DE2426586A1

DE2426586A1 - Verfahren zur herstellung von glukuronil-glukosamin-glykan-sulfaten mit antilipaemischer wirkung

Info

Publication number: DE2426586A1
Application number: DE19742426586
Authority: DE
Inventors: Pietro Bianchini
Original assignee: Opocrin SpA
Current assignee: Opocrin SpA
Priority date: 1973-06-14
Filing date: 1974-05-31
Publication date: 1975-01-09
Also published as: US3936351A; AR201869A1; CA1015269A; GB1436684A; JPS5035398A; ES427177A1; AU7015174A; FR2233332A1

Description

Via Pacinotti, Formigine
Frazione Corlo

Modena / Italien

Verfahren zur Herstellung von Glukuronil-Glukosamin-Glykan-Sulfaten mit antilipämischer Wirkung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Glukuronil-Glukosamin-Glykan-Sulfaten mit hoher spezifischer antilipämischer Wirkung (10-20 U.LS./mg), wobei 1 U.LS. die Substanzmenge ist, welche bei intravenöser Einspritzung in eine Ratte mit einem Gewicht von 200 g in der Lage ist, nach zehn Minuten das Erscheinen von Lipotroteinolipasis.im Kreislauf derart auszulösen, daß ein Abfallen der optischen Densität der Mischung 1:2 Plasma/Kokosoel um 50% "in vitro" nach fünfzehn

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Minuten Entwicklungszeit auftritt.

Diese Erzeugnisse werden bekanntlich in der Therapie wegen ihrer hypo-lämisierenden Wirkung benützt, doch übersteigen die gegenwärtig benützten Präparate nicht 1 U.LS./mg; es handelt sich dabei um Mukus-Polysaccharid-polycarboxilate und -Polysulfonate. Ihre Extraktion bedingt ein Verfahren der Proteolyse oder alkalinisches Ausziehen zum Zwecke der Hydrolisierung des angeborenen Glykan-Protids, um damit den Polysaccharidanteil freizulegen.

Einige bekannte Verfahren zur Herstellung der Glukoronil-Glukosamin-Glykan-Sulfate mit antilipämischer Wirkung sehen hintereinander das Ausfällen des extrahierten Materials mittels Lösungsmitteln vor, die Lösung des Niederschlags und nachfolgende Reinigung mittels verschiedener Verfahren, wie Chromatographie an einer Harzsäule und/oder das selektive Ausfällen der Komplexe und unlöslicher Salze. Diese Verfahren bewirken aufgrund ihrer langen Dauer und Aufwendigkeit einen beträchtlichen Stoff- und Zeitverlust und ergeben gewöhnlich einen biologisch ziemlich geringen Gehalt im Endprodukt (etwa 1-2 U.LS./mg). Verfahrensbeispiele dieser Art sind in den britischen Patentschriften 1 172 919 und 899 010 beschrieben.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, welches die unmittelbare Herstellung bei hohem Reinheitsgrad der antilipämischen Wirkung aufweisenden Erzeugnisse, die frei von anaphylaktogenen Substanzen, von Hystamin und Pyrogenen sind, zuläßt und die selektive Ausfällung der in Wasser unlöslichen Komplexe vorsieht und der unmittelbar auf die Proteolyse oder die alkalinischen Hydrolyse

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stufe auf das tierische behandelte Organ soweit eine anschliessende Beseitigung des Verunreinigungsmaterials mittels Waschen des Niederschlags mit einer Salzlösung entsprechender Konzentration folgt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glukuronil-Glukosamin-Glykan-Sulfaten mit antilipämiseher Wirkung, wobei Düoden oder Pankreas von Tieren einer Hydrolyse unterworfen und diesen Organen eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert zwischen ungefähr 5 bis 10 in Gegenwart eines antibakterischen Wirkstoffes lediglich als Inhibitor der bakterischen Flora zugesetzt wird, die Schwemme bei 3O-7O°C bis zu 48 Stunden lang unter Luftabschluß gehalten und alsdann auf 70-100⁰C 10-40 Minuten lang erhitzt wird und die festen Bestandteile ausgeschieden werden.

Die Erfindung besteht darin, daß der durch die Abtrennung erhaltenen Flüssigkeit eine organische Base mit einer aliphatischen Kette von mindestens 7 Kohlenstoffatomen in einer Menge zwischen 1% und 4% Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht des behandelten Tierorgans zugesetzt wird und die Flüssigkeit wird mittels einer 20-40%-igen Lösung einer anorganischen Base auf einen pH-Wert zwischen 7,5 und 8,5 eingestellt, daß die Flüssigkeit zwischen 2 und 20 Minuten lang auf 70-100°C erhitzt wird, um den Niederschlag zu verdicken und dessen Zentrifugierung zu erleichtern, daß die festen Bestandteile von der Flüssigkeit abgesondert werden und der Rückstand zuerst mit destilliertem Wasser und danach mit einer wässrigen Salzlösung mit einer MoIarität zwischen 0,5 und 1 gewaschen wird, daß der Niederschlag mittels einer wässrigen Lösung des gleichen Salzes, das auch für

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die vorangehende Waschung benutzt wurde, mit einer Molarität zwischen 2,5 und 4 entkomplexiert wird und daß die Verbindung aus der Lösung mittels eines Alkohols mit weniger als 4 Kohlenstoffatomen bei einem pH-Wert zwischen 3 und 5 ausgefällt wird.

Vorzugsweise ist die Hydrolyse, welcher die Tierorgane (Duodenum oder Pankreas) zu Beginn des Verfahrens unterworfen wurden, eine enzymatische Hydrolyse, welche mittels proteolytischer Enzymen durchgeführt wird, beispielsweise wie Pepsin, Tripsin, Papain und andere. In diesem Falle wird der pH-Wert der wässrigen Lösung der fraglichen Tierorgane vorzugsweise der optimalen Wirksamkeit jedes der in der Hydrolyse benutzten Enzyme angepaßt.

Zur besseren Erläuterung werden nachfolgend einige Beispiele zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gegeben.

Beispiel 1

100 kg zermahlenem Schweine-Duodenum (Zwölffingerdarm) werden IO kg NaCl, 4OO g NaOH und 200 Liter H₃O zugesetzt, wobei ein pH-Wert von ungefähr 6-7 erreicht wird. Die Schwemme wird 15-20 Minuten lang gekocht, danach wird sie auf 6O⁰C gekühlt, dann werden 1.500.000 U.I Penicyllin, 600 g Papain (1:100), 600 g Natriumhyposulfit zugesetzt, wonach man das Ganze 16 Stunden lang bei 6O⁰C reifen läßt, danach wird die Mischung 15-30 Minuten lang gekocht, dann zentrifugiert und anschließend wird die zentrifugierte Flüssigkeit filtiert.

Der völlig klaren Flüssigkeit werden 3 Liter einer Quaternar-Ammonium-Base zugesetzt, die aus folgender Mischung besteht; 40% Methyl-Dodecyl-Benzyl-Trimethyl-ammoniumchlorid 10% Methyl-Dodecyl-Xylen bis (Trimethyl-Ammoniumchlorid) 50% Wasser. 409882/1133

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Die Flüssigkeit wird auf einen pH-Wert von 7,7 mittels 30%-iger NaOH gebracht, 5 Minuten lang gekocht, damit eine Flockung des Niederschlages erreicht wird, und dann zentrifugiert oder filtriert (die Flüssigkeit wird als Abwasser weggeschüttet). Der Rückstand wird zweimal mit 20 Liter destilliertem Wasser (das Waschwasser wird weggeschüttet) gewaschen, um die überschüssige' Mischung eventueller pyrogener Substanzen im Rückstand zu entfernen, da derselbe ja das injektierbare Produkt bilden soll; alsdann wird der Rückstand mit 20 Liter einer Lösung aus 0,8 M NaCl (Waschlösung wegzuschütten) gewaschen,um die Substanzen zu entfernen (karboxylische Bindungen), die schwach an die guarternäre Ammoniumbase gebunden waren, die zuvor benutzt wurde und welche keine biologische Wirkung besitzen. Der Rückstand wird mit 20 Liter einer NaCl Lösung 3 M behandelt, um die Zersetzung bzw. Ausscheidung aus dem Komplex nur der Substanzen zu bewirken, an welche die Wirkung gebunden ist, und alsdann wird die Zentrifugierung vorgenommen (der feste Rückstand ist wegzuwerfen) und die zentrifugierte Flüssigkeit wird auf einem pH-Wert von 4,5 mittels Eis-Essigsäure eingestellt. Es werden 1,5 Volumen Methanol zugesetzt, es wird zentrifugiert und der zentrifugierte Rückstand wird in 50 1 einer NaCl-Lösung gelöst und klar filtriert. Der klaren Flüssigkeit, die auf einen pH-Wert von 4 gebracht und 1,5 Volumenprozent Methanol zugesetzt. Es wird zentrifugiert und der Rückstand wird zweimal mit Methylalkohol und einmal mit Asthylaether gewaschen. Der Rückstand wird zuletzt im Vakuum getrocknet. Mittels letzterer Stufe wird ein einspritzbares (injektierbares), apyrogenes, hystaminfreies und von anaphilolaktogenen Substanzen freies Produkt erhalten, das aus Glukoronil-Glukosamin-Glykan-Sulfaten besteht, mit einer Klärwirksamkeit von ungefähr 20 ü.LS. Die erhaltene Substanz weist außerdem einen durchschnittlichen Gehalt an Ascorbin-Säuren

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(Vitamine) von 180 mcg/mg, Sulfaten 260 mcg/mg und an Hexosaminen von 310 mcg/mg auf.

In dem vorgenannten Beispiel wurde Papain als protheclytisches Enzym benützt, doch kann das Verfahren auch mit jedem anderen beliebigen proteolytischen Enzym durchgeführt werden, beispielsweise mit Pepsin, Trypsin und Chimotrypsin, indem von Fall zu Fall der pH-Wert entsprechend angepaßt wird und ebenso die Temperatur bei der Verarbeitung des benützten Enzyms. Das gleiche Verfahren gemäß dem vorbeschriebenen Beispiel kann auch unter Benützung anderer Reaktionsmittel durchgeführt werden, doch der gleichen Gattung wie angegeben. Beispielsweise kann die Base aus quaternärem Ammonium, die der klaren Flüssigkeit zugesetzt wird, aus n-Alchyl (50% C₁₄ - 40% C _ -" 10% CjgJ-Dimethyl-Benzyl-Amminium-Chlorid bestehen, die benützte Salzlösung zum Waschen des Rückstandes kann aus einer Lösung aus KCl 0, 5M oder CH^COONa IM bestehen; die wässrige Lösung um den Niederschlag zu entkomplexieren, kann aus einer wässrigen Lösung von KCl 3,5M bestehen oder auch aus CH₃COONa 2,5M.

Beispiel 2

100 kg zermahlenem Rinder-Pankreas werden 15 kg NaCl, 50 Liter H₂O, 1.500.000 ü.I Pennicyllin und NaOH bis zur Erreichung eines pH-Wertes von 5 zugesetzt und das Ganze wird 44 Stunden bei ungefähr 40⁰C reifen gelassen, so daß eine Autolyse des Pankreas erhalten wird. Die Mischung, die erhitzt und 15 Minuten lang kochend gehalten wird, wird zentrifugiert und dann filtriert. Der völlig klaren Flüssigkeit, die auf einen pH-Wert von 8,2 mittels 25%-igen KOH gebracht wurde, wird 1 kg Thrimethyl-Azetyl-ί Ammonium-Bromid zugesetzt. Die so erhaltene Mischung wird 10 :

Minuten lang auf 80 erhitzt, um die Ausflockung des Niederschla-j ges zu erreichen. Die Flüssigkeit wird alsdann zentrifugiert und !

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filtriert (die Flüssigkeit wird weggegossen). Der Rückstand wird zweimal mit 20 Liter destilliertem Wasser gewaschen (das Waschwasser wird weggeschüttet) und einmal mit 20 Liter einer Lösung 0,,5M an KCl (die Waschlösung wird weggegossen) . Alsdann wird der Rückstand mit 20 Litern einer Lösung aus KCl 4M behandelt, um die Entkomplexierung nur der Substanzen zu erreichen, an welche die biologische Wirkung gebunden ist. Alsdann wird die Lösung (der feste Bestandteil wird weggeworfen) zentrifugiert und die opaleszente (farbigschillernde) Flüssigkeit wird auf einen pH-Wert von 3,5 mit einer 10%-igen HCl-LÖsung gebracht. Es werden zwei Volumen Äthanol zugesetzt, dann wird zentrifugiert und der Rückstand aus der Zentrifugation wird zweimal mit Methyl-Alkohol und einmal mit Äthyläther gewaschen. Der Rückstand wird im Vakuum getrocknet; dadurch wird ein einspritzbares (injektierbares) Erzeugnis erzielt, das apirogen, hyatamynfrei und frei von anaphylaktogenen Substanzen ist, aus Glukuronil-Glukosamin-Glykan-Sulfaten besteht und eine klärende Wirkung von ungefähr 20 U.LS./mg besitzt. Die erhaltene Substanz weist außerdem einen durchschnittlichen Gehalt an Säuren von 270 mcg/mg, an Sulfaten von 270 mcg/mg und an Hexosaminen von 330 mcg/»g auf.

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Claims

Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung von Glukuronil-Glukosamin-Glykan-SuIfaten mit antilipämiseher Wirkung, wobei Duoden (Zwölffingerdarm) oder Pankreas von Tieren der Hydrolyse unterworfen und diesen Organen eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert zwischen 5 und ungefähr 10 in Gegenwart eines antibakterischen Wirkstoffes lediglich als Inhibitor der bakterischen Flora zugesetzt wird, die Schwemme bei 3O-7O°C bis zu 48 Stunden lang unter Luftabschluß gehalten und alsdann auf 70-100⁰C 10-40 Minuten lang gehalten wird und die festen Bestandteile ausgesondert werden, dadurch gekennzeichnet, daß der durch die Abtrennung erhaltenen Flüssigkeit eine organische Base mit einer aliphatischen Kette von mindestens 7 Kohlenstoffatomen in einer Menge zwischen 1 und 4 Gewichtsprozent bezogen auf das Gewicht des behandelten Tierorgans zugesetzt wird und die Flüssigkeit mittels einer 20-40%-igen Lösung einer anorganischen Base auf einen pH-Wert zwischen 7,5 und 8,5 eingestellt wird, daß die Flüssigkeit zwischen 2 und 20 Minuten lang auf 70-100°C erhitzt wird, um den Niederschlag zu verdicken und dessen Zentrifugierung zu erleichtern, daß die festen Bestandteile abgesondert werden und der Rückstand zuerst mit destilliertem Wasser und danach mit einer wässrigen Salzlösung mit einer Molarität zwischen 0,5 und 1 gewaschen wird, daß der Niederschlag mittels einer wässrigen Lösung des gleichen Salzes, das auch für die vorangehende Waschung benutzt wurde, mit einer Molarität zwischen 2,5 und 4 entkomplexiert wird und daß die erwünschte Verbindung aus der Lösung mittels eines Alkohols mit weniger als 4 Kohlenstoffatomen bei einem pH-Wert zwischen 3 und 5 ausgefällt wird.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gefällte Endverbindung erneut in einer 1,3M Salzlösung klar filtriert und dann bei einem pH-Wert zwischen 3 und 5 mit einem Alkohol mit weniger als 4 Kohlenstoffatomen ausgefällt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse eine enzymatische Hydrolyse ist und daß der pH-Wert auf den die wässrige Lösung der Tierorgane gebracht wird, maßgeblich dem Optimum der Wirksamkeit eines jeden der zur Hydrolyse benützten Enzyms entspricht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Salzlösung, die zum Waschen des Rückstandes benutzt wird, eine Lösung aus NaCl 0,8M, KCl 0,5M oder CH₃COO Na IM ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Rückstand mittels einer wässrigen salzigen Lösung bestehend aus NaCl 3,5M oder CH₃COO Na 2,5M entkomplexiert wird.

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