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DE2360118A1 - Vakzinen gegen ferkel-colibacillose und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Vakzinen gegen ferkel-colibacillose und verfahren zu ihrer herstellung

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Publication number
DE2360118A1
DE2360118A1 DE2360118A DE2360118A DE2360118A1 DE 2360118 A1 DE2360118 A1 DE 2360118A1 DE 2360118 A DE2360118 A DE 2360118A DE 2360118 A DE2360118 A DE 2360118A DE 2360118 A1 DE2360118 A1 DE 2360118A1
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DE
Germany
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escherichia coli
enterotoxin
labile
heat
adjuvant
Prior art date
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Granted
Application number
DE2360118A
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English (en)
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DE2360118B2 (de
DE2360118C3 (de
Inventor
Lucia Dobrescu
Constant Huygelen
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Smithkline Beckman - Animal Health Products Sa
Original Assignee
Recherche Et Industrie Therapeutiques Rit Genval (belgien)
RIT RECH IND THERAPEUT
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Publication date
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Publication of DE2360118A1 publication Critical patent/DE2360118A1/de
Publication of DE2360118B2 publication Critical patent/DE2360118B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2360118C3 publication Critical patent/DE2360118C3/de
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    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Description

RECHERCHE ET INDUSTRIE TIIERAPEUTIQUES, R.. Ί.T., Genval, Belgien
"Vakzinen gegen Ferkel-Colibacillose und-Verfahren-zu ihrer Herstellung" ·
Priorität: 4. Dezember 19?2, V.Ot./u, Kr. 511 998.
Die Erfindung betrifft neue Vakzinen gogen Oolibacillose, insbesondere Vakzinen gegen Ferkel-Golibacillose.
Die neonatale Colibacillose des Schv/eins ist eine wichtige Todes ursache bei "Ferkeln. Es sind bereits zahlreiche Versuche unternommen, v/orden, um diese Krankheit durch aktives Immunisieren des Muttertieres gegen Eseherichia coli entweder durch Tot- oder Lebendvakzinen oder durch Verabreichen von Eseherichia coli-Anti seriün an die Schv.'eine zu b
Die aktive Immunisierung; der Mutterschweine iat durch parenterale Vsrabreichuiif; von Eseherichia eoli-Vakzinen. (vgl. z.B. U.R. VJiI-spri und J* Svendsen, Amer, J. Vet. Res.,'Bond J2 (1973), Seiten
bis 89S) vorgenommen v/ordon. l>a jedoch der bzw. die zur Ι-ητπι-verv.'eiideten Eseherichia coli-Stänsme nur spezifische 409823/1134
Antikörper hervorrufen, während mit einem bestimmten Ausbruch der Krankheit mehrere und'verschiedene Stämme verbunden sein können, haben diese Versuche zur Vorbeugung auf Basis einer antibakteriellen Immunität widersprechende und im allgemeinen unbefriedigende Resultate ergeben. Selbst wenn in einigen Fällen ein guter Schutz erhalten wurde, war er auf die in der Vakzine enthaltenen Serotypen von Escherichia coli beschränkt.
Die Verabreichung von Antiserum (vgl. z.B. O.P. Miniats. Can. Vet, J., Band 11 (1970), Seiten 52 bis 56) kann keine praktikable Vorbeugung gegen Ferkel-Üolibacillose gewährleisten. Der durch die Verabreichung von Antiserum erreichte Schutz ist tatsächlich von kurzer Dauer und erfordert eine kontinuierliche Verabreichung an die Ferkel.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bei Verabreichung von hitzelabilem (LT) Escherichia coli-Enterotoxin mit einem Adjuvans an trächtige Mutterschweine 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln anstelle der Verabreichung ganzer Zellen von Escherichia coli die geimpften Mutterschweine nicht nur Antikörper in ihrem Kolostrum
und in ihrer .. Milch entwickeln, sondern dadurch auch die Ferkel gegen die wirkung der Bnterotoxine geschützt werden. Der Schutz erstreckt sich gegen die Wirkung von Snterotoxinen, die durch Escherichia coli-Serotypen gebildet v/erden, welche sowohl homolog als auch heterolog zu dem Escherichia coli-Stamm sein können, aus deiu das hitzelabile (LT) Enterotoxin isoliert wurde. Anders ausgedrückt schützt die Verabreichung des hitzelabilen (LT) Escherichia coli-Enterotoxins an das Muttertier die Ferkel nicht nur gegen die durch das hitzelabile (LT) Sscherichia coli-Enterotoxin verursachte
409823/1134 9ADOR1GINAL
Colibacillosei sondern auch gegen die durch das hitaestabile (ST) Enterotoxin verursachte Colibacillose.
Aufgabe der"Erfindung war es daher, neue Vakzinen gegen Fer-kel-Colibaeillose zur Verfügung zu stellen, mit der diese Krankheit zuverlässig bekämpft werden kann. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung sind somit Vakzinen gegen Ferkel-Colibacillose, die eine wirksame Menge an zellfreiem, hitzelabilen (LT) Escherichia eoli-Enterotoxin und ein Ad.juvans enthalten.
Das vorgenannte hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin kann aus jedem enteropathogenen Escherichia coli-Serotyp isoliert v/erden, der die Ferkel-Colibacillose hervorrufen kann und notwendigerweise das hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin enthält. Ein bevorzugtes Beispiel eines solchen enteropathogenen 35scherichia coli-Gerotyps ist der bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, T.St.A. unter der Hummer ATCC 21 972 hinterlegte Escherichia coli-Stamn.
Die Isolierung des hitzelabilen (LS) Escherichia coli-Enterotoxins ist bekannt. Sie ist .von GYLE3 und BARNUH (J. Infect. Dis., Band 120 (1969), Seiten 419 bis 426) beschrieben worden;. Variationen dieses Verfahrens sind'von H.V/. SMITH und CL. GYLES (J. . I-Ied. Mcrobiol., Band 3 (1970), Seiten 387 bis 401), H.V.'. SMITH und S. HALLS (J. rath. Bact., Band 93 (196?), Seiten 531 bis 543) und K.H.· './ILOON, G. GYLES und J. SVEIiIVJE^ (Cand. J. Comp. Med. , Band 35 (1971), Seiten 294 bis 297) beschrieben worden. Sämtliche dieser Verfahren und sämtliche andere, bekannte- .äquivalenbe Vfer-^ .-
409823/1134 . \
8A ORIGINAL '·
fahren können zur Herstellung des erfindungsgemäßen hitzelabilen ' (LT) Escherichia coli-Enterotoxinpräparats verwendet v/erden.
Für die vorliegende Erfindung ist es nicht erforderlich, das hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin rein herzustellen. Eine solche Reinigung könnte gegebenenfalls z.B. durch Elektrophorese, .Dichtegradienten-Ultrazentrifugation oder Adsorption/ Elution an hydrophilen vernetzten Dextranen, v/ie Sephadex (ein von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala I, Schweden hergestelltes und vertriebenes Produkt), vorgenommen werden. Für die vorliegende Erfindung ist es im wesentlichen ausreichend, daß das Enterotoxin freigesetzt und von den Escherichia coli-Zellen abgetrennt wird und praktisch frei von Lipopolysacchariden ist.
Als Adjuvans, das die Aufgabe hat, eine starke Immunreaktion zu gewährleisten, kann erfindungsgemäß jedes Produkt oder Gemisch verwendet werden, von dem man weiß, daß es bei Vakzinen als Adjuvans wirkt. Spezielle Beispiele adäquater Adjuvantien sind gelförmige Aluminiumverbindungen, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und ALHYDROGEL (Warenzeichen eines von der SUPERFOS Export Company, Kopenhagen, hergestellten und vertriebenen Aluminiumhydroxid-Gels), und Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie das Adjuvans 65 (eine V/asser-in-öl-Emulsion von Antigen in Erdnußöl, das durch Mannitmonooleat emulgiert und durch Aluminiummonostearat stabilisiert ist) und komplettes Freunds Adjuvans (eine V/asser-in-öl-Emulsion von Paraffinöl, das mit Mannitmonooleat emulgiert ict und abgetötetes Ilycobacterium tuberculosis enthält).
v/ird eine wirksame Menge dor, hitzelabilen (LT) 409823/1134
Escherichia coli-Enterotoxinpraparats mit dem Adjuvans an trächtige Mutterschweine intramuskulär oder subkutan verabreicht. Die Dosiereinheit beträgt mindestens 5 mg und vorzugsweise 10 bis 150 mg gefriergetrockneten Extrakt.
•Die Beispiele erläutern' die Erfindung.
Beispiel 1 .
Züchtungsmedium (fest):
g BACTO-TRYPTOSE-Brühe und I5Q g BACTO-AGAR (BACT0--TRYPTQ3E und BAGTO-AGAR sind Handelsnaraen von· Produkten, die von den DIFCO-Laboratorien, Detroit 1, Michigan, V.St.A. vertrieben werden) werden mit 10 Liter Wasser versetzt. Das Gemisch wird unter .Rühren 60 Minuten auf 121°C erhitzt. 20 g BACTO-DEXTROSE (Handelsname eines von den DIFCO-Laboratorien hergestellten und vertriebenen Produkts) v/erden in 20 ml destilliertem .Wasser gelöst, und die Lösung wird durch ein Millipore-Sterilisierfilter (Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, V.St.A.) von 0,45 Mikron filtriert. Die beiden Präparationen werden vereinigt und in aliquoten Teilen von 110 ml in 500 cm — Roux-Kolben verteilt. ' .
Herstellung der Anzuchtkultür: , · '
Der Stamm Escherichia coli ATCC 21 972 wird mit steriler physiologischer Kochsalzlösung rehydratisiert und 18 Stunden bei 37°C in Petri-Schalen inkubiert, die jeweils 20 ml.TRYPTOSE-AGAR-Festmeclium enthalten, das durch Vermischen von 26 g TRYPTOSE-Brühe■ und 30 g AGAR DIFCO (TRYPTÖGE-Brühe und AGiIR DIFCO sind von den DIFCO-Laboraborien hergestellte und vertriebene Produkte), Auffüllen mit Wasser bis zu einem Volumen von 1 Liter und 4-5minüti
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ges Erhitzen des Gemisches auf 115°C hergestellt wird.
Sodann wird-ein flüssiges Kulturmedium (als PP^ bezeichnet) wie nachstehend beschrieben hergestellt: JOgProteose-Pepton Kr. 3 (ein von den DIFCO-Laboratorien hergestelltes und vertriebenes Produkt), 4 g Hefeextrakt und 5 S Glucose werden in 1 Liter V/asser bei 600C gelöst. Nach dem Abkühlen wird die Lösung mit 5 G NaCl, 5»O5 g HapHPCL und 1,2 g KH2PO2, versetzt. Das Medium, dessen pH-Wert 6,9 bis 7,0 beträgt, wird durch ein Seitz-EKii-I-'ilter filtriert und in 100 ml—Kulturkolben verteilt.
Die so Kulturkolben werden mit ä.on auf den Petri-3chalen erhaltenen glatten Kolonien beimpft, wobei eine Kolonie auf 20 ml flüssiges PP7-Kedium verwendet wird. Die beimpften Kulturkolben v/erden unter Schütteln auf einer Schub te!einrichtung (22 bis 24 Schutte!bewegungen pro Minute) 6 Stunden bei 37°C inkubiert.
Züchtung von Sscherichia coli: · ■
2 Jeder der das Zuchtungsmedium enthaltenden 500 cm — Eoux-Kolben v/ird mit einem aliquoten Teil von 4 ail dex· in dem flüssigen PP7- Medium erhaltenen Escher ichia coli-Kultur, d.h. , mit et v/a
4 χ Kk Bakterien, beimpft. Die Kolben werden unter Schütteln auf Schütteleinrichtungen mit 22 bis 24 Schüttelbewegungen pro Minute einen Tag bei 37°C inkubiert. Jede Zellkultur wird in 25 ml destilliertem Wasser geerntet, und die Ernten aus 15 Roux-Kolben (eine Serie) werden in 1 Liter-Kolben vereinigt. Aus jeder Serie v/ird eine Probe von 1 ml sur Reinheitsprüfung entnommen.
Hierzu werden 0,5 ml auf TRYPTOoE-AGAR-Brühe in Petri-3chalen eingesät und 7 Ta^e bei 540C inkubierü. Die restlichen 0,5 ml
409823/113 4
236011B.
werden in Petri-Schalen eingesät, die 20 ml Sabouraud-Dextrose- ■ Agar enthalten, der durch Auflösen von 65 g Sabouraud-Dextrose-Agar DIFCO (ein von den DIFCO-Laboratorien hergestelltes und vertriebenes Produkt) in 1 Liter heißem destilliertem Wasser und anschließendem Sterilisieren hergestellt wird. Die Kultur wird 7 Tage bei 22°C inkubiert.
Die Ernten v/erden mit einer sterilen, wäßrigen !prozentigen- Neomycinsulfat-Lösung (1,2 ml Neomycinsulfat-Lösung pro 100 ml Ernte) versetzt. Die Zellen werden durch 3Ominütiges Beschallen des Mediums in einem Branson-Europa-Beschallungsgerät Modell J 22 (Branson Europa N.Y., Soest, Niederlande) aufgebrochen, wobei das Medium in einem schmelzenden Eisbad gehalten wird.
Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die Suspension zum Abtrennen der Zelltrümmer 2 Stunden bei 5 C und -2550 UpM zentrifugiert. Der überstand wird zunächst durch ein Klärfilter und dann durch ein Ilillipore-Sterilisierfilter (Hillipore .ist ein Vvarenzeichen der Killipore Corporation, Bedford, Massachusetts, V.St.A.) filtriert«
Das liitrat wird mit zuvor durch Ethylenoxid sterilisiertem Ammoniumsulfat bis zur 50prozentigen Sättigung (380 g Ammoniumsulfat pro Liter Filtrat) versetzt, und das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Der erhaltene Niederschlag wird 2 Stunden bei 5°C und 2550 UpH zentrifugiert. Das Sediment wird in· einen hauptsächlich aus regenerierter Cellulose bestehenden Beutel gegossen und gegen fließendes V/asser dialysiert, bis die mit Kesslers Reagens bestimmte Konzentration des Ammoniumsulfats auf 0,1 bis 0,01 Trozent gesunken ist.
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Die Sterilisation des Enterotoxinpräparats erfolgt durch Filtrieren durch ein Millipore-Sterilisierfilter (Millipore ist ein Warenzeichen der Millipore Corporation) von 0,4-5 Mikron und Gefriertrocknen.
Beispiel 2
Ein aliquoter Teil von 1 g des in Beispiel 1 erhaltenen gefriergetrockneten Enterotoxinpräparats wird durch Zugabe von 20 ml steriler, Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (pH 7Λ) rehydratisiert. Die sterile, Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung besteht aus 8 g KaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HrO4,2g KH2PO4, 1,325 g CaCl2 χ 2H2O, 1 g MgCl2 χ 6H2O und 10 Liter destilliertem Wasser.
Die so erhaltene Vakzine wird unter sterilen Bedingungen mit 20 ml sterilen, komplettem Freunds Adjuvans, d.h., mit einer mit I-iannltmonooleat emulgierten und mit abgetötetem Kyco.bacterium tuberculosis versetzten IVasser-in-Öl-Smulsion von Paraffinöl, gründlich vermischt. Die so erhaltene, adjuvanshaltige Vakzine wird in 1I- ml—Ampullen verteilt, die entweder abgeschmol— zen oder dicht verschlossen werden und eine (LT) Enterotoxinrnenge entsprechend 100 mg gefriergetrocknetem Präparat pro Ampulle enthalten. Der Inhalt jeder Ampulle entspricht einer Vakzine-Dosiereinheit. Die Vakzine wird trächtigen Mutterschweinen 3 bis 6 V/ochen vor dem Ferkeln intramuskulär oder subkutan verabreicht.
Die adjuvanshaltige Vakzine kann auch in größere Ampullen verteilt v/erden, wobei ganzzahlige Vielfache der Dosiereinheit und somit die ontsprechenden Vielfach-^oscn-Vakzinepräparate erhalten worden.
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B e i.'s ρ i e i 3
Das Verfahren wird bis einschließlich der 6stündigen Inkubation von Escherichia coli AICG 21 972 -bei 37°C in flüssigem PP,-Medium wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Die Züchtung von Escherichia coli wird dann in einem flüssigen Züchtungsmedium wie nachstehend beschrieben vorgenommen:
Aliquote Teile von 6 ml der so erhaltenen Escherichia coli-Kultur (d.h.-, etwa 6 χ ίο" Bakterien) werden in 300 ml flüssiges ΡΡ,-Medium enthaltende Züchtungskolben eingeimpft. Die Kulturen werden einen Tag unter Schütteln auf Schiit fceleinriehtungen (22 bis 24 Schüttelbewegungen pro Minute) inkubiert. Die Ernten aus 5 Züchtungskolben (eine Serie) werden -vereinigt. Jede Ernteserie wird 2 Stunden bei 2550 UpM zentrifugiert, das Sediment wird'in 150 ml destilliertem Wasser suspendiert, und eine Suspensionsprobe wird wie in Beispiel 1 auf Reinheit geprüft.
Die Zellsuspension wird 30 Minuten in einem Branson-Europa-Beschallungsgerät Modell J 22 beschallt, wobei das. Medium in einem schmelzenden Eisbad gehalten wird. Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die Suspension zum Abtrennen der Zelltrümmer 2 Stunden bei 5O0C und 2550 UpM zentrifugiert. Der überstand wird durch ein Millipore-Steriiisierfilter von 0,45 Mikron filtriert, wobei 100 ml Filtrat erhalten werden. Der pH-Wert des Filtrats wird mit η Salzsäure, auf 6,4 eingestellt. Das Filtrat·wird dann mit Thiomersal bis zu einer Endkonzentration von 0,02 Prozent versetzt . .
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- IO -
Beispiel 4
ml einer 2prozentigen wäßrigen Lösung von ALHYDRCGEL (ein von SUPERFOS EXPORT Company hergestelltes und vertriebenes Produkt.) •werden gründlich mit 80 ml des in Beispiel 3 erhaltenen Filtrate vermischt. Die Adsorption des Enterotoxins an dem ALHYiiROGSL wird mittels des Ausfällungsversuchs mit Trichloressigsäure geprüft.
20 ml des Überstands werden verv/orfen. Das restliche Gemisch wird in zehn 10 ml—Ampullen -verteilt> die verschlossen v/erden. Der Inhalt jeder Ampulle (9 nil) entspricht einer Vakzine-Dosiereinheit von 100 rag (auf Trockengewichtbasis) des hitzelabilen (LT) Escherichia cöli-Enterotoxins.
Die Vakzine v/ird trächtigen Mutterschi/einen 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln intramuskulär oder subkutan verabreicht. Die adjuvanshaltige Vakzine-kann auch in größere Ampullen .verteilt v/erden, wobei ganzzahlige Vielfache der Dosiereinheit und somit die entsprechenden Vielfachdosen-Vakzinepräparate erhalten werden.
Beispiel 5
Das Verfahren wird wie in Beispiel 3 durchgeführt, v/ob ei jedoch das Gemisch in 100 Glasampullen verteilt v/ird, die verschlossen v/erden. Der Inhalt jeder Ampulle (0,9 ml) entspricht einer Vakzine-Dosiereinheit von 10 mg (auf Trockengewichtbasis) des hitzelabilen (LT) Escherichia coll-SnterotoxInextrakts. Die Vakzine v/ird trächtigen Mutterschweinen 3 bis 6 V/ochen vor dem Ferkeln intramuskulär oder subkutan verabreicht.
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Die Verhütung der Ferkel-Golibacillose durch subkutane Verabreichung der erfindungsgemäßen hitzelabilen (LT) Escherichia
coli-Enterotoxinpräparate wird durch die nachfolgenden Versuche I5 2 und 3 gezeigt. In jedem dieser Versuche werden die -Mutter-Schweine 3 bis 6 V/ochen vor dem Ferkeln geimpft, und ein Mutterschwein v/ird als Kontrolltier verwendet, 24 Stunden nach der Geburt werden die Ferkel pro kg Körpergewicht mit 400 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten (LI) Escherichia coli-Enterotoxins infiziert, wobei.für die Verabreichung ein Kagenschlauch verwendet v/ird. Bei drei Würfen v/erden einige Ferkel - wie aus den
nachstehenden Tabellen I bis III ersichtlich - mit 660 mg des
aus dem Stamm ATGC 21 972 erhaltenen hitzestabilen (ST) Escherichia coli-Snterotoxin infiziert. Die klinische Entwicklung der · Ferkel wird fachgerecht verfolgt, wobei auf das Auftreten typischer Symptome.der Colibacillose geachtet wird.
Tn den Tabellen I bis III bedeutet
Vakzine A die Vakzine des Beispiels 2 bei der 100 mg (auf
Trockengewichtbasis) Dosiereinheit,
Vakzine B die Vakzine des Beispiels 4 bei der 100 mg (auf
Trockengewichtbasis) Dosiereinheit und
Vakzine G die Vakzine des Beispiels 5 bei der 10 mg (auf
Trockengewichtbasis) Dosiereinheit.
(x) 48 Stunden nach dem Ferkeln tritt Hastitis auf.
(xx) Gewichfcsverlust 4 Stunden nach dem Auftreten der
Diarrhöe. -
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Tabelle I: Versuch 1
Mutterschwein geimpft
mit		 Ferkel Nr. infi
ziert
mit		 Diarrhöe )auer,
Stunden
•		 Sterb
lich
keit ,		 Gewicht,
Prozent
(24- Stunden
nach der
Infektion )
2-10 LT Anzahl der
Stunden
zwischen
Infektion
und Aus
bruch		 _ _ keine Xnderung
Nr. 2-11 LT _ . — - + 3,5
2-12 LT — — - • + 9,5
A 2-15 LT - — — keine Xnderung
2-14- ST — — — + 3,6
2 2-15 ST — — - keine Änderung
2-16 ST — — - + 2,8
3-17 LT — — - + 10,6
3-18 LT — - + 11,8.
3-19 LT — — - + 6,3
A 3-20 LT — — - + 5,8
3-21 ST — — - + 10
" 3 3-22 ST — - - + 11,9
3-23 ST — - - + 10,4-
3-24- ST - — - + lö
10-01 LT - - 24 — - 10
10-02 LT 6 24 - - 10,9
10-03 LT 6 bis 12 12 - - 5,3
10-04- LT 6 96 + - 14-, 7
- 10-05 LT 6 10 - - 7,6
10-06 ST 6 bis 12 - - keine Xnderung
fr10 10-07 ST - -3 - seine Xnderung
(Kon-
trolle) 		10-08 ST 1 — - ce ine Änderung·
10-09 ST — 12 - keine Xnderung
6
409823/1134
Tabelle IIι Versuch 2
Mutterschwein geimpft
mit		 Nr. infi
ziert
mit		 Ferkel JDauej}
Stun
den		 Sterb
lich
keit		 Gewicht $
Prozent,
(24 Stunden
nach der
Infektion)
- 47-12 LT Diarrhöe keine Änderung
Nr. 47-13 LT' Anzahl der
Stunden
zwischen
Infektion
und
Ausbruch		 ■ - - + 9*2
A 47-14 LT — - keine Inderung
47-15 LT + 6S4
47 47-16 LT - - + 6,6
48-08 LT — — " +•5,2
B 48-09 LT -«, + 6,7
48-10 LT «, - + 3,7
48 48-11 1 LT «. + 10,5
50-01 LT - ■ ■ . 21 + - 19,8
50-02 LT - - - keine Inderung
50-03 LT - - + 2,6
- - 50-04 LT - 14-21 + - 22,1
50-05
50-06		 .LT
LT		 - 48
10		 r 18,8
- 3,2
50-07 LT 6 21
I		 - 28?5
(Kon
trolle		 14
21
6
409823/1134
• 13 * ir . 21 5eimpf
mit		 • * * - Hr. : Versuch 3 'Ferkel Bauer,
Stun
den		 ~ 14 - Sterb
lich
keit		 Gewicht,
Prozent
(24 Stunden
nach der
Infektion)
• Tabelle III χ - B 13-119 Diarrhöe — 23601t8 —- - + 8,4
Mutterschwel 13-120 Anzahlder
Stunden
zwischen
Infektion
und Aus
bruch		 - - +. 11,4
13-121 infi
ziert
mit		 .— ι — + 2
.1Tr. 13-122 LT -■ — _ keine Änderung
13-123 LT — - — + 7,1
15 13-124 LT - - — 2 — + 8,1
13-125 LT - — — + 8
13-126 LT 4 ■ ~" - + 5,8
13-127 LT — ;40 + - 21
13-128 LT "* · : - - + 8,4 .
σ 21-110 LT 8 48 + - 15
21-111 LT ■ 6-11 -" 6,9
20 21-112 LT 48 + - l*,3
{Kon- ,
trolle,		 21-114 LT 3 ■ - i - - - .- 5,9
21-115 LT 4 6 - - 6,3
■ 21-116 LT '■ — — - 3,6
σ 21-117 LT . 6 - - - 2
21-118· LT — - - - 12,5
15-129 LT' - ι — — + 7,4
15-130 LT 6 · — — + 4,9
15-131 LT - — + 13,2
15-132 LT - — — + 16
15-133 LT — - - . keine Änderung
20-101 LT — 6 - 3,6
20-102 LT - 6 — - 16,5
20-103 LT - 5 4 — - 4,5 XX,
20-104 LT 6 6 — - 5,3
?0-105 LT 25 6 — - 4,7
0-106
0-107		 LT 19 4-9 - Keine Änderung,
- 3,2
0-108 LT j 6 '6 — ■ - 5i7
0-109 LT 3 6 - - 4,2
LT
LT		 6
LT 6
LT
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Die Ergebnisse der Versuche zeigen, daß 6 von 7 Würfen von ge^ impften Mutterschweinen gegen die orale Infektion, mit Escheri- ' chia coli-Enterotoxinen geschützt sind. Der erreichte Schutz beträgt 90 Prozent für einen Wurf und 100 Prozent für die 5 anderen Würfe. Kein von den IControllschweinen stammender liurf ist widerstandsfähig gegen die gleiche Infektion mit Enterotoxinen; die Sterblichkeit -und Morbidität unter den Kontrollferkeln beträgt 71,4- bis 8858 Prozent.
In fünf von sieben Würfen von geimpften Mutter Schweinen sind sämtliche Ferkel vollständig geschützt; in einem Wurf sind 8 von 10 Ferkeln vollständig geschützt. Für die mit IT-Enterotoxin infizierten und von KontrollSchweinen stammenden Ferkeln werden folgende Ergebnisse erhalten: In einem Wurf zeigen 5 von 5 Tieren, im zweiten Wurf 5 von 7 Tieren und im dritten VJurf 8 von > 9 Tieren typische Symptome.
Beispiel?
Ein aliquoter Teil von 12 g des gemäß Beispiel 1 hergestellten und gefriergetrockneten Ent erot oxinpr Spar at s v/ird in 1 Liter pyrogenfreiem destilliertem V/asser suspendiert. Die Suspension wird.mit einer !Lösung von 20 g ALHYDROGEL (ein von SÜPERF08 EXPORT Company hergestelltes und vertriebenes Produkt) in 1 Liter pyrogenfreiem destilliertem Wasser vermischt. Der pH-Wert · wird mit η Salzsäure auf 6 eingestellt, und das Gemisch v/ird · zur Adsorption des Enterotoxins an ALHYDROGEL 40 Stunden im Dunkeln bei Saumtemperatur stehengelassen, wobei Mn und wieder gerührt wird. Der End-pH-Wert beträgt 6,3.
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Nach dem Zentrifugieren wird der überstand verworfen und das Sediment durch Zugabe von 2,2 Liter eines 5O:5O-Gemisches aus physiologischem Serum und Puffer (22 g Na2HPO4 (m/10) und 78 g KH2PO4 (m/10) und 10 mg Thiomersal auf 100 ml\ pH 6,3) rehydratisiert. Das Gemisch wird 2 Stunden bei A-0G gerührt und in zwei 1100 ml-Chargen geteilt, die mit A und B bezeichnet werden. Charge A enthält 5 »4· mg des Enterotoxinpräparats und 9 mg AL-HYDROGEL pro.ml und wird in aliquote Teile von 5 ml aufgeteilt, die somit 27 mg des Enterotoxinpräparats enthalten. Die aliquoten Teile werden"in Glasampullen gefüllt, die anschließend abgeschmolzen werden. Charge B wird verdünnt durch Zugabe von 303 ml eines 5O:5O-Gemisches aus physiologischem Serum und Puffer (22 g Na2HPO4 (m/10) und 78 g KH2PO4 (m/10) und 10 mg Thiomersal auf 100 ml; pH 6,3), das mit 2,7 g ÄLHYDROGEL versetzt wurde. Gharge B enthält 4-,3 mg des Enterotoxinpräparats und 9 1^g ÄLHYDROGEL pro' ml und \tfird in aliquote Teile von 2,5 ml aufgeteilt, die somit 10,75*ng des Enterotoxinpräparats enthalten. Die aliquoten. Teile werden in Glasampullen gefüllt, die dann abgeschmolzen werden.
Die aus den Chargen A und B hergestellten Vakzinepräparate wei-den v/ie nachstehend beschrieben in Zucht Zentren, die mit durch Colibakterien verursachte Diarrhöe verseucht sind, an Mutterschweinen geprüft. Hierzu werden die Mutterschweine 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln subkutan mit einer Einzeldosis an Vakzine geimpft: 59 Mutterschweine erhalten eine Dosis der Charge A-Vakzine und 28 Mutterschv/eine eine Dosis der Charge B-Vakzine. 50 Mutterschweine dienen als Kontrolle und erhalten die gleichen Volumina desselben ALHYDROGEL-Puffergemisches ohne den Entero-
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t oxinext r akt ·,
Sämtliche Ferkel werden auf das Auftreten von Diarrhöe beobaeh-: tet. Am und nach dem zweiten Tag des klinischen Krankheitssymptoms werden die Merkel täglich mit Chloramphenicol, Ampicillin oder Sulfadoxin/Trimethoprim behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV unter Berücksichtigung der Konsistenz der Fäzes, der Dauer der Diarrhöe, der Anzahl der Verabreichungen von Antibiotika und der Sterblichkeit durch Wasserentzug zusammengestellt.
ν ■
Tabelle IV
Vakzine-
Dosis		 Zahl
der
Würfe		 Wurfe mit
Di£
Zahl		 schwerer
irrhoe (*)
Prozent		 Würfe mit S
Zahl		 terblichkeit
Prozent
5 ml von
Charge A		 59 15 25,4 2 3,5
2,5 ml
von
Charge B		 28 10 55,7 2 7,1
Placebo 50 24 48 8 *
16
(x) Flüssige Fäzes während mehr als zwei Tagen, mehrere Ver- abreichungen von Antibiotika, mit und ohne Sterblichkeit·
(xx) 25 Mutterschweine erhalten 2,5 ml. und die anderen 25 Mutterschi'/eine 5 ml.
Die in Tabelle IV zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß durch die Verabreichung erfindungsgemäßer Vakzinen der Krankheitsund Sterblichkeitsprozentsatz beträchtlich herabgesetzt ., wird, wobei bei Verabreichung der 27 mg-Enterotoxin—Dosiereinheit an die Mutterschweine ein besserer Schutz erhalten wird.
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Claims (6)

  1. Patentansprüche 23601 Ί 8
    φ, Vakzinen gegen Ferkel-Colibaeillose, enthaltend" eine wirksame Menge an zellfreiem, hitzelabilem (LT) Escherichia coli-En'terotoxin und ein Adjuvans.
  2. 2. Vakzinen nacli Anspruch 1, dadurch ge'kennzeichnet, daß das liitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin ein zellfreier und im wesentlichen ναμ Lipopolysacchariden freier Extrakt aus Escherichia coli ist.
  3. 3. Vakzinen nach- Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin aus dem Stamm Escherichia coli A1SGG 21 972 stammt.
  4. 4-, Vakzinen nach Anspruch 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans ein öliges Adjuvans oder· eine gelförinige Aluminiumverb indung ist.
  5. 5. Vakzinen nach Anspruch 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß die Enterotoxin-Bosiereinheit 10 bis 150 mg"gefriergetrockneten Extrakt beträgt.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung der Vakzinen nach Anspruch 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man aus Zellen eines hitzelabiles Enterotoxin produzierenden Escherichia coli-Staraiaes das hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin isoliert und mit einem Adjuvans vermischt,
    ■/
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