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DE2430380C3 - Herstellung eines Stoffes mit immunologischer Wirkung - Google Patents

Herstellung eines Stoffes mit immunologischer Wirkung

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DE2430380C3
DE2430380C3 DE2430380A DE2430380A DE2430380C3 DE 2430380 C3 DE2430380 C3 DE 2430380C3 DE 2430380 A DE2430380 A DE 2430380A DE 2430380 A DE2430380 A DE 2430380A DE 2430380 C3 DE2430380 C3 DE 2430380C3
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DE
Germany
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trypanosomes
bromide
diamino
medium
concentration
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DE2430380A
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DE2430380A1 (de
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Klaus-Dieter Dipl.-Chem. Dr. 3550 Marburg Hungerer
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Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
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Behringwerke AG
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    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/005—Trypanosoma antigens
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 genannte Verfahren.
Die Patentansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.
Mit der Erfindung wird bei lebenden Trypanosomen bei vollem Erhalt ihrer immunologischen Potenz deren Pathogenität ausgeschaltet Diese als chemische Attenuierung bezeichnete Maßnahme ermöglicht es, einen Impfstoff zu entwickeln, der auch am Menschen anwendbar ist
Die Chagas-Erkrankung gilt als eines der großen Gesundheitsprobleme SUd- und Mittefamerikas. Sie wird hervorgerufen durch eine Infektion mit Trypanosoma cruzi. Die Zahl der echt Infizierten auf dem Subkontinent ist umstritten, doch schätzte die Weltgesundheitsorganisation 1960 die Zahl der Infizierten auf etwa 7 Mio, die einer Infektionsgefahr Ausgesetzten auf etwa 35 Mio.
Die zur Eindämmung der Infektion angewendeten Methoden sind vielgestaltig. An erster Stelle steht wohl die Arbeit an der Überträger-Ausrotlung (Raubwanzen der Gattung Triatoma) in den Behausungen der Bevölkerung, Aufklärung der Bevölkerung und Sanierung der Wohnmöglichkeiten. Diese Methode wird — unterstützt von der WHO — in vielen Ländern bereits mit großem Erfolg durchgeführt Ein zweiter Erfolg bei der Bekämpfung der Chagas-Erkrankung war die Einführung des am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Lampit bekannten Chemotherapeuticums, eines im Menschen hochwirksamen äthiologischen Agens. Die Problematik der Chemotherapie liegt jedoch im Auftreten irreversibler pathologischer Veranderungen z. B. an Herz und anderen Hohlorganen während der Infektion, die durch Verabreichung von Arzneimitteln in einer relativ späten Phase der Erkrankung nicht mehr behoben werden können. Eine in der Bekämpfung von Infektionen viraler oder bakterieller Genese allgemein angewendete prophylaktische Maßnahme, die Applikation eines Impfstoffs, gilt bis heute noch als mit zu vielen Risiken verbunden.
In einer ganzen Reihe von Arbeitsgruppen (z. B. Kagan. Marsden, Nussenzweig, Menezes, Hungerer) konnte zwar gezeigt werden, daß natürlich attenuierte Ku'turformen von T. cruzi nach Injektion in Mäuse diese gegen eine tödliche Infektion mit pathogenen Trypanosomen schützen. Die Problematik ist die im unterschiedlichen Maße nachweisbare Resipathogenität der Kulturformen.
Eine Unterdrückung der Pathogenität von T. cruzi beschrieb 1950 J. Emmett, J. ParasitoL 36 (1950), 45-47. Er bestrahlte noch hochinfektiöse Kalturformen mit Röntgenstrahlen und fand, daß eine Bestrahlung von 100 000 r die Trypanosomen zwar am Leben läßt ihre Infektiosität aber zerstört Solche bestrahlten Kulturformen immunisieren jedoch nicht mehr Mäuse gegen eine pathogene Infektion (E. Chiari, E. Mansur Neto, Z. Brener; Rev. Inst Med. trop. Säo Paulo, 10 (1968).
Die in der Beschreibung der DE-AS 1234 930 referierten Experimente zur chemischen Modifizierung
(z. B. mit Formalin, Hydroxylamin u. a.) von Trypanosomen führten ebenfalls nicht zu einem Impfstoff.
Ein anderer Weg wurde von J. F. Feicandes, M. Halsman, O. Castellani; ExpL Parasit 18 (1966), 203—210 beschrieben. Sie inkubierten Kultur- und Blutformen mit Actinomycin D. Dabei verloren die Trypanosomen ihre Fähigkeit, sich zu vermehren, ihre immunogene Potenz behielten sie jedoch bei. Einer Anwendung dieses Impfstoffes am Menschen steht jedoch von vorherein die hohe Toxizität von Actinomyein D im Wege.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen immunologisch wirksamen Stoff gegen die Chagas-Erkrankung zu finden, der durch Blockierung der Restpathogenität von Kulturformen für den Menschen
jo ungefährlich ist aber seine volle immunologische protektive Wirkung beibehält Die zur Attenuierung verwendete Substanz selbst sollte in der im Impfstoff vorliegenden Konzentration für den Menschen völlig untoxisch sein. Diese Substanz wurde überraschender-
J5 weise in Vertretern der Klasse der Phenanthridine gefunden.
Phenanthridine wurden bereits 1938 synthetisiert und untersucht im Hinblick auf ihre therapeutische Wirksamkeit gegenüber Trypanosoma congolense und Trypanosoma vivax. GH. Browning, K.M. Calver, M. W. Lecksie; (Nature [London] 157 [19461 262-264) zeigten auch eine chemotherapeutische Wirksamkeit gegenüber T. cruzi in Mäusen. Danach erschienen eine Reihe von Arbeiten, z, B. von Riou und Mitarbeitern über den Wirkungsmechanismus des 33-Diamino-5-äthyl-6-phenylphenanthridiniumbromid an T. cruzi (E.
Dealin, G. Riou, G R. Acad. Sc Paris [D] 268 [19691
1327-1330).
Es wurde nun gefunden, daß sine bestimmte
μ Inkubation von Trypanosomen mit Phenanthridin-Derivaten die Vitalität und Infektiosität derartig verändert daß Mause nrch Injektion mit derart behandelten Trypanosomen keine pathogene Infektion erleiden, aber einen vollen Immunschutz ausbilden.
Als Phenanthridin-Derivale im Sinne der Erfindung eignen sich selbstverständlich alle physiologisch verträglichen Vertreter dieser Körperklasse. Besonders geeignet sind solche Derivate, die in 3- und 8-Stellung mit Aminogruppen, in 6-Stellung mit einem Phenylrest
M) und in 5-Stellung mit einer niederen AIky!gruppe substituiert sind. Als Beispiele solcher Verbindungen seien erwähnt das 3,8-Diamino-5 methyl-6-phenyl· phenanthridin, das Isometamidin und das 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenyl-phenanthridin. Da die Phenanthridin-
h'> Derivate im allgemeinen in Wasser schlecht löslich sind, empfiehlt es sich, sie erfindungsgemäß in Form ihrer wasserlöslichen Salze anzuwenden. Als Säuren für die Salzbildung eignen sich selbstverständlich alle organi-
sehen und vor allem anorganischen Säuren, die physiologisch verträgliche Anionen besitzen und die mit Phenanthridin-Derivaten wasserlösliche Salze bilden. Besonders geeignet sind Salze der Phenanthridin-Derivate mit Halogenwasserstoffsäuren wie Chlorwasserstoffsäure oder Bromwasserstoffsäure. Beispiele geeigneter Salze sind ß.e-Diamino-S-methyl-e-phenyl-phenantridinrum-bromid (Dimidiumbromid), Isometamidiumchlorid und insbesondere 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenylphenanthridiniumbromid
Die Phenanthridin-Derivate bzw. deren Salze werden in einer Konzentration angewandt, die einerseits groß genug ist, um bei den Trypanosomen die erwünschte chemische Attenuierung zu bewirken, die andererseits nicht so groß ist, daß sie Trypanosomen nachhaltig schädigt Sie reicht von 0,5 bis 1000 γ pro ml und beträgt zweckmäßig 5 bis 100 y/mL
Die Trypanosomen werden in einer Konzentration von 103 bis 108 Trypanosomen pro ml der erfindungsgemäßen Behandlung unterworfen. Eine besonders günstige Trypanosomen-Konzentralion ist 5 bis 5 χ ΙΟ7 Trypanosomen pro ml. Die Trypanosomen werden in dieser Konzentration in einem flüssigen Kulturmedium suspendiert, das selbstverständlich geeignet ist, den Stoffwechsel dieser Organismen voll zu unterhalten. Als Kulturmedium eignen sich alle für die Haltung von Trypanosomen geeigneten Medien. Entscheidend ist selbstverständlich, daß das Kulturmedium möglichst arm oder sogar frei von Antigen-Determinanten ist Diese Voraussetzung wird insbesondere von proteinfreien Medien erfUi. Als Beispiele für geeignete Kulturmedien seien das Leber-Infusion-Tryptose-Medium (LIT, nach Camargo, Rec. tnst Med. trop, Säo Paulo, 6 [1964J 93—100) genannt, ferner f?rote;iifreie, chemisch definierte Medien, wie sie beispielsweise von Morgan, Morton und Parker; Proc. Soc. Exp. Biol. Med 73 (1950), 1 -8, SaIk, Younger und Ward; Am. J. Hyg. 60 (1954), 214—230 oder Parker, Castor und McCulloch; Special Publications, N. Y. Acad. Sei. 5, (1957), 303-313 beschrieben wurden.
Die Behandlung der in dem Kulturmedium suspendierten Trypanosomen mit einem Phenanthridin-Derivat bzw. dessen Salz erstreckt sich über eine Zeit von 1 bis 120, zweckmäßig 20 bis 48 Stunden. Die Temperatur beträgt 18-37°C zweckmäßig 25 bis 33°C Entsprechend allgemein bekannten chemischen Gesetzen ist die Behandlungszeit um so länger auszudehnen, je niedriger die Temperatur ist
Demgemäß sind im Sinne des vorstehend Gesagten die kürzeren Behandlungsdauern den höheren Temperaturen und die längeren Behandlungsdauern den tiefet en Temperaturen zuzuordnen.
Nach der Behandlung werden die Trypanosomen von dem Kulturmedium abgetrennt Dies kann durch Dekantieren, Filtrieren oder zweckmäßig durch Zentrifugieren geschehen. Falls die Herstellung eines Impfstoffes angestrebt wird, können die so gewonnenen Trypanosomen in einer physiologisch verträglichen Lösung in der für einen Impfstoff geeigneten Konzentration wieder suspendiert werden.
In den im folgenden beschriebenen Versuchen soll aufgezeigt werden, daß die erfindungsgemäß behandelten Trypanosomen ihre Vermehrungsfähigkeit und ihre Pathogenität verlieren und demnach für die Herstellung einer Vaccine gegen die Chagas-Erkrankung geeignet sind.
Bei allen nachstehend angeführten Experimenten müssen Medien und Geräte unter streng sterilen
Bedingungen gehandhabt werden.
Der Nachweis des irreversiblen Vermehrungsstoppes durch die erfindungsgemäße Behandlung erfolgt beispielsweise nach folgender Methode:
Epimastigote Kulturformen von T. cruzi, Stamm Brasil, werden auf diphasischem Blutagar (modifiziert nach Senekjie; Am. J. Trap, med 23 [1943], 523-531) gezüchtet (4—5 Tage bei 28° C). Die flüssige Phase mit den Trypanosomen wird durch sterile Gaze filtriert Die
ι ο Suspension wird 20 Minuten bei 5000 g zentrifugiert und das Sediment zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Trypanosomen werden in einem verdünnten Medium nach R. C Parker, LN. Castor, E. A. McCulloch; (Spec. Public, N. Y. Acad ScL 5 [1957], 303-313), auf eine Dichte von 2 χ 107/mI aufgenommen.
jeweils 3 Proben ä 2^ ml werden mit steigenden Mengen S.e-Diamino-S-äthyl-e-phenylphenanthridiniumbromid versetzt (je 5y/ml, lOy/ml, lOOy/ml). 3 Proben werden mit Thiocid 1:10 000 behandelt, das die Trypanosornen in dieser Konzentration bei Erhalt der äußeren Form abtötet, und 3 Proben werden unbehandelt gelassen. Alle Ansätze werden 24 Stunden bei 28° C inkubiert dann 20 Minuten bei 5000 g zentrifugiert und das Sediment in 2,5 ml des 1 :10 verdünnten Mediums nach Parker (a.a.O.) aufgenommen. Alle Proben werden mit radioaktivem 14C-Thymidin (0,2 μ£) versetzt und 24 Stunden bei 28° C inkubiert Danach werden die Trypanosomen über ein Sartorius-Filter abgetrennt und dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Radioaktivität der Proben wird quantitativ ausgewertet
Die Hemmung des Einbaus des l4C-Thymidins in die Trypanosomen ist ein Maß für die Behinderung der
Vermehrungsfähigkeit.
Ergebnis
Hemmuitg des Einbaus von l4C-Thymidin
Thiocid-Kontrolle 100%
100 y/ml Ethidiumbromid 100%
IOy/ml Ethidiumbromid 88%
5 y/ml Ethidiumbromid 63%
Unbehandell 0%
Wie die vorstehende Tabelle zeigt, haben die -,(i erfindungsgemäß behandelten Trypanosomen teilweise oder vollständig ihre Vermehrungsfähigkeit verloren.
Der Nachweis des Verlustes der Pathogenität nach Inkubation mit S.e-Diamino-S-äthyl-e-phenylphenanthridiniumbromid kann beispielsweise wie folgt geführt werden:
A. In Herzzellkulturen
30 Herzen von nicht infizierten adulten Inzucht-Mäusen (Stamm NMRl), Gewicht einer Maus ungefähr 20 g,
ho unter streng sterilen Bedingungen entnommen, werden in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung ph 7,4 (PBS 7,4) aufgenommen und mechanisch zerkleinert, wobei blutige und weißliche Bindegewebsstüeke verworfen werden. Das Herzhomogenat wird in einem Trypsinier-
h5 kolben überführt und mit 20-30 ml PBS 7,4 aufgefüllt. Die Suspension wird kurz und kraftig auf dem Magnetrührer aufgewirbelt, nach kurzem Absitzen wird der Überstand mitsamt den darin befindlichen Erythro-
zyten abdekantiert. Der Rückstand wird unter Zusatz von 20 ml einer Trypsinlösung (97 ml PBS 7,4, 2 ml 5%iges Natriumbicarbonat, 0,25% Trypsin) bei 35°C10 Minuten gerührt Nach kurzem Absitzen wird der Überstand abdekantiert Der Rückstand wird weitere 6—7 Male trypstniert Die abdekantierten Überstände werden zentrifugiert (400 χ g, 10 Minuten); die Sedimente werden in 75 ml folgender Lösung aufgenommen, die weiterhin als »Dulbeccos Gebrauchsmedium« bezeichnet wird:
20% fötales Käberserum
10% Dulbeccos
7% Natriumbicarbonat
2% Glutamin
0,5% Penicilliii/Streptomycin
auf 100% mit Aqua bidest aufgefüllt
Jeweils 3 ml der Suspension des Herzzellgewebes werden in Röhrchen, sogenannte Leighton-tubes, die mit einem Deckgläschen 13 χ 54 mm beschickt sind, überführt Die mit Silikonstopfen verschlossenen Röhrchen werden bei 37° C inkubiert Nach 24 Stunden hat sich ein Zellrasen (Monolayer) ausgebildet
Inzuchtsmäuse vom Stamm NMRI, die etwa 12 Tage zuvor mit T. cruzi Stamm Brasil subkutan infiziert worden waren, werden steril entblutet und das Blut in Zitratpuffer gesammelt Es wird mit Dulbeccos Gebrauchsmedium verdünnt so daß eine Endkonzentration von 1,5 χ 106 Trypanosomen/m! entsteht Die Trypanosomen-Suspension wird halbiert und die eine Hälfte mit S^-Diamino-S-äthyl-e-phenylphenanthridiniumbromid auf lOy/ml eingestellt Die beiden Ansätze werden 24 Stunden bei 28° C inkubiert Danach werden die Trypanosomen abzentrifugiert und in frischem Dulbeccos Gebrauchsmedium (1,5 χ 106ZmI) aufgenommen.
Ergebnis
Nach Entfernen des Mediums von den Zellkulturen gibt man jeweils 3 ml der Trypanosomen-Suspension (4,5 χ 10* total) in die Leighton-tubes und inkubiert bei 33° C 72 Stunden. Danach wird das Medium gewechselt und weitere 48 Stunden inkubiert
Die in den Leighton-tubes befindlichen mit Zellre-ien bewachsenen Deekgläschen werden nach Giemsa angefärbt
Ergebnis
Die Zellen, die mit unbehandelten Trypanosomen inkubiert wurden, sind — wie das mikroskopische Bild zeigt — zwischen 40—70% infiziert Die Zellen, die jedoch mit Trypanosomen inkubiert wurden, die mit 3,8-Diamino-5-äthy!-6-phenyI-phenanthridiniumbromid vorbehandelt waren, sind nicht infiziert
B. An der M?.us
NMRi-Mäuse, die etwa 10 Taje zuvor mit etwa 5 χ 104 Trypanosomen vom Stamm Brasil pro Maus infiziert waren, werden unter streng sterilen Bedingungen in Gegenwart von Heparin entblutet (Durch-Schnittskonzentration 50—200 χ 106ZmI). Die Suspension wird mit dem Medium nach Parker (a^.o.) auf 2 χ 106Ml eingestellt und halbiert Die eine Hälfte wird mit S^-Diamino-S-äthyl-e-phenylphenanthridiniumbromid versetzt (Endkonzentration 10 y/ml). Beide Suspensionen werden bei 37° C für 24 Stunden inkubiert Die so inkubierten Suspensionen werden (0,5 ml pro Tier = 1 χ 106 Trypanosomen pro Tier) Mäusen (12—14 g) subkutan appliziert Der Verlauf der Erkrankung wird anhand der Gewichte, der Parasitämie und dem Tod der Tiere verfolgt
Erreger Behandlung
Gewicht
Parasitämie ToteZGesamtzahl
T. cruzi 10 y/ml 3,8-Diamino-5-äthyI-6-phenylphenanthridiniumbromid
T. cruzi -
Die erfindungsgemäß behandelten Trypanosomen haben — wie nachstehend bewiesen wird ~ immunisierende Eigenschaften.
Der Nachweis der Ausbildung einer schützenden Immunität kann beispielsweise wie folgt geführt werden:
2 Gruppen von Mäusen werden mit Trypanosomen (epimastigote Form) inokuliert Gruppe A, 10 Mäuse, erhalten je 0,5 ml subkutan Kulturformen (5 χ 107 pro Tier), Gruppe B, 10 Mäuse, Kulturformen, die erfindungsgemäß laut Beispiel behandelt worden sind (5 χ 1O7PrOTiCr)1GrUpPeQlOMaUSe1O^mIKoChSaIz. Nach 21 Tagen werden alle Tiere infiziert mit phatogenen Trypanosomen Stamm Brasil (1 χ 105 pro Tier subkutan).
Ergebnis
Die Tiere der Gruppe A und B überleben zu 100% mindestens 100 Tage nach Infektion, die Kontrolltiere der Gruppe C sterben alle innerhalb der Tage 10—15 nach Infektion.
Damit ist gezeigt, daß eine parenterale Verabrei-
zunehmend 0 bis extrem niedrig 0/10
abnehmend hoch 10/10
chung von erfindungsgemäß attentuierten Trypanosomen gegen eine tödliche Infektion von Trypanosomen zu schützen vermag.
Die Herstellung eines Impfstoffs, der als Wirkprinzip die Suspension der erfindungsgemäßen Trypanosomen in einem physiologisch verträglichen Medium enthält, läßt sich auf die dem Fachmann bekannte Weise bewerkstelligen, zweckmäßig unter Stabilisierung der Trypanosomen mit Schutzkolloiden, beispielsweise mit Proteinen wie Albumin oder Polysacchariden wie Dextran.
Die Erfindung soll am nachstehenden Beispiel näher erläutert werden:
Beispiel
(nachgereicht)
Behandlung von Kulturformen von T. cruzi mit S.e-Diarnino-S-äthyl-e-phenylphenanthridiniurnbromid.
Alle Gerät.1 und Medien müssen unter streng sterilen Bedingungen gehandhabt werden.
Ausgangsmaterial ist die Suspension von T, cruzi in der flüssigen Phase einer Blutagar-Kultur. Die 5 Tage
alte Kultur wird durch sterile Gaze in einen Meßzylinder dekantiert und in einer Thomakammer die Konzentration der Trypanosomen in der Ausgangssuspension bestimmt. Im Beispiel sind es 25 χ 10h Trypanosomen/ml in 75 ml, was einer Totalmenge von 1.8 χ 10q entspricht. Die Suspension wird in einen 250 ml Zentrifugenbecher mit Schraubverschluß überführt und 20 Mm. bei 4°C bei 3300 g zentrifugiert. Der
Überstand wird abdekantiert. Das Sediment wird in 100 ml physiologischer NaCI-Iüsung resuspendiert und erneut unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Der Überstand wird abdekantiert und das Sediment in einem Medium folgender Zusammensetzung (im folgenden »Medium« genannt) im Zentrifugenbecher suspendiert:
Aminosäuren mg/1 \ Kamine nTI 7 "> nip/1
Alanin HCI 25.0 Aminobcnzocsäure pn /,ζ 0.050
Arginin 70.0 Ascorbinsäure 50,000
Asparaginsäure 30.0 D-Biotin 0,010
Cystein HC! H1G D-C'a-Panioihcnat
Cystin 20.0 Cholinchlorid 0,500
Glutaminsäure 75,0 Cocarboxylasc 1,000
Glutamin 100.0 Folsäure 0,010
Glycin 50.0 Inosit 0,500
Histidin HCl · H2O 20,0 Nicotinamid 0,025
Hydroxyprolin 10,0 Nicotinsäure 0,025
Isoleucin 20.0 Pyridcml HCl 0,025
Leucin 60.0 Pyridoxin HCI 0,025
Lysin HCI 70.0 Riboflavin 0,010
Methionin 15.0 Thiamin HCI 0,010
Phenylalanin 25,0
Prolin 40.0
Serin 25.0
Threonin 30,0
Tryptophan 10.0
Tyrosin 40.0
Valin
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat 5,0 Natrium-Acetat 3H2O 83,0
Cholesterin 0,2 Natrium Glucuronat 4,8
Coenzym A 2.5 Thymidin 10,0
Deoxyadenosin iO.O Triphosphopyridin
Deoxycytidin HCI 10.0 -Nucleotid
Deoxyguanosin 10.0 -Mononatrium
Diphosphopyridin -Salz (TPN) 1,0
-Nucleotid Uridin-5'-triphosphat
-Tetrahydrat -Tetranatrium
-(DPN, 4H2O) 7,0 -Tetrahydrat (UTP) 1,0
Flavin Adenine NaCl 6800
-Dinucleotid (FAD) 1,0 KCl 400
L-Glutathion 10.0 MgSO4, 7 H2O 200
CaCl2 (anhyd.) 200
(NaH2PO4, H2O) !40 Glucose 1000
NaHCO3 2200 Phenol rot 17
Durch Zusabe von 85 ml Medium einer «on 2 χ 107 Tr¥i«n'«*Mnen/n>1 Di·*«« S"">en«:i«">n winj
durch ein Millipore-Filter (0,2 μ Porengroße) steril 65 24 Stunden bei 28°C in einem Brutschrank inkubiert.
filtrierten Lösung von 0,9 mg 3,8-DiaTiino-5-äthyl-6-phenylphenanthridiniumbromid in Medium (Endkonzentration lOy/ml in 90 ml) entsteht eine Suspension
Nach 24 Stunden wird erneut bei _3300g in der Zentrifuge bei 4° C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Sediment in 18 ml Medium
030 218/181
aufgenommen.
Die erhaltene Endkonzenlration von 1 χ ΙΟ8 Trypa nosomen/ml ist beispielsweise geeignet zur Immunisation von Mäus3fi.
Bei identischem Vorgehen wie vorher beschrieben kann anstatt von S.
ihridiniumbromid auch 3,8-Diamino-5-methyl-6-phenylphenanthridiniumbromid verwendet werden.
Ebenfalls kann anstatt 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenylphenanthridiniumbromid auch 7-{m-amidino-phenyldia/.oamino)-2-aminu-IO-äthyl-9-phenylphenanthridiniumchlorid-hydrochlorid verwendet werden.

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines Stoffes mit immunologischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß in einem einphasigen wäßrigen flüssigen Kulturmedium in einer Konzentration von 103—lOVinl suspendierte Trypanosomen mit einem Phenanthridin-Derivat in einer Konzentration von (W-1000 y/ml 1 — 120 Stunden bei 18-37°C inkubiert und die auf diese Weise attenuierten Trypanosomeii anschließend gewonnen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Phenanthridin-Derivat 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenylphenanthridiniumbromid verwendet wird.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium proteinfrei ist
DE2430380A 1974-06-25 1974-06-25 Herstellung eines Stoffes mit immunologischer Wirkung Expired DE2430380C3 (de)

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