DE2542792A1

DE2542792A1 - Verfahren zur erhoehung der antikoerpermenge in der milch von milchabsondernden rindern

Info

Publication number: DE2542792A1
Application number: DE19752542792
Authority: DE
Inventors: Vipin K Dr Med Singh
Original assignee: Diamond Shamrock Corp
Current assignee: Diamond Shamrock Corp
Priority date: 1973-02-14
Filing date: 1975-09-25
Publication date: 1977-04-07
Also published as: US3911108A; FR2326204B1; FR2326204A1; GB1508050A; CA1027477A

Description

Verfahren zur Erhöhung der Antikörpermenge in der Milch
von milchabsondernden Rindern Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Rindermilchprodukten, welche Antikörper enthalten, die gegenüber Antigenen spezifisch sind, welche sich in der Milchdrüse bzw. im Euter einer milchabsondernden Kuh nicht fortpflanzen. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Rindermilchprodukten, die Antikörper enthalten, welche dazu imstande sind, den über tragbaren Gastroenteritisvirus zu neutralisieren, der in Jungferkeln akute Darmkrankheiten bewirkt.
Herstellung von Antikörpern in der Milch eines milchabsondernden Säugetieres: Es ist bekannt, daß im Kolostrum und in der Milch einer Vielzahl von Tieren nach Einführung von Antigenen in die Milchdrüsen spezifische Antikörper erscheinen.
Untersuchungen beim Menschen, Kaninchen, Schweinen und Schafen weisen darauf hin, daß einer der Schutzantikörper in der Milch eines milchabsondernden Individuums ein sekretorischer Antikörper vom IgA-Typ ist, der sich vom Serumantikörper IgA dadurch unterscheidet, daß er eine komplexe Nicht-Globulin-Komponente, die als "sekretorische Komponente" oder " sekretorisches Teil" bezeichnet wird, besitzt und ein höheres Molekulargewicht aufweist.
Im Gegensatz zu Serum IgA, der durch parenterale Inokulierung eines Antigens erzeugt werden kann, wird der sekretorische IgA in der Milch von milchabsondernden Tieren nach einem natürlichen (oralen) Aussetzen oder nach einer lokalen Stimulierung der Milchdrüse mit Antigenen erzeugt. Es ist beobachtet worden, daß sekretorische IgA-Antikörper gegenüber proteolytischen Enzymen hoch beständig sind und daß sie daher imstande sind, durch den Magen unter Aufrechterhaltung der biologischen Aktivität hindurchzugehen und daß sie durch die Laktation hindurch als Haupt-Immuglobulin bestehen. Man nimmt daher an, daß der sekretorische IgA eine der Hauptsuellen für durch die Milch hervorgerufenen Schutz darstellt.
Mitchell et al (1958) haben im "Canadian Journal of Comparative edicine", Band XXII, Nr. 5, berichtet, daß Myxoviren, die Influenza, Newcastle'sche Krankheit und Geflügelpest bewirken, außer daß sie wie andere Myxoviren Erythrozyten von Geflügel agglutinieren, auch die gemeinsame Eigenschaft haben, daß sie in den Milchdrüsen von milchabsondernden Rindern oder Geißen sich fortpflanzen, wenn sie durch den Brustazarzenkanal in die Milchdrüse instilliert werden. Sie haben berichtet, daß die Fortpflanzung etwa eine Woche fortdauert, wonach der Virustiter abnimmt und der Virus verschwindet. Sie haben beobachtet, daß ein oder zwei Tage nach dem Verschwinden des Virus in der Milch, und zwar zuerst von den infizierten Segmenten, neutralisierende Antikörper erschienen. Sie haben weiterhin beobachtet, daß die Antikörper über Monate fortdauern, möglicherweise über die Lebensdauer des Tieres, und daß die Milchdrüse mit dem Virus nicht mehr reinfiziert werden konnte. Sie haben weiter berichtet, daß, wenn der Virus zuerst inaktiviert worden ist, die Antikörperbildung nicht induziert wird und daß sich auch keine Antikörper bilden, wenn Viren instilliert werden, die sich in der Drüse nicht fortpflanzen. Sie haben weiterhin berichtet, daß unveröffentlichte Arbeiten von anderen Autoren darauf hinweisen, daß die Viren der östlichen, westlichen und venezuelanischen Encephalomyelitis, der Kuhpocken und der Kinderlähmung sich in der Milchdrüse nicht fortpflanzen. Sie haben weiterhin beobachtet, daß Viren, denen gegenüber die Drüse empfindlich ist, mit dem Wirtsbereich nicht in Beziehung stehen und daß der Virus, wenn er durch andere Wege als subkutan eingeführt wird, nicht dazu imstande war, die Drüse zu infizieren oder sich dort zu lokalisieren. Schließlich haben sie beschrieben, daß bislang noch keine Arbeiten durchgeführt wurden, um zu bestimmen, ob die in der Milch vorhandenen spezifischen Antikörper empfindlichen Tieren einen Schutz verleihen, wenn sie oral verabreicht werden.
Diese Beobachtungen von Mitchell et al werden anscheinend teilweise durch spätere Arbeiten von Mitchell et al (1967), die in "Canadian Journal of Microbiologylt, Band 13, Seiten 1069 bis 1078, veröffentlicht worden sind, widerlegt.
Darin wurde beschrieben, daß der Adenovirius-Virus vom Typ 3, der nur einmal in die Milchdrüse einer milchabsondernden Ziege injiziert worden war, nicht dazu imstande war, sich fortzupflanzen oder Antikörper zu erzeugen, doch dazu imstande war, nach einer Reihe von sechs aufeinanderfolgenden Injektionen in fünftägigen Intervallen Antikörper zu erzeugen. Dabei erreichten die Antikörper 12 Tage nach der sechsten Injektion einen maximalen Wert und gingen dann rasch auf einen konstanten Titer von 1 : 50 zurück. In dem gleichen Artikel berichten die Autoren auch, daß der Enders-Stamm des Mumpsvirus, Myxovirus Parotidis, obgleich er in der Drüse sich fortpflanzt, nur die Bildung eines niedrigen Antikörpertiters induzierte.
Zu den von Mitchell et al berichteten Anfangsergebnissen stehen anscheinend auch die Arbeiten von anderen Personen im Gegensatz, die dazu imstande waren, einen Kinderlähmungsantikörper herzustellen, indem sie den Virus in die Milchdrüse instillierten, obgleich dieser sich in dem Organ nicht fortpflanzte. Auch diese weiteren Experimentatoren berichteten, daß der aktive Virus einen besseren antigenen Stimulus als der tote Virus ergab.
Easterday et al (1959), die in 1?Am.J.Vet.Res.?? Seiten 819 bis 824, die Arbeiten von Mitchell et al kommentierten, beobachteten, daß es auf der Grundlage ihrer Arbeiten und auch der Arbeiten von Mitchell et al ziemlich offensichtlich zu sein scheint, daß eine Anzahl von Viren sich nicht nur in der MilchdHuse fortpflanzen können, sondern auch eine Entzündung erzeugen können. Die Autoren waren weiterhin der Meinung, daß einige der idiopathischen Fälle von Mastitis, die von Praktikern entdeckt wurden, das Ergebnis einer Virusinfektion der Milchdrüse sein können. Sie wiesen darauf hin, daß es eine Sache der Spekulation sei, ob die Viren - wenn überhaupt -spezifische Milchdrüsenviren oder andere Typen von Viren seien. Die Autoren haben berichtet, daß zusätzlich zu dem Virus der Newcastle'schen Krankheit, der von Mitchell et al untersucht wurde, der Virus der bläschenförmigen Stomatitis und der Kuhpockenvirus beim Infundieren in die Milchdrüse eines milchabsondernden Rindes EntzUndungsreaktionen bewirkten, die über variierende Perioden andauerten und die in den meisten Fällen die Erzeugung von erheblichen Mengen neutralisierender Antikörper stimulierten.
Andere Experimentatoren haben in ähnlicher Weise beobachtet, daß die Inokulierung der Milchdrüse eines milchabsondernden Rindes mit ähnlichen Viren eine Infektion und in einigen Fällen eine schwere Reaktion bewirkte, die zu einer zeitweiligen Disfunktion der Drüse führte. Bannister et al (1959) haben in Cyan. J. Comp. Med. and Vet. Sci.
Band 23, Seiten 47 bis 49, berichtet, daß in einer Kuh mit dem Virus einer enzotischen Fehlgeburt von Mutterschafen, einem Glied der Psittacosis-Lymphogranuloma-Gruppe eine Mastitis erzeugt wurde. Greig et al (1965) haben in 'cyan. J. Comp. Med. & Vet. Sci.", Band 29, Seiten 57 bis 62, beschrieben, daß sie gefunden haben, daß das Rindereuter von nicht-immunen Tieren gegenüber Herpesviren von Rindern leicht empfänglich war, wobei eine akute begrenzte Infektion erzeugt wurde, die zu einer zeitweiligen Disfunktion der Drüse führte. Straub et al (1965) haben in t'3erl. Munch. tierärztl. Wschr.", Band 78(20), Seiten 386 bis 389, beschrieben, daß die intramammäre Inokulierung von 2 ml einer frisch geernteten Suspension von CBV-D-Enteroviren mit einem Virusgehalt von 10 5 TCID50 in den infizierten Teilen eine akute katarrhalische Mastitis bewirkte, die vor der Erholung etwa 14 Tage lang anhielt.
Einige der frühesten Vissenschaftler, die postulierten, daß das ätiologische Mittel für die nicht-spezifische Mastitis ein Virus ist, waren Peterson et al (1938), die in "Cornell Veterinarian", Band 28, Seiten 307 bis 323, Fehlgeburtenversuche beschrieben haben, um normalen milchabgebenden Kühen durch Injektion einer abnormen Milch oder von anderen Extrakten in ihre Euter eine nicht-spezifische Mastitis zu verleihen. Sie sind zu der Schlußfolgerung gekommen, daß - obgleich ein positiver Beweis fehlte - die am meisten wahrscheilliche äthiologische Ursache einer nicht-spezifischen Mastitis ein Virus zu sein schien. Sie haben weiterhin aufgrund von Beobachtungen, die sich über einen Zeitraum von vier Jahren mit Herden erstreckten, die von Euterstreptokokken frei waren, sowie aufgrund von Beobachtungen mit zwei Mastitisversuchskühen postuliert, daß die wichtigste Periode beim Beginn einer nicht-spezifischen Mastitis vielleicht die spätere Hälfte der Trächtigkeitsperiode ist, wenn die mammären Epithelzellen jung sind und einer raschen Teilung unterworfen sind und auf diese Weise gegenüber einer Infektion von einer äußeren Quelle am meisten empfindlich sind.
Petersen et al haben in der US-PS 3 376 198 beschrieben, daß Antikörper gegen pathogene Organismen, mit Einschluß von Leberviren und -bakterien, in normaler Milch erzeugt werden können, d.h. in Milch, die von Kühen ohne irgendwelche Zeichen von Mastitis oder einer Infektion erhalten wird, indem man in die Zisterne der Milchdrüse einer trächtigen Kuh entweder durch die Warzenkanäle oder hypoderm durch die mammäre Wand ein Antigen inokuliert, welches von einem pathogenen Organismus herrührt, wenn es nicht-pathogen gemacht worden ist. Petersen et al haben beschrieben, daß lebende Viren und Bakterien nicht-pathogen gemacht wurden und auf diese Weise für ihr Verfahren geeignet gemacht wurden, indem der Virus oder die Bakterien inaktiviert oder abgetötet wurden. Petersen et al haben auch beschrieben, daß nach dem Gebären abnehmende Antikörperkonzentrationen erhöht werden können, indem man periodisch Förderungsschüsse des ausgewählten Antigens in das Euter während der Milchabsonderungsperiode einführt oder indem man alternativ die Förderungsschüsse intravenös, intramuskulär oder subkutan injiziert. Sie haben beschrieben, daß solche Förderungsschüsse im Abstand gegeben werden können, um eine Anpassung an das Belieben der Bedienungsperson vorzunehmen, jedoch nicht so häufig verabreicht werden sollten, daß eine antiphylaktische Reaktion auftritt. Die Patentinhaber weisen darauf hin, daß bei den meisten Arten von Huftieren diese Zeit weniger als 10 bis 14 Tage ist, daß die Verabfolgung auf jeden Falle jedoch nicht häufiger als jeden weiteren Tag erfolgen sollte, wenn lokale Entzündungen und Stauungen vermieden werden sollen.
Mitchell et al (1969) beschreiben auch in "Canadian Journal of Comparative Medicine", Band 33, Seiten 166 bis 168, eine vor und nach dem Gebären durchgeführte Inokulierung der Milchdrüse eines Huftieres. Diese Autoren berichten insbesondere, daß eine nicht-milchabsondernde Ziege, als ihr Herpes simplex instilliert wurde, nach dem Gebären eine Milch mit einer geringen Menge eines Milchantikörpers ergab, die geringfügig auf einen Titer von 1 : 50 durch mehrere Injektionen des Virus in unregelmäßigen Intervallen einen Monat nach dem Gebären erhöht werden konnte, obgleich der Virus in der Milchdrüse nicht entdeckbar war.
Übertragbare Gastroenteritis: Die übertragbare Gastroenteritis (TGE) ist eine hochinfektiöse Viruserkrankung von Schweinen, die im größten Teil der Welt schwerwiegende ökonomische Verluste verursacht. TGE kann Schweine aller Züchtungen und aller Altersstuien befallen; wobei diese Krankheit aber bei sehr jungen Schweinen eine extensive Sterblichkeit bewirkt.TGE'wurde zuerst von Doyle and Hutchings in "J.A.
V.M.A.", Band 108, Seiten 257 bis 259 (1946) beschrieben.
Seitdem ist diese Krankheit nicht nur in vielen Staaten der USA, sondern auch in vielen fremden Ländern beschrieben worden. Es scheint allgemein anerkannt zu sein, daß TGE durch einen Virus bewirkt wird, der zur Koronavirusgruppe gehört und der nur ein Serotypus des Virus ist.
Die klinischen Zeichen von TGE variieren entsprechend dem Alter des infizierten Schweines. Bei sehr jungen Schweinen kann die Mortalität 700 erreichen, während Schweine, die nach dem Entwöhnen infiziert werden, selten sterben. Das primäre klinische Anzeichen ist Erbrechen und Diarrhoe, gefolgt von Entwässerung. Der Tod ist vermutlich auf schwere Störungen des Elektrolythaushalts und eine Acidosis zurückzuführen.
Jungferkel, die eine Beständigkeit gegenüber einer TGE-Epidemie haben, sind vermutlich durch das Kolostrum und die Milch des Mutterschweins geschützt, von dem sie gesäugt werden. Man nimmt an, daß dieser Schutz durch eine passive laktogene Immunität erreicht wird, die durch Antikörper erhalten wird, welche in dem Kolostrum und der Milch eines immunen Mutterschweins enthalten sind, däs vor dem Werfen dem TGE-Virus ausgesetzt worden ist. Da der TGE-Virus auf der Oberfläche der intestinalen Schleimhaut wirkt und nicht im systemischen Kreislauf, ist zum Schutz der Jungferkel eine kontinuierliche Zuführung der Milch des Mutterschweins erforderlich.
Trächtige Mutterschweine, die mit vom Darm hergeleitetem TGE-Virus gefüttert worden sind, entwickeln eine solche Immunität gegenüber dem Virus und sie schützen ihre saugenden Ferkel. Obgleich diese Praxis im allgemeinen erfolgreich war, um den genährten Wurf passiv zu immunisieren, ist sie doch möglicherweise gefährlich und daher unannehmbar, weil es möglich ist, daß die Krankheit fortgesetzt oder in nicht-befallene Züchtereien eingeführt wird.
Als Ergebnis sind daher Anstrengungen gemacht worden, um den lebenden TGE-Virus der Darmherkunft zu ver<zerten, indem man ihn in die Milchdrüse von trächtigen lIutterschweinen injiziert. Obgleich eine milde Schwellung der injizierten Milchdrtise auftrat, verlief das Werfen normal und die Nutterschweine blieben klinisch während und nach der experimentellen Reizung des genährten Wurfes normal. Weiterhin entwickelte keines der säugenden Schweinchen irgendwelche klinischen Zeichen nach der Reizung. Dies steht anscheinend mit früheren Arbeiten im Gegensatz, die gezeigt haben, daß eine subkutane und intramuskuläre Immunisierung der Mutterschweine nicht dazu imstande war, die saugenden Schweinchen zu schützen.
Ähnliche Ergebnisse sind berichtet worden, wenn lebende Zellkultur-TGE-Viren anstelle von lebenden Darm-TGE-Viren verwendet werden. Kanadische Experimentatoren haben beobachtet, daß TGE-Viren, die über vierzig Durchgänge in Schweinenieren-Zellkulturen kultiviert worden waren, schützten, wenn sie in trächtige Mutterschweine intramammilar hineinokuliert wurden, den resultierenden saugenden Wurf von einer künstlichen Reizung, während Würfe, die von Mutterschweinen gesäugt wurden, die intramuskulär immunisiert worden waren, entweder krank wurden oder starben.
Die gleichen kanadischen Experimentatoren haben auch die intramammare Inokulierung von trächtigen Mutterschweinen mit inaktivierten TGE-Viren von Zellkultur- und Schweineherkunft untersucht. Es wurde beobachtet, daß zwei intramammäre Inokulierungen von jedem Impfstoff, obgleich bis zu einem gewissen Grad der Immunität stimuliert wurde, gemessen durch die Antikörpertiter im Serum und in der Milch, keinen absoluten Schutz verliehen, da die saugenden Schweine eine Morbidität zeigten. Jedoch verliehen drei intramammäre Inokulierungen des trächtigen Mutterschweines mit jedem der inaktivierten TGE-Viren, neben einer Bewirkung von höherem Antikörpergehalt in dem Serum und in der Milch, den saugenden Schweinen einen vollständigen Schutz, wie es durch die Abwesenheit von klinischen Zeichen nach der experimentellen Reizung erwiesen wurde.
In den US-Patentschriften 7 479 430 und 3 585 108 wird beschrieben, daß ein TGE-Virus, der durch rasche Seriendurchgänge in wachstumstragenden Gewebekulturen, z.B.
Schweinenierenkulturen, geschwächt worden war, dem saugenden Jungtier eine Immunität verleiht, wenn er dem Mutterschwein während der letzten sechs Wochen der Trächtigkeit intramuskulär verabreicht wird. In der US-PS 704 203 wird beschrieben, daß ein mit niederem Durchlauf (5 bis 15 Durchgänge) zellgezüchteter Virus von TGE, wenn er inaktiviert und in ähnlicher Weise intramuskulär in ein trächtiges Mutterschwein während der letzten Wochen der Trächtigkeit hineinokuliert wird, dem saugenden Wurf einen hohen Immunitätsgrad verlieh, wenn dieser am vierten Alterstag mit 1000 infektiösen Dosen von TGE-Virus oral gereizt wurde.
In der US-PS 3 519 710 wird beschrieben, daß empfänglichen Jungferkeln ungeachtet der Immunität des säugenden Muttertieres eine aktive Immunisierung gegen TGE verliehen werden kann, indem man den Jungferkeln entweder oral oder parenteral ein abgeschwächtes Im serum aus Schweinezellen-gezüchteten TGE-Viren verabreicht, welches quantitativ ausreichend ist, um die Bildung von Antikörpern hervorzurufen, um eine Immunität gegen TGE zu erreichen.
Neuerdings widerspricht jedoch eine Arbeit von Ristic etal (15. Februar 1972) in "J.A.V.M.A.", Band 160, Nr. 4, einigen der Ergebnisse dieser früheren Arbeiten. Von Ristic wurde nämlich beobachtet, daß ein Hochdurchlauf-Zellkultur-TGE-Virus, der oral, intramammilar oder intramuskulär verabreicht wird, obgleich er die Entwicklung von Antikörpern im Kolostrum und Serum von ausgesetzten Mutterschweinen stimuliert, welche Antikörper dazu imstande sind, den cytopathischen Effekt von Zellkultur-TGE-Viren zu neutralisieren, gereizten Schweinen, die von den geimpften Mutterschweinen gesäugt wurden, keinen Schutz verlieh. Weiterhin ergab sich, daß das Kolostrum der Mutterschweine, wenn es in einem in-vivo-Neutralisationstest getestet wurde, in gleicher Weise negativ war. Der Hauptteil von Antikörpern, die in dem Kobstrum der geimpften Mutter schweine identifiziert wurden, gehörte zur IgG-Klasse der Immunoglobuline anstelle zur IgA-Klasse der Immunoglobulin, die vom Kolostrum von Mutterschweinen isoliert worden waren, die vor dem Werfen oral mit lebenden Darmherkunfts-TGE-Viren inokuliert worden waren. Ristic regt zwei mögliche Hypothesen zur Erklärung dieser immunogenen Diskrepanzen zwischen dem Darmherkunfts- und dem Zellkultur-fortgepflanzten Virus an, nämlich (a), daß der zellgezüchtete Virus eine Mutante des Darmherkunftsvirus ist, und (b), daß beide Viren, obgleich sie serologisch ähnlich sind, immunogen unterschiedliche TGE-Viren sind.
Bei der Erklärung des Schutzeffektes des IgA-AntiRörpers, der vorwiegend in dem Kolostrum und der Milch eines milchabgebenden Mutterschweines vorhanden ist, welches vor dem Werfen mit lebendem Darm-TGE-Virus inokuliert worden ist, regt Ristic an, daß dieser Schutzeffekt möglicherweise auf die Fähigkeit dieses Antikörpers zurückzuführen ist, proteolytischen Enzymen zu widerstehen und daher funktionell intakt durch den Magen durchzugehen, was anscheinend darauf zurückzuführen ist, daß er die sekretorische Stückkomponente besitzt.
Andere Forscher haben früher berichtet, daß cytopathische zellgezüchtete TGE-Viren nicht das einzige äthiologische Mittel von TGE zu sein brauchen und daß ein weiterer nicht-cytopathischer Virus, der in Zelllrulturen wächst und der Zeichen von TGE mit anschließendem Tod oder Widerstand gegen eine weitere Infektion erzeugen kann, auch bei der Gesamtathiologie von TGE im Spiele sein kann.
Aufgrund der vielen Arbeiten von Universitäts- und Industriewissenschaftlern hinsichtlich der Äthiologie und der Prophylaxe oder Heilung von TGE ist es heute anerkannt, daß derzeit immer noch kein völlig zufriedenstellendes Mittel verfügbar ist, um empfindliche Jungferkel entweder aktiv oder passiv zu immunisieren. Der eine TGE-Impfstoff, der von der Veterinary Biologics Division of the U.S. Department of Agriculture zugelassen ist, nämlich ein modifizierter Lebendvirusimpfstoff, der bis zu einem Grad abgeschwächt ist, daß er bei der oralen Verabreichung an ein 72 h altes Jungferkel keine Krankheit oder keinen Tod bewirkt, ist, obgleich er als sicher betrachtet wird, nur teilweise zufriedenstellend. Andererseits kann eine passive Immunisierung von Jungferkeln durch die Milch von Mutter schweinen, die mit dem lebenden Darm-TGE-Virus inokuliert worden sind, deswegen nicht angewendet werden, weil die Gefahr besteht, daß die Krankheit verbreitet wird.
Selbst, wenn für die passive Immunisierung der säugenden Schweine ein zufriedenstellender TGE-Impfstoff entwikkelt würde, dann wäre dieser immer noch bestimmten inhärenten Nachteilen unterworfen. Als erster und wichtigster Nachteil sind die hohen Kosten eines solchen Impfprogramms zu nennen, weil es notwendig ist, alle trächtigen Mutterschweine ungeachtet, ob eine TGE-Epidemie vorhanden ist oder nicht, zu impfen, da die Mutterschweine ihren Würfen nur dann eine laktogene Immunität übertragen können, wenn sie vor dem Werfen geimpft werden. Dies ist aber ein Programm vom Versicherungstyp und die Kosten wären für viele SchzAreinezUchter nicht annehmbar. Als zweiter Nachteil ist zu nennen, daß die laktogene Immunität durch eine schwere Reizung des TGE-Virus gebrochen werden kann, oder wenn die Jungferkel eine nicht-angemessene Menge der Milch des Mutterschweines zu sich nehmen, was z.B. auf ein abnormales Laktationsmuster des Mutterschweines zurückzuführen sein kann. Ferner kann eine laktogene Immunität versagen, wenn der Titer der TGE-Antikörper in der Milch des Mutterschweines nennenswert während der Laktationsperiode zurückgeht.
Versuche, um Jungferkeln, d.h. solchen mit einem Alter von weniger als 2 Wochen, wenn die Mortalität am größten ist, durch Verwendung eines geschwächten TGE-Impfstoffes eine aktive Immunität zu verleihen, wie es z.B. in der US-PS 3 704 203 beschrieben worden ist, sind nicht zufriedenstellend gewesen. Vermutlich ist das auf die immunogene Unreife der Jungferkel zurückzufren.
Es ist weiterhin kein prophylaktisches oder therapeutisches Produkt auf der Basis der Chemotherapie oder einer Anti-TGE-Antikörpertherapie bekannt, das epidemische Ausbrüche von TGE verhindert oder heilt, obgleich die Äthiologle und Pathogenese von TGE seit langem aufgeklärt ist und eine Notwendigkeit für solche prophylaktische oder therapeutische Produkte besteht.
Im Hinblick auf den derzeitigen Stand der Technik hinsichtlich der Stimulierung von Antikörpern in der Milchdrüse von milchabsondernden Rindern ist es ein allgemeines Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, um in der Milch eines milchabsondernden Rindes die Menge von Antikörpern zu erhöhen, die für ein Antigen spezifisch sind, welches sich in der Milchdrüse eines milchabsondernden Rindes nicht fortpflanzt, das jedoch dazu imstande ist, eine meßbare Antikörperantwort zu stimulieren.
Weiterhin soll durch die Erfindung ein Rindermilchprodukt zur Verfügung gestellt werden, das Anti-TGE-Antikörper enthält, welche dazu imstande sind, TGE-empfindliche Jungferkel zu schützen. Durch die Erfindung soll auch ein technisch und wirtschaftlich durchführbares Verfahren zur Herstellung eines solchen Rindermilchprodukts und schließlich eine Methode zum Schutz von Jungferkeln gegen TGE unter Verwendung eines solchen Rindermilchprodukts zur Verfügung gestellt werden.
Erfindungsgemäß wird nun die Milchdrüse eines milchabsondernden Rindes mit einem Antigen, das sich in der Drüse nicht fortpflanzt, welches aber dazu imstande ist, eine meßbare Antikörperantwort zu stimulieren, an mindestens zwei aufeinanderfolgenden Tagen in Intervallen während der Laktationsperiode des Rindes restimuliert, wobei die Milchdrüse des Rindes zuerst mit dem Antigen vorstimuliert worden ist, indem das Antigen in die Drüse des Rindes entweder vor seiner Trockenpräpartumperiode oder während der 24-h-Periode nach dem Gebären inokuliert worden ist.
Die Figuren 1, 2, 3 und 4 stellen Diagramme dar, welche die in-vitro-bestimmten TGE-Antikörpertiter der Milch der Kühe 10, 359, 102 bzw. 406 zeigen. Diese in den Beispielen beschriebenen Kühe wurden in regelmäßigen Intervallen mit einem immunogenen lebenden TGE-Virus nach dem Verfahren der Erfindung restimuliert.
Obgleich für die Erfindung jedes Rind verwendet werden kann, werden normalerweise Milchkühe verwendet und insbesondere diejenigen Rassen, die die höchste Milchausbeute geben, z.B. Holstein-Kühe.
Die Antigene, die bei der Erfindung verwendet werden, können alle Substanzen sein, die nach intramammärer In-Sektion in die Milchdrüse eines milchabsondernden bzw.
laktierenden Rindes (1) sich in der Milchdrüse nicht fortpflanzen, (2) in der Milchdrüse keine signifikante Mastitisreaktion bewirken und (3) dazu imstande sind, eine meßbare Antikörperantwort in der Brustdrse nach 1 bis 6 einzelnen intramammären Drüseninjektionen in Intervallen von 4 bis 10 Tagen zu stimulieren. Potentiell geeignete Antigene können alle beliebigen Viren, Mycoplasmen, Rickettesien, Bakterien, Pilze, Protozien, Proteine, allergiebewirkenden Substanzen usw. sein, die diese drei Eigenschaften besitzen, wenn sie intramammär in die Milchdrüse eines laktierenden Rindes hineinokuliert werden. Beispiele für Antigene, die diese drei Eigenschaften haben und daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind der Virus der übertragbaren Gastroenteritis, der Virus der Kalbsruhr, die Bakterien der Schweinedysenterie, der Synzytiumvirus, Mycoplasmen, Vibra-Cholera-Bakterien, Poliomyelitisviren, Escherichia-coli-Bakterien, Shigella-sp-Bakterien und bestimmte Erregungsmittel für Krankheiten der Atmungsorgane, bei denen der Schutz von lokal erzeugtem sekretorischen IgA begleitet ist. Alle beliebigen lebenden Antigene, z.B. Bakterien, Viren und Pilze, die als solche nicht verwendet werden können, da sie eine signifikante Mastitisreaktion ergeben, können für das Verfahren der Erfindung geeignet gemacht werden, indem man sie zuerst nach bekannten Methoden, beispielsweise durch eine Abschwächung, Inaktivierung oder Detoxifizierung, behandelt, um ihre infektiösen und pathogenen Eigenschaften für die Milchdrüse zu neutralisieren oder auf einen annehmbaren Wert zu vermindern, wobei darauf geachtet wird, daß die ursprünglichen immunogenen Charakteristiken des lebenden Organismus nicht signifikant verändert werden. Da lebende Organismen gewöhnlich eine maximale Antikörperreaktion erzeugen, werden sie für die Erfindung bevorzugt, wenn durch ihre Verwendung keine signifikante Mastitisreaktion entsteht. Die Antigene werden in einem geeigneten flüssigen Medium, z.B.
einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung, zur intramammären Injektion aufgelöst, wobei darauf geachtet wird, daß die Lösungen keine verunreinigenden Substanzen enthalten, die eine Infektion der Milchdrüse bewirken könnten, oder andere äußere Antigene, die die Stimulierung der Antikörper von dem Antigen vermindern können.
Bei der Bestimmung, ob ein potentielles Antigen für das Verfahren der Erfindung geeignet ist, wird eine Menge des Antigens, das in einer aseptischen biologischen Lösung dispergiert ist, die mit der Milchdrüse der Kuh verträglich ist, in jedes Viertel der Milchdrüse einer laktierenden Kuh in einer Konzentration und mit einem Volumen eingespritzt, die ausreichend sind, um eine Antikörperreaktion hervorzurufen, jedoch nicht so hoch sind, daß eine Mastitisreaktion bewirkt wird.
Wenn es scheint, daß sich das Antigen in der Drüse vermehrt, was sich durch die Anwesenheit des Antigens in der Milch des Rindes, die beim zweiten oder bei einem späteren Melken nach dem Impfen erhalten wird, anzeigt, und wenn eine nennenswerte Menge von Antikörpern danach in der Milch entdeckt werden, nachdem das Antigen nicht mehr länger vorhanden ist, dann irürde es sich hierbei um ein geeignetes Antigen für die Durchführung der Erfindung handeln. Wenn jedoch keine Virusfortpflanzung oder Antikörperantwort innerhalb 14 Tagen nach der ersten Injektion beobachtet wird, dann werden Injektionen entweder mit konstanten oder alternativ mit ansteigenden Dosen des Versuchsantigens in regelmäßigen Intervallen, z.B. 4 bis 10 Tagen, für bis zu 6 Inokulierungen wiederholt, um zu bestimmen, ob in der inokulierten Milchdrüse irgendwelche Antikörper gebildet worden sind, was sich durch das Vorhandensein von Antikörpern in der Rindermilch anzeigt. Wenn während des Verlaufs des Gebens dieser Versuchsinokulierungsschüsse eine Mastitisreaktion, die auf keinen anderen Grund zurückführbar ist, beobachtet wird und wenn das Volumen und die Dosis der Schüsse nicht als zu hoch angesehen wird oder wenn nach 6 Versuchsstimulierungen entweder mit konstanten oder allmählich ansteigenden Dosen keine Antikörper in der Milch des laktierenden Rindes gefunden werden, dann kann angenormen werden, daß die Versuchssubstanz kein geeignetes Antigen für die Durchführung dieser Erfindung ist. Wenn jedoch das untersuchte Antigen eine meßbare Antikörperantwort in dem Euter des laktierenden Rindes erzeugt, wie es durch das Vorhandensein von Antikörpern in der Milch des Rindes ausgewiesen wird, ohne daß irgendnfelche Zeichen für eine Fortpflanzung gezeigt werden und ohne daß weiterhin irgendeine signifikante Masbitisreaktion bewirkt wird, dann kann diese Substanz als geeignetes Antigen für die Durchführung der Erfindung angesehen werden.
Obgleich gewöhnlich nur eine Art eines latenten Antigens pro Laktationsperiode verwendet wird, kann es doch Fälle geben, wo ein Gemisch von Antigenen verwendet werden kann, um ein immunes Milchprodukt zu erhalten, das mehr als einen Typ von Antikörpern hat, wenn Versuche anzeigen, daß dies durchgeführt werden kann, ohne daß eine Mastitisreaktion hervorgerufen wird, und daß ein annehmbarer Wert von Antikörpern erhalten werden kann.
In jedem Fall sollte der gleiche Typ oder die gleichen Typen von Antigenen durch eine Laktationsperiode hindurch verwendet werden. Schlechtere Ergebnisse werden erhalten, wenn neue Typen eines latenten Antigens zuerst verwendet werden, nachdem die Laktation begonnen hat. Wenn ferner das immune Milchprodukt dazu verwendet werden soll, um dazu beizutragen,um Tiere vor einer Krankheit zu schützen, die durch den Organismus bewirkt wird, von dem sich das Antigen herleitet, dann sollte das verwendete Antigen ein solches sein, das die Produktion von Antikörpern stimuliert, die dazu imstande sind, die Organismen, wie sie in ihren natürlichen Wirten vorkommen, zu neutralisieren.
Eine Vielzahl von Methoden kann dazu verwendet werden, um die Rindermilchantikörper zu erfassen und quantitativ zu bestimmen. Diese Methoden schließen serologische invitro-Tests ein, bei denen die Reaktionen zwischen dem Antigen und dem Milchantikörper beobachtet und mikroskopisch oder makroskopisch aufgezeichnet werden, und in-vivo-Neutralisationstests, bei denen das Wirtstier der Indikator für die Testergebnisse ist.
Für die am aufeinanderfolgenden Tag erfolgende Vielfach-Restimulierungs-Verfahrensweise gemäß der Erfindung, um wirksam erhöhte Ausbeuten von Antikörpern für das latente Antigen zu erzeugen, ist es erforderlich, daß die Milchdrüse der Kuh entweder während der Vorgebärungs-Trockenperiode oder sobald nach dem Kalben, wie es möglich ist, und nicht später als 24 h danach, mit mindestens einer und vorzugsweise zwei Inokulierungen bzw. Imclungen des latenten Antigens vorstimuliert wird. Da gefunden wurde, daß die Vorgebärungs-Vorstimulierungs-Verfahrensweise in dem laktierenden Rind die größte Antikörperant,çort gibt, wird sie bevorzugt. Während eine Vorgebärungs-Inokulierung in die trockene Milchdrüse eine erhöhte Antikörperausbeute in der darauffolgenden Milch der Kuh induziert, wird es doch bevorzugt, mindestens zwei, in manchen Fällen drei oder mehr Vorgebärungs-Inokulierungen durchzuführen, um die Antikörperausbeute auf einen Maximalwert zu bringen. Wenn mehr als eine Vorgebärungs-Inokulierungs angewendet wird, dann werden bessere Ergebnisse beobachtet, wenn sie im Abstand von etwa 1 bis 2 Wochen vorgenommen werden, wobei die letzte Inokulierung etwa eine Woche bis drei Wochen vor dem erwarteten Kalbungsdatum gegeben wird. Wenn nur eine Präpartuminokulierung verwendet wird, dann wird sie am besten etwa 1 bis 3 Wochen vor dem Kalben verabreicht. Wenn die letzte oder die einzige Vorstimulierung innerhalb der 6-Tage-Periode unmittelbar vor dem Kalben verabreicht wird, dann kann die Ausbeute der Antikörper in dem Kolostrum und in der ersten Milch für-einige Antigene vermindert sein. Wenn weiterhin Vielfach-Präpartum-Vorstimulierungen vor einigen Antigenen in einem zu engen Zeitraum, z.B. im Abstand von 1 bis 6 Tagen, gegeben werden, dann kann ein erhöhtes Risiko einer Beschädigung des Euters bestehen.
enn eine geringere Menge der Antikörper annehmbar ist oder wenn aus einem gewissen Grund die Kuh vor dem Kalben nicht vorstimuliert worden ist, dann kann die Kuh sobald nach dem Kalben, wie möglich, vorstimuliert werden, wobei der Zeitpunkt der Injektion nicht später als 24 h nach dem Kalben liegt. Wenn diese "Tag-des-Kalbens"-Inokulierungsverfahrensweise angewendet wird, dann wird nach an aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführten Vielfach-Restimulierungen eine höhere Antikörperantwort erhalten, indem eine zweite Inokulierung innerhalb eines Zeitraums von 18 bis 30 h nach der ersten Inokulierung gegeben wird.
Vor einer solchen zweiten Vorstimulierung sollte die Kuh zuerst gemolken werden.
Das Volumen und die Dosierungen von entweder der Vorgebärungs- oder Tag-des-Kalbens-Vorstimulierungen sollten von der gleichen allgemeinen Größenordnung sein wie bei der nachstehend beschriebenen, am aufeinanderfolgenden Tag erfolgenden Vielfach-Restimulierungsverfahrensweise.
Die am aufeinanderfolgenden Tag erfolgende Vielfach-Restimulierungsverfahrensweise wird normalerweise begonnen, wenn der Gehalt an Antikörpern in der Milch nach dem Kolostrum auf einen wirtschaftlich unannehmbaren Wert abfällt. Dieses Anfangsintervall kann bei verschiedenen Kühen, die das gleiche Antigen erhalten, oder bei Kühen, die verschiedene Antigene erhalten, variieren, so daß keine exakte Zeitperiode angegeben werden kann. Im allgemeinen ist für die meisten Antigene ein Intervall von etwa 5 bis 10 Tagen die übliche Periode. Die Vielfach-Restimulierungen der Milchdrüse des laktierenden Rindes werden vorzugsweise so verabreicht, daß ein Zeitraum von 18 bis 26 h zwischen den Inokulierungen an aufeinanderfolgenden Tagen besteht. Bei Anwendung von weniger als etwa 18 h kann die nachfolgende Antikörperproduktion vermindert werden. Wenn eine größere Zeitspanne als etwa 26 h angewendet wird, dann besteht die N'glichkeit, daß das Kuheuter mit Milch überfüllt und entzündet wird, wodurch es gegenüber bakteriellen Infektionen und Beschädigungen mit einem möglichen Verlust der zukünftigen Milchproduktion empfindlich wird. Die hierin verwendete Bezeichnung ?1aufeinanderfolgende Tage" soll alle beliebigen Serien von zwei oder mehr Restimulierungen bedeuten, die so verabreicht werden, daß ein Zeitintervall von etwa 18 bis 26 h zwischen zwei beliebigen Restimulierungen besteht, obgleich es Fälle geben kann, wo sie am gleichen Tag verabreicht werden, wo sie mit einem Abstand von weniger als 24 h verabreicht werden oder wo sie mit einem dazwischenliegenden Tag mehr als 24 h voneinander entfernt verabreicht werden.
Um die Wirksamieit der am aufeinanderfolgenden Tag durchgeführten Vielfach-Restimulierungsverfahrensweise zu maximalisieren, werden die Kühe vorzugsweise nur einmal und im Zeitpunkt so eng vor der Verabreichung der Restimulierungsschüsse wie es möglich ist ausgemolken. Wenn sie mehr als einmal oder zu einem nennenswerten Zeitraum vor der Restimulierung, z.B. 4 h oder mehr, ausgemolken werden, dann können die nachfolgenden Ausbeuten der Antikörper signifikant vermindert sein. Aus diesem Grund sollte der Zeitraum zwischen dem Ausmelken und der Restimulierung auf einem praktischen Minimum gehalten werden und die Kühe sollten in dem Zeitraum zwischen zwei aufeinanderfolgenden Schüssen nur einmal gemolken werden. Nach der Endrestimulierung am aufeinanderfolgenden Tag erfolg das erste Melken der Kuh vorzugsweise etzma 18 bis 24 h nach der Inokulierung, wenn eine maximale Antikörperproduktion realisiert werden soll. Für jede beliebige Kuh, die ein hoher Milcherzeuger ist, kann es nach jeder der Restimulierungsinokulierungen erforderlich sein, die teilweise vor dem Verstreichen der bevorzugten 18- bis 26-h-Perioden zwischen vollständigen Melkungen teilweise zu melken, wenn das Euter mit Milch zugefüllt und ausgedehnt wird und die Kuh eine Halteperiode von 18 bis 26 h zwischen den Melkungen ohne mögliche Beschädigung des Euters nicht aushalten kann.
Obgleich für die meisten Antigene zwei am aufeinanderfolgenden Tag durchgeführte Restimulierungen normalerweise als das Optimum angesehen werden, kann es einige Antigene geben, die eine maximale Antikörpermenge ergeben, wenn drei am aufeinanderfolgenden Tag durchgeführte Restimulierungen angewendet werden. Wenn gefunden wird, daß ein Drei-Inokulierungs-Arbeitsplan am vorteilhaftesten ist, und wenn nach diesem verfahren wird, dann sind natürlich die oben hinsichtlich der Anzahl und Zeitbestimmung des Melkens beschriebenen bevorzugten Praktiken in gleicher Weise anwendbar und es sollte ihnen gefolgt werden, wenn eine maximale Antikörperausbeute erhalten werden soll.
Bei der Durchführung der am aufeinanderfolgenden Tag durchgeführten Vielfach-Restimulierungsarbeitsweise gemäß der Erfindung wird festgestellt werden, daß die Antikörperantwort während der folgenden 1 bis 2 Tage nach der letzten am aufeinanderfolgenden Tag durchgeführten Restimulierung zu einer maximalen Ausbeute ansteigt, welche in manchen Fällen als das 16-fache des Antikörpergehalts vor der Restimulierung beobachtet worden ist. Sodann geht sie allmählich auf den vorherigen Titer zurück. Obgleich die Anzahl der Tage der erhöhten Antikörperproduktion zwischen verschiedenen Serien von Restimulationen und auch zwischen verschiedenen Antigenen variieren kann, wird normalerweise festgestellt werden, daß erhöhte Ausbeuten für etwa 4 bis 10 Tage erhalten werden können, wonach die am aufeinanderfolgenden Tag durchgeführte Vielfach-Restimulierungsarbeitsweise erneut angewendet werden kann, um die Produktion der Milchantikörper zu restimulieren.
Für die meisten Antigene ist die optimale Zeit zur Wiederholung der Vielfach-Restimulierungen im allgemeinen der erste oder der zweite Tag nach dem Abfall des vorigen Restimulierungstiterwertes. Es kann jedoch Situationen geben, wo..die weitergehende Antikörperantwort ausreichend sein kann, um eine Weiterführung des Melkens über eine Anzahl von Tagen zu rechtfertigen, wenn eine Wirtschaftsanalyse darauf hinweist, daß der Wert der Antikörper, die erzeugt werden, nicht eine sofortige Restimulierung rechtfertigt. In jedem Fall geht man davon aus, daß für die meisten latenten Antigene das optimale wirtschaftliche Intervall zwischen zwei am aufeinanderfolgenden Tag durchgeführten Inokulierungen als in den Bereich von 4 bis 10 Tagen fallend bestimmt wird, wobei 5 bis 8 Tage das üblichste und bevorzugteste Zeitintervall sind. Es wird darauf geachtet, daß die Reihe der aufeinanderfolgenden Restimuliergen in der Zeit nicht so eng ist, daß eine immunologische Lahmung des Euters oder ein Aufblähen des Euters oder eine Nastitisreaktion bewirkt werden.
Sowohl bei den Vorgebärungs- oder Tag-des-Kalbens-Vorstimulierungen als auch bei den am aufeinanderfolgenden Tag durchgeführten Vielfach-Restimulierungen wird es bevorzugt, daß Jedes Viertel der Milchdrüse inokuliert wird, wobei vorzugsweise eine subkutane Spritze und eine Nadel verwendet werden, die in die Wand des Euters nahe an die Basis der Warzen in solcher Weise eingesetzt werden, daß das injizierte Antigen die Zisterne des Euters erreicht.
Obgleich auch eine Infusion durch die Warzen von jedem Viertel angewendet werden kann, kann diese Methode doch infektiöse Organismen in die Drüse hineinführen, so daß sie nicht bevorzugt wird. Bei jeder Methode sollten natürlich aseptische Verabreichungsweisen angewendet werden. Wenn weniger als alle Viertel inokuliert werden, dann kann die Menge der Antikörper, die in der Milch erhalten wird, vermindert sein. Das Volumen der Antigendosis, die in jedes Viertel inokuliert wird, sollte für die meisten Antigene etwa 1 bis 10 ml sein. Dosierungen von weniger als etwa 1 ml können möglicherweise keine gute Verteilung des Antigens in dem Euter ergeben, während mehr als etwa 10 ml eine Mastitis und eine mögliche Beschädigung des Euters bewirken können. Bei manchen Antigenen können selbst 10 ml zu viel sein und in solchen Fällen sollte die Maximaldosis nicht über etwa 5 bis 7,5 ml hinausgehen. Die Konzentration des Antigens wird daher normalerweise so eingestellt, daß diese bevorzugte 1-bis-1O-ml-Injektionsdosis pro Viertel verwendet werden kann. Wenn die Konzentration des Antigens in dem suspendierenden flüssigen Medium zu niedrig ist, somit Dosen von mehr als etwa 10 ml pro Viertel für jede Inokulierung erforderlich wären, kann eine Konzentrierung mittels Lyophilisierung oder Eindampfen erfolgen. Im Idealfall sollte, wenn möglich, die Konzentration des Antigens in den Dosen bei oder gerade unterhalb des Optimalwerts liegen, wie er in dem Wirtstier vorkommt, in dem das Antigen erzeugt wird.
Die optimale Dosis (Volumen x Titer des Antigens) der Vorstimulierungs- und Restimulierungsinokulierungen, die erforderlich ist, um die Antikörperproduktion zu maximalisieren, variiert entsprechend dem Typ des verwendeten Antigens, kann aber rasch durch orientierende Vorversuche für ein gegebenes Antigen bestimmt werden. Die Dosis des Antigens, die verwendet wurde, um zu bestimmen, ob es für die Erfindung geeignet ist, könnte als Ausgangspunkt für solche Vorversuche verwendet werden. Im allgemeinen bestimmt sich die Dosis durch wirtschaftliche Erwägungen, d.h. es wird die minimale Dosis, die mit einer hohen Ausbeute an Antikörpern einhergeht, verwendet. Oberhalb einer bestimmten Dosis sind weitere Erhöhungen der Ausbeute so minimal, daß die Kosten des weiteren verwendeten Antigens nicht gerechtfertigt sind. Schließlich sollte die Dosis des latenten Antigens nicht so hoch sein, daß eine immtmogene Lähnung, Mastitis oder eine andere Disfunktion der Milchdrüse bewirkt wird.
Der Prozeß der Erzeugung von Antikörpern durch die am aufeinanderfolgenden Tag durchgeführten Vielfach-Restimulierungen gemäß der Erfindung wird normalerweise so lange weitergeführt, wie die Kuh eine annehmbare Milchausbeute erzeugt und festgestellt wird, daß die Milch eine geeignete Menge von Antikörpern enthält. Da Milchkühe gewöhnlich 5 Monate lang und in manchen Fällen bis zu 7 Monaten nach dem Kalben wirtschaftlich annehmbare Milchausbeuten ergeben, kann das Vielfach-Restimulierungsverfahren über 5 und möglicherweise bis zu 7 Monaten weitergeführt werden, wenn ein wirtschaftlich geeigneter Gehalt von Antikörpern in der Milch weiterhin erhalten wird. Wenn sich jedoch der Gehalt der Antikörper während der letzteren Monate der Laktationsperiode vermindert, wodurch die Kosten auf einen nicht annehmbaren Wert erhöht werden, oder wenn eine Mastitisreaktion auftritt, dann kann naturgemäß beschlossen werden, die erfindungsgemäßen Restimulierungen zu un-terbrechen. In jedem Falle sollte, ungeachtet der Milchproduktionsgeschichte der Kuh, wenn sie nach der nächsten Kalbungsperiode dazu verwendet werden soll, um Antikörper entweder für das gleiche oder ein unterschiedliches Antigen herzustellen, bis etwa 8 bis 10 Wochen vor dem erwarteten Kalbungstag trocken gelassen werden, um eine gute Milcherzeugungsfähigkeit in der nachfolgenden Laktationsperiode gemäß der Milchwirtschaftspraxis zu gewährleisten.
Kühe, die erfindungsgemäß restimuliert werden, werden vorzugsweise unter Verwendung von aseptischen Methoden gemolken, um eine Verunreinigung der Milch mit infektiösen Organismen zu minimalisieren.
Die ganze immune Milch, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird, kann so, wie sie erzeugt wurde, direkt verwendet werden, z.B. als therapeutische oder prophylaktische Futterergänzung. Alternativ kann die immune Milch weiter gereinigt oder konzentriert werden, indem z.B. die ganze Milch entrahmt wird, um ein Magermilchprodukt für solche Zwecke, wie zur Erhöhung der Lagerungsstabilität oder zur Erhöhung der Konzentration der Antikörper in dem Produkt, zu erhalten.
Wenn ein immunes Milchprodukt, das von Kasein frei ist, gewünscht wird, dann kann das Magermilchprodukt mit einer geeigneten kaseinausfällenden Substanz, z.B. Essigsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Labferment und dergleichen, behandelt werden und das ausgefällte Kasein kann entfernt werden, um ein Molkeprodukt herzustellen, das den Hauptteil der Antikörper enthält, die in der ursprünglichen Ganz- bzw. Vollmilch enthalten waren. GewUnschtenfalls kann sogar ein noch reineres Produkt, z.B. für analytische Zwecke, erhalten werden, indem man die Gammaglobulinfraktion der Molke, die den Hauptteil der Antikörper enthält, mit einem Gammaglobulin ausfällenden Salz, z.B.
Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und dergleichen, aussalzt.
Die ausgefällte Gammaglobulinfraktion kann nach dem Waschen und Trocknen als Feststoff verwendet werden oder sie kann alternativ in einem geeigneten Dispergierungemedium redispergiert werden. Schließlich können gewünschtenfalls die verschiedenen, in der Gammaglobulinfraktion vorhandenen Antikörper isoliert werden, indem der Gammaglobulinniederschlag in einer geeigneten Lösungsmittelmedium wieder aufgelöst wird und indem die resultierende Lösung einer säulenchromatographischen oder Elektrophoresebehandlung unterworfen wird.
Alle vorstehend genannten flüssiger immunisierten Milchprodukte können gewünschtenfalls weiter konzentriert werden, z.B. durch Vakuumverdampfen, wobei Temperaturen und Zeitbedingungen angewendet werden, die einen Verlust der Antikörperkraft auf einen Minimalwert zurückführen. Alternativ können alle obengenannten immunisierten flüssigen Milchprodukte in ein festes Produkt umgewandelt werden, das im wesentlichen von einem Dispergierungsmedium frei ist. Dies kann beispielsweise durch Sprühtrocknen oder Vakuumtrocknen geschehen, wobei die angewendeten Temeraten so ausgewählt werden, daß der Verlust an Antikörnern auf einen Minimalwert zurückgeführt wird. Dies kann auch durch Gefriertrocknen geschehen. Solche festen Produkte können als solche verwendet erden oder sie können vom Endverbraucher in einem geeiffneten Dispergierungsmedium wieder dispergiert werden.
Ungeachtet der eingenommenen Form wird jedes der oben beschriebenen Produkte als ein Milchprodukt angesehen, welches im Sinne der Erfindung Antikörper enthält. Solche Produkte sollten normalerweise vor der Verwendung bei Temperaturen gelagert werden, die einen Verlust der Antikörperwirkung auf einen Minimalwert zurückführen. Für den gleichen Zweck oder zur Beibehaltung der Sterilität können mit allen beliebigen der immunisierten Milchprodukte Stabilisatoren oder Konservierungsmittel, wie Kaopectat-Verbindung, Merthiolat oder Antibiotika, vermischt werden.
Die immunen Milchprodukte können dazu verwendet werden, um die Verhinderung oder Heilung von Krankheiten zu unterstützen, die durch Organismen hervorgerufen werden, von denen sich das Antigen herleitet. Sie können insbesondere dazu wirksam sein, um die Kontrolle von enterischen Krankheiten zu unterstützen, bei denen sich das erregende Mittel im Verdauungstrakt fortpflanzt. Bei solchen Krankheiten können die immunisierten Milchprodukte den gefährdeten oder kranken Tieren in einem Futter oder in einer flüssigen Ergänzung in analoger Weise, wie es derzeit bei Antibiotika geschieht, verfüttert werden, um die Prophylaxe oder Heilung der Krankheit zu unterstützen. Bei Atmungskrankheiten können die gereinigteren Produkte, z.B.
die Gammaglobulinfraktion, in einer geeigneten biologischen Lösung in zerstäubter Form den bedrohten oder infizierten Stellen zugeführt werden. Für systemische Krankheiten können solche gereinigten immunisierten Milchfraktionen am besten parenteral in geeigneten biologischen Dispergierungsmedien verabreicht werden.
Die stärker gereinigten immunisierten Milchprodukte, z.B.
die Molke oder die Gammaglobulinfraktionen, können auch als Analysenreagentien verwendet werden, um unbekannte Arten oder Mengen eines besonderen Mikroorganismus, für den sie spezifisch sind, zu charakterisieren oder quantitativ zu erfassen. Schließlich können sie auch dazu verwendet werden, um einen Organismus aus einem Gemisch von Organismen nach ähnlichen Methoden zu isolieren, wie sie bei der immunologischen Isolierung von männlichen Spermatozoen gemäß der US-PS 3 692 897 angewendet werden.
Beispiel Herstellung des TGE-Antigens, das zur Inokulierung des Rindes verwendet wurde: Das TGE-Antigen, das zur Vorstimulierung und Restimulierung des Rindes verwendet wurde, war ein Ohio-TGE-Virus-Isolans (Ohio TGE virus Isolant), der nach folgender Verfahrensweise in drei Tage alten Jungferkeln gezüchtet und daraus gewonnen wurde.
Das Ohio-TGE-Isolans wurde aus den Darm- und Schleimhautgeweben von Jungferkeln während eines Ausbruchs von TGE in der Gegend von Spencerville, Ohio, im Verlauf von 1968 bis 1969 isoliert. Der isolierte Virus wurde als das Pathogen von TGE identifiziert, weil er typische Anzeichen von TGE, z.B. Erbrechen, wäßrige Diarrhoe und Entwässerung, erzeugte, als er drei Tage alten Ferkeln zugeführt wurde, und weil er Schmieren, wie die zuvor identifizierten TGE-Viren, ergab, wenn er mit fluoresceinkonjugierten Anti-TGE-Antikörpern verfleckt wurde.
Das Ohio-TGE-Virus-Isolans, das bei diesem Ausbruch erhalten wurde, wurde sodann wie folgt dazu verwendet, um einen TGE-Vorratsvirus herzustellen. Drei Tage alte Jungferkel wurden oral mit einer infektiösen Dosis des Ohio-TGE-Virus-Isolans inokuliert und nach dem Erkranken wurden sie getötet. Die Darmgehalte und das Schleimhautgewebe der infizierten Jungferkel wurden sodann nach der Methode von Ristic et al, beschrieben in "Electron Microscopy and Ether Susceptivity of Transmissal of Gastroenteritis Viruses of Sinne, Am. J. Vet. Res., Band 26 (1965), Seiten 609 bis 616, extrahiert und gereinigt. Insbesondere wurden die Jungferkel, die mit dem Ohio-TGE-Virus-Isolans infiziert worden waren und die typische Anzeichen von TGE zeigten, 48 h nach der Infektion getötet. Das Ilium, Jejunum und Duodenum wurden entfernt, in Glasbehälter gegeben und mindestens 24 h bei -550C gelagert. Die Gewebe wurden sodann bei 40C aufgetaut und in einer 0,15m-phosphatgepufferten Salzlösung (PBS), enthaltend 1000 Einheiten Penicillin, 2,5 mg Streptomycin und 5 Einheiten Mycostatin pro ml der PBS-Lösung, in einem Volumen, ausreichend um eine 20ige Dispersion (Gewicht/Volumen) zu ergeben, suspendiert. Die suspendierten Gewebe wurden in einem elektrischen Mischer bei 40C ungefähr 2 min lang homogenisiert und dann 20 min bei 4°C mit 10000 x G zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde sodann weiter gereinigt, um irgendwelche verunreinigenden Viren oder Bakterien zu entfernen, indem sie auf die Oberseite von nicht-diffundierten Saccharosedichtegradientenschichten (10, 20, 30 und 40 Gew.-% Saccharose) geschichtet wurden, die in 50-ml-Kunststoffzentrifugierrohren enthalten waren, und indem die Rohre 30 min bei 4°C mit 41000 x G zentrifugiert wurden. Das Band des Materials, das sich zwischen den 10-und 20-%-Saccharoseschichten gebildet hatte, wurde gewonnen und es wurde festgestellt, daß es sich um einen'hoch infektösen TGE-Virus mit einem LD50-Titer von 10 5 pro ml, bestimmt nach dem Jungferkeltitrationstest, der nachstehend beschrieben wird, handelte.
Das TGE-Virusantigen wurde hergestellt, indem der TGE-Vorratsvirus 3 Tage alten, von spezifischen Pathogenen freien (SPF) Schweinen, die in einzelnen Isolierungseinheiten untergebracht waren, zugeführt wurde. Jedes Schwein erhielt eine Dosis von 105 LD50-Einheiten des TGE-Virus oral 2 h nach dem vorhergegangenen Füttern. Die Schweine wurden mit 100 ml einer Milch dreimal am Tag gefüttert, die aus pasteurisierter Lagermilch, Eiern und einem Mineralgemisch bestand. Die infizierten Schweine, die typische Zeichen von TGE zeigten, wurden 48 h nach der Infektion getötet und das Ilium, Jejunum und Duodenum wurden entfernt und in Glasbehältern mindestens 24 h bei -650C gelagert. Die infizierten Gewebe wurden danach bei 40C aufgetaut und in einem vorgekühlten elektrischen Mischer 1 bis 2 min emulgiert. Zu dem Mischer wurde eine "Cold Hankts Balance Salt Solution (HBSS)" mit einem pH-Wert von 7,2 allmählich in einem genügenden Volumen gegeben, daß eine 10/o (Gewicht/Volumen) Darmsuspension erhalten wurde (10 g emulgierte Darmgewebe in 90 ml HBSS), und die Suspension wurde 20 min bei 40C in 250-ml-ltunststoffzentrifugenrohren mit 10000 x G zentrifugiert. Die resultierende überstehende Flüssigkeit, die das suspendierte TGE-Virusantigen enthielt, wurde gesammelt und abgekühlt. Es wurden 0,05 ml Kalbsserum, 100 Einheiten Penicillin und 100 mcg Streptomycin pro ml der Virus suspension zugegebe und das fertige TGE-Virusantigen wurde in Impfflaschen bei -650C gelagert, bis es veskrendet wurde.
Die Virulenz des TGE-Virusantigens wurde bestimmt, indem der Virus in drei Tage alten Schweinen titriert wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse wurden als lethale Dosis50 (LD50) - die höchste Verdünnung des TGE-Virus, der 50% der drei Tage alten Schweine, die oral mit dem TGE-Virusantigen inokuliert wurden, abtötet - ausgedrückt. Die LD50-Titrationsverfahrensweise wurde vorgenommen, indem die TGE-Virusantigensuspension mit einer "Hank's Balanced Salt Solution" mit einem pH-Wert von 7,2 verdünnt wurde, wobei 1 0-fache Verdünnungen, beginnend mit 1 : 10 bis zu 1 1000000 Verdünnungen, verwendet wurden. 1 ml jeder Virusverdünnung wurde oral jedem von sechs drei Tage alten Jungferkeln 2 h nach einem zuvordurchgeführten Füttern verabreicht. Danach wurden sie in einzelnen Isolierungs einheiten gehalten und mit der oben beschriebenen Milchformulierung dreimal am Tag gefüttert. Die Schweine wurden täglich auf Anzeichen von TGE untersucht und die Mortalitätsraten wurden 7 Tage nach der TGE-Virus-Inokulierung aufgenommen. Aufbauend auf den beobachteten Mortalltätsraten wurde der 50;'"Endpunl;t (LD50) nach der Methode von Reed und Münch beschrieben in Am.J.Hyg., Band 27 (1938), Seiten 493 bis 497, errechnet.
Eine Reihe von Ansätzen des TGE-Virusantigens, hergestellt und getestet wie oben beschrieben, hatte Infektlonstiter, die sich von einer LD50 von 10 5 bis 5 ' 5 pro ml erstreckten. Wenn weiterhin 5-ml-Dosen der TGE-Virusantigenansätze (5 x 105 LD50) an trächtige Mutterschweine, die gegenüber dem TGE-Virus serologisch negativ waren, vier Wochen vor dem erwarteten Wurfdatum verfüttert wurden, dann waren die säugenden Jungtiere geschützt, wenn sie mit 100 LD50 des NADL-TGE-Virus am oder nach dem dritten Alterstag gereizt bzw. einem Immunitätstest unterworfen wurden. Das TGE-Virusantigen wurde bei -650C gelagert, bis es benötigt wurde. Beim Testen durch Standardtestverfahrensweisen waren in dem TGE-Virusantigen keine Bakterien, Pilze oder Mycoplasmen identifizierbar.
Inokulierung von Rindern mit dem TGE-Virusantigen: Sechs trächtige Holstein-Kühe, 5 bis 9 Jahre alt und nicht länger milchabsondernd bzw. laktierend, wurden intramammilär in jedem Viertel mit 5 ml (105 LD50 pro ml) des TGE-Virusantigens, beschrieben in Tabelle I, an einer Stelle injiziert, die ungefähr 3,81 cm oberhalb der Basis der Warze war, wobei verwerfbare Polypropylenspritzen und Stahlnadeln Nr. 22 verwendet wurden. Die Inokulierung erfolgte nach dem in Tabelle I dargestellten Inokulierungsplan. Nach dem Kalben wurden diese Kühe mit Einschluß einer weiteren Kuh, die keine Präpartuminokulierungen erhalten hatte, innerhalb 1 h nach dem Melken an zwei aufeinanderfolgenden Tagen an den in Tabelle I gezeigten Postpartumtagen inokuliert, wobei 2;L bis 24-h-Intervalle verwendet wurden, um die Produktion der Anti-TGE-Antikörper zu restimulieren.
Das Kolostrum wurde innerhalb 12 h nach dem Kalben gesammelt und sodann wurden die Kühe zweimal am Tag während der Sechs- oder Sieben-Tage-Intervalle zwischen den Restimulierungsschtissen gemolken, ausgenommen die Zeiträume im Anschluß an die Restimulierungsinokulierungen, wo die Kühe nur einmal, etwa 22 bis 24 h nach jeder Inokulierung, gemolken wurden.
Bestimmung der Anti-TGE-Antikörper in dem Kolostrum und in der Milch der inokulierten Rinder-Die in-vitro- und in-vivo-Untersuchung der Anti-TGE-Antikörper, die in dem filtrierten und entrahmten Postpartum-Kolostrum und der Milch enthalten waren, wurde gemäß den Fußnoten 4 und 5 der Tabelle I für die Tage nach dem Kalben, die in der Tabelle angezeigt sind, bestimmt. Die Analysenwerte für die Anti-TGE-Antikörper zeigten, daß zwei Präpartuninokulierungen der Kühe 102 und 406 mit dem Ohio-Isolans-TGE-Virusantigen offenbar ausreichend waren, um eine so große Konzentration der 3ungferkel-Schutzanti-TGE-Antikörper in dem Postpartum-Kolostrum und in der Milch der ersten wenigen Tage zu stimulieren, wie drei Präpartuminokulierungen der Kühe 10 und 359. Nach der Restimulierung erschien es jedoch, daß eine geringfügig größere Antikörperantwort bei den Kühen 10 und 359 erhalten wurde, welche drei Präpartuminokulierungen erhalten hatten.
Es wurde nicht beobachtet, daß die Anwendung von intramuskulären Inokulierungen bei der Kuh 40off um die intramammären Inokulierungen zu ergänzen, die TGE-Antikörperantwort entweder in dem Kolostrum oder in der ersten Milch oder in der nach den Restimulierungen erhaltenen Milch im Vergleich zu der Kuh 102 erhöht hat, die nur intramammäre Injektionen erhalten hatte, so daß dies als nicht notwendig erscheint.
Es erscheint, daß eine Serie von doppelten Restimulierungen einer laktierenden Kuh (Kuh 42) keine signifikant geeignete TGE-Antikörperantwort erzeugt, wenn die Inokulierungen zuerst zu jeder annehmbaren Zeit nach dem Kalben begonnen werden. Wenn jedoch die TGE-Virusantigenvorstimulierungen so bald wie möglich nach dem Kalben begonnen werden und in keinem Fall später als 24 h danach und die am aufeinanderfolgenden Tag erfolgenden Vielfach- Restimulierungen in optimalen regulären Intervallen danach verabreicht werden, dann kann ein erheblich höherer Gehalt der Anti-TGE-Antikörper erhalten werden. Bessere Ergebnisse werden erhalten, indem man eine zweite Vorstimulierung innerhalb 18 bis 30 h der ersten Vorstimulierung gibt.
Die Anti-TGE-Antikörper-Untersuchungswerte zeigen weiter hin, daß eine Reihe von einzigen Restimulierungsschüssen, jeweils mit einem Gehalt von 5 x 105 LD50 des TGE-Virusantigens pro Viertel, gegeben in wöchentlichen Intervallen (Kuh 368), einen geeigneten Wert der Anti-TGE-Antikörperantwort, gemessen durch den in-vitro-Titrationstest, selbst dann nicht stimuliert, wenn die Kuh eine Präpartuminokulierung erhalten hat. Aufgrund der beobachteten extrem niedrigen Titer würde aufgrund der Beziehungen zwischen den anderen in-vitro- und in-vivo-Titer gemäß Tabelle I anzunehmen sein, daß die in-vlvo-Untersuchung nicht höher als etwa 1 : 1 oder 100 BPPU sein wurde und daß sie höchstwahrscheinlich weniger als 1 : 1 für alle in-vitro-Titer von 1 : 10 oder weniger sein würde, die für beliebige einzige Restimulierurigsschußperioden nach der ersten beobachtet würden. Aus dieser Beobachtung kann geschlossen werden, daß - obgleich ein geeigneter Wert der Antikörper in den ersten zwei Wochen nach dem Kalben erhalten werden kann, wenn eine Kuh präpartuminokuliert wird - es über eine 5 bis 7 Monate lange Laktierungsperiode nicht wirtschaftlich ist, Anti-TGE-Antikörper unter Verwendung nur einer Einzelschuß-Restimulierungsverfahrensweise zu. erzeugen, wenn jede Inokulierungsdosis pro Viertel 5 x 105 LD50-Einheiten oder weniger des TGE-Virusantigens enthält.
Wenn jedoch die Dosierung des TGE-Virusantigens über diese Menge erhöht wird und wenn das Rind zuerst entweder während der Trocken-Vorgebärungsperiode oder innerhalb 24 h nach dem Kalben, wie vorstehend bei der bevorzugten Doppelre stimulierungsverfahrensweise beschrieben worden ist, vorstimuliert worden ist, dann werden höhere Ausbeuten des Anti-TGE-Antikörpers erhalten. Insbesondere, wenn einer Einzelrestimulierungsverfahrensweise gefolgt wird, sollte eine signifikant größere Menge, z.B. etwa 7 bis 10 x 105 LD50-Einheiten oder sogar mehr, des TGE-Virusantigens in jedes Viertel zur Zeit jeder einzelnen Restimulierung inokuliert werden. Wenn es erforderlich ist, unerwunschte Euterreaktionen, die auf ein zu großes Volumen zurückzuführen sind, zu vermeiden, dann kann die einzige Inokulierungsdosis in einer konzentrierteren Form als die Inokulierungsdosen angewendet werden, die für die Doppel-Restiinulierungsverfahrensweise verwendet werden, so daß das Dosisvolue auf einen annehmbaren Wert vermindert wird.
Die in-vitro-Anti-TGE-Antikörperuntersuchungen bei der Kuh 31 zeigen an, daß das NADL-TGE-Virusantigen ungefähr die gleiche Wirksamkeit zur Stimulierung einer Anti-TGE-Antikörperantwort in einer Kuh hat, welche sowohl präpartum als auch postpartum gemäß der Erfindung inokuliert worden ist.
Die in-vitro-Anti-TGE-Antikörpertiter für die Kühe 10, 359, 102 und 406 sinc graphisch in den Figuren 1, 2, 3 und 4 dargestellt. Diese zeigen die Untersuchungen für alle Tage in Intervallen zwischen den Serien der Restimulierungsschüsse. Die Figuren zeigen, daß die Doppel- RestinuIierurg an aufeinanderfolgenden Tagen in 6- oder 7-Tages-Intervallen eine 4- bis 32-fache Antwort der Antikörpererzeugung während der dritten bis vierten Tage nach der letzten Restimulierung erzeugt und das wibrend der restlichen zwei bis drei Tage der neisten Intervalle die Antikörperwerte immer noch einer geeigneten 1: 20-Titer- halten, der, wie die Werte der Tabelle 1 zeigen, gewöhnlich mindestens einem Schweineschußtiter von 1 : 2 oder 290 BPPU äquivalent ist Obgleich ein willkürliches 6-Tage-Intervall zwischen den Reihen der Restimulierungsinokulierungen nach der zweiten Reihe gewählt wurde, erscheint offentsichtlich aus den Werten der Figuren 1, 2, 3 und 4 daß eine ungleich größere Erzeugung von Anti-TGE-Antikörpern erhalten werden könnte, wenn man kürzere Intervalle, z.B. von 4 oder 5 Tagen, zwischen der Reihen der Restimulierungsinokulierungen anwendet, vorausgesetzt, daß sie keine immunogene Lähnung oder Mastitisantwort in den Euter bewirken. Die Gewünschtheit von solchen kürzeren Intervallen würde natürlich anhand von Kostananalysen bestimmt werden müssen, un zu bestimmen, ob der zusätzliche Wert der gesteigerten Erzeugung von Antikörpern größer ist als es zum Ausgleich der zusätzlichen Kosten der häufigeren Doppel-Restimulierungen erforderlich ist. Umgekehrt könnten solche wirtschäftlichen Analysen anzeigen, daß minimale Anti-TGE-Antikörperkosten erhalten werden können, wenn man längere Intervalle zwischen Vielfach-Restimulierungen, z.B. 7-bis 10-Tages-Intervalle, anwendet, solange wie der Wert der Antikörper in der Rindermilch ökonomisch wirtschaftliche Werte aufweist.
Schutzeffekt der Rindermilch, die Anti-TGE-Antikörper enthält: In Tabelle II sind die Ergebnisse einer Reihe von Versuchen zusammengestellt, die durchgeführt wurden, um die Schutzeigenschaften von verschiedenen Proben von gefilterter und entrahmter Milch zu ermitteln, welche in verschiedenen Intervallen nach dem Kalben von Rindern erhalten wurde, die durch das erfindungsgemäße Verfahren restimuliert wurden. Die Werte zeigen, daß 32000 Jungferkel-Schutzeinheiten (BPPU) pro Tag alle getesteten Jungferkel vor einer Mortalität bei einer Reizung (challenge) mit 100 LD5O des National Animal Disease Laboratory (NADL) TGE-Virus schützen, während 16000 BPPU pro Tag nur 15 der 24 getesteten Schweine schützten. Die Ergebnisse bestätigen weiter, daß der Wert von BPPU, der für jede Probe der linßermilch bestimmt wurde, mit dem tatsächlich beobachteten Schutzeffekt übereinstimmt, wenn die Milch prophylaktisch gereizten Jungferkeln verfüttert wird.
Aufgrund dieser Beobachtung wurde geschlossen, daß die Menge der Rindermilch, die den Jungschweinen verfüttert wird, um wirksam zu sein, entsprechend der Konzentration der Jungferkel-Schutzeinheiten in der Milch eingestellt werden muß oder, mit anderen Worten, daß der BPPU-Titer als Standard zur Bestimmung der Aktivität und daher der Menge verwendet werden muß, die für eine gegebene Probe oder kombinierte Proben der Rindermilch erforderlich ist, welche den Jungschweinen für einen prophylaktischen Schutz verfüttert wird.
In den Fällen, wo die natürliche Reizung (challenge) größer wie in Tabelle II ist oder wo ein größerer Schutzgrad gewünscht wird, könnten mehr als die 32000 BPPU, die in diesen Versuchen verwendet wurden, den Jungferkeln verfüttert werden, um einen stärker absoluten Schutz zu verleihen, wenn es die wirtschaftlichen Verhältnisse der Situation als zweckmäßig erscheinen lassen. Alternativ, wenn eine natürliche Reizung von einer geringeren Infektiosität erwartet oder festgestellt wird, dann kann mit guten Ergebnissen eine erheblich geringere Menge als 32000 BPPU verwendet werden. Bei normalen natürlichen Reizungssituationen wird erwartet, daß etwa 16000 BPPU, die jedem Jungferkel pro Tag bis zu etwa 10 bis 14 Tagen des Alters verfüttert werden, ausreichend sein können, um vom wirtschaftlichen Standpunkt einen optimalen Schutz zu verleihen, wenn man die Kosten für das immunisierte Nilchprodukt mit den Verlusten vergleicht, die durch Todesfälle bei ungenügend geschützten oder zwerggewachsenen Jungferkeln vergleicht. Da dieses wirtschaftlich bestimmte Optimum von vielen Faktoren, z.B. von der Schwere der TGE-Erankheit, die vom Schareinezüchter festgestellt wird, der Umgebung der empfindlichen Jungferkel, der Jahreszeit und den vorherrschenden wietterbedingungen und dergleichen, abhängt, ist es nicht möglich, eine Menge anzugeben, die für jede Situation anwendbar ist. Nach begrenzten Untersuchungen mit verschiedenen Mengen kann jedoc;l leicht der optimale BPPU-Wert vom Schweinezüchter für die jeweilige Situation festgestellt werden.
Zusätzlich zu ihrer prophylaktischen Verwendung kann die Rindermilch, die Anti-TGE-Antikörper enthält, auch therapeutisch zur Behandlung von TGE angewendet werden, insbesondere, wenn die Krankheit nicht zu weit fortgeschritten ist. Während den frühen Stufen der Krankheit, bevor eine erhebliche Zottenatrophie erfolgt hat, kann erwartet werden, daß die Anti-TGE-Antikörper, die in dem erfindungsgemäßen Rindermilchprodukt vorhanden sind, den TGE-Virus wirksam neutralisieren und auf diese Weise die Entwicklung von späteren mortalitätsinduzierenden Effekten von TGE verhindern. Selbst Schweinchen, die an einer fortgeschrittenen Form von TGE leiden, können einen höheren Heilungsprozentsatz zeigen, wenn ihnen TGE-Virus-neutralisierende Mengen der erfinaungsgemäßen Milchprodukte zugeführt werden, was auf die schnelle Zottenregenerierung zurückzuführen ist, die bei den Jungschweinen beobachtet wird.
Obgleich bei dem obigen Beispiel ein lebender TGE-Virus von Darmherkunft als TGE-Virusantigen verwendet wurde, könnte naturgemäß auch jeder-beliebige andere lebende TGE-Virus mit solchen immunogenen Eigenschaften verwendet werden, daß er - wenn er serologisch negativ gegenüber TGE vier Wochen vor de erwarteten Wurfdatum einem trächtigen Mutterschwein in einer Menge zugeführt wird, daß 5 x 105 LD50 infektiöse Dosen des Virus (oder 5 ml der Virussuspension) ergeben werden - die Produktion der Antikörper in dem Kolostrum und der Milch stimulieren wurde, wodurch die saugenden Jungtiere gegen eine orale Reizung mit 100 LD50 des NADL-TGE-Virus geschützt würden. Unter ??Schützen?? ist zu verstehen, daß - obgleich einige wenige der saugenden Schweine eine Morbidität zeigen könnten - keine sonst gesunden saugenden Schweine, die eine angemessene Menge der Milch des Mutterschweins erhalten, durch den TGE-Reizungsvirus sterben sollten.
Unter Verwendung dieses Tests kann bestimmt werden, ob ein anderer lebender TGE-Virus, erhalten von anderen Quellen, z.B. ein bei gUnstigen Zellen zellgezüchteter TGE-Virus, ein geeignetes TGE-Virusantigen für das erfindungsgemäß Verfahren entweder allein oder im Gemisch mit einem lebenden TGE-Virus von Darrnherkunft sein würde. Wenn solche Gemische verwendet werden sollen, kann ihre Eignung als TGE-Virusantigen in der Weise bestimmt werden, daß man das vorgeschlagene Gemisch dem trächtigen Mutterschwein wie oben beschrieben verfüttert, um zu bestimmen, ob sie den immunogenen Charakter haben, der erforderlich ist, um schützende Anti-TGE-Antikörper in der Milchdrüse eines laktierenden Rindes zu stimulieren. Der Einfachheit halber wird jedes lebende TGE-Virusantigen oder -Antigengemisch mit den obigen Eigenschaften als "immunogener lebender übertragbarer Gastroenberitisvirs" bezeichnet.
Wenn das Rindermilchprodukt, das Anti-TGE-Antikörper enthält, als Futter oder als flüssige Ergänzung für Jungferkel zum Schutz gegen TGE verwendet werden soll, dann kann es wie folgt verarbeitet werden, um ein steriles Milchproduit zu ergeben, das von infektiösen Organismen frei ist.
Die Vollmilch wird nach dem Filtrieren durch einen R&rmiseparator geleitet, um ein Magermilchprodukt zu ergeben, welches dann mit 2 ml ß-Propiolacton pro 1000 ml der Magermilch versetzt wird. Das Gemisch wIrd 2 h bei 37°C inkubiert und sodann mindestens 24 h bei 40C vor der Verwendung gelagert. Nach dieser Behandlung zeigt die Magermilch einen negativen Test gegenüber Bakterien, Mycoplysmem oder Viren. Diese Behandlung hat anscheinend keinen Einfluß auf die Anzahl der BPPU-Einheiten in der Magermilch. Jungferkel, die dreimal am Tag mit 27 ml der behandelten Milch gefüttert wurden, welche 400 BPPU-Einheiten/ml enthielt, zeigten keine nachteiligen Effekte und sie widerstanden einer Reizung mit 100 LD50 des NADL-TGE-Virus, gegeben 48 h nach dem Beginn des Fütterungsprogramm. Alternativ kann anstelle des ß-Propiolactons ein anders äquivalentes chemisches Sterilisierungsmittel, z.B.
Äthylenoxid, Propylenoxid und Epichlorhydrin, wie es in der US-PS 2 705 696 beschrieben wird, und ähnliche Sterilisierungsinittel gegeben werden, um die erfindungsgemäßen Nilchprodukte von infektiösen Mikroorganismen zu befreien, ohne daß die Antikörperaktivität signifikant vermindert wird.
Gewünschtenfalls kann die behandelte Magermilch konzentriert oder lyophilisiert werden, um ein aktiveres Milchprodukt zu ergeben. Alternativ kann die Molkefraktion isoliest werden, bevor die Behandlung mit dem ß-Propiolacton, wie oben beschrieben, erfolgt, und das Produkt kann entweder dann als solches verwendet werden oder vor dem Gebrauch konzentriert oder lyophilisiert werden.
Sowohl mit dem Magermilchprodukt als auch dem Molkeprodukt wird eine maximale Retention der Anti-TGE-Antikörper beobachtet, wenn die Produkte vor dem Gebrauch bei 40C gelagert werden.
Die hierin verwendete Bezeichnung "Rindermilchprodukt, das Antikörper gegen die übertragbare Gastroenteritls enthält soll das Produkt, nämlich entweder das Kolostrum, die Vollmilch, die Magermilch, die Molke oder die aus Vollmilch oder dem Kolostrum erhaltenen Gammaglobulinfraktionen, bezeichnen, welches Antikörper enthält, die dazu imstande sind, lebende NADL-TGE-Viren durch einen in-vivo-fleutralisationstest, wie er in der Fußnote 5 der Tabelle I beschrieben wird, zu neutralisieren.
Tabelle I Vor und nach dem Gebären durchgeführte Immunisierungs von Rindern mit TGE-Virusantigen¹ und Bestimmung der Anti-TGE-Antikörper in dem Kolostrum und in der Milch² Kuh Inokulie- Abstand der Abstand der Postpar- Anti-TGE-Antikörper-Bestimmung Nr. rungs Inokulie- Inokulie- tumtag Jungferkelstelle rungen vor rungen nach des Mel- Zellkulturtiter Schweineschutz- Schutzeindem Gebä- dem Gebären, kens (in-vitro-Test)4 titer (in-vivo- heiten (BPPU) ren, Tage Tage Test)5 pro ml Milch 10 IMM³ 34, 22, 8 0 1 : 640 1 : 8 800 1 1 : 320 1 : 16 1600 2 1 : 320 1 : 2 200 IMM³ 6 und 7 8 1 : 160 1 : 8 800 9 1 : 640 1 : 8 800 10 1 : 160 1 : 8 800 IMM³ 14 und 15 16 1 : 160 1 : 4 400 17 1 : 320 1 : 4 400 18 1 : 80 1 : 2 200 IMM³ 21 und 22 23 1 : 160 1 : 2 200 24 1 : 160 1 : 2 200 25 1 : 40 1 : 2 200 Fortsetzung Tabelle I IMM³ 28 und 29 30 1 : 40 1 : 8 200 31 1 : 320 1 : 2 200 32 1 : 160 1 : 2 200 IMM³ 35 und 36 37 1 : 20 1 : 4 400 38 1 : 80 1 : 2 200 39 1 : 20 1 : 2 200 359 IMM³ 43, 25, 15 0 1 : 640 1 : 16 1600 1 1 : 320 1 : 16 1600 2 1 : 160 1 : 4 400 IMM³ 6 und 7 8 1 : 320 1 : 16 1600 9 1 : 640 1 : 16 1600 10 1 : 640 1 : 8 800 IMM³ 14 und 15 16 1 : 320 1 : 16 1600 17 1 : 320 1 : 8 800 18 1 : 160 1 : 8 800 IMM³ 21 und 22 23 1 : 160 1 : 8 800 24 1 : 320 1 : 8 800 25 1 : 320 1 : 8 800 Fortsetzung Tabelle I IMM³ 28 und 29 30 1 : 40 1 : 4 400 31 1 : 40 1 : 4 400 32 1 : 80 1 : 4 400 IMM³ 35 und 36 37 1 : 160 1 : 8 800 38 1 : 160 1 : 4 400 39 1 : 80 1 : 4 400 102 IMM³ 30, 16 0 1 : 160 1 : 16 1600 1 1 : 80 1 : 16 1600 2 1 : 40 1 : 16 1600 IMM³ 6 und 7 8 1 : 160 1 : 8 800 9 1 : 320 1 : 4 400 10 1 : 40 1 : 2 200 IMM³ 14 und 15 16 1 : 20 1 : 2 200 17 1 : 80 1 : 4 400 18 1 : 40 1 : 4 400 IMM³ 21 und 22 23 1 : 40 1 : 4 400 24 1 : 160 1 : 4 400 25 1 : 160 1 : 4 400 Fortsetzung Tabelle I IMM³ 28 und 29 30 1 : 80 1 : 4 400 31 1 : 160 1 : 4 400 32 1 : 40 1 : 2 200 IMM³ 35 und 36 37 1 : 80 1 : 2 200 38 1 : 80 1 : 2 200 39 1 : 20 1 : 2 200 406 IMM³+IM7 43, 25, 15 0 1 : 320 1 : 4 400 1 1 : 320 1 : 4 400 2 1 : 160 1 : 4 400 IMM³+IM7 6 und 7 8 1 : 80 1 : 8 800 9 1 : 160 1 : 8 800 10 1 : 80 1 : 8 800 IMM³+IM7 14 und 15 16 1 : 160 1 : 8 800 17 1 : 80 1 : 4 400 18 1 : 40 1 : 4 400 IMM³+IM7 21 und 22 23 1 : 40 1 : 2 200 24 1 : 80 1 : 4 400 25 1 : 80 1 : 2 200 Fortsetzung Tabelle I IMM8 5 und 6 7 1 : 40 kein Schutz der Jungferkel 8 1 : 40 " 9 1 : 20 " IMM8 12 und 13 14 1 : 40 1 : 1 100 15 1 : 40 1 : 1 100 16 1 : 20 kein Schutz der Jungferkel IMM8 19 und 20 21 1 : 10 1 : 1 100 22 1 : 20 kein Schutz der Jungferkel 23 1 : 20 " 368 IMM³ 42, 28, 14 0 1 : 10 1 1 : 64 2 1 : 160 5 1 : 80 IMM³ 6 7 1 : 40 8 1 : 80 10 1 : 40 IMM³ 14 16 1 : 10 17 1 : 20 18 1 : 10 Fortsetzung Tabelle I IMM³ 21 23 1 : 20 24 1 : 20 26 1 : 10 IMM³ 28 29 1 : 10 30 1 : 10 31 1 : 20 32 1 : 10 31 IMM³ 43, 29, 15 0 1 : 160 1 1 : 16 2 1 : 80 6 und 7 8 1 : 40 9 1 : 160 10 1 : 80 14 und 15 16 -17 1 : 80 18 1 : 80 21 und 22 23 1 : 40 24 1 : 40 25 1 : 80 28 und 29 30 1 : 20 31 1 : 20 32 1 : 40 35 und 36 37 1 : 20 38 1 : 20 39 1 : 20 Fußnoten: 1. TGE-Virusantigen, erhalten von dem Ohio-TGE-Virus-Isolans, wurde für die Kühe 10, 359, 102, 406, 42 und 368 verwendet. National Animal Disease Laboratory (NADL) TGE-Virus wurde als Antigen für die Kuh 31 verwendet. Der NADL-Virus war ein Niller-Stamm Nr. 3 vom TGE-Reizungsvirus, erhalten bei einem Ausbruch von TGE auf der Farm von Eli C. Aller, Fredricksburg, Ohio, im Jahre 1965. Die Suspension des Dünndarms, erhalten von einem TGE-infizierten Jungferkel, wurde 13-mal durch primäre Schweinenierenzellkulturen in 6- bis 8-tägigen Intervallen geleitet.
Der dreizehnte Zellkulturdurchlauf wurde durch ein 0,45-µ-Milliporenfilter filtriert und dazu verwendet, um ein keimfreies Schwein zu infizieren. Hierauf wurden zwei weitere Durchläufe in keimfreien Schweinen durchgeführt, wobei filtrierte 0,45 Suspensionen der Dünndärme verwendet wurden.
2. Die untersuchte Milch wurde durch ein Kendall-Nicht-Gazefilterkissen geleitet und durch Durchlauf durch - einen Rahmseparator DeLaval Nr. 108 entrahmt.
3. 5 ml von 105 LD50-Einheiten von TGE-Virusantigen wurden in jedes Viertel sowohl prä- als auch postpartum an einer Stelle ungefähr 3,8 cm oberhalb der Basis der Warze unter Verwendung einer wegwerfbaren Polypropylenspritze und einer Stahlnadel Nr. 22 injiziert.
4. Die höchste zweifache Serienverdünnung von entrahmter Milch mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), beginnend mit 1 : 10 (1 Volumen Milch und 9 Volumen HBSS), die ein gleiches Volumen eines Purdue-Ho chzellen-Kulturdurchlauf-TGE-Virus, enthaltend 1000 TC-LD50 pro ml, nach 1-stündiger Inkubierung bei 37 C, bestimmt durch die Abwesenheit von cytopathischen Effekten 7 Tage, nachdem 0,2 ml des inkubierten Gemisches zu einem 30-ml-Zellkulturbehälter gegeben worden waren, der eine primäre Schweinenierenzellkultur enthielt.
5. Die höchste zweifache Serienverdünnung der Milch mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), beginnend mit 1 : 2 (1 Volumen Milch und 1 Volumen HBSS), die ein gleiches Volumen des National Animal Disease Laboratory (NADL) TGE-Virus neutralisiert, enthaltend 100 LD50 für 3 Tage alte Jungferkel pro ml, nach einstündigem Inkubieren bei 370C, bestimmt durch die Abwesenheit einer Mortalität über 7 Tage in zwei 3 Tage alten Jungschweinen, die jeweils mit 2 ml des inkubierten Gemisches gefüttert worden waren.
6. 100 x Schweineschutztiter.
7. Weitere 5 ml der 105 LD50-Einheiten des TGE-Virusantigens wurden ebenfalls intramuskulär injiziert.
8. Wie Fußnote 1, mit der Ausnahme, daß nur Postpartuminjektionen verwendet rurden.
Tabelle II Beziehung zwischen dem Jungferkelschutztiter der einzelnen Proben der immunisierten Milch und dem Schutz, der den Jungferkeln gegen eine Reizung (challenge) mit dem TGE-Virus2 verliehen wurde Post- BPPU3/ml Gesamt- Gesamt-BPPU- Nr. des Ergebnisse der partum- der milch, Einheiten, Test- Reizung Melk- Milch die je- die jedem schweins Morbi- Mortatage dem Schwein pro dität lität Schwein Tag verfUtpro Tag tert wurden verfüttert wurde4 O-2 1600 40 ml 64000 12 0/12 0/12 8-10 800 40 ml 32000 12 2/12 0/12 15-18 800 40 ml 32000 12 0/12 0/12 23-25 400 40 ml 16000 12 6/12 4/12 30-32 400 40 ml 16000 12 6/12 5/12 Fußnoten: 1. Nicht alle Milchproben waren von der gleichen Kuh.
Alle Postpartum-Milchproben wurden von Kühen erhalten, die doppelt restimuliert worden waren, mit der Ausnahme des Kolostrums, das an den ersten zwei Tagen nach dem Kalben erhalten worden war. Alle Milchproben wurden filtriert und entrahmt.
2. Die Reizung (challenge) bestand aus der peroralen Verabreichung von 100 LD50 NADL-TGE-Virus an jedes Jungferkel im Anschluß an das erste Füttern am dritten Alterstag.
3. Jungferkelschutzeinheiten.
4. Verfüttert an Jungferkel in 10-ml-Teilmengen viermal am Tag, beginnend am zweiten Tag des Alters und weitergeführt über die folgenden sieben Tage.
Zusätzlich wurde jedem Schwein in einer Milch pfanne die Milch einer normalen Kuh angeboten.
5. Aufgebaut auf täglichen Beobachtungen der Jungferkel über sieben Tage nach der Reizung.
L e e r s e i t e

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Erhöhung in der Milch eines milchabsondernden Rindes der Menge der Antikörper, die gegenüber einem Antigen spezifisch sind, welches in der lSIilchdrüse des milchabsondernden Rindes sich nicht fortpflanzt oder das darin keine signifikante Mastitisreaktion bewirkt, welches aber dazu imstande ist, eine meßbare Antikörperantwort zu stimulieren, dadurch g e k e n n z e ic h -n e t , daß man a) die Milchdrüse eines trächtigen Rindes mit dem Antigen während eines Zeitraums vorstimuliert, der etwa 60 Tage vor dem Kalben beginnt und etwa 48 h nach dem Kalben endigt, und daß man b) danach die Nilchdrüse des Rindes mit dem Antigene an mindestens zwei aufeinanderfolgeriden Tagen in Intervallen während der Laktations- bzw. Nilchabsonderungsperiode des Rindes restimuliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Milchdrüse nicht milchabsondernd ist und daß sie während der 60-Tage-Periode vor dem Kalben, jedoch nicht während der 48-h-Periode nach dem Kalben vorstimuliert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Antigen ein immunogener lebender Virus der übertragbaren Gastroenteritis ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man die Milchdrüse nur während der 43-h-Periode nach dem Kalben vorstimuliert 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Antigen ein immunogener lebender Virus der übertragbaren Gastroenteritis ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man die Milchdrüse zweimal vorstimuliert, wobei die erste Vorstimulierung innerhalb 24 h des Kalbens vorgenommen wird und die zweite Vorstimulierung etwa 1S bis 24 h nach der ersten Vorstimulierung vorgenommen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Antigen ein immunogener lebender Virus der übertragbaren Gastroenteritis ist.

8. Rindermilchprodukt, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß es Antikörper gegen die übertragbare Gastroenteritis enthält. ############################################ übertragbaren Gastroenteritiskrankheit, dadurch g e - k e n n z e i c h n e t , daß man dem Jungferkel ein Rindermilchprodukt verfüttert, welches Antikörper gegen die übertragbare Gastroenteritis in einer genügenden Nen- ge enthält, daß verhindert w +, daß das Schwein an der Krankheit stirbt. # 10. Verfahr nach Anspruch 9, dadurch g e k e n n - z e 1 c h e t , daß man das Pindermilchprodukt dem JunHel vor der Infektion mit der übertragbaren Gastro- teritis verfüttert.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man das Rin dukt dem Jungferkel nach der ion mit der übertragbaren G . . rt.

/ .) Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern gegen die übertragbare Gastroenteritis in der Milch eines milchabsondernden bzw. laktierenden Rindes, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß man a) die Milchdrüse eines trächtigen Rindes mit dem Antigen während eines Zeitraums vorstimuliert, der etwa 60 Tage vor dem Kalben beginnt und etwa 48 h nach di Kalben endigt, und daß man b) sodann die Milchdrüse mit einer Einzeldosis des Virus der immunogenen übertragbaren Gastroenteritis in Intervallen von 4 oder mehr Tagen nach der Laktationsperiode des Rindes restimuliert.

t 1b. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Milchdrüse nicht laktierend ist und daß sie während der 60 Tage vor dem Kalben, jedoch nicht während der 48-h-Periode nach dem Kalben vorstimuliert wird.

14. 11 Verfahren nach Anspruch 12, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Milchdrüse nur während der 48-h-Periode nach dem Kalben vorstimuliert wird.

15. 12. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch g e k e n n -z e 1 c h n e t , daß man die Milchdrüse zweimal vorstimuliert, wobei die erste Vorstimulierung innerhalb 12 h des Kalbens und die zweite Vorstimulierung 18 bis 30 h nach der ersten Stimulierung erfolgt.