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DE2460903C3 - Neue 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidine - Google Patents

Neue 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidine

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Publication number
DE2460903C3
DE2460903C3 DE2460903A DE2460903A DE2460903C3 DE 2460903 C3 DE2460903 C3 DE 2460903C3 DE 2460903 A DE2460903 A DE 2460903A DE 2460903 A DE2460903 A DE 2460903A DE 2460903 C3 DE2460903 C3 DE 2460903C3
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DE
Germany
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green
tolidine
tetraalkylbenzidines
solution
test
Prior art date
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Expired
Application number
DE2460903A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2460903B2 (de
DE2460903A1 (de
Inventor
Walter Dr.Rer.Nat. Rittersdorf
Walter Dr.Rer.Nat. 6940 Weinheim Vogel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Boehringer Mannheim GmbH
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Priority to DE2460903A priority patent/DE2460903C3/de
Priority to AR261715A priority patent/AR206739A1/es
Priority to GB3776576A priority patent/GB1464360A/en
Priority to GB4533675A priority patent/GB1464359A/en
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Description

Die Reaktion von Wasserstoffpeioxid mit Oxidationsindikatoren unter Katalyse durch Peroxidase oder peroxidatisch wirksame Stoffe zu farbigen Verbindungen spielt in der analytischen Chemie eine besondere Rolle, weil sie außer dem Nachweis von Wasserstoffperuxid und Peroxidasen auch die Bestimmung einer Reihe von Stoffen gestattet, die mit Sauerstoff und einer Oxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagieren. i*m folgenden eien als Beispiele einige dieser Stoffe und in Klammern die entsprechenden Oxidasen aufgezählt: Glucose (Glucoseoxidase), Galactose (Galactoseoxidase), L-Aminosäure (L-Aminosäureoxidase), Cholesterin (Choles'.erinoxidase) und Harnsäure (Uricasc). Es sind dies vor allem Stoffe, deren Nachweis und Bestimmung in der medizinischen Diagnostik und in der Lebensmittelchemie von großer Bedeutung sind.
Als Nachweisreaktion für Peroxidasen kommt die Methode insbesondere für die Bestimmung von Hämoglobin in Frage, wobei man auch anstelle von Wasserstoffperoxid organische Hydroperoxide als Oxidationsmittel verwenden kann.
Gemäß ihrer großen Bedeutung in der medizinischen Schnelldiagnostik sind für fast alle der oben genannten Reaktionen sogenannte Schnellteste beschrieben, die eine qualitative oder quantitative Bestimmung einzelner Reaktionskomponenten ermöglichen. Dabei werden saugfähige Träger oder Filme verwendet, die alle Reagenzien enthalten und bei denen nach dem Kontakt mit der Untersuchiingsflüssigkeit die Farbreaktion ablauft, wenn die fragliche Substanz anwesend ist. Die gebildete Farbe wird mit Hilfe von Farbvergleichstafcln beurteilt oder an Remissionsphotometern gemessen, so daß aus der Farbinlcnsität auf eine Konzentration der reagierenden Substanz geschlossen werden kann.
Als Oxidiitionsindikatnren für diese Schnclltcste sind eine Reihe von Verbindungen in der Literatur und in Patenten beschrieben, jedoch haben sich iti der Praxis nur wenige diirchgcset/.t. Ls handelt sich hierbei fast ausschließlich um Verbindungen der Hcn/idinrcihe und /war von diesen wiederum insbesondere um ο I'olidm. Trotz der weiten Verbreitung dieses Indikators und seiner unzweifelhaften Vorteile gegenüber den anderen bekannten Indikatoren hat o-Tolidin ji-doch auch Nachteile. Zum einen ist die Substanz in den Rezepturen für die Schnellteste nicht immer optimal haltbar, was zu unerwünschten Verfärbungen und Empfindlichkeitseinbußen bei längerer Lagerung führen kann. Zum anderen ist das bei der Indikator-Reaktion entstehende blaugrüne Radikalkasion nicht sehr stabil, da es relativ leicht unter Weiteroxidation in das braune Chinodiimin übergeht. Die Reaktionsfarben haben daher durch die braune Nebenfärbung z.T. einen schmutzigen Charakter, zudem verändern sie sich rasch und sind daher meist schon kurz nach der vorgeschriebenen Ablesezeit nicht mehr richtig auswertbar. Hei Serienanalysen und für die Dokumentation ist dies ein entscheidender Nachteil. Man kann zwar das Radikalkation mit anionisciien Net/mitteln in gewissem Umfang stabilisieren, diese sind jedoch nicht immer anwendbar, da sie auf die Oxidasen für die Primärreaktion destabilisierend wirken können.
Es stellte sich deshalb die Aufgabe, neue Oxidationsindikatoren für Schnellteste zu finden, die die vorstehenden Nachteile nicht aufweisen.
Es wu.de nun überraschend gefunden, daß man Schnellteste der obigen Art erhält, die haltbarer sind und die stabilere Farbstoffradikale 'iefern, wenn man anstelle von j-Tolidin die neuen 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidine der allgemeinen Formel I
H,N— ί
Nil,
K,
in der R| und R, eine i.-Propylgruppe oder R| eine Methyl- und R2 eine Äthylgruppe bedeutet, verwendet.
Die erfindungsgemäßen Oxidationsindikatoren der allgemeinen Formel I sind neu und können insbesondere in Schnelltesten zum Nachweis und zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid, Substanzen, die unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagieren, und peroxidatisch wirksamen Substanzen verwendet werden.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen, die denen der Formel I analog sind, sind bekannt (DE-AS 14 95 705), jedoch sind bisher lediglich 3,3',5,5'Tetramethylbenzidin (V. R. Holland et al., Tetrahedron 30. 3299-3302 [1974] und 3.3',5.5'-Tetraäthylbenzidin [R. Stroh et al., Angew. Chcm. 69, 124-131 [1957]) näher charakterisiert. Besonders vorteilhaft fassen sich diese Verbindungen durch Umlagerung der entsprechenden Hyurazobenzolverbindungen oder durch Kondensation von o-Tolidin mn Äthylen bzw. Benzidin mit Propylen herstellen. Von V. R. Holland et hI. ist in der genannten Arbeit ferner beschrieben, daß 3.3',5,5'-Tetramcthylben-/iilin /um Nachweis von okkultem Hint im Stuhl und Harn im Küvetlentest geeignet ist, wobei als Vorteil gegenüber o-Tolidin die geringere Cancerogenität hervorgehoben wird. Auf (»rund des hohen Substan/-preises hat sich dieser Test in der Praxis jedoch nicht durchgesetzt.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind auch von ilen Ansprüchen und der allgemeinen Beschreibung des Can. Pal Nr. H IH J44 mitiimfaUt. wek lies Sclinellleste /um Halogenid- bzw. Pseiidohalogenid Nachweis in Körperflüssigkeit«^ beschreibt. Diese Schrielltesti.· enthalten noch Kupfer (H)-Verbindungen, welche mit den Halogeniden unter Bildung von
Kiipfer-(l)-halogeniden und freien Halogenen reagieren, die ihrerseits die Benzidin· Verbindungen oxidieren. Die Oxidation führt offenbar zu den gleichen farbigen Radikalkationen wie die peroxidase-katalysierte Oxidation mit Hydroperoxiden. In dem genannten Patent wird von den zahlreichen beanspruchten Benzidin-Abkömmlingen o-Tolidin (3,3'-Dimethylbenzidin) bevorzugt. 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidine und insbesondere die Verbindungen der Formel I sind in dieser Publikation nicht bespielhaft beschrieben, so daß auch ihre vorteilhaftere Verwendung gegenüber o-Tolidin daraus nicht hergeleitet werden kann.
Die größere Stabilität der Verbindungen der allgemeinen Formel I und ihrer Radikalkationen ist weiterhin insofern überraschend, als der elektronendrückende Einfluß der zusätzlichen Alkylgruppen eher eine gesteigerte Oxidierbarkeit und damit eine Weiterreaktion zum braunen Chinondiimin hätte erwarten lassen.
Die erfindungsgemäßen Tetraaikylbenzidine können in allen Fällen eingesetzt werden, in denen bisher o-Tolidin verwendet wurde, wobei die bekannten Rezepturen entsprechend modifiziert werden. Gegebenenfalls können zur Farbstabilisierung verwendete anionische Netzmittel durch weniger aktive ersetzt oder ganz weggelassen werden. So können die Tetraalkylbenzidine beispielsweise verwendet werden in Testpapieren zum Nachweis von Glucose im Harn, von Blut im Harn, von Cholesterin im Serum, Wasserstoffperoxid in Milch oder in Testfilmen zur Bestimmung von Glucose in Blut und Serum und in vieler, anderen Testen. Alle diese Teste zeichnen sich dadurch aus, daß die Farbreaktionen leuchtender, stabiler und z.T. besser abgestuft sind als bei der Ver-vendui^ von o-Tolidin, da die blaugrünen bis grünen Färbungen der Radikalkationen der Tetraalkylbenzidine nicht d: rch Anteile der braunen Chinondiimine »verschmutzt« sind.
Bei den in den folgenden Beispielen beschriebenen Schnelltesten treten die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Tetraalkylbenzidine besonders hervor, wobei einzelne Vertreter der Verbindungsklasse gegebenenfalls noch besonders vorteilhafte Wirkungen haben können: So zeigt sich die gesteigerte Haltbarkeit der Tetraalkylbenzidine gemäß Formel I gegenüber o-Tolidin insbesondere bei der Lagerung von Testpapieren zum Nachweis von Blut im Harn. Die gesteigerte Stabilität der Radikalkationcn führt bei den Testfilmen zur Glucosebestimmung dazu, daß die Messung in einem relativ langen Zeitraum vorgenommen werden kann. Die Verwendung der Tetraalkylbenzidine beim I larnglucose-Test führt zu Testpapieren, bei denen die Reaktionsfarbe tagelang nahezu unverändert bleibt, was für Früherkennungsaktionen, bei denen die Probanden die benutzten Teststreifen an eine zentrale Answerlungsstcllc senden, von besonderer Bedeutung ist.
An den folgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläuleit werden:
Beispiel I
$..>'-Di methyl- 5,5'-diiithvlben/iilin
Vnriiinie I
In einem 2 I Dieili,ilsk(ill)en mit Rührer und I ropftnchler und thermometer suspendiert man 1Ib-I g (0,564 Mol) J - M s.; t h > I b;ith>l anilin livdroililidiil im einer Mischung V(Mi /1I1IM)I kon/enlrierler S.il/siiure (J-=\.\H) und JKliiil W1IS1Oi uul tropft unter guter Hiskiihluiig hei 0 his ! ( ίιγ· Losung vom J1Ig Natriumniirit in I ■■>() ml W1ISSi1-T 11 ■ K-1 IUiIiIiTi innerhalb iO Minuten /ii.
Man rührt dann noch ca. 1 Stunde bei 0 bis 3°C nach und verdünnt die Diazoniumsalzlösung durch Zugabe von 600 ml Eiswasser.
In der Zwischenzeit werden in einem 6-l-Dreihalskol-". ben mit Rührer, Tropftrichter und Thermometer (Y-Stiick) 210 g Kupfer-(II)-sulfat in 900 ml Wasser gelöst und mit J63 ml konzentriertem Ammoniak ('t/=0,88) versetzt. Dann löst man 90 g Hydroxylammoniumchlorid in IiOmI Wasser und tropft unter
in Eiskühlung eine Lösung von 95 g Kaliumhydroxid in 72 ml Wasser zu. Diese gut gekühlte Lösung gibt man bei 10 bis 15 C unter Stickstoff innerhalb 15 Minuten zu der gerührten Kupfertetraaminlösung, wobei ein hellblauer Kupfer-I-salzkomplex gebildet wird. Unter Eiskühlung, kräftigem Rühren und unter Stickstoff wird nun bei 12 bis 151C innerhalb von 1,5 Stunden die gekühlte Diazoniumsalzlösung zugetropft (Tropftrichter mit Einleitungsrohr versehen, das mit U-fönniger Biegung unter die Oberfläche der Kupfersalzlösung
jo reicht). Nach beendeter Zugabe wird eine Stunde nachgerührt, danach schüttelt man die Reaktionslösung mit 4 χ 200 ml Äther aus. Die vereinigten Ätherextrakte werden 3 χ 50 ml 25% Natronlauge, 2 χ 100 ml Wasser, 3 χ 100 ml 2 N-Salzsäure und 2 χ !00 ml Wasser durch-
j'i geschüttelt. Man erhält 55,4 g Azoverbindung als rotes öl. Die chromatografische Trennung an einer Kieselgelsäule (Füllhöhe 100 cn? Säulendurchmesser 4,8 cm) mit Chloroform-Ligroin 1:4 (Kieselgelmenge 1,5 kg, 0 0,063-0,2 mm) gibt 33,7 g reines 2,2'-Dimethy 1-6,6'-
!Ii diäthylazobenzol als rotes Öl. Man löst dieses in 1,61 Diäthyläther, gibt JiO ml Äthanol dazu, dann eine Lösung von 135 g Ammonchlorid in 1,5 1 Wasser und fügt unter kräftigem Rühren portionsweise bei 22°C 300 g Zinkstaub zu. Nach ästündigem Rühren ist die
·,; Reduktion beendet. Man trennt die fast völlig entfärbte, organische Phase ab und schüttelt die wäßrige Schicht dreimal mit je 250 ml Äther nach. Die vereinigten Ätherextrakte werden dann mit 210 ml 3 N-Schwefelsäure versetzt und gerührt. Dabei bildet sich das Sulfat
in als farblose, zunächst klebrige Fällung. Nach Zugabe von 200 ml Äthanol erhält man 30,5 g 3,3'Dimethy 1-5.5'-diäthylbenzidinsulfat als farblose Kristalle. Man trägt dieses Produkt in 150 ml siedend heißes Wasser ein, kühlt unter Rühren auf Zimmertemperatur, versetzt mit
>'. 200 ml 2 N-Natronlaugc und extrahiert mit 4 χ 100 ml Chloroform. Die vereinigten Chloroformextrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Rückstand 25,5 g hellbraune Kristalle. Dieses Rohprodukt wird aus Methanol-Wasser umkristallisiert. Man
in erhält 23g= 15,2% beigefarbene Kristalle, Schmp. 69 bis 70"C.
Das Dihydrochlorid (CsHi4N2 · 2 HCI) schmilzt bei 289 bis 29 ΓC (Zersetzung).
Variante Il
1.5 g Aluminium und 0.1 g Quecksilberchlorid werden mit 75 g Anilin im Autoklaven auf 300"C- erhitzt, wobei sich das Aluminium unter Wasserstoff-Entwicklung iiullöst. Nach dem Erkalten werden 92 g o-Tolidin und
«ι 4.5 g wasserfreies Aluminiumchlorid zugegeben. Daii.Kh wird iiiif 280 bis 300 C hochgehei/t und Äthylen von 20OiIlHi. aufgepreßt. Nach ca. 3 Stunden ist die Athvlcnaufn.ihmc beendet. Danach wird abgekühlt und die Reaklionsmasse mit verdünnter Natronlauge .iusge-
t. > schüttelt. Aus der organischen Phase werden im Vakuum 2 Äthylanilin und 2,6-Diitthylaniliii iihilcstilücrt (bis ca. 120 /10 mm).
Der Rückstand wird mehrfach uns venliimiler
Salzsäure umkristallisiert. Man erhält das Dihydrochloric! des 3,3'-Dimethyl-5,5'-diäthylbenzidins.
Schmp. 288 bis 292"C (Zersetzung).
B e i s ρ i e I 2 ~>
3,3',5,5'-Tetraisopropylbenzidin
Eine Lösung von 100 g 2,6-Diisopropylanilin in 1280 ml Wasser und 102 ml konzentrierter Salzsäure (d=\,\8) wird auf 90°C erwärmt und rasch zu einer m 97°C heißen Lösung aus Kaliumhexacyanoferrat-(lll) in 5100 ml Wasser und 143 g Natriumhydroxid getropft Wegen der auftretenden freien Blausäure wird unter einem gut ziehenden Abzug gearbeitet. Die entstehende, rotgefärbte Suspension wird 15 Minuten nachge- π rührt, abgekühlt und mit 6 χ 300 ml Äther ausgeschüttelt. Die Ätherextrakte werden über Natriumsulfat getrocknet, abgesaugt und eingeengt. Man erhält 97 g Azoverbindung als rotes Öl. Die chromatografische Trennung an einer Kieselgelsäule (Füllhöhe 110 cm, Säulendurchmesser 8 cm) mit Chloroform-Ligroin 1 :4 (Kieselgelmenge 1,5 kg, 0 0,05-0,2 mm! gibt 32,45 g ziegelrote Kristalle, Schmp. 134 bis 136° C.
Die Azoverbindung wird in 500 ml Eisessig gelöst, 150 g Zinkstaub zugegeben und 30 Minuten unter 2j Rühren unter Rückfluß erhitzt. Danach wird der überschüssige Zinkstaub abgesaugt und das Lösungsmittel im Vakuum eingeengt. Man erhält 17,5 g farblose Kristalle, diese rührt man mit 150 ml Wasser an, gibt 150 ml 2 N-Natronlauge zu und schüttelt dreimal mit je jo 150 ml Chloroform durch. Dabei erhält man 12,4 g rohes 3,3',5,5'-Tetraisopropylbenzidin; dieses wird mit 90 ml Acetanhydrid versetzt, kurz aufgekocht und das überschüssige Acetanhydrid am Roiationsdampfer eingeengt. Man löst den Rückstand in 20 ml Isopropa- j> nol, gibt 180 ml Ligroin zu und saugt die gebildeten Kristalle ab. Die erhaltene N,N'-Diacetylverbindung wird nochmals aus Isopropanol-Ligroin 2 :1 umkristallisiert. Man isoliert 7,6 g farblose Kristalle, Schmp. 366°C. Diese werden zur Abspaltung der N-Acetylgruppen in -to einem Gemisch von 180 ml Eisessig und 50 ml konzentrierter Salzsäure im Autoklaven 6 Stunden auf 130 bis 1400C erhitzt.
Danach wird die Reaktionslösung eingeengt, der Rückstand mit 200 ml 2 N-Natronlauge versetzt und die -π in Freiheit gesetzte Base mit 4 χ 50 ml Chloroform extrahiert Man trocknet die Chloroformextrakte über Natriumsulfat, saugt ab und engt ein. Dabei wird 3,3'.5.5'-Tetraisopropylbenzidin als bräunliches öl erhalten. ■">« Ausbeute 5,6 g (Mol-Gew. 352).
Das Dihydrochlorid (CnH36N2 ■ 2 HCI) schmilzt bei 263 bis 265° C (Zersetzung).
B e i s ρ i e I 3 η
Testpapier zum Nachweis von Blut im Harn
Filterpapier (Schleicher und Schüll Nr. 23SL) wird nacheinander mit folgenden Lösungen imprägniert und bei 40° C getrocknet: w)
Lösung 1
1,2molarer Citratpuffer vom
pH 5,25
Äthylendiamirite'raessigsäure.
Dinatriumsalz
Dioctylnatriumsulfosi/cciniit
2,5-[)inieihylhexan-2,5-dihydrc>- Lösung 2 ad 1,6 g
peroxid (ca. 70%ig) 3,3'-Diathyl-5,5'-dimethyl- 12,7 g
Phnsphorsäuretrimorpholid benzidin oder 3,3',5,5'-Tetraiso- 30,0 ml
Äthanol propylbenzidin 100,0 ml
Dest. Wasser Phenanthridin
Toluol
ad
0,3 g
0.2 g
100,0 ml
Man erhält ein weißes Testpapier, welches sich beim Eintauchen in bluthaltigen Urin nach ca. 20 bis 30 Sekunden blaugrün bzw. grün verfärbt. Sind die Erythrozyten intakt, so sind die Papiere grün gesprenkelt. 1st Hämolyse eingetreten, oder befinde! sich von vornherein freies Hämoglobin im Urin, so werden die Papiere gleichmäßig grün gefärbt. Die Empfindlichkeit liegt bei ca. 5 Erythrozyten/mm öder der entsprechenden Menge Hämoglobin. Eine niec/ige Zahl intakter Erythrozyten kann unter Umständen noch einzelne grüne Punkte auf dem Testpapier hervorrufen. Die Empfindlichkeit gegenüber Myoglobin entspricht der von Hämoglobin.
Nach dreitägiger Temperaturbelastung bei 60°C sind die Testpapiere ganz schwach gelblich gefärbt, ihre Empfindlichkeit ist im wesentlichen gleich geblieben, lediglich die Reaktionszeiten haben sich auf ca. 60 bis 90 Sekunden verlängert. Ein Testpapier der gleichen Zusammensetzung mit o-Tolidin anstelle von Tetraalkylbenzidin ist nach der gleichen Belastung gelbbraun verfärbt, die Empfindlichkeit liegt etwa bei 20 Erythrozyten/mm3.
Beispiel 4
Testpapier zum Nachweis von Glucose im Harn
Filterpapier (Schleicher und Schüll 597 NF) wird mit Lösungen folgender Zusammensetzung getränkt und bei 500C getrocknet:
Lösung 1 Lösung 2 ad 222 mg
Glucoseoxidase(70 U/mg) 3,3'-Diäthyl-5,5'-dimethyl- 28 mg
Peroxidase(70U/mg) benzidin
Morpholinäthanolsulfonat-Puffer Äthanol 50 ml
(pH 6,1,0 m) ad 80 mg
Tartrazin 300 mg
Polyvinylpyrrolidin 100 ml
Wasser, dest.
600 mg
130 ml
35.0 ml
0.1 g
0.5 g
Auf die gleiche Weise werden Testpapiere hergestellt, die äquimolare Mengen o-Tolidin enthalten. Die Reaktionsfarben dieser Testpapiere mit glucosehaltigen Harnen ca. 60 ois 120 see. nach dem Eintauchen sind in untenstehender Tabelle zusammengefaßt. Die Farben mit 3,3'-Diäthyl-5,5'-dimethylbenzidin verblassen beim Trocknen geringfügig ohne den Farbwert zu ändern und sind dann über Tage stabil. Die mit o-Tolidin erhaltenen Farben beginnen schon nach 5 bis 10 Min. zu vergilben und zu verblassen und sind nach dem Trocknen in ca. 2 bis 4 Std. je nach Glucosekonzentration ganz verblaßt oder schwach olivbraun.
7 24 60 903
o-Tnliüin
ιημ '» Cilucose .1..V-[)iiithyl-5.5r-
gelb dimethylbenzidin
0 hellgrün gelb ι
50 grün hellgrün
100 blaugrün mittelgrün
250 grünblau grün
500 olivschwarz dunkelgrün
1000 tief grün n>

Claims (2)

  1. Patentansprüche:
    l.Tetraalkylbenzidine der allgemeinen Formel I
    // V-NH,
    in der R, und R> eine i.-Propylgruppe oder R, eine Methyl- und R2 eine Äthylgruppe bedeutet.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise entweder die entsprechende Hydrazobenzolverbindung umlagert oder o-Tolidin bzw. Ben/.idin mit Äthylen bzw. Propylen kondensiert.
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