DE2302721B1 - Verfahren zur Bestimmung der Creatinkinase - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung der CreatinkinaseInfo
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Description
| Mit frisch hergestellter | Mit 6 Wochen bei 4° | Mit frisch hergestellter | Mit 6 Wochen bei 4° | |
| Sörutii | GSH-Lösung U/l | gelagerter GSH-Lösung U/l | NAC-Lösung U/l | gelagerter NAC-Lösung U/l |
| 1 | 30 | 19 | 32 | 30 |
| 2 | 58 | 44 | 60 | 60 |
| 3 | 107 | 95 | 105 | 104 |
| 4 | 124 | 109 | 130 | 125 |
| 5 | 230 | 219 | 235 | 230 |
| 6 | 33 | 10 | 35 | 30 |
| 7 | 75 | 55 | 80 | 78 |
| 8 | 132 | 115 | 130 | 128 |
| 9 | 190 | 170 | 185 | 180 |
| 10 | 239 | 220 | 245 | 240 |
| 11 | 20 | 0 | 24 | 20 |
| 12 | 49 | 2 | 52 | 47 |
| 13 | 115 | 70 | 110 | 110 |
| 14 | 180 | 140 | 185 | 179 |
| 15 | 231 | 190 | 235 | 225 |
Die obigen Werte zeigen insbesondere bei Vergleich der Seren Nr. 1, 6, 7, 11, 12, 13 und 14, daß mit gelagerter
GSH-Lösung ganz erhebliche Falschbestimmungen auftreten, während erfindungsgemäß nur sehr
geringe Abweichungen auftreten, die zumeist innerhalb der Fehlergrenze der Bestimmungsmethode
liegen.
Die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Aktivierungsmittels steht vermutlich mit seiner besseren
Haltbarkeit im Vergleich zu GSH in Beziehung. Diese verbesserte Stabilität sowohl in Lösung als auch in
lyophilisierter Form zeigt nachstehende Tabelle II.
| NAC | Lösung | Lyophilisat | < | Lösung | 3SH | |
| Lager | bei 4° | bei 33° | bei 4° | |||
| dauer | mg/ml | mg/Flasche | mg/ml | Lyophilisat | ||
| 102 | 102 | 100 | bei 33° | |||
| Wochen | 99 | 102,5 | 88 | mg/Flasche | ||
| 0 | 98 | 101 | 80 | 105 | ||
| 1 | 87 | 98,7 | 68 | 100 | ||
| 2- | 81 | 97,0 | 55 | 95 | ||
| 3 | 77 | 97,5 | 45 | 92 | ||
| 4 | 85 | |||||
| 5 | 77 |
Die unterschiedliche Stabilität wird auf eine unterschiedliche Oxydationsempfindlichkeit der SH-Gruppe
zurückgeführt. Der aufgefundene Stabilitätsunterschied war nicht vorhersehbar.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise unter Anwendung der durch die Gleichungen 2 und 3
veranschaulichten Methode durchgeführt.
Infolge der großen Bedeutung, die der Bestimmung der CK-Aktivität im Serum insbesondere zur Erkennung
verschiedener Krankheiten zukommt, werden von der Industrie Reagentien-Zusammenstellungen für
eine bestimmte Anzahl an Tests zur Verfügung gestellt. In diesen Zusammenstellungen befinden sich
die für den Test notwendigen Reagentien in vorgewogener bzw. abgemessener Menge, und werden in einer
Form dargeboten, die eine exakte Bestimmung der CK-Aktivität ermöglicht.
Durch Zusammenfassung der verschiedenen, sich gegenseitig nicht störenden notwendigen Bestandteile
in wenige Flaschen, durch Herstellung von Reaktionsmischungen und durch spezielle Konfektionierungsarten
soll die Bestimmung einfach und schnell durchführbar sein.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Reagens erforderlich, welches aus
Creatinphosphat, ADP und einem System zur Bestimmung von ATP oder Creatin besteht und einen
Gehalt an N-Acetylcystein aufweist.
Zweckmäßig besteht ein derartiges Reagens aus
1. 3,5 bis 15 mMol Imidazol,
0,8 bis 3,5 mMol Glucose,
0,8 bis 3,5 mMol Glucose,
0,3 bis 1,5 mMol Magnesiumacetat,
0,5 bis 2,5 mMol Alkaliazid,
0,1 bis 0,4 mMol EDTA (Äthylendiaminotetraessigsäure)
in 60 ml Wasser gelöst mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0.
2. 0,04 bis 2,0 mMol ADP,
0,02 bis 1 mMol NADP-Na2,
0,02 bis 1 mMol NADP-Na2,
0,3 bis 1 mMol AMP-Na2 als Lösung in 3 ml
Wasser oder Lyophilisat.
3. 0,5 bis 3 mMol Creatinphosphat in 5 ml Wasser oder als Lyophilisat.
4. 30 bis 350 U Hexokinase,
30 bis 350 U Glucose-o-phosphat-dehydrogenase
(G 6 P-DH) in 1 ml Glycerin/Wasser 1:1,
5. 0,3 bis 3,0 mMol N-Acetylcystein in 2 ml Wasser oder als Lyophilisat oder aus einem Aliquot
davon.
Die Bestandteile 1 bis 5 dieses Reagens liegen zweckmäßig in trockener Form oder in Form einer
Lösung in fünf getrennten Behältern, z. B. Flaschen, vor und werden zur Bestimmung der Durchführung
in der weiter unten angegebenen Weise miteinander gemischt.
Das Reagens kann aber auch nur aus zwei verschiedenen Mischungen bestehen, von denen
Mischung 1 aus 3,5 bis 15 mMol Imidazol,
0,8 bis 3,5 mMol Glucose,
0,8 bis 3,5 mMol Glucose,
0,3 bis 1,5 mMol Magnesiumacetat,
0,5 bis 2,5 mMol Alkaliazid in 60ml Wasser gelöst bei pH 6,5 bis 7,0 und
0,5 bis 2,5 mMol Alkaliazid in 60ml Wasser gelöst bei pH 6,5 bis 7,0 und
Mischung 2 aus 0,2 bis 0,6 mMol ADP, 1,0 bis 5,0 mMol AMP,
0,05 bis 0,5 mMol NADP, 5,0 bis 20,0 mMol Creatinphosphat,
2,0 bis 5,0 mMol N-Acetylcystein, 100 bis 300 U Hexokinase, 100 bis 1500 U G 6 P-DH,
100 mg Serumalbumin in 100 ml Wasser bei pH 6,5 bis 7,0 oder als Lyophilisat
oder einem Aliquot davon besteht.
Bei dieser Ausführungsform des Reagens wird eine gewisse Menge der in Form einer Lösung vorliegenden
Mischung 1 zur Auflösung eines bestimmten Teils der in fester Form vorliegenden Mischung 2 verwendet
oder mit einem entsprechenden Anteil der Lösung von Mischung 2 gemischt.
Die Erfindung ermöglicht eine merkliche Steigerung der Zuverlässigkeit der Creatinkinasebestimmung
durch Zurverfügungstellung eines überlegenen Aktivierungsmittels. Dieses Aktivierangsmittel NAC, wirkt
nicht proteindenaturierend, besitzt praktisch keinen Geruch, ist sehr gut wasserlöslich und kostet nur etwa
den zehnten Teil des bisher bevorzugten Aktivators GSH. a5
Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
30
Lösung 1: 7,0 mMol Imidazol,
1.6 mMol Glucose,
0,73 mMol Magnesiumacetat,
1.07 mMol Natriumazid,
0,22 mMol EDTA
werden mit 50 ml bidest. Wasser gelöst, mit 2 N Essigsäure pH = 6,8 eingestellt und mit Wasser auf
60 ml aufgefüllt.
Lösung 2: 0,06 mMol ADP,
Lösung 2: 0,06 mMol ADP,
0,037 mMol NADP-Na2,
0,46 mMol AMP-Na2
werden mit 3 ml Wasser gelöst und in einer geeigneten Flasche gefriergetrocknet.
Lösung 3: 2,10 mMol Creatinphosphat werden in 5 ml Wasser gelöst und in einer geeigneten Flasche lyophilisiert.
Lösung 4: 175 U Hexokinase,
Lösung 3: 2,10 mMol Creatinphosphat werden in 5 ml Wasser gelöst und in einer geeigneten Flasche lyophilisiert.
Lösung 4: 175 U Hexokinase,
175 U G6P-DH
werden in 1 ml 50-proz. Glycerin gelöst. Lösung 5: 0,7 mMol N-Acetylcystein
werden in 2 ml Wasser gelöst und in einer geeigneten Flasche lyophilisiert.
In dieser Form sind die Reagentien-Mischungen mindestens 1 Jahr bei 4° C und 4 Wochen bei 33 0C
haltbar.
Zur Herstellung eines Reaktionsgemisches wird der Inhalt der Flaschen 2, 3 und 5 mit Lösung 1 gelöst.
Diese Lösung ist mindestens 6 Wochen bei +4° C haltbar.
Die Bestimmung der CK-Aktivität wird nun wie folgt durchgeführt:
2,50 ml Reaktionsgemisch und
0,10 ml Serum
0,10 ml Serum
werden in eine Küvette pipettiert, gemischt und bei 25°C 5 min inkubiert. Nach Zugabe von
0,02 ml Lösung 4
wird in einem geeigneten Photometer, das die exakte Isolierung der Wellenlängen 340 nm, 334 nm oder
366 nm gestattet, die Extinktion gemessen und der Extinktionsanstieg im Abstand von genau 1 min
5 min lang verfolgt. Aus den Extinktionsdifferenzen pro min ergibt sich, multipliziert mit einem Faktor,
die im Serum vorhandene CK-Aktivität.
Lösung 1: 7,0 mMol Imidazol,
1.6 mMol Glucose,
0,73 mMol Magnesiumacetat,
1.07 mMol Natriumazid,
0,22 mMol EDTA
0,22 mMol EDTA
werden mit 50 ml bidest. Wasser gelöst, mit 2 N Essigsäure pH = 6,8 eingestellt und mit Wasser auf
60 ml aufgefüllt.
Lösung 2: 0,25 mMol ADP,
Lösung 2: 0,25 mMol ADP,
2,50 mMol AMP,
0,15 mMol NADP,
8,75 mMol Creatinphosphat,
2,5 mMol N-Acetylcystein,
700 U Hexokinase,
350UG6P-DH,
100 mg Serumalbumin
werden in 80 ml bidest. Wasser gelöst, mit verdünnter Natronlauge bzw. Essigsäure pH = 6,8 eingestellt,
mit bidest. Wasser auf 100 ml aufgefüllt, gemischt und zu je 1,0 ml in geeignete Flaschen gefüllt. Die
Lösung wird lyophilisiert.
Zum Test wird der Inhalt einer Flasche mit 2,50 ml Lösung 1 gelöst, 0,1 ml Serum zugegeben und die
Bestimmung der CK-Aktivität wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Claims (1)
1 2
densten SH-Verbindungen vorgeschlagen, wie Cystein,
Patentanspruch- Glutathion (GSH), Mercaptoäthanol, Mercaptoacetat,
' Dithiothreitol, Dithioerythritol u.dgl.
Den bisher als Aktivatoren vorgeschlagenen SH-
Verfahren zur Bestimmung der Creatinkinase 5 Gruppen-haltigen Verbindungen haften jedoch die
durch Umsetzung von Creatinphosphat mit ADP verschiedensten Mangel an. So neigen Cysteinlösungen
zu Creatin und ATP in Gegenwart eines SH- sehr leicht zur Auskristallisation, gefriergetrocknete
Gruppen-haltigen Aktivierungsmittels und Mes- Präparate lösen sich nach einiger Zeit nicht mehr vollsung
der quantitativen Veränderung eines Reak- kommen klar auf. Mercaptoäthanol, Mercaptoprotionsteilnehmers,
dadurch gekennzeich- io panol, Mercaptoacetat, Thioglycolat usw. können
net, daß die Umsetzung in Gegenwart von N-Ace- wegen ihres intensiv unangenehmen Geruchs kaum
tylcystein als Aktivierungsmittel durchgeführt wird. verwendet werden. Dithiothreitol, Dithioerythritol,
Cystein-Methylester usw. werden sehr leicht durch Luftsauerstoff
oxydiert und verlieren dann ihre aktivieren-15 den Eigenschaften. Aminoäthylisothio-uronium-bro-
mid besitzt eine stark Protein-denaturierende Eigenschaft, die es unmöglich macht, diese Substanz zusammen
mit Proteinen, z. B. Albumin, Hexokinase, G 6 P-DH usw. zu lyophilisieren. Andere Substanzen,
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung ao wie Guanylcystein oder Carbamoylcystein sind sehr
der Creatinkinase durch Umsetzung von Creatinphos- schwer löslich.
phat mit ADP zu Creatin und ATP in Gegenwart Bisher war daher GSH das Aktivierungsmittel der
eines SH-Gruppen-haltigen Aktivierungsmittels und Wahl. 1970 und 1972 veröffentlichte die Deutsche
Messung der quantitativen Veränderung eines Reak- Gesellschaft für Klinische Chemie (Z. klin. Chem.
tionsteilnehmers. 25 u. klin. Biochem. 8, 658-59 [1970] und 10, 185-86
Verschiedene Erkrankungen haben charakteristi- [1972]) Empfehlungen über die Standardisierung der
sehe Veränderungen der Creatinkinase (CK)-Aktivität Methode zur Bestimmung der Aktivität der CK. In
in den Körperflüssigkeiten, z. B. im Serum, zur Folge. diesen Veröffentlichungen wird die Verwendung von
Zur Erkennung dieser Erkrankungen kommt daher GSH als Reaktivator der CK empfohlen. Es ist relativ
der CK-Bestimmung große Bedeutung zu. Außerdem 30 stabil, fast geruchlos, das Oxydationsprodukt GSSG
ist die CK-Bestimmung auch für Forschungszwecke leicht löslich und besitzt keine Proteindenaturierenden
von beträchtlicher Bedeutung. Eigenschaften.
Creatinkinase katalysiert die Reaktion (1) Es stellte sich jedoch heraus, daß bei einem Teil
der untersuchten Serumproben eine zu niedrige CK-
Creatinphosphat + ADP =?= Creatin + ATP (1) 35 Aktivität gefunden wird, wenn GSH-Lösungen oder
längere Zeit gelagerte GSH-Lyophilisate verwendet
Es sind verschiedene Verfahren bekannt, welche werden. Die gefundene Aktivität entspricht nicht
die Bestimmung der CK gemäß Gleichung (1) durch mehr dem Krankheitsbild. Es ist jedoch speziell bei
Messung der quantitativen Veränderung eines der einem Herzinfarkt unbedingt notwendig, daß mög-Reaktionsteilnehmer
gemäß obiger Gleichung ermög- 40 liehst rasch nach dessen Eintritt die exakte Aktivität
liehen. Bedeutung erlangt haben hierbei vor allem der CK ermittelt wird. Aus der Höhe des Aktivierungs-Verfahren,
welche die Rückreaktion ausnutzen und anstiegs über den Normalwert von 50 U/l hinaus kann
Creatin (Rotthauwe et al, Klin. Wochenschrift auf die Größe des Infarkts geschlossen und vom Arzt
39, 1269 [1961]) oder ATP (I.T.Oliver, J. biol. können daraufhin die notwendigen Maßnahmen un-Chemistry
61,116 [1955]) messen. 45 ternommen werden.
Vorzugsweise mißt man die Alktivität des Enzyms Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung
durch die Bestimmung des laufend entstehenden eines Verfahrens zur Bestimmung der Creatinkinase,
ATP's. Dies erfolgt in bekannter Weise (I. T. Oliver, bei welchem ein Aktivator eingesetzt wird, welcher
J. biol. Chem. 61, 116 [1955]) durch Reaktion mit die Nachteile der bisher bekannten Aktivatoren nicht
Glucose unter der Katalyse von Hexokinase. 50 aufweist.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß bei
ATP + Glucose =?= ADP + Glucose-6-phosphat (2) einem Verfahren zur Bestimmung der Creatinkinase
der eingangs genannten Art, dadurch daß die Um-
Glucose-6-phosphat kann leicht mit NADP und setzung in Gegenwart von N-Acetylcystein als Akti-G
6P-DH in GIuconat-6-phosphat überführt werden. 55 vierungsmittel durchgeführt wird.
NADP wird hierbei in NADPH umgewandelt, welches Mit dem erfindungsgemäßen Aktivierungsmittel
NADP wird hierbei in NADPH umgewandelt, welches Mit dem erfindungsgemäßen Aktivierungsmittel
Licht der Wellenlänge 340 mm stark adsorbiert. bleibt die CK-Aktivität über sehr lange Zeiträume
hinweg unverändert erhalten, und sogar bei Vorliegen NADP + G6P ===== NADPH + 6-PG + H+ (3) in Form von Lösung bleibt nach wochenlanger Lage-
60 rung die Aktivität unverändert.
Die Aktivität der CK kann daher sehr leicht durch Die Überlegenheit des erfindungsgemäß verwen-
die Messung der Geschwindigkeit der NADPH-BiI- deten N-Acetylcysteins (NAC) gegenüber dem bisher
dung gemessen werden. bevorzugten GSH zeigt die nachstehende Tabellel,
Seit langem war es schon bekannt, daß bei den in der die Ergebnisse von Aktivitätsbestimmungen der
Verfahren zur Bestimmung der Creatinkinase ein 65 CK in 15 verschiedenen Seren gezeigt sind, die jeweils
Aktivierungsmittel zugesetzt werden muß, bei dem es mit frisch hergestellter GSH bzw. NAC-Lösung und
sich um eine SH-Gruppen-haltige Verbindung han- mit 6 Wochen bei 4° gelagerter GSH bzw. NAC-Lödelt.
Zu diesem Zweck wurden bereits die verschie- sung erhalten wurden.
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