DE2460334C3

DE2460334C3 - Verfahren zur Gewinnung von Insulin und Pankreatin aus Schweinepankreas

Info

Publication number: DE2460334C3
Application number: DE2460334A
Authority: DE
Inventors: Leonhard Dr. 6240 Koenigstein Haefner; Hans 6231 Schwalbach Kargl; Friedrich 6239 Eppstein Kieser; Wilhelm Dr. 6233 Kelkheim Schramm
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1974-12-20
Filing date: 1974-12-20
Publication date: 1979-09-06
Also published as: CH628322A5; US4029641A; DE2460334A1; IE42224B1; NZ179582A; BE836952A; NL7514576A; PL98610B1; NL170804C; LU74045A1; SE7514448L; FR2295016B1; NO754325L; SE436541B; CS214870B2; HU176799B; YU322975A; DK581375A; ZA757871B; DE2460334B2

Description

Die Pankreata der Schlachttiere sind als pharmazeuti- ■«> sehe Rohstoffe zweifach interessant. Sie dienen einmal als alleiniges Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Insulin, zum anderen enthalten sie für die therapeutische Anwendung wertvolle Enzyme. So sind Rinderpankreata für die Gewinnung von Trypsin und Chymotrypsin «5 neben Insulin wichtig, während aus Schweinepankreata das therapeutisch wertvolle Enzymgemisch Pankreatin mit lipolytischen, amylolytischen und proteolytischen Aktivitäten gewonnen werden kann.

Aufgrund dieser Bifunktionalität hat es, seit pankreatische Inhaltsstoffe in Medizin, Pharmazie und Technik verwendet werden, nicht an Versuchen gefehlt, aus einem gemeinsamen Ausgangsmaterial beide Wirkstoffsysteme zu gewinnen. Solcher Doppelverarbeitung stellen sich jedoch Schwierigkeiten entgegen, die darin ^ liegen, daß für die Gewinnung von Insulin Extraktionsbedingungen erforderlich sind, unter denen die Enzyme größtenteils irreversibel inaktiviert werden. So bevorzugt man zur vollständigen Extraktion des Insulins saure Bedingungen — meist unter pH 4 — in Gegenwart eines^hn organischen Lösungsmittels — meist 50 — 80 Vol.-% Äthanol. Die Amylasen und Lipasen des Pankreas sind jedoch unter diesen Bedingungen nicht beständig und werden weitgehend denaturiert

Eine größere Beständigkeit zeigt das proteolytische ^h> System Trypsin-Chymotrypsin. Die zusätzliche Gewinnung von kristallisiertem Trypsin bzw. Trypsin-Chymotrypsin-Gemisch aus den Extraktionsrückständen der Insulin-Fabrikation ist z. B. aus folgenden Patentschriften bekannt: GB 6 13 030, DE 8 75 640, FR 9 99 346, US 26 86 148 und 27 51 330 sowie DE 10 13 834.

Die gleichzeitige Gewinnung von Insulin und Pankreatin gestaltet sich demgegenüber problematischer. Ein wirtschaftlich brauchbares Verfahren hat sich wegen der oben geschilderten Schwierigkeiten bisher nicht durchgesetzt So ist in der deutschen Patentschrift 7 45 284 ein Verfahren beschrieben, bei dem zum größtmöglichen Schutz der Enzyme die Extraktion des Insulins bei alkalischem pH-Wert vorgenommen wurde. Aus den deutschen Patentschriften 8 74 062 und 8 75 856 ist die fermentschonende saure Insulinextraktion bekannt Die Enzyme wurden jedoch auch nach diesen Verfahren so weit geschädigt, daß kein den heutigen Ansprüchen genügendes Produkt unter wii*-.chaftlichen Bedingungen erhalten werden kann. Neben den absoluten pH-Bereichen, in denen gearbeitet wurde, ist offenbar eine der Hauptursachen für die erhebliche Fermentinaktivierung die Verwendung von anorganischen bzw. organischen Säuren für die Einstellung des pH-Wertes. Dieser Erkenntnis trägt auch das Verfahren der DE-OS 2146 275 Rechnung. Hier wird die Gewinnung von Insulin neben Pankreatin aus gefriergetrocknetem Pankreatin beschrieben. Aus den entfetteten lyophilisierten Drüsen wird mit wäßrigorganischem Lösungsmittel — bevorzugt ist 60 — 80% Äthanol — nach Zusatz von Neutralsalzen, wie Natriumchlorid, ohne direkten Säurezusatz das Insulin extrahiert Die Extraktion von Insulin aus frischen oder tiefgekühlten Pankreata nach Zusatz von Salzen, wie Natriumchlorid oder Ammoniumchlorid, ist aus der US-PS 27 79 706 bekannt.

Alle bisher beschriebenen Verfahren haben erhebliche Nachteile, teils dadurch, daß die Insulinausbeute zu gering ist, teils dadurch, daß die Enzyme weitgehend inaktiviert werden oder daß technologisch aufwendige und damit teure Verfahrensschritte wie die Gefriertrocknung dazwischengeschaltet sind.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Insulin und Pankreatin aus frischen oder tiefgefrorenen Schweinepankreata durch Extraktion der Drüsen in wäßrigem Medium in Gegenwart von Aceton und wasserlöslichen anorganischen Salzen, ohne Säurezusatz bei einem pH von 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion mit wäßrigem Aceton mit einem Aceton-Gehalt von mindestens 40 Volumen-% durchführt und den pH üurch Zugabe eines wasserlöslichen Salzes mit solchen Kationen einstellt, die mit den sauren Begleitstoffen des Insulins unter den ExtraktionsbecJiingungen undissoziierte Verbindungen bilden, nach der Extraktion, gegebenenfalls nach weiterem Acetonzusatz, den Feststoff vom Extrakt trennt, den Extrakt in an sich bekannter Weise auf Insulin verarbeitet und den Feststoff nach. Abtrennen aus dem Extraktionsgemisch unverzüglich durch Zugabe der Lösung eines Puffersalzes oder eines Puffersalzgemisches auf einen pH-Wert zwischen 6 und 7 einstellt und in an sieh bekannter Weise zu Pankreatin verarbeitet.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die Nachteile der bisher bekannten Arbeitsweisen vermieden. Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Extraktion von Insulin aus frischen oder durch Tiefkühlung konservierten Pankreata in überaus schonender Weise erfolgen kann, wenn man den zerkleinerten Drüsen, die in einem Gemisch aus Wasser und Aceton suspendiert sind, die Lösung eines Salzes

zusetzt, dessen Kationen in der Lage sind, mit Inhaltsstoffen der Drüsen so zu reagieren, daß Wasserstoffionen aus dem Reaktionsgemisch freigesetzt werden, die eine pH-Verschiebung verursachen. Die Freisetzung der Wasserstoffionen erfolgt in erster s Linie durch Umsetzung von in den Drüsen enthaltenen Fettsäuren, die mit Metallionen undissoziierte Verbindungen bilden. Als Metallionen kommen solche in Frage, die physiologisch unbedenklich sind, da es sich meist nicht vermeiden läßt, daß Reste dieser Salze im ι ο Pankreatin verbleiben.

Vorzugsweise verwendet man wasserlösliche Calciumsalze, jedoch können auch Magnesium-, Zink-, Aluminium-, Eisen-, Kobalt-, Nickel-, Zinn- und Mangan-Salze verwendet werden. Die erforderliche Menge is des zuzusetzenden Salzes wird durch pH-Wert-Messung ermittelt Calciumsalze, insbesondere Calciumchlorid, werden bevorzugt verwendet, einmal wegen ihrer guten Löslichkeit: ium anderen wegen ihrer physiologischen Unbedenklichkeit Ein vorteilhafter N'ebeneffekt ist die bekannte enzymstabilisierende Eigenschaft der Calciumionen.

Beispielsweise läßt sich durch Zugabe von ca. 0,7 Gew.-°/o, bezogen auf das Gewicht der eingesetzten Drüsen, Calciumchlorid zu den in einem Aceton-Wasser-Gemisch suspendierten zerkleinerten Drüsen so eine Verschiebung des pH-Wertes der Mischung nach pH 5 — 6, vorzugsweise 5,4 — 5,6, erreichen; Bedingungen, unter denen die empfindlichen Enzyme des Pankreas eine kau..i nachweisbare Minderung erleiden. Dieser Effekt läßt sich gegebener'alls durch Zusatz eines geeigneten Salzes verstagen, wenn die chemische Reaktion dieses Salzes mit dem Talciumsalz eine Freisetzung von Wasserstoffionen bewirkt Geeignet hierfür sind saure Salze mehrbasiger Säuren, wenn die entsprechenden Calciumsalze, die hierbei gebildet werden, schwach oder gar nicht unter den vorherrschenden Bedingungen dissoziieren. Beispielsweise eignen sich hierfür Natriumdihydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat

Zusätze von anderen Neutralsalzen wie Natriumchlorid oder Ammoniumchlorid und ähnliche, deren Verwendung für die Extraktion von Insulin unter anderen Bedingungen beschrieben ist, stören diese Reaktionen nicht und können gegebenenfalls zugesetzt werden.

Beispielsweise läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren folgendermaßen durchführen: Die frischen oder durch Tiefkühlung konservierten Schweinepankreata werden zerkleinert und in einem Gemisch aus beispielsweise 24 Vol.-% Wasser und 76 VoL-% Aceton, dem gegebenenfalls die erwähnten Neutralsalze sowie die vorstehend erwähnten Salze mehrbasiger Säuren zugesetzt worden sind, suspendiert FQr die Extraktion und die nachfolgende Abtrennung der unlöslichen 55 g Drüsenbestandteile ist es vorteilhaft, die Acetonkonzentration in der flüssigen Phase zwischen 40 und 80 Vol.-% zu halten, um einerseits das Herauslösen des Insulins aus dem Drüsengewebe zu ermöglichen und um andererseits die Aktivierung der Zymogene durch autolytische m> Vorgänge in der Ansatzmischung zu verhindern.

Das Volumen der Extraktionsflüssigkeit wird nach praktischen Erwägungen festgelegt, die in der ausreichenden Extraktion des Wirkstoffes und in der günstigen technischen Handhabbarkeit der Suspension b> begründet sind. Von besonderem Vorteil ist eine Verfahrensweise, bei der der Feststoffgehalt der Suspension etwa zwischen 10 und 20 Volumen-% liegt Diesem Gemisch wird dann zweckmäßigerweise erst jetzt das Calciumsalz, am besten in Form einer wäßrigen Lösung, zugesetzt Die auf den gewünschten pH-Wert, der bevorzugt zwischen pH 5,4 und 5,6 liegt, gebrachte Suspension wird gerührt Die ausreichende Extraktionszeit liegt, sofern man in den üblichen Rührgefäßen arbeitet, etwa zwischen 0,5 und 1,5 Stunden. Danach werden die Feststoffe, bevorzugt durch Zentrifugieren, abgetrennt Der Feststoff kann auch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mehrfach extrahiert werden, die Zahl der Extraktionen sollte jedoch im Interesse einer guten Qualität des Pankreatins möglichst gering gehalten werden.

Die geklärten Extrakte werden gegebenenfalls vereinigt und durch Zusatz von alkalischen Lösungen auf einen pH-Wert zwischen 7 und 8, bevorzugt zwischen 7,3 und 7,7, eingestellt

Hierfür verwendet man vorteilhaft schwaches Ammoniakwasser, Natronlauge oder eine wäßrige Lösung eines mit alkalischer Reaktion hydrolysierenden Salzes, wie z. B. Dinatriumhydrogenphosphat Die hier gegebenenfalls ausflockende Inertproteinfraktion läßt sich durch Zentrifugieren abtrennen. Der klare Extrakt wird wieder sauer gestellt, im Vakuum vom Aceton befreit, entfettet, das Konzentrat mit Kochsalz gefällt und der erhaltene Salzkuchen in an sich bekannter Weise auf Insulin weiterverarbeitet

Der nach der Abtrennung des insulinhaltigen Extraktes anfallende Feststoff bildet das Ausgangsmaterial für Pankreatin. Zur Schonung der Fermentaktivitäten wird er unverzüglich durch Zugabe der Lösung eines Puffersalzes oder eines Puffersalzgemisches auf einen pH-Wert zwischen 6 und 7 gebracht und dann in an sich bekannter Weise zu Pankreatin verarbeitet

Beispiel 1

50 kg tiefgefrorene Schweinepankreata werden mit einem Fleischwolf zerkleinert und in tiner vorgelegten Mischung aus 1201 Aceton und 501 Wasser bei 15° C suspendiert. Durch Zugabe von wäßriger Calciumchloridlösung (100 g Calciumchlorid in 150 ml Wasser) wird der pH-Wert auf 5,6 eingestellt. Man rührt 30 Minuten bei 15° C, versetzt mit 45 I Aceton und trennt dann den Feststoff durch Zentrifugation ab. Die Klarphase enthält das Insulin, der Feststoff wird zu Pankreatin verarbeitet

Der Feststoff wird mit 40 I wäßriger Na₂HPO₄-Losung angeteigt, die so viel Phosphat enthält daß sich ein pH-Wert von 6,0 bis 6,5 einstellt, und durch Vakuumdestillation bei 25⁰C Produkttemperatur auf einen Acetongehalt 15 Volumen-% gebracht. Der dickflüssige Destillationsrückstand wird nun je nach Drüsenqualität bis zu 3 Stunden bei 25"C gehalten, danach mit 2501 Aceton verrührt und auf 3O⁰C angeheizt

Feststoff und Klarphase werden durch Zentrifugieren getrennt. Der Feststoff wird nochmals bei 25° C mit 1501 Aceton, das 101 Wasser enthält, extrahiert, durch Zentrifugieren abgetrennt und zur Erhaltung der Fermentaktivitäten im Vakuum bei 25—30⁰C getrocknet.

Ausbeute: 9 kg Pankreatin mit folgenden Fermentaktivitäten: 90 Amylase-Einheiten pro Gramm nach Willstätter und 75 Lipase-Einheiten pro Gramm nach W i 11 s t ä 11 e r. Die Definition der genannten »Willstätter-Einheiten« für Lipase ist aus Hoppe-Seylers Zeitschrift für Physiologische Chemie, Band 133 (1924) Seiten 229-246, insbesondere Seite 238 und für Amylase aus Hoppe—Seylers Zeitschrift für Physiologische Chemie, Band 126 (1923) Seiten 143-168,

sondere Seite 156 zu ersehen,
sr durch Zentrifugieren erhaltene Insulin-Extrakt im Vakuum bis zur Acetonfreiheit eingedampft dabei ausfallende Fett wird abgetrennt Aus dem -igen Destillationsrückstand wird das gelöste in in an sich bekannter Weise isoliert,
isbeute: 3 g Insulin mit 25 I. EL/mg = 75 0O0 I. E. in.

Beispiel 2

Die zur Insulinextraktion verwendete Mischung besteht aus 1201 Aceton und 501 Wasser, indenen 1 kg Ammoniumchlorid und 0,5 kg primäres Natriumphosphat gelöst sind.

Sonstige Ansatzmengen und -bedingungen und Ausbeuten wie unter Beispiel 1.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von Insulin und Pankreatin aus frischen oder tiefgefrorenen Schweinepankreata durch Extraktion der Düsen in wäßrigem Medium in Gegenwart von Aceton und wasserlöslichen anorganischen Salzen, ohne Säurezusatz bei einem pH von 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion mit wäßrigem Aceton mit einem Acetongehalt von mindestens 40 Volumen-% durchführt und den pH durch Zugabe eines wasserlöslichen Salzes mit solchen Kationen einstellt, die mit den sauren Begleitstoffen des Insulins unter den Extraktionsbedingungen undissoziierte Verbindungen bilden, nach der Extraktion, gegebenenfalls nach weiterem Acetonzusatz, den Feststoff vom Extrakt trennt, den Extrakt in an sich bekannter Weise auf Insulin verarbeitet und den Feststoff nach Abtrennen aus dem Extraktionsgemisch unverzüglich durch Zugabe der Lösung eines Puffersalzes oder eines Puffersalzgemisches auf einen pH-Wert zwischen 6 und 7 einstellt und in an sich bekannter Weise zu Pankreatin verarbeitet

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Extraktionsgemisch lösliche saure Salze mehrbasiger Säuren zusetzt

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man die Extraktion des Insulins mit wäßrigem Aceton mit einem Aceton-Gehalt von 50 — 60 Volumen-% und die Abtrennung der Feststoffe aus dem Extrakt mit wäßrigem Aceton mit einem Aceton-Gehalt von 60 — 70 Volumen-% durchführt.