DE2359225A1

DE2359225A1 - Desodorantien

Info

Publication number: DE2359225A1
Application number: DE2359225A
Authority: DE
Inventors: Egbert Dr Charlet; Werner Dr Frommer; Uwe Dr Keup; Winfried Dr Wingender
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1973-11-28
Filing date: 1973-11-28
Publication date: 1975-06-12

Description

Zentralbereich Patente, Marken und Lizenzen

S/Hg 509 Leverkusen, Bayerwerk

£ιτ (Ph)_7 2 7. NOV. 1971

Desodorantien

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines bekannten Proteinasen-Inhibitors mikrobieller Herkunft als desodorierenden Wirkstoff.

Es ist bekannt, daß einzelne Proteinasen-Inhibitoren tierischen oder pflanzlichen Ursprungs als Desodorantien Verwendung finden können (deutsche Offenlegungsschrift 1 939 419)· Diese Proteinasen-Inhibitoren lassen sich jedoch nur in· wässrigen Lösungen verwenden, da sie aufgrund ihrer geringen Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Methanol, Äthanol, Isopropanol und Butanol für eine Anwendung in Aerosol-Spraya nicht in Frage kommen. Ferner ist ihre Herstellung im Vergleich zu den mikrobiellen Herstellungsverfahren wesentlich aufwendiger.

Es wurde gefunden, daß der Proteinase-Inhibitor der Formel (I)

HOOC-CH-NH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CHO j ι ι ι

Λττ ( pTT \ PTT ( PTT ι ι T 1

' NH * H,C CH, NH

γ^^\ ι ■> -> I

I C=NH · C=NH

^-^ NH₂ , NH₂

in reiner Form oder als ro'her Inhibitor, wie er bei der mikro-Le.A 15 414' - 1 -

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OHiQlNAL INSPECTED

biellen Herstellung ohne Peinreinigung anfällt, starke desodorierende Eigenschaften aufweist. ■

Überraschenderweise ist·der erfindungsgemäß verwendbare Inhibitor der Formel I als desodorierender Stoff stärker wirksam als die bereits bekannten Inhibitoren tierischer oder pflanzlicher Herkunft. Im Falle des Inhibitors der Formel I kann die desodorierende Wirkung sowohl auf einer Hemmung der proteolytisehen als auch esterolytischen Enzyme beruhen. Die erfindungsgemäße Verwendung des Proteinasen-Inhibitors der Formel I stellt somit eine Bereicherung der Technik dar.

Der erfindungsgemäß zu verwendende Proteinasen-Inhibitor ist bereits bekannt (vgl. The Journal of Antibiotics, Vol. XXV, Nr. 4, Seiten 263 - 27ο (.1972) und Enzyme Inhibitors of Microbial Origin by H. Umezawa, University Park Press, Baltimore (1972), Seiten 29 - 32).

Für seine Herstellung können auch weiterhin Stämme der Art Streptomyces michiganensis (Corbaz et al), insbesondere der Stamm Streptomyces michiganensis CBS 538.68 verwendet werden. Die Art Streptomyces michiganensis ist von Corbaz et al., Arch. Microbiol. 2_6 (1957), Seite 192 beschrieben. Der besonders geeignete Stamm CBS 538.68 ist bereits seit 1968 im Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland, hinterlegt. Des weiteren sind für die Herstellung des erfindungsgemäßen Inhibitors die Stämme Ami 634, Halde 116o geeignet, die im Arch. Microbiol. 32_ (1959), Seite 187 beschrieben und im Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland, unter den Nummern CBS 194-7*3 und CBS 193.73 hinterlegt sind.

Für die Herstellung de^ Wirkstoffes der Formel I verwendet man hierbei die für Streptomyceten üblichen Nährlösungen bei den für Streptomyceten üblichen Temperaturen. Für die Her-

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stellung des Inhibitors eignet sich besonders eine Nährlösung aus Maisstärke, Glucose, Kaseinhydrolysat und Hefeextrakt. Anstelle-von Maisstärke und.Glucose kann auch Glycerin, Sorbit, Mannit und Inosit oder Gemische dieser Stoffe als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Ebenso kann anstelle von Kaseinhydrolysat und Hefeextrakt auch Sojamehl oder Pepton oder' Fleischextrakt Verwendung finden. Unter gewissen Ernährungsbedingungen kann der Zusatz von pH-stabilisierenden Salzen, wie CaCO, oder 'K- oder Nä-Phosphaten fördernd für die Stoffproduktion sein. Die Konzentration der- Nährlösungsbestandteile können in weiten Grenzen schwanken. Vorzügsweise verwendet man zur Herstellung des Inhibitors der Formel I eine Nährlösung der Zusammensetzung: 2 $ Maleinsäure, 1 fo Glucose, o,5 i° Kaseinhydrolysat, 1 io Hefeextrakt und o,4 $ CaCO,. Sterilisation 1 Stunde bei 121⁰C -

Bei der Durchführung des Verfahrens werden die Nährlösungen in der üblichen Weise mit Dampf sterilisiert. Die Kultur beimpft man mit o,3- 1o fo, vorzugsweise 1 - 5 i° einer Vorkultur-und bebrütet unter intensiver Belüftung bei 2o - 4o C, vorzugsweise 25 - 3o C so lange, bis ein maximaler Inhibitortiter erreicht ist, vorzugsweise 2-5 Tage.

Die Isolierung des rohen Inhibitors (crude inhibitor) aus der Kulturbrühe nach Abtrennung der Mycelien durch Zentrifugation oder Filtration kann auf verschiedene Weise erfolgen:

a) Einengen der Kulturbrühe bei vermindertem Druck (1ό - 5o Torr) bei Bad-Temperaturen von 2o - 1oo C, vorzugsweise 4o - 8o°C, auf ca* 1/5 bis 1/1-O des Ausgangsvolumens. Ber eingeengte Extrakt wird filtriert oder zentrifugiert und das klare Filtrat ^der klare Überstand) lyophilisiert.

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b) Ausfällung der inaktiven Begleitstoffe aus der Kulturbrühe (oder der nach a) eingeengten Kulturbrühe) durch Zusatz von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen oder Ketonen, vorzugsweise Methanol, Äthanol, Aceton bis zu einem Gehalt von 60 - 80 fo. Der ausfallende Niederschlag wird durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt und das Filtrat im Vakuum eingeengt und lyophilisiert.

c) Aussalzen der inaktiven Begleitstoffe aus der Kulturbrühe (oder der nach a) eingeengten Kulturbrühe) z. B. mit Ammonsulfat, Kochsalz usw. Der ausgefallene Niederschlag wird durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt und das Piltrat im Vakuum eingeengt und nach vorheriger Entsalzung lyophilisiert.

d) Extraktion des Inhibitors aus der Kulturbrühe (oder der nach a) eingeengten Kulturbrühe) durch Ausschütteln mit n-Butanol. Der butanolische Extrakt wird im Vakuum eingeengt und lyophilisiert.

e) Adsorption der inaktiven Begleitstoffe an Ionenaustauscher, vorzugsweise an den schwach basischen Ionenaustauscher Amberlite 45 0H~ Form, aus der Kulturbrühe (oder nach a) eingeengten Kulturbrühe). Das Eluat wird im Vakuum eingeengt und lyophilisiert.

f) Behandlung der (gegebenenfalls nach a) eingeengten) Kulturbrühe mit Adsorbentien, vorzugsweise Aktivkohle und/oder makroporöse Polystyrolharze, wobei der Inhibitor praktisch vollständig gebundep. wird. Die Desorption erfolgt mit wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Methanol, Äthanol, Isopropanol, Aceton, vorzugsweise 8o^igem Äthanol im sauren oder neutralen Bereich, vorzugs-

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weise pH 2, und bei 3o - 8o C, vorzugsweise 6o°C. Das ■ Desorbat wird im Vakuum eingeengt und lyophilisiert.

Der Inhibitor der Formel I fällt hierbei jeweils in fester Form als roher Inhibitor an, der naoh den allgemein üblichen Methoden (z. B. Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie und/oder Elektrophorese) der Feinreinigung unterworfen werden kann.

Aus Streptomyces michiganensis können in geringerem Maße weitere Proteinase-Inhibitoren des Typs der Verbindung der Formel I erhalten werden, welche ebenfalls desodorierende Eigenschaften aufweisen.

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Der Wirkstoff der Formel I weist bei hervorragender Verträglichkeit (keine Nebenwirkungen auch bei empfindlichen Personen) eine starke desodorierende Wirkung an Menschen auf.

Der Inhibitor der·Formel I kann in reiner Form,jedoch auch in besonders günstiger Weise in einer bei der mikrobiellen Herstellung anfallenden und Begleitstoffe enthaltenden rohen Form ("crude inhibitor") eingesetzt werden, da die Begleitstoffe nicht stören. Eine Feinreinigung, welche recht aufwendig und teuer ist, kann also entfallen.

Zur vorliegenden Erfindung gehören Zubereitungen, die den Wirkstoff der Formel I in reiner Form oder in roher Form (crude inhibitor), wie er bei der mikrobiellen Gewinnung ohne Peinreinigung anfällt, neben Hilfsstoffen, wie niehttoxischen, inerten und hautverträglichen festen, halbfesten und flüssigen Verdünnungsmitteln, Lösungsmitteln, Füllstoffen, Formuüerungshilfsmitteln, kosmetisch wirkenden Stoffen, Konservierungsstoffen und/oder Riechstoffen und im Falle von Sprays weiterhin Treibgasen enthalten.

Als Zubereitungen, welche den Wirkstoff der Formel I in reiner Form oder in roher Form (crude inhibitor), wie er bei der mikrobiellen Gewinnung ohne Feinreinigung anfällt, enthalten, können beispielhaft Lösungen, Emulsionen, Salben, Cremes, Gele, Lotions, Seifen, Puder, Sprays und Stifte genannt werden. Grundsätzlich können alle auf dem Gebiet der Desodorantien üblichen Formulierungen gewählt werden (vgl. z. B. auch Hermann Römpp, Chemie -Lexikon, 6. Ajiflage, Band I, Spalten 14o2 - 14o3)· So können beispielsweise Salben, Pasten, Cremes und Gele neben dem Wirkstoff die üblichen Hilfsstoffe enthalten, z. B. tierische und pflanzliche F^tte, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyäthylenglykole, Silicone, Bentonite,

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Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe.

Auch Puder und Sprays können neben dem Wirkstoff die üblichen Hilfsstoffe enthalten, z. B. Milchzucker, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikat und Polyamidpulver oder Gemische dieser Stoffe. Sprays können, zusätzlich die üblichen Treibmittel, z. B. Chlorfluorkohlenwasserstoffe, enthalten.

Lösungen und Emulsionen können neben dem Wirkstoff die üblichen Hilfsstoffe, wie Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, z. B. Wasser, Äthylalkohol, Isopropylalkohol, Äthylcarbonat, Äthylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnußöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Ricinusöl und Sesamöl, Glycerin, Glycerinformal, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyäthylenglykole und Fettsäureester des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthalten. Sprays können auch hierbei die üblichen Treibmittel, z. B. Chlorfluorkohlenwasserstoffe, enthalten. .

Wegen der starken Wirksamkeit und der guten Verträglichkeit des Wirkstoffes der Formel I kann der Wirkstoffgehalt in den oben genannten Zubereitungen außerordentlich weit variiert werden. Besonders geeignet sind solche Zubereitungen, welche den Wirkstoff der Formel I in Mengen von etwa o,o5 bis etwa 1o, vorzugsweise o,1 bis 1, insbesondere o,2 bis o,5 Gewichtsteile enthalten. Der jeweils optimale Wirkstoffgehalt kann von jedem Fachmann aufgrund seines Fachwissens leicht festgestellt werden. **·

Die erfindungsgemäßen »Zubereitungen können außer dem Wirkstoff der Formel I auch weitere desodorierend wirkende biochemische oder chemische Stoffe enthalten.

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Die Herstellung der oben aufgeführten Formulierungen erfolgt nach allgemein üblichen Methoden, z. B-. durch Mischen des Wirkstoffes der Formel I mit den jeweiligen Wirkstoffen und im Falle von geformten Körpern durch anschließendes Gießen oder Pressen der Mischungen in die gewünschten Formen.

Zur vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung des Wirkstoffes der Formel I und der Zubereitungen, die den Wirkstoff der Formel I enthalten, als desodorierende Mittel, also als Mittel zur Verhinderung, Verringerung und/oder Beseitigung von unerwünschtem Körpergeruch zur Verwendung auf der menschlichen Haut. Der Wirkstoff "bzw. die Zubereitungen, welche den Wirkstoff enthalten, können hierzu in üblicher und beliebiger Weise auf die verschiedenste Weise mit der Haut in Berührung gebracht werden, z. B. durch Bestreichen, Besprühen usw. Wegen der außerordentlich guten Wirksamkeit und Verträglichkeit des Wirkstoffes der Formel I kann die auf die Haut gebrachte Wirkstoffmenge über einen sehr weiten Bereich variiert werden.

Bei flüssigen Zubereitungen können z. B. o,1 ml pro cm Haut aufgetragen werden. In entsprechenden Mengen können die übrigen Zubereitungen eingesetzt werden. Die optimale Menge kann je nach Zubereitung durch jeden Fachmann aufgrund seines Fachwissens leicht festgestellt werden.

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Beispiele für desodorierende Zubereitungen, die den Wirkstoff der Formel I (in reiner oder auch roher Form) enthalten

1. Spray

o,2 g Wirkstoff der Formel I o,7 g Parfüm o,7 g Glycerin o,7 g Isopropylmyristat 3,5 g Dipropylenglykol und

64,2 g Äthanol werden gemischt und in einer Druckdose mit 12 g CCl₂F₂ und 18 g C₂Cl₂F₄ versetzt.

2. Aerosol

1,o g Wirkstoff der Formel Ιο, 5 g Parfüm *

9o,o g Isopropanol und 1o,o g Glycerinmönoessigsäureester werden gemischt.

2o,o g dieser Mischung werden in einer Druckdose mit

80 g einer Mischung aus CCl₃F₂ und- C₃Cl₂F₄ versetzt.

3. Stift

8,0 g Natriumstearat

5,o g Sorbit 75,o g Propylenglykol 1o,o g Wasser 1,75g Parfüm und o,25 g Wirkstoff der Formel I

werden gemischt und in einer geeigneten Form in die Stiftform gebracht.

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4· Creme

19 g Aluminiumphenolsulfonat 25,o g Cetylalkohol 25,0 g Petroleumwax 12,o g Natriumlaurylsulfat und 3,o g Wasser werden gemischt.

9,9 g dieser Mischung werden mit o,1 g Wirkstoff der Formel I gemischt.

5· Creme

2o,o g Wirkstoff der Formel I

35,o g äthoxylierte Fettsäureester von Sorbitan (Tween 60^ ') 3o,o g Fettsäureester von Sorbitan 15o,o g Wollfett
3ο,ο g Erdnußöl

5,o g Silikonöl

5,o g Cetylalkohol

2o,o g Tylose

75,o g Sorbit und

62o,o g Wasser werden gemischt.

6. Puder

5,0g Zinkoxid

o,9 g Wirkstoff der Formel I

5,o g Titandioxid
1o,o g CaCO₅

0,9g Wollfett

1,o g Cetylalkohol

2,o g Fatrium-aluminiumsulfat -

5,0g Salicylsäure 2,o g Borsäure ^

werden mit soviel Parfüm und Talkum versetzt, daß loo g •Mischung entstehen. Die Bestandteile werden sorgfältig

gemischt.

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7. Puder

1,5 g Glycerindilaurat o,8g Wirkstoff der Formel I o,4 g Aluminiumstearat

o,3 g Zinkoxid · 52,o g Talkum und 45,o g Maisstärke werden gemischt,

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Die hervorragende desodorierende Wirkung des erfindungsgemäßen Inhibitors kann durch die folgenden Versuche demonstriert werden:

Zu Versuchen standen 2o weibliche und 14 männliche Probanden (Menschen) zur Verfügung, die am Tage mittlere bis schwere Körperarbeit zu verrichten hatten.

Zwei kosmetisch-parfümistisch geschulte Mitarbeiter führten unabhängig voneinander die Geruchsüberprüfung im doppelten Blindversuch durch. Die Ergebnisse sind den Tabellen 1 bis zu entnehmen.

Versuch 1

Die Probanden wuschen sich am Morgen des 1. Versuchstages in den Achselhöhlen nur mit Wasser und benutzten weder desodorierende Präparate noch Seife. Bei Arbeitsbeginn wurde der Körpergeruch in den Achselhöhlen geprüft. Daraufhin wurde eine Achselhöhle mit 1 ml einer Lösung von o,2 g des. erfindungsgeraäß verwendbaren Inhibitors der Formel I in 99 g eines Äthylalkohol-Wasser-Gemisches (1 : 1, Volumen) eingerieben. Die Probanden gingen anschließend ihrer normalen Arbeit nach. Am Ende der Arbeitszeit der Probanden, also nach etwa 9 Stunden, erfolgte eine vergleichende Beurteilung durch Riechen an jeweils der behandelten und der nicht behandelten Achselhöhle. Die Probanden durften sich weder an dieses Tages Abend noch am folgenden Morgen mit desodorierenden Mitteln oder Seife waschen. Es war lediglich das Abtupfen mit einem trockenen Tuch gestattet. Am Morgen des folgenden (zweiten) Tages erfolgte abermals die Beurteilung durch Riechtest bei Arbeitsbeginn.

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Versuch 2 '

(Vergleich mit einem Proteinase-Inhibitor tierischer Herkunft)

Der Versuch wurde durchgeführt wie der Versuch 1.

Als Vergleichssubstanz wurde ein Proteinase-Inhibitor aus Rinderorganen verwendet, der als ein basisches Polypeptid vom Molekulargewicht 6512 vorliegt und 16 verschiedene Aminosäuren in einer Kette von insgesamt 58 Aminosäureresten enthält (Kallikrein^-Trypsin-Inhibitor).

Der Wirkstoff der Formel I wurde in einer Konzentration von o,2 io (Gewicht) und die Vergleichssubstanz in einer Konzentration von 1 io (Gewicht) eingesetzt. Als Lösungsmittel wurde Wasser-Äthanol (1 : 1, Volumen) verwendet.

Versuch 3 ■ ·

(Vergleich mit einem Proteinase-Inhibitor pflanzlicher Herkunft)

Der Versuch wurde durchgeführt wie der Versuch 1. Der Wirkstoff wurde in Form einer o,2 %'(Gewicht) Lösung in Wasser verwendet. Als Vergleichssubstanz diente ein Proteinase-Inhibitor aus Kartoffeln in einer 4 i> (Gewicht) Lösung in Wasser. Hierbei zeigte sich, daß die desodorierende Wirkung der o,2 % Lösung der Verbindung der Formel I derjenigen einer etwa 4 $ Lösung der Vergleichssubstanz entspricht.

Die Bewertung der Geruchsintensität erfolgte nach folgendem Schema (vgl. Tabellen· 1 bis 4): ' -^

O = kein Körpergeruch ' + ■ = mäßiger Kb"rpergeruch ++ = deutlicher Körpergeruch +++ = unangenehm starker Körpergeruch

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tn Tabelle 1 A. weibliche Probanden

-¹ ' Versuchs- Anfangswert abends morgens

^ Person morgens 1. Tag 1 . Tag 2. Tag

-» nicht behandelt nicht behandelt behandelt nicht behandelt behandelt

16 + + O ++ +-co

18 + + O ++ + Nj

19 O _{+++ +} -

2o+ ++O

_tH Tabelle 2 B. männliche Probanden

je Versuchs- Anfangawert abends morgens

_i Person morgens 1. Tag 1 .Tag 2. Tag

nicht behandelt nicht behandelt behandelt nicht behandelt behandelt

ö 'Cn · 9 0 ++ 0 ++ +

11 0 ++

13 0 ++

H +

» Tabelle

Versuchs- Anfangawert person morgens 1. Tag

nicht behandelt

A. weibliche Probanden

abends
1 . Tag

morgens 2. Tag

σ\

1 2 5 4-5 6 7 8 9 1o

4 -

= Inhibitor der Formel I

2 = Kallikrein^-Trypsin-Inhibitor aus Rinderorganen (178 FIP-TIE/mg)

CD

Tabelle

Versuchs- " Anfangswert person morgens 1 . Tag

nicht behandelt

B. männliche Probanden

abends
1 . Tag

morgens 2. Tag

. 9 10

4 -

•f+

T = ■ Inhibitor der' Formel I

2 = Kalirkrein^-Trypsin-Inhibitor aus Rinderorganen (178 FIP-TXB/mg)

cn ■CD

Die Yersuchaergebnisse der Tabellen 1 und 2 zeigen, daß bei Anwendung einer o,2 $ (Gewicht) wässrig-alkoholischen Inhibitor-Lösung eine sehr gute bis gute desodorierende Wirkung auftritt, die über einen ausreichenden Zeitraum anhält. Eine o,2 % (Gewicht) wässrige Inhibitor-Lösung zeigt eine ähnliche Wirkung.

Die Ergebnisse der Tabellen 3 und 4 sowie der Versuch 3 zeigen die eindeutige Überlegenheit des Wirkstoffes der Formel I gegenüber Proteinase-Inhibitoren tierischer und pflanzlicher Herkunft.

Die gleichen Versuchsergebnisse, wie sie bei Verwendung der reinen Verbindung der Formel I gefunden wurden, konnten auch bei der Verwendung des rohen Inhibitors, wie er bei der mikrobiellen Gewinnung ohne Feinreinigung anfällt, erzielt werden, wobei in den Versuchen Zubereitungen verwendet wurden, die statt o,2 io (Gewicht) des reinen Inhibitors 1 <?o (Gewicht) des rohen Inhibitors enthielten.

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Die Herstellung des Wirkstoffs der Formel I, insbesondere die Herstellung des rohen Inhibitors (crude inhibitor) sei anhand der folgenden Beispiele erläutert:

BeiSOiel 1 .

Beimpft man in einem Permenter unter sterilen Bedingungen 12o L einer Nährlösung der Zusammensetzung 2 fo Maisstärke, 1 io G-lucose, 1 fo Hef ee'xtrakt, o,5 $ Kaseinhydrplysat und o,4 fo CaCCÜ,der man zur Entschäumung vor der Sterilation noch o,1 Vol.-$ Siliconentschäumer zugesetzt hat, mit 1 L Vorkultur des Stammes CBS 538.68 (gewonnen in der gleichen Nährlösung in Schüttelkolben) und bebrütet bei 28 C unter starkem Rühren und Belüften, so erhält man nach einer Fermentationsdauer von 41 Stunden eine Kulturbrühe, die in dem unten beschriebenen Hemmtest 12o F.I.P.-T.I.E/ml ergibt.

Nach Abtrennung des Mycels durch Zentrifugation wird die KuItürbrühe (1oo L) mit Aktivkohle/3 mm Körnung (75 mg/ml) versetzt und 3o Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Aktivkohle wird von der Kulturlösung getrennt und der inaktive Überstand verworfen.

Der Inhibitor wird mit 4o L salzsäurehaltigem 8o^igen Äthanol (pH 2) bei 6o°C unter Rühren von der Aktivkohle desorbiert und der Desorptionsschritt nochmals mit 3o L salzsaurem Äthanol (pH 2) wiederholt. Die vereinigten Desörbate werden mit NaOH auf pH 6,8 eingestellt und auf etwa 2,5 L eingeengt. Io L eines 1 : 1o mit Wasser.verdünnten Aktivkohle-Extraktes werden mit 2 kg vorbehandeltem (mit reinem Methanol gewaschen) makroporösem Polystyrolharz versetzt' und 3o Minuten bei Räumtemperatur gerührt. Na₄Ch Abnutschen des inaktiven Überstandes erfolgt die Elution de«s Inhibitors mit einem Gradienten aus Äthanol und Wasser stufenweise. Die Hauptmenge des Inhibitors wird mit 3o$igem Äthanol (3 x 1o L) von dem Harz desorbiert.

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Zur Entfärbung wird das dunkelbraune Konzentrat mit einem schwach basischen Ionenaustauscher in der OET-Form im batch-Verfahren behandelt und das Eluat im Vakuum eingeengt und lyophilisiert.

Die spezifische Aktivität des nach diesem Verfahren gewonnenen

Inhibitors beträgt 182 F.I.P.-Einheiten/mg.

Ausbeute: 7 g eines Peststoffes, der den Inhibitor der Formel I enthält und der direkt als desodorierender Stoff

verwendet werden kann.

Beispiel 2

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 12o ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 2 fo Maisstärke, 1 $ Glucose, 1 <$> Hefeextrakt, o,,5 $> Kaseinhydrolysat und o,4 $ CaCO,, Sterilisation 1 Stunde 121⁰C, enthält, mit 1 ml einer 3 Tage alten Vorkultur des Stammes CBS 538.68 in der gleichen Nährlösung und bebrütet 3 Tage auf einer Rundschüttelmaschine bei 28 C, so erhält man eine Kulturbrühe, die in dem unten beschriebenen Hemmtest 1oo P.I.P.-Trypsin-Inhibitor-Einheiten/ ml ergibt.
Die Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 12o ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 2 °/o Maisstärke, 1 $ Glucose, 1 io Hefeextrakt, o,5 $ Kaseinhydrolysat und o,4 fo CaCO,, Sterilisation 1 Stunde 121⁰C, enthält, mit 1 ml einer 3 Tage alten Vorkultur des Stammes Ami 634 = CBS 194-73 in der gleichen Nährlösung und bebrütet 2 Tage auf einer Rundschüttel-

o *

maschine bei 28 C, so erhält man eine Kulturbrühe, die in dem unten beschriebenen Hemmtest 2,75 P.I.P.-Trypsin-Inhibitor-Einheiten/ml ergibt.
Die.Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1.

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Beispiel 4

Beimpft man einen 1-Liter-ErlenmeyerkQlbenfr der 12o ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 2 <fo Maisstärke, 1 fo .Glucose, 1 io Hefeextrakt, o,5 $ Kaseinhydrolysat und ο*4 i° CaCO,, Sterilisation 1 Stunde 121⁰C, enthält, mit 1 tfll einer 3 Tage alten Vorkultur des Stammes Halde 116o = CBS 193-73 in der gleichen Nährlösung und "bebrütet 3 Tage auf einer .Rundschüttelmas chine "bei 28⁰C, so erhält .man eine. KuI tür "brühe, die in dem unten "beschriebenen Hemmtest 13ö F«-I *P.-Trypsin-rnhibitor-Einheiten/ml ergibt.
Die Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1.

Beispiel 5 ■ .

Beimpft man einen . 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 12o ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3 io Sojamehl,, 3 $ Glycerin, o,2 io CaCO,,Sterilis ationi Stunde 121⁰C, enthält, mit 1 ml einer 3 Tage alten Vorkultur des Stammes CBS 538.68 in der gleichen Nährlösung und bebrütet 3 Tage auf einer Eündschüttelmaschine bei 28⁰C, so erhält man eine Kulturbrühe mit

9o F.1.5.-T₄

Die Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1.

Beispiel 6

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 12o ml einer Nährlösung der Zusammensetzung o,5 $ Pepton, o,5 ^ Fleischextrakt, o,2 i> Hefeextrakt, o,o3 i° Kaseinhydrolysat, 1 io Inosit, 1 $ Sorbit, 1 ^Mannit, 1 φ Glukose, o_f1 o,5 ι KCl, o,ö5 i° MgSO^, ο,οΐ % PeSD^* Sterilisation 1 Stunde 121⁰C, enthält, mit 1*ml einer 3 Tage alten Vorkultur des * Stammes CBS 538.68 in der gleichen Nährlösung und bebrütet 3 Tage auf einer Runds^chüttelmaschine _:bei 28 C, so erhält man eine Kulturbrühe, die in dem unten beschriebenen Hemmtest 3o F.I.P.-T.I.E/ml ergibt.'
Die Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1.---

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Die in den Beispielen 1 bis 6 erhaltenen Stoffe enthalten den Wirkstoff der Formel I, welcher aus diesen Stoffen nach üblichen Methoden isoliert werden kann. Da die Begleitstoffe nicht stören, können jedoch auch die Rohprodukte erfindungsgemäß verwendet werden.

Die enzyminhibitorische Wirkung des rohen Inhibitors kann mit folgender Testmethode bestimmt werden:

Trypsin- und Trypsinhemmtest nach F.I.P. - R. Ruyssen, Symposium on Pharmaceutical Enzymes and their Assay, Mai 24, 1968.

Reagenzien:

o,o2 m BAEE (N-C* -benzoyl-..-argininäthylester-hydrochlorid)

ο,οο 15 ei Borat-Puffer pH 8,σ o,1 η NaOH Trypsin 1oo P.I.P.-Einheiten/ml Inhibitor-Lösung

Ausführung:

Messung der Hemmung der esterolytischen Aktivität bei

konstanter Temperatur (25⁰C) und konstantem pH (8,o) im Auto-

titrator.

Definition der Einheit P.I.p.:

Eine Trypsin-Inhibitor-F.I.P.-Einheit wird definiert als die Menge (in mg), die vollständig eine F.I.P.Trypsin-Einheit hemmt (ausgedrückt als die Hydrolyserate eines Mikromols BAEE pro Minute).

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Claims

Patentansprüche

(V) Desodorierendes Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Proteinase-Inhibitor der Formel

HOOC-CH-NH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CHO . _:

4 (CH₂) ₃ Jm (ch₂)₃

.NH H,C CH, NH

I 3 3 ι

C=NH C=NH

I I

NH₂ NH₂

in reiner Form oder" als rohen Inhibitor, wie er ohne Feinreinigung "bei der mikrobiellen Herstellung anfällt.
2. Desodorierendes Mittel gemäß Anspruch 1, welches o,o5 bis 1o Gewichtsteil-e Proteinase-Inhibitor enthält.
3· Desodorierendes Mittel gemäß den Ansprüchen 1 und 2, welches o,1 bis 1 Gewichtsteil Proteinase-Inhibitor enthält.
4. Desodorierendes Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, welches den Proteinase-Inhibitor in roher Form enthält.
5. Desodorierendes Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, welches den Proteinase-Inhibitor in reiner Form enthält.
6. Verfahren zur Herstellung eines desodorierenden Mittels, dadurch gekennzeichnet, daß man den Proteinase-Inhibitor gemäß der Formel in Anspruch 1 in reiner Form oder als rohen Inhibitor mit Hilfsstoffen vermischt.

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Verfahren zur Verhinderung, Verringerung und/oder Beseitigung von unerwünschtem Körpergeruch, dadurch gekennzeichnet, daß man den Proteinase-Inhibitor gemäß der Formel in Anspruch 1 in reiner Form oder als rohen Inhibitor oder als desodorierendes Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 mit der zu desodorierenden menschlichen Haut in Berührung bringt.

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