DE2405810B2

DE2405810B2 - Digital-photometer zur selbsttaetigen messung der enzymaktivitaet mehrerer proben

Info

Publication number: DE2405810B2
Application number: DE19742405810
Authority: DE
Inventors: Walter Ing.(grad.) 7082 Ober- Kappe
Original assignee: Carl Zeiss AG
Current assignee: Carl Zeiss AG
Priority date: 1974-02-07
Filing date: 1974-02-07
Publication date: 1977-07-07
Also published as: US4055752A; DE2405810A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Digital-Photometer nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Die Messung der Enzymaktivität spielt insbesondere in der klinischen Chemie seit Jahren eine große Rolle, da sie für verschiedene Erkrankungen eine sehr frühe Diagnose sowie eine Verlaufs- und Therapiekontrolle ermöglicht.

Die Aktivität eines Enzyms ist gegeben durch die Anfangsgeschwindigkeit einer enzym-katalysierten Reaktion unter bestimmten Bedingungen, also durch die Abnahme der Substratkonzentration mit der Reaktionszeit. Zur Messung der Enzymaktivitäten ist deshalb die Substratkonzentration zu verschiedenen Reaktionszeiten zu bestimmen. Dies ist besonders schnell und einfach durch Extinktionmessung möglich, falls während der Reaktion ein lichtabsorbierender Stoff verbraucht wird oder entsteht. 1st dies nicht der Fall, so wird eine Indikatorreaktion angeschlossen, bei der ein Produkt der eigentlichen Testreaktion unter Bildung eines lichtabsorbierenden Stoffes verbraucht wird. In diesem Fall läßt man erst eine Vorreaktion ablaufen und startet nach einer bestimmten Zeit die Testreaktion durch Zugabe eines Startreagenz.

Um den Geräteaufwand in erträglichen Grenzen zu halten, begnügt man sich im allgemeinen bei der Messung von Enzymaktivitäten damit, den Extinktionswert in genau definierten Zeitabständen zu messen und in die so ermittelten Meßwerte eine Gerade einzupassen, deren Steigung der gesuchten Aktivität proportio-Die Untersuchungszeilen für eine Probe liegen bei einigen Minuten. Daher führt man im allgemeinen mit einem Photometer mehrere Bestimmungen zugleich durch, indem man mehrere Proben abwechselnd nacheinander in den Strahlengang bringt und die Extinktionswerte mißt.

Bekannt ist ein Digital-Photometer zur Messung der Enzymaktivität einer Anzahl von in Küvetten enthaltenen Proben. Diese Küvetten sind in einem Küvetien· wechsler angeordnet und werden über ein Zeitschaltwerk zu fest vorgegebenen Zeitpunkten aufeinanderfolgend in wiederholten Zyklen in den Strahlengang des Photometers gebracht. Mit dem Photometer ist ein programmierbarer Rechner verbunden, dem die zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnenen verstärkten Meßsignale zugeleitet werden und der daraus die Enzymaktivitäten der Proben errechnet und einem Anzeigegerät zuleitet, vergl. den Prospekt Nr. 621-24a der Fa. Ernst Leitz GmbH, Wetzlar vom März 1972, betreffend das Doppelstrahl-Photometer DP-digital.

Ein solches Digital-Photometer ist aufwendig, da das eigentliche Meßprogramm in der Küvettenwechsel-Automatik als Hardware vorliegen muß und zusätzlich ein programmierbarer Rechner notwendig ist. Außerdem sind die erzeugten Meßwerte in vielen Anwendungsfällen nicht genau genug, da trotz stark unterschiedlicher Eigenabsorption der Proben der Verstärker des Photometers auf einen Mittelwert eingestellt ist, und somit nicht alle Proben in einem photometrisch günstigen Bereich gemessen werden.

Aus Zeiss Informationen, 20. Jahrg.. Heft 80 (1972) Seite 8 — 9, ist es ferner bekannt, einen Rechner in einem optischen Meßgerät wie /.. B. einem zur Auswertung von Dünnschichtchromatogrammen dienenden Photometer einzusetzen und den Ablauf der Photometerfunktionen durch den Rechner zu steuern. Der Rechner gibt dabei seine Steuerbefehle in Abhängigkeit von den vom Photometer gelieferten Meßdaten und führt sämtliche Rechenoperationen zur Ermittlung der gesuchten Parameter durch.

Schließlich ist es aus Applied Optics, Vol. 12, Nr. 8, 1973 Seite 1976-1982 auch bekannt, den Rechner eines rechnergesteuerten optischen Meßgerätes zur Mittelung von Meßwerten heranzuziehen, welche bei wiederholter Durchführung einer Messung gewonnen wurden.

Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Digital-Photometer zur selbsttätigen Messung der Enzymaktivität von in Küvetten enthaltenen Proben zu schaffen, das sich gegenüber bekannten Geräten durch einen verringerten Aufwand auszeichnet und trotzdem sehr genaue Meßwerte liefert. Das neue Photometer soll außerdem schnell und verläßlich arbeiten und vielseitig einsetzbair sein.

Dieses Ziel wird gemäß der Erfindung durch die irr kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebener Maßnahmen erreicht.

Bei dem neuen Digital-Photometer ist keine Küvet tenwechsel-Automatik erforderlich, da der Rechner mi den vom Zeitschaltwerk erzeugten Taktimpulsen direk den Küvettenwechsel sowie den Meßvorgang steueri Das Meß- und Auswerteprogramm liegt als Softwan vor, so daß wesentliche Einsparungen am Photomete erzielt werden. Außerdem wird durch diese Steuerun; erreicht, daß Rechen- und Wechselzeiten die Zeit de Meßwertnahme nicht beeinflussen, da das Taktsignal ir Rechnerprogramm integriert ist.

Eine optimale Meßgenauigkeit wird dadurch erreich

daß die Verstärkung des Meßsignal-Versiärkerx mittels des Rechners jeweils auf einen für die jewei ige Probe vom Rechner ermittelten optimalen Wvrt eingestellt wird. Dazu ermittelt der Rechner für jede Probe beim ersten Meßvorgang den unter Berücksichtigung der möglichen Änderungen photometrisch günstigsten Meßbereich, der beispielsweise zwischen den Extinktionswerten 0 und 0,4 liegt, und stellt den Verstärkungsgrad entsprechend ein. Der so ermittelte Wert wird gespeichert und immer wieder dann eingestellt, wenn sich die betreffende Probe in Meßstellung befindet, ohne daß die bedienende Person die Geräteeinstellung verändern muß.

Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unter.insprüche.

Zur Ermittlung der Enzymaktivitäten der P-oben legt der Rechner durch die für jede Probe gewonnenen Meßwerte eine Regressionskurve, die durch ein Polynom zweiten Grades dargestellt wird. Ein solches Polynom der allgemeinen Formel

E(t) = a_o + ait + a₂t²

verfügt gegenüber der üblicherweise verwendeten Gerade über ein weiteres Glied, das für a₂ = 0, d. h. dann, wenn die Testreaklion nicht während der gesamten Meßzeit linear verläuft, eine Korrektur bewirkt und so die Regressionskurve gegenüber dvr Geraden besser in die Meßpunkle einpaßt. Der Rechner legt die Regressionskurve so durch die Meßpunkte, daß die Summe der Quadrate der Abweichungen in den einzelnen Meßpunkten möglichst klein ausfällt. Aus der Steigung der Regressionskurve in einem vorbestimmten Zeitpunkt wird dann die Enzymaktivität ermittelt, wobei zugleich aus dem Einpaßfehler der Kurve, den Standardabweichungen der Einzelmessungen und der Krümmung der Regressionskurve ein Gesamt-Meßfchler ermittelt wird. Dieser stellt ein objektives Maß dar und vermittelt dem Messenden einen klaren Hinweis, mit welcher Genauigkeit die Enzymaktivität bestimmt wurde.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand der F i g. 1 bis 3 der Zeichnungen näher erläutert. Im einzelnen zeigt

F i g. 1 eine typische Meßkurve, welche die Abhängigkeit der Extinktion fvon der Zeit t zeigt,

Fig. 2 eine Prinzipdarstellung eines Ausführungsbeispiels eines Digitalphotometers,

Fig.3 eine Schaltung für einen Verstärkungsregler, wie er in der Vorrichtung nach Fig. 2 Verwendung findet.

Im Ausführungsbeispiel der Fig.2 ist ein Einstrahlphotometer gezeigt, da die Langzeitkonstanz von guten Einstrahlphotometern für die Messung von Enzymaktivitäten ausreichend ist. Grundsätzlich ist jedoch auch die Verwendung von Zweistrahlphotometern ohne weiteres möglich.

Das Photometer der Fig. 2 besteht aus einer Lichtquelle 1, die beispielsweise als Quecksilberdampflampe ausgebildet sein kann. Das von dieser Lichtquelle ausgehende Licht durchsetzt einen Kondensor 2, einen <₎₀ Filter 3, eine Linse 4, geht durch den Probenraum, in dem sich die Küvettenwechseleinrichtung 5 bewegt, und fällt schließlich auf einen Empfänger 6.

Die Küvettenwechseleinrichtung 5 enthält im dargestellten Beispiel sechs Küvetten 7, welche mittels eines (.5 Motors 8 durch den Probenraum bewegt werden.

Das vom Empfänger 6 erzeugte Signal wird im Vorverstärker 9 verstärkt, geht dann durch einen Verstärker mit einstellbarer Verstärkung 10, wird schließlich im Endverstärker 11 verstärkt und gelangt zum Eingang eines Analog-Digital-Wandlers 12. Dieser wandelt das Signal in ein Digitalsignal um und führt dieses über eine Leitung 13 einem frei programmierbaren Rechner 14 zu. Die Programmeingabe für den Rechner 14 erfolgt bei 15 über eine Loseeinrichtung, beispielsweise für Magnetkarten oder Magnetbänder. Mit dem Rechner 14 ist ferner ein Drucker 16 verbunden, der die Ergebnisse ausdruckt.

Der Rechner 14 ist über ein Interface 17 mit einer Bedienungseinheit 18 verbunden, welche zweckmäßig als Bedienungsfeld des Photometers ausgebildet ist und verschiedene Leuchttasten, jedoch kein Ablese- oder Anzeigeinstrument enthält.

In das in Fig. 2 dargestellte Photometer sind verschiedene Filter 3 einsetzbar. Im seitlichen Teil der Filterfassungen sind durch Vertiefungen Codierungen entsprechend den Meßwellenlängcn angebracht. Diese Codenummern werden von Mikroschaltern abgefragt, und die jeweilige Information wird über eine Leitung H dem Interface 17 und dem Rechner 14 zugeführt.

Es ist auch möglich, anstelle der Filter einen Monochromator vorzusehen, der mit einer Digital-Ausgabe für die jeweils eingestellte Meßwellenlänge ausgestattet ist.

Das Interface 17 enthält eine Echtzeituhr, die unter anderem dafür sorgt, daß bei Messung der Enzymaktiv 1 täten die Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Messun gen einen genau festgelegten Wert hat. Zu diesem Zweck werden Taklinipulse zum Rechner 14 gegeben, welche bewirken, daß das im Rechner enthaltene Programm im Takt dieser Impulse arbeitet.

Die Schaltung des in Fig. 2 mit 10 bezeichneten Verstärkers ist in Fig. i dargestellt. Sie enthält drei Operationsverstärker 21, 31,41, die jeweils in derselben Art geschaltet sind. Diese Schaltung soll am Beispiel des Operationsverstärkers 21 näher erläutert werden, liin Eingang die-.es Operationsverstärkers ist mit vier Feldeffekttransistoren 22,23,24,25 und vier Widerständen 26, 27, 28,29 verbunden. Jeder der Feldeffekttransistoren weist einen Eingang auf. die entsprechend dem Dual-Code mit in Klammern gestellten Zahlen bezeichnet sind. Diese Eingänge werden über die Leitung 20 vom Rechner 14 (F i g. 2) angesteuert.

Durch die Widerstände 26—29 und den Rückführungswiderstand 30 wird die Verstärkung des Operationsverstärkers 21 im Verhältnis 1 :2 :4 :8 geändert.

Dadurch sind die Verstärkungsfaktoren 0, 1, 2 15

einstellbar. Der Ausgangswiderstand 42 sorgt im Zusammenwirken mit einem hier nicht dargestellten nachfolgenden Operationsverstärker dafür, daß es sieh bei der Ausgangsspannung des beschriebenen ersten Schaltungsblocks um die Einerstelle im verwendeten Code handelt. Darauf weisen auch die verwendeten Eingangsbezeichnungen hin. Die Zehnerstelle ist durch den zweiten Schaltungsblock gekennzeichnet, welcher den Operationsverstärker 31 enthält, während die Hunderterstclle durch den dritten Schaltungsblock mit dem Operationsverstärker 41 gekennzeichnet ist. Die Ausgangswiderstände 44, 43, 42 weisen ein Verhältnis ihrer Widerstandswerte von 1:10: lOOauf.

Die Wirkungsweise der in F i g. 2 dargestellten Vorrichtung ist folgende. Nach dem Einschalten des Gerätes zündet zunächst die Lampe 1, wobei dafür gesorgt ist, daß erst nach einer definierten Einlaufzeit von beispielsweise acht Minuten die weiteren Gerätefunktionen freigegeben werden. Nach erfolgter Freiga-

be wird bei 15 das Programm in den Rechner 14 cingclescn und gestartet. Nach der Kontrolle ob das richtige Filter im Meßstrahlengang ist, leuchtet eine Start-Taste auf. Ihre Betätigung setzt die im folgenden beschriebenen Vorgänge in Betrieb. Vom Rechnerprogramm gesteuert, bewegt der Motor 8 die erste der Küvcttcn 7 in Meßposition. Aus dem über die Leitung 13 ankommenden digitalen Meßsignal berechnet sodann der Rechner 14 die optimale Verstärkungseinstellung und steuert mit dem ausgerechneten digitalen Faktor die Feldeffekttransistoren der Schaltung nach F i g. 3 an. Damit stellt sich diese Schaltung auf einen Verstärkungsgrad entsprechend diesem Faktor ein. d. h., die Verstärkung des Verstärkers 10 ist optimal eingestellt. Diese Verstärkereinstcllung wird gespeichert, und es werden jetzt vom Rechner 14 gesteuert kurz hintereinander mehrere, beispielsweise zehn Meßwerte gewonnen, aus denen der Rechner 14 den Mittelwert und die Standardabweichung bestimmt. Der so gewonnene durch den Mittelwert der Einzelmessungen definierte Meßpunkl ist in Fig. 1 mit 45 bezeichnet, während die errechnete Standardabwcichung bei 46 angedeutet ist. Nach Durchführung dieser Rechnungen bewegt der Motor 8 die nächste Küvette in Mcßposiiion. Danach steht das Programm im Rechner 14 auf Stop und wird nach einer vorgegebenen Zeit über die Echtzeituhr im Interface 17 wieder gestartet. Das Programm führt nun die beschriebenen Schritte für die Küvcttcn Nummer 2 bis Nummer b nacheinander schrittweise durch. Dabei wird jeweils die optimale Verstärkung des Reglers 10 für jede Küvette eingestellt und gespeichert.

Nach Ablauf des ersten Küvettendurchganges wird die Küvettcnwechseleinrichtung in die Ausgangsposition zurückgefahren, und ein neuer Mcß/yklus beginnt. In diesem Zyklus wird die optimale Vcrstärkungseinstcllung für jede Küvette nicht mehr berechnet, sondern sie wird vom Speicher entnommen. In aufeinanderfolgenden Meß/yklen werden so beispielsweise für jede der Küvettcn sechs Meßpunkte gewonnen, welche für eine der Küvelten in Fig. I mit 45 bis 51 bezeichnet sind. leder Meßpunkt wird, wie schon erwähnt, aus einer Vielzahl von Einzelmessungcn gewonnen, wobei der Rechner 14 jeweils Mittelwert und Standardabweichung errechnet.

Nach Abschluß aller Meß/yklcn wird vom Rechner 14 durch die Meßpunkte 45 bis 51 eine Regrcssionskurvc gelegt. Diese wird als Polynom zweiten Grades so errechnet, daß die Summe der Quadrate der Abweichungen in den einzelnen Meßpunkten möglichst klein ist.

Da die Enzymaktivität durch die Anfangsgeschwindigkeit der enzymkatalysierten Reaktion gegeben ist, werden für die Auswertung nur die Meßpunkte 45 bis 51 im Zeitintervall l\-t2 herangezogen. Das Zeitintervall io-fi ist einer eventuell notwendigen Vorreaktion vorbehalten.

In Fig. 1 ist die Regressionskurve mit 52 bezeichnet. Diese Kurve stellt eine Parabel dar. Die Parabel hat gegenüber der üblicherweise verwendeten Regressionsgeraden Vorteile. Sie enthält diese Gerade als Spczialfall; liegen also alle Meßpunkte auf einer Geraden oder statistisch um sie verteilt, so ergibt sich dasselbe Ergebnis. Ist jedoch die Extinktionsänderung pro Zeiteinheit nicht konstant, was insbesondere bei hohen Enzymaktivitäten der Fall ist, so gibt die Parabel den wirklichen Verlauf sehr viel besser wieder als eine Gerade.

Der Rechner 14 bestimmt nun die Richtung der Tangente an die Kurve 52 /.. B. im ersten oder im /weiten Mcßpunkle. Diese Tangente ist in Fig.! mit 53 bezeichnet. Da für die Bestimmung der Tangente 53 der Kurvcnverlauf über die gesamte Untersuchungszeit (Punkte 45—51) ausgenutzt wird, ist die so ermittelte Steigung wesentlich genauer, als die Steigung einer Regressionsgeraden, die man z. B. nur durch die Meßpunkte 45—48 legen würde.

Aus der Steigung der Tangente 53 berechnet der Rechner 14 durch Multiplikation mit einem Faktor, der im Programm enthalten sein kann, der jedoch auch gesondert eingegeben werden kann direkt die gesuchte Enzymaktivität und gibt den Meßwert über den Drucker 16 aus. Zugleich wird vom Rechner 14 aus dem Einpaßfehler der Regressionskurvc 5 * den Standardabweichungen und der Krümmung der Kurve 52 der Meßfehler berechnet und zusammen mit dem Meßwert bei 16 ausgedruckt. Das Gerät liefert also zu jedem Meßwert eine objektiv richtige Fchlerangabc.

Anschließend leuchtet wieder die Startlampc auf: das Gerät ist bereit, die nächsten Proben zu messen.

Die Bedienung des Digitalphotomcters ist trotz der ungewöhnlich hohen Leistungsfähigkeil äußerst einfach da der Bedienende nur einige wenige Drucktasten, die vorzugsweise mit Klartext versehen sind, betätigen unc das Programmcinlcscn bewerkstelligen muß.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Digitalphotometer zur selbsttätigen Messung der Enzymaktivität einer Anzahl von in Küvetten enthaltenen Proben, mit einem Küvettenwechsler zur wiederholten, aufeinanderfolgenden Einbringung der Küvetten in den Strahlengang des Photometers zu Zeitpunkten, die durch ein Zeitschaltwerk vorgegeben sind, mit einem Verstärker für die Meßsignale und mit einem programmierbaren Rechner zur Ermittlung der Enzymaktivitäten der Proben aus den für jeweils eine Probe zu verschiedenen Zeitpunkten erhaltenen Meßsignalen, dadurch gekennzeichnet, daß das Zeitschaltwerk (17) zur Lieferung von Taktimpulsen mit dem Rechner (14) verbunden ist, daß der Rechner zur Erzeugung von den Küvettenwechsel sowie den Meßvorgang auslösenden Steuerbefehlen programmiert ist und daß die Verstärkung des Verstärkers (10) mittels des Rechners (14) jeweils auf einen für die jeweilige Probe vom Rechner ermittelten optimalen Wert einstellbar ist.

2. Digital-Photometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen mit diskreten, rein digital einstellbaren Verstärkungsstufen ausgerüsteten Verstärker (10) enthäl', dessen Einstelleingang (9') mil dem Rechner (14) verbunden ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jeder durch einen Steuerbefehl vom Rechner (14) ausgelöste Meßvorgang aus einer Anzahl schnell hintereinander ablaufender Einzelmessungen besteht, aus denen der Rechner durch Mittelwertbildung das jeweilige Meßsignal bildet.

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