination

DE-OS DE-OS DE-PS

25 51208 20 25 71« 1192 367

1: H)
1: 20
1: 40
1 : 80
1:160

5120

2560

320

80

Damit zeigen die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten und antigenbeschichteten Erythrozyten-Präparationen eine erheblich höhere Empfindlichkeit als die Präparat ionen des Standes der Technik.

Die Erfindung soll an nachfolgenden Ausführungsheispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1
a) Stabilisierung der Erythrozyten

300 ml Hühnerblut werden in 100 ml 3.5%iger Citratlösungaufgefangen und noch am gleichen Tag verarbeitet.

Die Erythrozyten werden bei ca. 2000 x g abzentrifupiert und 5mal in 10 Volcmina kalter (ca. 10° C) 0,85%iger NaCI-Lösung gewaschen. Dabei soll Schaumbildung vermieden werden. Das gewaschene Zcllsediment wird in 8 Volumina 0,85%iger NaCI-Lösung mit einem nH von 6,8 suspendiert. V₄ des Volumens der Zellsuspcnsion einer 14%igen Formaldehydlnsung pH 5,5 wird in einen Zellophan-Dialyseschlauch gegossen (Breite 2,5 cm) und an einem Ende verschlossen. Dabei wird etwa '/, des Schlauches leer belassen. Diu Luft wird ausgedrückt, das offene Ende zugebunden, der Schlauch auf den Boden eines Bechers gelegt und die Erythrozytensuspension darüber gegossen. Der Becher wird bei Raumtemperatur auf einem mechanischen Schüttler (orbital shaker) bewegt. Die Geschwindigkeit wird so reguliert, daß starke Mischung bei geringster Schaumbildung er= reicht wird. Nach 3 Stunden wird der Zellophansack entfernt, sein Inhalt in den Becher gegossen und weitere 16-18 Stunden geschüttelt. Danach werden verklumpte Zclltriimmcr auf der Oberfläche der Flüssigkeit und an Jen Becherwandungen gefunden, die durch vorsichtiges Dekantieren entfernt werden son-Zu der homogenen Zellsuspension wird '/, Volumen isotonische NaCI-Lösung gegossen und dann 6mai mit jeweils 750 ml gewaschen. Schließlich wird das gewaschene, formalinisierte Zellsediment in S phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 (PBS) mit 0,02% Natriumtimerfonat suspendiert, so daß eine 25 %ige Lösung entsteht, die bei 4° C aufbewahrt wird.

Für die Behandlung der aldehydbehandelten, ge-

Ki waschenen, stabilisierten Erythrozyten mit CrCI₁ werden sie in einer ca. 1:4 verdünnten gepufferten Kochsalzlösung pH 7,5 suspendiert. Dieser Suspension wird ein gleiches Volumen einer wäßrigen Chrom(III)-chlorid-Lösung in einer Konzentration von 0,002%

is zugesetzt und der Ansatz K) Min. bei 37° C belassen. Danach entfernt man das Chromsalz durch mehrmaliges Waschen in physiologischer Kochsalzlösung.

b) Beschichtung mit Antigen

1. Ein durch Ultraschalleinwirkung (2 x 1 Min. 22 KHz) aus Toxoplasnvc.i erhaltener und durch Zentrifugation von partikulären Bestandteilen gereinigter Antigenextrakt wird in geeigneter Verdünnung, die in einem Vorversurh ermittelt wird, mit der AIdehyd-Chrom(III)ch!orid-behandelten Erythrozytensuspension (l,25%ig) versetzt und für eine Einwirkungszeit von 1 Stunde bei 37° C belassen. Der pH-Wert wird dabei auf 6,4 gehalten.

3d Danach erfolgt eine zweimalige Waschung in

0,l-l%iger Gummi arabicum-Lösung und die Suspendierung des Sedimentes in m/15 Trishydroxymethyl-aminomethan-HCI-Puffer pH 8,0, dem 5% Natrium-Glutami nat und 15"7f Kaninchenserum zugesetzt ist.

Die Suspension enthält \,25'/c Erythrozyten.
In dieser Suspensions- und Stabilisatorflüssigkeit kann das Reagenz flüssig bei +4° C gelagert oder lyophil getrocknet werden. Di«. Auflösung erfolgt in dem Originalvolumen destillierten Wassers.

2. In entsprechender Weise kann ein Lues-Reagenz hergestellt werden, indem man anstelle eines Ultraschallextraktes von Toxoplaj-men einen Extrakt von Treponema pallidum aus infizierten Kaninchenhoden einsetzt und die Serumverdünnung in einem Absorptionsmedium durchführt.

Beispiel 2

so Frisch gewonnene Schaferythrozyten werden in dem zweifachen Volumen der Alsever's Lösung folgender Zusammensetzung suspendiert:
20,5 g Dextrose

h g Natriumeitrat (Na₂C„H,O₇ 2H₂O)

0,552 g Citronensäure (H,C₆H<O, H₂O)

4,2 g .Natriumchlorid
ad 1000 ml mit Aqua dest.

Danach werden die Erythrozyten bei ca. 2000 χ g abzentrifugiert und fünfmal in 10 Volumenteilen kalfto ter phosphatgepufferter 0,15 molarer Kochsalzlösung vom pH'Wert 7,2 gewaschen. Nach dem Waschen werden die Erythrozyten bis zu einer Konzentration von H% (v, v) in 0,15 molarer gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 suspendiert. Zu einem Volute mcntcil dieser Erythrozyten-Suspension wird das gleiche Volumen einer 3%igcn Glutardialdehydlösung in gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7.2 tropfenweise unter langsamen Rühren der Zellsus-

pension zugesetzt. Danach 1: i fΛI man I⁷ Stunden bei Raumtemperatur rühren, wäseht ilie Suspension anschließend fünfmal mit gepufferter Kochsalzlösung von pH 7,2 und resuspendiert die aldchydhuhandelten Erythrozyten in Kochsalzlösung, so daß eine I:S'',ige (v/v) Suspension tier auf diese Weise stabilisierten Erythrozyten entsteht.

Für die Behandlung der aldehydhehandellen. gewaschenen, stabilisierten Erythrozyten mit ('hrom(ll)chlorid werden sie in einer ca. 1:4 \erdiinnten gepufferten Kochsal/Iösiing von pH 7.2 stis pendiert. Dieser Suspension wird ein gleiches VoIu-

men einer wäßrigen ('hrom(ll)chlorid-l.i>sung in einer Konzentration von 0,05% zugesetzt, der Ansät/ bei M" C M) Minuten belassen. Danach entfernt man das C'hromsalz durch mehrmaliges Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung.

Die Beschichtung mit Antigen kann in der gleichen Weise wie unter Beispiel I b) besehrieben vorgenommen we rile n.

Geeignete Erythrozyten-I'räpaiationen für die Beschichtung mil Antigen erhält man auch, wenn statt Glulardialdchyd. wie im vorliegenden Beispiel ausgeführt. Methylglyoxal \erw\ndet wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer stabilen lyophilisierbaren Erythrozyten-Präparation, dadurch gekennzeichnet, daß man auf in einer wäßrigen isotonischen Lösung suspendierte Erythrozyten gleichzeitig oder in beliebiger Reihenfolge nacheinander einen niederen aliphatischen Aldehyd und ein wasserlösliches Salz das 2- oder 3wertigen Chroms einwirken läßt und danach die Erythrozyten wäscht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliches Chromsalz Chrom(II)chlorid oder Chrom(III)chlorid verwendet wird.