DE2453363B2

DE2453363B2 - Verfahren zur herstellung heterologer arterientransplantate

Info

Publication number: DE2453363B2
Application number: DE19742453363
Authority: DE
Inventors: Heribert Dr. Trogen; Stöcklin Walter Dr. Ettingen; Schmitz (Schweiz)
Original assignee: Solco Basel AG, Birsfelden (Schweiz)
Priority date: 1974-11-11
Filing date: 1974-11-11
Publication date: 1976-08-26
Also published as: AR207877A1; AT346469B; DK142044B; HU172194B; PH11934A; US4083066A; BE835292A; CH595105A5; CA1076752A; IL48395A; DE2453363A1; GB1488534A; PL102824B1; FR2290182B1; YU276375A; JPS5516016B2; ATA849875A; EG12503A; SE7512608L; FR2290182A1

Description

35 Arterien nicht abzubauen vermögen.

Durch Inkubation der noch Muskel- und elastisches Gewebe enthaltenden Arterien in die Ficin-Lösung erreicht man die »Verdauung« dieser antigen Gewebeanteile. Für den Verdauungsvorgang ist wie bei jedem enzymatischen Vorgang die Einstellung auf das pH-Optimum erforderlich.

Nacn Inkubation in der Ferment- bzw. Ficin-Lösung werden die proteolytisch behandelten Rinder- bzw. Kälberarterien mit dsetilliertem Wasser gut ausgewaschen und die enzymatisdie Reaktion durch Einbringung in eine Natriumchlorid-Lösung bestimmter Konzentration während einer definierten Zeit gestoppt.

Das nach dieser Behandlung verbliebene Material besteht aus dem in der Arterie per se vorhandenen Kollagengerüst. Dieses Kollagenrohr ist, obwohl nicht mehr antigen wirkend, für eine Transplantation jedoch nicht geeignet, da es nicht die erforderliche

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Für den Ersatz von defekten Arterien stehen bisher prinzipiell die folgenden 3 Methoden zur Verfügung:

a) autologe Vene

b) Kunststoffimplantate

c) heterologe Arterientransplantate.

Obwohl alle 3 Methoden gewisse Erfolge zu verzeichnen haben, sind die bisherigen Ergebnisse aber ungenügend.

Der große Vorteil des Ersatzes einer defekten Ar- 40 Dichtigkeit und Stabilität besitzt, terie durch eine autologe Vene ist die immunologi- Die Dichtigkeit und Stabilität werden durch eine

sehe Unbedenklichkeit, da das Transplantat aus dem Körper des Patienten stammt. Nachteilig wirkt sich hier jedoch aus, daß die Vene (z. B. Vena saphena magna) zuerst in einer aufwendigen Operation gewonnen, werden muß, wobei multiple Inzisionen nötig sind, die für gefährdete Patienten ein zusätzliches Operationsrisiko darstellen.

Kunststoff-Prothesen sind ebenfalls immunologisch unbedenklich und lassen sich zudem in Reserve halten. Hingegen eignen sie sich nicht für die risikolose Überbrückung von Gelenken.

Heterologe Gefäßtransplantate haben sich auf
Grund der folgenden Eigenschaften als wertvoll erwiesen. Sie sind sehr gut nähbar und sind in fast jeder 55
erforderlichen Länge und dem erforderlichen Durchmesser herstellbar. Durch Zusammennähen kürzerer
Prothesenstücke können mühelos Prothesenstücke beliebiger Länge hergestellt werden. Da für die Transplantation dieser heterologen Gefäß-Prothesen 2 bis 6° z. B. in einer Konservierungslösung bei 37° C in 3 Hauptschnitte genügen, ist das Operationsrisiko einem Brutschrank erfolgen. Die sterilisierten Gefäßsehr gering und daher auch bei stark gefährdeten Pa- prothesen verbleiben bis zu ihrer Anwendung in tienten (Hypertonie, cardiale Insuffizienz, Diabetes Glasrohren, mellitus usw.) geeignet. Bei dieser bekannten Arbeitsweise handelt es sich

Heterologe Arterientransplantate wurden bisher 65 um ein statisches Verfahren, d. h. die proteolytische

Gerbung der Kollagenschläuche erreicht und zwar dadurch, daß man die Kollagenschläuche für eine bestimmte Zeit in eine gepufferte Gerblösung einbringt. Als Gerbstoffe haben sich bisher Dialdehydstärke, Glyoxal und Polyacrolein als vorteilhaft erwiesen, doch können hierzu auch weitere Gerbstoffe wie Formaldehyd, Dialdehydcellulose und Glutaraldehyd verwendet werden. Der hierbei ablaufende Vorgang wird als »Quervernetzung« bezeichnet. Die Prüfung der Dichtigkeit erfolgt durch Belastung des Gefäßes mit Preßluft bis zu einem Druck von 240 mm Hg, wobei die Arterien in Wasser eingetaucht sind.

Die auf diese Weise erhaltenen Gefäßprothesen werden auf lumenadäquate Glasstäbe aufgezogen und in verschließbare Glasrohre gebracht, die zur Sterilisation eine entsprechende Lösung enthalten. Die Sterilisationsdauer beträgt 14 Tage und kann

auf die folgende Weise gewonnen:

Die insbesondere bei der Schlachtung von Säugetieren geeigneter Größe, wie z. B. Kälbern und Rin-Spaltung und die Quervernetzung werden statisch, d. h. durch Einlegen der Arterien in die jeweils verwendeten Lösungen, vorgenommen. Verfahren zur

Herstellung von Arterientransplantaten der beschriebenen Art sind z. B. in den USA.-Patentschriften 29 OO 644 und 30 93 439 angegeben. Analoges gilt auch für das in der deutschen Patentschrift 10 63 330 beschriebene Verfahren zur Herstellung von Stoffen für Fremdtransplantationen und für das in der USA.-Patentschrift 34 08 659 beschriebene Verfahren zur Herstellung künstlicher Blutgefäße, bei dem das natürliche Ausgangsmaterial entsprechend der histologischen Struktur in getrennte Schichten Lafgetrennt wird.

Bei den auf diese Art und Weise hergestellten Transplantaten wird nicht ausdrücklich beachtet, daß das Kollagen, d. h. die nach dem Abbau noch vorliegende Gerüstsubstanz, gewisse immunologische !5 Schwierigkeiten mit sich bringen kann, insbesondere wenn bei der üblichen statischen Herstellung nicht alles akut bzw. subakut immunogene Material, insbesondere Reticulin, entfernt worden ist.

proteolytischen Abbau gleichmäßiger und vollständiger durchzuführen als bei bekannten Verfahren, bei denen die Arterien lediglich in die jeweils verwendete Lösung eingelegt werden. Bei den erfindungsgemäß hergestellten Arterientransplantaten lassen sich weder elastische Fasern noch intaktes Muskelgewebe nachweisen, weshalb auch die Abstoßungsgefahr der Prothesen vermindert ist. Die folgenden Beispiele eiTäutern die Erfindung.

Beisüiel 1

Vorbereitung der Arterien für die chemische Präparierung

Im Schlachthof gesammelte, möglichst lange Kälberarterien (Carotis) werden in eisgekühlter, physiologischer Kochsalzlösung (0,9%) ins Labor transportiert. Dort werden sie vom umgebenden Gewebe be-

1 Kollateralen mi " "

brachte auch eine erhöhte Gefahr einer Kontaminierung mit Keimen und eine mitunter unbemerkte Infektion der Arterien mit sich, wodurch die immunologische Situation ungünstig verändert wird.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß die genannten Nachteile der bekannten Verfahren zur Herstellung heterologer Arterientransplantate vermieden werden können, wenn man die proteolytische Spaltung und die Quervernetzung kontinuierlich bzw. dynamisch durchführt, d. h. die Arterien von den jeweiligen Lösungen durchströmen läßt.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung heterologer Arterientransplantate, bei dem man tierische Arterien vom umgebenden Gewebe befreit, die abzweigenden Kollateralen mit Seide ligiert, das Muskelgewebe und die elastischen Fasern durch proteolytische Spaltung entfernt und die erhaltenen Kollagenschläuche quervernetzt, und besteht darin, daß man die proiteolytische Spaltung und die Quervernetzung durchführt, indem man die Arterien von den hierzu verwendeten Lösungen durchströmen läßt.

Vorzugsweise werden zur Erzielung besserer Dauerresultate Arterien möglichst junger, insbesondere auch neugeborener Tiere wie die von Kälbern, Schafen und Schweinen verwendet.

Durch die erfindungsgemäße Arbeitsweise wird eine vollständige Behandlung vor allem des Innenlumens der Arterien gewährleistet. Weiterhin wird eine Verbindung der Arterien durch Kopplungsstücke wie z. B. Glasrohre, die gleichzeitig eine grundsätzlich beliebig große Zahl von Arterien verbinden können und somit eine völlige Gleichheit des Endmaterials gewährleisten, ermöglicht.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß sich die nacheinander folgenden Reaktionsschritte, d. h. Verdauung;, Waschen, Abstoppen der Verdauung, Waschen, Quervernetzung und Waschen durch geeignete Steuerung nacheinander kontinuierlich durchführen lassen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine Prothese erhalten, die immunologisch weitgehend unbedenklich ist und sich daher als; Ersatz defekter Arterien besonders gut eignet. Wie an Hand von licht- und elektronenoptischen Untersuchungen gezeigt werden konnte, ist es erfindungsgemäß möglich, unter Verwendung der gleichen Enzymlösung bei der Herstellung heterologer Arteriientransplantate den (000 unsteril) ligiert.

Die so vorbereiteten Arterien werden direkt für die chemische Präparation verwendet.

Beispiel 2

Herstellung von Dialdehydstärke

16,2 g Maisstärke (Trockengewicht; bei wasserhaltigem Material entsprechend mehr) werden mit

100 ml destilliertem Wasser angerührt. Zu dieser weißen Suspension wird während 1 h eine Lösung von 23,5 g Natrium-metaperjodat in 300 ml destilliertem Wasser unter Rühren zugetropft und anschließend 18 h bei etwa 25° C weitergerührt. Die Suspension wird nun durch eine Nutsche abfiltriert und der Rückstand 6mal gründlich mit je 50 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das letzte Waschwasser sollte jodatfrei (Kaliumjodidstärkepapier) sein. Der Rückstand wird zuletzt noch mit

100 ml Aceton zur Verhinderung der Bildung eines hornigen Produkts gewaschen. Der Rückstand wird bei 40° C während 24 h im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 17,2 g (15,7 g Trockengewicht).

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die erfindungsgemäße chemische Präparation der Arterien nach der dynamischen Methode. Die Anordnung zur Durchführung des Verfahrens ist in der Zeichnung dargestellt.

Ansatz: 20 Arterien (vorbereitet nach Beispiel 1). Die Arterien werden an Oliven gebunden. In einem 10-1-Becherglas wird die Ficin-Lösung vorbereitet:

7,5 1 ention. Wasser (auf 30° C vorgeheizt) 75 g Ficin = 1%
7,5 g L-( + )-Cystein=l%o

Mit 1-n-Natriumcitrat-Lösung wird die in einen Glaszylinder eingefüllte Ficin-Lösung auf pH 6,0 eingestellt und in ein Wasserbad von 45 bis 50° C gestellt. Anschließend wird bei geschlossenen Quetschhähnen 6 die Ficin-Lösung durch Leitung t von der Pumpe angesaugt und in die Zuleitungen zu den Arterien 7 und die Verteilungsglocke 4 gepumpt. Sobald die Verteilungsglocke mit Ficin-Lösung gefüllt ist, wird der Quetsdihahn 5 geschlossen, die Quetschhähne 6 geöffnet und nun während 3 h die

Ficin-Lösung bei konstanter Innentemperatur von Die für gut befundenen Arterien werden auf einen

38° C durchgepumpt. Glasstab aufgezogen, in ein einseitig zugeschmolzenes

Danach wird die Ficin-Lösung abgesaugt und das Glasrohr gestellt, dieses mit einer Lösung von Ätha-

Wasserbad entfernt; Durch Leitung 2 wird deionisier- nol — destilliertem Wasser (50/50 Volumprozent) +

tes Wasser zugeführt und mehrmals mit deionisier- 5,5 1% Propylenoxidl aufgefüllt und mit Gummistopfen

tem Wasser gespült. Nach dem Absaugen des Spül- und Isolierband verschlossen. Die so präparierten

wassers durch Leitung 3; wird über Leitung 2 eine Arterien werden 14 Tage bei 37° C im Brutschrank

\ Lösung von 93,7 g Natriumchlorid (80%) in 7,51 konserviert.

j deionisiertem Wasser (entsprechend einer l°/oigen

Lösung) zugeführt, wie vorstehend entlüftet und io Beispiel4

während 18 h bei Raumtemperatur durchgepumpt. _. . * τ, ·· ,· . _A. · , _D

Dann wird diese Natriumchlorid-Lösung durch Lei- ^{C ie}.^mis*^e. Präparation der Arterien analog Bei-

tung 3 abgesaugt und nochmals wie vorstehend mit ^sP'^{el 3} ™^{l dem} ^^S(J^ied> ?^{aß fur} ^n enzymati-

deionisiertem Wasser gespült. sehen Abbau an Stelle der l°/o>gen auf pH 6,0 ein-

Über Leitung 2 wird nun eine Lösung von 97,5 g 15 gellten F.cm-Losung eine 0,2« „ige,mit Phcsphat-

Dialdehydstärke (hergestellt gemäß Beispiel 2) in Citrat-Pufer auf pH 7,8 eingestellte Trypsm-Losung

_t 7500 ml Wasser ( = 1,35%) und mit Natriumhydro- verwendet wird.

s gencarbonat-Lösung auf pH 8,8 gepuffert, einge- _, . · ι c

' füllt, während 24 h durchgepumpt, durch Leitung 3 ü e ι s ρ ι e l 5

abgesaugt und mehrmals wie vorstehend mit deioni- *° Chemische Präparation der Arterien analog Bei-

siertem Wasser gespült. spiel 3 mit dem Unterschied, daß an Stelle der 1,3%-

Mit der Pumpe eines Blutdruckmeßapparats wird igen Dialdehydstärke-Lösung eine 0,5%ige mit

nun jede Arterie auf 240 Torr Innendruck geprüft. 10%igem Natriumhydrogencarbonat auf pH 8,8 ge-

Hierzu wird die aufgeblasene Arterie in ein Wasser- pufferte Glyoxal-Lösung (37,5 g Glyoxal auf

bad getaucht. Undichte Stellen werden, wenn mög- ²5 7500 ml Wasser) für die Quervernetzung verwendet

lieh, noch mit Seide abgebunden. wird.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung heterologer Arterientxansplantate, bei dem man tierische Arterien vom umgebenden Gewebe befreit, die abzweigenden Kollateralen mit Seide ligiert, das Muskelgewebe und die elastischen Fasern durch proteolytische Spaltung entfernt und die erhaltenen Kollagenschläuche quervernetzt, gekennzeichnet, daß man die proteolytische Spaltung und die Quervernetzung durchführt, indem man die Arterien von den hierzu verwendeten Lösungen durchströmen läßt.

dem entnommenen Arterien, vorzugsweise Carotiden werden in kalter, physiologischer Kochsalzlösung eingelegt und vom Schlachthof ins Laboratorium transportiert. Dort werden die nat^;ven Gefäße vom umgebenden Gewebe befreit und die Kollateralen mit Seide ligiert. . .

Das auf diese Weise erhaltene Präparat ist jedoch nicht transplantabel, da das in der Gefäßwand befindliche Muskelgewebe sowie die elastischen Fasern d a d u r c h ίο eine Antigen-Antikörperreaktion (Abstoßungsreaktion) hervorrufen wurden. Aus diesem Grunde ist es erforderlich, dieses antigen wirkende Gewebe aus dem Gefäß zu eliminieren. Dies geschieht durch Inkubation der Arterie in eine Enzymlösung, insbeson-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- 15 dere eine gepufferte Ficin-Losung. Ficin ist em prokennzeichnet, daß man die notwendigen Reak- teolytisches, d. h. ein eiweißspaltendes «πη«". g^etionüschritte wie Verdauung und Quervernetzung wonnen aus wilden Feigen. Es können jedoch auch

andere proteolytische Enzyme wie Trypsin und Papain verwendet werden. Von diesen proteolytischen

mittels eines geeigneten Durchströmungsgeräts nacheinander kontinuierlich durchführt. „

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- 20 Enzymen ist bekannt, daß sie das Kollagengerust de

kennzeichnet, daß man zur weiteren Vereinfachung eine große Anzahl Arterien, die in geeigneter Weise aneinander gereiht sind, von der jeweils verwendeten Lösung durchströmen läßt.