DE2201991C2 - Verfahren zur Gewinnung von steroidalen Insektenhäutungshormonen - Google Patents

Description

a) das Gesamtkrisiallisat in destilliertem Wasser aufnimmt, wodurch Crustecdyson in die wäßrige Phase übergeht und ein wasserunlöslicher Rückstand A verbleibt, daß man den Rückstand A wiederholt bis zur praktisch vollständigen chromatographisch nachweisbaren Extraktion von Crustecdyson wäscht, die kombinierten wäßrigen Lösungen mit Methanol bis zu einer Methanolkonzeniration on bis zu 40 Vol.-°/o versetzt und dann auf '/5 des ursprünglichen Volumens einengt, das erhaltene Konzentrat kühlt, die ausfallende feste Fraktion C abtrennt, die flüssige Phase zur Trockne eindampft und den erhaltenen festen Rückstand mehrere Male aus einem Gemisch von Methanol und Aceton im Verhältnis 1:5 bis zum Erhalt von chromatographisch reinem Crustecdyson umkristallisiert,

b) den unlöslichen Anteil A in heißem reincii Methanol aufnimmt, wodurch beim Abkühlen eine Methanol-Lösung erhalten wird, die alles Ecdyson und gegebenenfalls restliches Crustecdyson neben einer unlöslichen Phase B enthaltend alles Makisteron A enthält, worauf man die so erhaltene methanolische Lösung zur Trockne eindampft und den Rückstand einer wiederholten Kristallisation aus destilliertem Wasser so unterwirft, bis man vollständig reines Ecdyson erhält.

c) die unlösliche Phase B wiederholt umkristallisiert und zwar beim ersten Mal mit reinem Methanol und bei den folgenden Maien mit Methanol enthaltend 1% Wasser bis zu chromatographisch reinem Makisteron A,

d) die Mutterlaugen aus den verschiedenen Kristallisationsstufen von c) vereinigt bei niederer Temperatur zur Trockne eindampft, den erhaltenen Rückstand auf einer Silica-Gel-Säule unter Verwendung von Chloroform enthaltend 5 bis 10 Vol.% Methanol als Eluens Chromatographien, die Eluate zur Trockne eindampft und den Rückstand aus Äthylacetat zu kristallinem Muristeron mit Fp (korrigiert) 227 his 230°C umkrisliillisiert.

Die Erfindung betriff die Herstellung von steroidalen Hormonen, die die Metamorphose von Insekten beeinflussen und steuern und die als biologische Insektizide verwendet werden können.

Von den erfindungsgemäß herstellbaren Insektenhäutungshormonen sind Crustecdyson (auch Ecdysteron genannt), Makisteron A und Ecdyson bereits bekannt, während ein weiteres Hormon, das Muristeron genannt und im folgenden näher definiert wird, bisher weder beschrieben noch identifiziert worden ist.

Crustecdyson, d. h. 20,30,14a,2OR,22R,25-Hexahydroxy-5j9-cholest-7-en-6-on der Formel:

HO OH

HO

wurde zum ersten Mal aus einer Crustai.ee, und zwar aus Jasus calandei (Chem. COM. 1966, Seite 37) in einer Menge von 2 mg reinem Hormon je Tonne Crustacee isoliert. Sein Vorhandensein wurde auch zusammen mit

jo Ecdyson in Bornbyx mori festgestellt. Es kommt auch im Insekt Antherea pernyi vor (200 mg aus 31 kg Puppen). Es wurde isoliert aus Podocarpus elatus Pflanzen, begleitet von Pflanzensteroiden als Verunreinigungen (Chem. Com. 1966, Seile 905), in einer Menge von 0,05% bezogen auf das Gewicht des pflanzlichen Materials (Chem. Com. 1968, Seite 971): es findet sich auch in P.macrophyllus (T. Lett, 1968, Seite 3883). Schließlich kommt es vor in Polypodium vuigare L (0,07%— 1,0% des Trockengewichtes) (Phytochemistry, 9,1247 (1970)). Makisteron A, 2j3,3/U4a,20R,22R,25-He?;ahydroxy-

24-methyl-5/?-cholest-7-en-6-on der Formel:
HO OH CH₃

OH

HO

wurde in Podocarpus macrophyllus in einer Menge bis zu 0,01% (T. Lett. 1969, Seite 3887) nachgewiesen.
Aus der Gruppe der Polyhydroxysteroide wurde das

Ecdyson der Formel:

OH

HO

OH

(III)

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als erstes isoliert und identifiziert (A, Butenandt, P. Karlson und Mitarbeiter, Ann. Chem. 662,1 (1963); dies war der Ausgangspunkt für weitere Forschungen hinsichtlich der Eigenschaften dieser Steroide und ihres Eingreifens in den Entwicklungszyklus von Insekten.

Während der vergangenen Jahre wurde in der Fachliteratur, insbesondere der Patentliteratur sine Reihe von Verfahren zur Herstellung dieser Hormone beschrieben. Das Hauptproblem blieb jedoch bisher ungelöst, nämlich die Herstellung in einer gewerblich annehmbaren Menge, d. h. in hohen Ausbeuten und zu erträglichen Gestehungskosten. Tatsächlich haben alle diese bisher bekanntgewordenen Verfahren den gemeinsamen Nachteil, daß sie außerordentlich kostspielig und darüber hinaus sehr beschwerlich sind.

Es ist weiter bekannt, daß man Insektenhäutungshormone aus bestimmten Pflanzen durch Extraktion mit Wasser und/oder Methanol oder Äthanol gewinnen kann (US-PS 34 33 814 und 35 27 777).

Der Erfindung liegt nun die Feststellung zugrunde, daß die eingangs genannten Insektenhäutungshormone als reine Substanzen und in Form eines teilweise gereinigten Extraktes in sowohl gewerblich als auch wirtschaftlich annehmbaren Mengen durch Extraktion aus Pflanzen der Familie Convolvulaceae, Untergruppe Ipomaea, Gattung Calonyction (choisy) Hallier f. gewonnen werden können.

Gegenstand der Erfindung ist das Verfahren gemäß den Patentansprüchen.

Die erfindungsgemäß für die Extraktion der steroidalen Insektenhäutungshormonen verwendeten Pflanzen kommen wild in gebirgigen und subtropischen Bereichen, insbesondere in der Sub-Himalaja-Zone (Indien) vor, wo sie von den Eingeborenen »Kaladana« genannt werden; diese Bezeichnung umfaßt in der Praxis eine Anzahl von miteinander nah verwandten Pflanzen, deren Identifizierung strittig ist. So heißt es in »Chopra's Indigenous Drugs of India«, U.M. Dhur and Sons Privae Limited, Calcutta, 1958 (Seite 51), daß Kaladana der wissenschaftlichen Bezeichnung Ipomaea hederacea entspricht.

Im Gegensatz hierzu wird in J. Pharm. Sc, VoI. 56, No. 6, Seite 771, 1967 im Kontext eines Artikels von Gupta und Mitarbeitern bekräftigt, daß Kaiadana der Name ist, unter welchem Ipomaea muricata üblicherweise bekannt ist. In »British Pharmaceutical Codex« 1949, Seite 459 wiederum heißt es, das Kaladana aus getrockneten Samen von Ipomaea hederacea besteht.

Die Pflanze Kaladana, die das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren ist gehört mit Sicherheit zu der oben angegebenen Familie, Untergruppe und Art und besitzt folgende charakteristische Merkmale:

Ein perennierendes Lianengewächs mit sehr langen sich verdrehenden odür verschlingenden Trieben, die sich verzweigen, krautartig aber an der Basis holzartig hart sind und ein oder zwei längs verlaufende Kerben oder Einschnitte aufweisen, welche dicht mit kurzen krautartigen Stacheln besetzt sind; diese Stacheln sind leicht abwärts gebogen, haben eine stumpfe Spitze und sind nicht stechend.

Verwandt mit C. muriciüum (L) G. Don unterscheidet sich die in Rede stehende pflanze durch die alternierend angeordneten herzförmigen, in eine Spitze auslaufenden Blätter, die weder gelappt noch pfeilspitzenförmig sind, einen leicht buchtig-grwellten Rand besitzen und größer sind: Die Länge beträgt bis zu etwa 25 cm und Hie Breite bis zu 22 cm: der Ltlattstiel ist etwa '/2 bis Vi so lang wie das Blatt, an der Basis leicht verbreitert und in diesem Bereich kaum behaart

Die Blüten sind zu 2 oder 3 auf einem achsel-ständigen Stengel angeordnet; die Blumenkrone ist ein länglicher konischer Tubulus von weißlicher Farbe, nicht so lang wie bei C. muricatum (etwa 7 cm), der Rand ist trichterförmig und gedreht, stumpf 5lappig mit einem Durchmesser von etwa 8 cm; der Farbton ist ein mehr oder weniger starkes Lila oder Rosa. Die Blume blüht zur Nachtzeit; Staubgefäße und Griffel ragen nicht aus dem Blütenhüllen-Tubulus heraus; der Kelch besitzt spitz zulaufende und aufgesetzte Lappen, die jedoch gepreizt oder weit sind, bis sie beim Reifen der Kapsel eiförmig-spitz zulaufend und leicht divergierend werden.

Die Kapsel hängt herab, ist eiförmig-spitz zulaufend und besitzt drei (2 bis 4) schwarze Samenkörner in Form eines Keils oder Einsatzes (die Außenfläche ist eiförmig oder oval und die Innenfläche eben oder planar); die Samenkörner jind fein flaumig-granulär und besitzen eine mittlere Länge von 7 mm und eine E.idte von 6 mm.

Die Pflanze kommt frei, d. h. wild in dem gebirgigen Sub-Himalaja-Bereich von Indien und Westpakistan bis zu Höhen von 150Om vor. Die aus den Samen bestehende Droge wird lokal als Abführmittel benutzt, das Pulver Nngegen als Antipyreticum.

Die Pflanze wird anhand der Zeichnung näher erläutert. In dieser zeigt

F i g. 1 einen Trieb der Pflanze mit Blättern und Blüten,

F i g. 2 die reifen Samen tragenden Kapseln, und

Fig. und 4 die Vorder- bzw. Seitenansicht eines Samens.

Für die Gewinnung der Insektenhäutungshormone wird von den Samen der Pflanze Kaladana ausgegangen, die reich sind an diesen Hormonen, die daher in beträchtlicher Menge und zu sowohl wirtschaftlich als auch technischgewerblich annehmbaren Gestehungskosten erhalten werden. Das Verfahren ist sehi einfach und schnell und gestattet die Isolierung der genannten Hormone in hohen Ausbeuten, beispielsweise 0,5 bis 1 % der frischen Samen und in einem außergewöhnlich hohen Reinheitsgrad.

Die aus dem Kaladana-Extrakt isolierte und identifizierte neue Substanz Murisieron besitzt die Struktur eines Polyhydroxysteroids; ihre Eigenschaften und Merkmale werden weiter unten näher erläutert.

Der bei dem Verfahren anfallende Kaladana-Extrakt weist zusätzlich zu seiner natürlichen Wirkung als starkes Antifraßmittel gegenüber Insekten eine sehr starke spezifische biologisch insektzide Aktivität und ein weites Wirkungsspeklrum auf.

Außer für den Schutz für Pflanzenkulturen können die erfir.'jUfigsgemäß gewonnenen Insektenhäutungshormone auch, wie an sich bereits bekannt, auf pharmazeutischem und veterinär-medizinischem Gebiet Verwendung finden. Bei Versuchen im freien Feld zeigte sich, daß Lösungen enthaltend 0,1 bis 0,2% Gesamtkristallisat die gewünschte insektizide und Kulturpflanzen schützende Aktivität gegenüber Schadinsektenarten besaß, die verschiedenen Klassen angehörten wie Lepidopteren (insbesondere Pieris brassicae und Eombyx mori) und Coleopteren (insbesondere Doriphora decemlineata).

Für das e^rfindungsgemäß durchzuführende Extraktionsverfahren werden die Samen zunächst an der LuIt oder auf andere geeignete Weise getrocknet und dann zu einem schrotartigen Mehl vermählen, aus dem in

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einer ersien Verfahrcnsstiife ohne Erwärmen mil llilfe eines Kohlen wasserstoff-1.ösi ι iigsmi I IeIs. vorzugsweise l'etrolätlier oder l.igroin (Siedebcreich 80 bis 90 C) this enthaltene Fett abgetrennt wird.

Der Rückstand wird dann erschöpfend mit einem Gemisch aus einem aliphatischen Chlorkohlenwasserstoff. einem aliphatischen Alkohol und einer stickstoffhaltigen Base extrahiert. Diese Extraktion wird vorzugsweise mehrere Male bei Raumtemperatur und unter Rühren und schließlich mit dem aliphatischen Chlorkohlenw assersioff allcine. gleichfalls unter Rühren und bei Raumtemperatur wiederholt.

leder Extraklionslauf dauert im Falle eines diskontinuierlichen Verfahrens etwa 12 Stunden: in jedem Falle wird die Extraktion als beendet angesehen, wenn sich der letzte Extrakt im Libermann Test für den Nachweis von Steroiden als negativ erweist. Selbstverständlich kann die Extraktion auch kontinuierlich durchgeführt werden unter Anwendung der jedem Fachmann geläufigen Verfahrensweise.

Die kombinierten Extrakte werden im Vakuum bei Temperaturen nicht über 40" C eingeengt und stehengelassen. Aus dem Konzentrat scheidet sich ein kristallines Produkt ab, das im folgenden Gesamtkristallisat T genannt wird und die gewünschten Hormone enthält.

Das Exiraktionsgemisch setzt sich zusammen aus:

beschrieben wurde. Die neue Substanz folgende Eigenschaften charakterisiert:

wird durch

a) einem chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform; es können aber auch Kohlenstofftctrachlorid. Methylenchlorid oder Trichloräthvlen Verwendung finden;

b) einen aliphatischen Alkohol enthaltend 1 bis 4 Kohlenstoffatome, vorzugsweise Methanol, urd

c) einer stickstoffhaltigen Base aus der Gruppe Ammoniak und Amine.

Das Verhältnis der verschiedenen Komponenten des Extraktionsgemisches zueinander hängt von diesen Komponenten selbst ab: Im Falle Chloroform/Methaiiol.'Ammoniak beträgt das Verhältnis 9:0.1:0.1 Volumina.

Um die im Gesamtkristallisat T enthaltenen steroidalen Hormone zu identifizieren, wurde das Kristallisat mit wenig kaltem Chloroform gewaschen und dann getrocknet und analysiert. Die chromatographische Analyse wurde auf einer dünnen Schicht aus Silicagel G durchgeführt unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Äthanol und Wasser (80:19:1) als Entwicklungssystem und von Vanillin-Schwefelsäurereagens zum Sichtbarmachen der Flecken nach Erhitzen auf !20"C während 10 Minuten; dabei zeigte sich, daß der oben genannte kristalline Niederschlag eine Anzah! von Verbindungen enthielt, von denen sich zwei als Crustecdyson und Makisteron erwiesen. Unter anderem wurden erhalten: Ein blauer Fleck mit Rk = 0,22, ein violetter Fleck mit R_F = 0.20, charkteristisch für Makisteron A und ein gelber Fleck Rf = OJ 5. der charakteristisch ist für Crustecdyson.

Im Zusammenhang mit dem blauen Fleck wurde festgestellt, daß im Gesamtkristallisat T zusätzlich zu Crustecdyson und Makisteron A noch andere polyhydroxylierte Sterine vorhanden sind, unter denen in wesentlichen Mengen sowohl das Ecdyson als auch die neue Substanz Muristeron festgestellt wurde.

Muristeron gehört zu derselben Familie von steroidalen Insektenhäutungshormonen, wie sie bereits oben

1. IR-Ahsorptionsspekirum in KIIr zeigt charakteristische Banden bei JbOO bis 5200. inbO und Id)O cm ':

2. das UV-Absorptionsspektrum in Methanol zeigt A...„ = 2 5") nm(f = W)O);

J. das optische l)rehungs\envngen betragt [λ] = + 49.b ±1 . (Konzentralion _t -1.02 in Pyritlin).

Behandelt man die Substanz mit Aceton in Gegenwart einer kleinen Menge eines Saiirekatalys.itors wie Phosphorniolybdänsäure. so erhält man ein Gemisch aus Mono- und Diacetonid. das sich chromatographisch mit einer Silicagel-Säule trennen läßt, indem mit Chloroform-Äthanol zunächst im Verhältnis 99 : I und

UiIIlIl MTI VCIIIdlllll.t to.). I./ CIIIH-II «Vim. iviii iiClM

Elutionsmittel im Verhältnis 99 : I wird das Diacetonid erhalten, das beim Acetylicren mil Essigsäureanh>drid in I'yridin ein Diacetonid-monoacetat liefert, das hei 20H bis 214¹X (Kofier) nach Umkristallisieren aus Hexan schmilzt. Wird mit C'hloroform-Äihanol im Verhältnis

ji 98.5 : 1.5 eluiert. so erhält man das Monoacetonid. das in gleicher Weise acetyliert wird, wobei man ein Gemisch aus Monoacetonid-lriacelat und Motioa. c- "iid diaiet.it erhält. Dieses Gemisch wird au AL-O _t chromatogr.; pinen und mit Chloroform-Äthanol 9M _: j und dann im: in Chloroform-Äthanol 98.5 : 1,5 eluiert. Im ersteren Falle erhält man das M.inuacetoniii-triacetai. Ip 255 bis 260"C (Kofier) nain Umkristallisieren aus Ättnlaceta'.-Hexan. im leizieren Fa!k· das Monoaceionul-diaceia:. Fp !40 bis 144 C (Kofier) nach Umkristallisieren aus

H llcan.

Die eingangs genannten Insektenhäutungshormone lassen sich auf schnelle und zweckmäßige Weise isolieren. Dazu wird das Gesamtkristailisat T chrom.·.tographisch auf einer dünnen Schicht getestet (Lösungs-

4Ii mittelsysiem: Methylenchlorid 25. Methanol 5. Benzol 5: j°/o Vanillin in Alkoholreagens + 0.5 cm¹ H:SOi bei 120 C 10 Minuten) und dann dem Auftrennungsverfahren unterworfen, welches auf der unterschiedlichen Löslichkeit dieser Substanzen in Wasser und organi-

4i sehen Lösungsmitteln beruht Beim Aufnehmen des alkaloidfreien Gesamtkristallisats T mit destilliertem Wasser gegebenenfalls unter Erhitzen, ging das Crustecdyson (Ecdysteron) in wäßrige Lösung. Diese Maßnahme wurde mehrere Male wiederholt bis ein Dünnsehichtchromatographie-Test anzeigte, daß die Intensität des gelben Fleckes von Crustecdyson in der wasserunlöslichen Fraktion A verringert worden war. bis dieser endgültig schwächer wurde als der violette Fleck von Makisteron und als der biaue Fleck.

Zu der mi; Crustecdyson (Ecd\stcron) angereicherten wäßrigen Lösung winde Methanol gegeben bis eine Methanoikon/entrnü-"-n von 40 VoL-⁰O erreicht worden war; die^e wäßrig alkoholische Lösung wurde dann auf 1'5 des ursprünglichen Volumens eingeengt. Nach dem Abkühlen schied sich eine Fraktion aus. die Makisteron A und Crustecdyson in beinahe gleichen Menge enthielt, wie dies der Dünnschichtchromatographie-Test ergab, der wie oben beschrieben, durchgeführt wurde. Diese Produkt C wurde aus dem Konzentrat abfiitriert Die Mutterlaugen wurden bei niederer Temperatur zur Trockne eingedampft und der Rückstand wiederholt aus einem Methanol-Acetongemisch (1:5) umkristallisiert, bis er sich ais chromatographisch

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rein erwies. D.is auf diese Weise erhaltene C rustecd\son (t-.cdysteron) schmolz bei 239 bis 242 C unter /erset/ung. [\] = ■<■ 59 ± I (c- I in Methanol). Mil überschüssigem F.ssigsaureanhvdrid in kaltem Psridin wurde daraus ein Acetvlderivat mit Ip 153 bis 157 C erhalten.

Der wasserunlösliche Rückstand Λ. der noch mit Wass·'· vollgesogen war. wurde mit heißem reinem Methanol aufgenommen. Heim Abkühlen auf Raumtemperatur wurde- die unlösliche Phase B auf einem Filter gesammelt. Das wäßrig-ineihanolische i-'i'irat enthielt beim Dünnschichtchromatographie-Test das restliche Crustecdvson. das sich im wasserunlöslichen Rückstand aus dem Gesamtkristallisat befunden hatte zusammen mil Ecdyson. Die weitere Reinigung von Ecdyson wurde aufgrund seiner geringeren Wasserlöslichkeit durchgeführt. So ließ sich durch einfaches und wiederholtes Umkristallisieren aus destilliertem Wasser vollständig reifes Ecdyson erhöhen. Diese S'.i^stüi*/ besaß folgende physikalische und chemische Kenndaten:

Fp 160— 1 b3ⁿC: die geschmolzene Substanz wurde wieder fest und schmolz erneut bei 230 bis 240" C.

[i] = +65.7" ± I (C= 1,033 in Äthanol)

λ,,,.,, = 242 nm (log f = 11 960): nach Behandeln mit heißen Säuren während 1 h traten 2 neue Absorptionsbanden bei 244 und 297 nm auf.

A (KHr

3650 i 11 ><>. 1650. 1450. I 385. 1055.880 cm .

Be'. ι Behandeln von I dyson mi; überschüssigem kalten¹ Essigsaureanhvdnd in Pvridin wurde ein Triaceivlderivat mit Fp 85 bis 95 C erhalten.

Darauf wurde aus der unlöslichen Phase 15 das reine Makisteron A abgetrennt durch wiederholtes Umkristallisieren des Rückstandes zunäeh>t aus Methanol alkine und dann bis zur chromaiographischcn Reinheit aus Methanol enthaltend ΓVo Wasse\ Das auf diese Weise erhaltene Makisteron A schmolz bei 258 bis 260 C: [λ] =+65^c±r (V = 0.5 Methanol). Auch Makisteron A gab beim Behandeln mil Essigsäurcanhydnd in Pyridin ein Acetylderivat mit Fp 237"C Die Mutterlaugen aus den verschiedenen Kristallisationsstufen wurden vereinigt und bei niederer Temperatur zur Trockne eingedampft (D). Der Rückstand D wurde mit dem Rückstand C vereinigt, das Ganze in Methanol gelöst, die Methanollösung im Vakuum bei niederer Temperatur zur Trockne eingedampft und der so erhaltene Rückstand E einem neuen Auftrennungsverfahren unterworfen oder mit einem neuen Anteil Gesamtkristallisat T vereinigt.

Alternativ hierzu können auch die Rückstände D und C zur Extraktion weiterer, im Kristallisat T enthaltener polyhydroxylierte Steroide als reine Substanzen verwendet werden.

Die chromatographische Untersuchung des Rückstandes D wurde wie oben beschrieben durchgeführt und ergab einen grün gefärbten Fleck mit Rf-Wert etwa 0,23. der das Vorhandensein einer neuen Substanz nämlich Muristeron anzeigte. Es wurde festgestellt, daß sich diese Substanz aus dem Rückstand D chromatographisch mit Hilfe einer Kieselgel-Säule abtrennen ließ und in den Fraktionen eluiert mit Chloroform enthaltend 5 bis 10 VoI.-°/o Methanol enthalten war.

Durch Eindampfen dieser Eluate zur Trockne wurde ein Rückstand erhalten, der beim Umkristallisieren aus Äthylacetat ein kristallines Produkt ergab mit Fp (korrigiert) 227 bis 230⁰C, das sich leicht in Wasser löste und der empirischen Formel ('_>;l I u'>-■ entsprach.

Muristeron gab beim Behandeln mit l'ssigsaiireanhvtiritl in Pyridin ein Telraacelyldcrivat. das beim Kristallisieren aus Älhylacctat-Hcxan (I :1) einen korrigierlen Schmelzpunkt von 236 bis 238" C besaß.

Beispiel I

Kaladanasamcn (20 kg) wurden in einer Scheibenmühle mit Siebtcii enthalten 30 Löcher je cmvermählen. Das gemahlene Rohmaterial wurde durch Extraktion mil kaltem l.igroin (Siedebereich 60 bis 90^rC) entfettet. Drei aufeinanderfolgende Extraktionen reichten aus. wobei jeweils mil 35 I Benzin unter Rühren 5 Stunden lang extrahiert wurde. Das entfettete Material wurde dann unter Rühren 2mal nacheinander mit 60 I eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und wäßrigem Ammoniak im Volumenverhältnis 9 :0,9 :0.l extrahiert, jede F.xtraktionsstufe dauerte 12 Stunden, Atf

t ir»η wjirrlf»

imlpmnprahir vnriipnnm.

Darauf wurden 2 aufeinanderfolgende Extraktionen durchgeführt, von denen jede 3 Stunden dauerte, gleichfalls unter Rühren, mit 50 I Chloroform. Diese Stufe wurde wiederum bei Raumtemperatur durchge-

r. führt.

In jedem Falle wurde der Extrakt vom Feststoff durch Filtrieren unter verwundertem Druck abgetrennt.

Alle Extrakte wurden vereinigt und unter vermindertem Druck bei Temperaturen nicht über 40 t

s" eingeengt, bis auf ein Volumen von 10 I. Daraufhin ließ man d.>s Konzentrat einige Tage in einem Kühlschrank stehen, bis sich kein Kristallisat mehr abschied. Das Kristallisat wurde abirenutscht. auf dem Filter mit wenig Chloroform und Mann mit Petroläther gewaschen und ·η

Γι Vakuum getrocknet. Durch Einengen der Mutterlaugen und erneutes Stehenlassen im Kühlschrank wurden weitere Anteile Rohprodukt erhalten. Die Ausbeute betrug 140 g.

Die Analyse mittels Dünnschichtchroinatographic

»ι. (Silicagel G) unter Verwendung von Chloroform-Äthanol-Wasser (80:19:1) als Lösungsmittel und von Vanillin-Schwefelsäurereagenz als Fleckendetektor unter Erhitzen auf 120⁰C während 10 Minuten zeigte die oben näher beschriebenen Flecken mit Rf-Worter. 0,22

4, (blau). 0.20 (violett) und 0,15 (gelb).

Beispiel 2

120g Gesamtkristallisat T, erhalten nach Beispiel I, wurden in 1000 cm¹ (1 I) destilliertem Wasser aufgeschlämmt; die Aufschlämmung wurde 1 Stunde lang bei einer Temperatur von 25°C gerührt und dann abgesaugt. Das Filtrat wurde zur Seite gestellt und der Filterkuchen weiteren aufeinanderfolgenden Behandlungen mit Wasser unter denselben Bedingungen unterworfen. Für jede Behandlung wurden wiederum !000 cm³ Wasser verwendet.

Nach der vierten Behandlung ergab die Dünn Schichtchromatographie, wie oben durchgeführt, daß der gelbe Fleck von Crustecdyson im Kuchen (10 g)

b'.i endgültig schwächer war als der violette Fleck für Makisteron A und der blaue Fleck für Ecdyson.

Die vereinigten wäßrigen Filtrate (4000 cm^J) wurden mit Methanol (1600 cm³) versetzt und diese Lösung im Vakuum bei einer Temperatur von maximal 35°C auf ein Volumen von etwa H00cm^J eingeengt. Das Konzentrat wurde auf einem Eisbad abgekühlt und das ausgefallene kristalline Produkt (30 g) auf einem Filter gesammelt.

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Dieses Produkt C wurde mittels Diinnschichlchromatographic untersucht: Ks setzte sich zusammen aus Makisteron Λ und Crusiecdyson. Die Mutterlaugen von C wurden dann im Vakuum hei Temperaturen nicht über 35" C zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde ". mehrere Male aus einem Gemisch aus Methanol und Aceton I : 5 umkristallisiert, bis das kristalline Produkt chromatographisch rein war. Das auf diese Weise erhaltene Cru?te.cdyson (Ecdysteron) besaß die oben angegebenen physikalischen und chemischen lügen- m schäften.

Der wasserunlösliche Rückstand aus dem Gesamtkristallisat T wurde noch wasserfeucht auf einem Wasserbad bei 50"C mit Methanol aufgenommen und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Niederschlag π wurde auf einem Filter gesammelt (B). Das methanolische Filtrat zeigte bei der chromatographischen Untersuchung, daß es Crustecdyson und Ecdyson enthielt. Zur Abtrennung von Ecdyson wurde das Filtrat bei niederer Temperatur (35"C) im Vakuum zur :n Trockne eingedampft und der Rückstand wiederholt aus destilliertem Wasser umkristallisiert. Es waren mindestens 3 Kristallisationen notwendig, um ein chromatographisch reines Produkt zu erhalten. Für 7,5 g Rückstand wurden 1500 cm^J Wasser benötigt. 2"»

Zur endgültigen Reinigung wurde das Produkt nach dem Trocknen im Vakuum aus Äthyhicetat umkristallisiert. Das so erhaltene Ecdyson schmolz bei 230 bis 24O⁰C und besaß die weiter oben genannten chemischen und physikalischen Eigenschaften. m

Die unlösliche Phase B, etwa 15 g, wurde zunächst aus 50 cm³ Methanol und dann aus Methanol enthaltend I Vol.-% Wasser bis zur chromatographischen Reinheit umkristallisiert. Das so erhaltene Produkt war Makisteron A. Es besaß alle chemischen Charakteristika, die r> oben angegeben wurden. Die Mutterlaugen wurden vereinigt und im Vakuum bei Temperaturen unter 35"C zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rückstand D wurde mit dem Rückstand C vereinigt; das Ganze wurde in Methanol gelöst und die methanolische Lösung in Vakuum bei niederer Temperatur zur Trockne eingedampft; der erhaltene Rückstand E wurde dann einer neuen Auftrennungsstufe untenvorfen oder mit einem neuen Anteil Gesamtkristallisat Ti vereinigt.

Der Rückstand D (21 g) vermischt mit 50 g Silicagel (Korngröße 0,05 bis 0.2 mm) wurde in eine Säule aufgegeben, die mit 600 g desselben Silicagei vorbereitet worden war. Zunächst wurde mit Chloroform-Methanol 95 :5 eluiert und der Trocknerückstand dieses Eluates verworfen. Die anschließenden vier Fraktionen, so eluiert mit Chloroform-Methanol 90:10 (11) gaben einen Rückstand, der entsprechend der Dünnschichtchromatographie die neue, sich durch einen grünen Flecken anzeigende Substanz enthielt. Diese Substanz wurde erneut auf einer frisch wie oben bereiteten Säule Chromatographien, bis sie rein war, wobei jeweils nur mit Chloroform-Methanol 95 :5 eluiert wurde. Die neuen Eluate wurden zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Äthylacetat umkristallisiert; das kristalline Produkt, Muristeron, schmolz bei 22? bis 230⁰C so (korrigiert);

IR(KBr): 3600-3200; 1660:1630 cm-'

UV(CH₃OH) 236 nm; D. 0.0,994,52,58 ml

(ε=9050).

[α] > = +49,6° ± 1° (c= 1,02;Pyridin). b5

10

Beispiel 3 L rust ecdyson-Triaeet at

0.15 g Crustecdyson (Ecdystcron) gemäß Beispiel 2 wurden in 5cm¹ wasserfreiem Pyridin gelöst und nut 2 cm¹ Essigsäurcanhydrid bei Raumtemperatur 24 Stunden lang behandelt. Die Lösung wurde in Hiswasser ausgegossen und der Niederschlag auf einem filter gesammelt, getrocknet und wiederholt aus Äthylacetat·' η-Hexan umkristallisiert. Erhalten wurden 0.056 mg eines kristallinen Produktes mit Fp I5J bis 157 C das sich als Ecdysteron -Ti iacetat erwies.

Analyse	für CnI I	HjO	C 63.64.	H	8.36%:
Gefunden			C 63.46.	H	8.33%.
Berechnet
	ι-,„o,o ■

[λ] = +59" ± Γ (V= 1. Methanol) (Aust. |. Chem.. 22. 1045(1969);

Fp= 198.5"C-WX für das Hemihydrat. M -59').

Beispiel 4 Makistcron-Triacetat

0,2 g Makisteron gemäß Beispie! 2 wurden wie oben für Crustecdyson beschrieben behandelt. Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat/n-Hexan wurden 0.15 g Makisteron-Triacetat erhalten. Fp 237 X (Tet. Lett. 3883 (1966). 210 — 213).

Analyse

Gefunden

Berechnet für CmH^O₁₀ C 65.38. H 8,40%;

[λ] = + 74-' ± 1 (C= I. Methanol) C 65,80, H 8.38%.

Beispiel 5 Ecdyson-Triacetat

0.10 g Ecdyson aus Beispiel 2 wurden wie oben beschrieben behandelt.

Der feste Rückstand wurde auf Silica-Gel Chromatographien unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (99:1) als Eluens. Die einzelnen Fraktionen wurden kombiniert und aus Hexan umkristallisiert; erhalten wurden 45 mg einer amorphen Substanz, die bei 85 bis 95°C schmolz.

Beispiel 6 Muristeron-Tetraacetat

300 mg Muristeron aus Beispiel 2 wurden in 4 cm³ wasserfreiem Pyridin gelöst und mit 2 cm³ Essigsäureanhydrid versetzt; das Ganze wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wurde in überschüssiges Wasser ausgegossen, der Niederschlag abgetrennt, getrocknet und chromatographisch auf einer Silica-Gel-Säule (Korngröße 0,05 bis 0,2 mm) gereinigt; eluiert wurde mit Chloroform-Methanol 98 :2. Der beim Eindampfen der Eluate erhaltene Rückstand wurde aus Äthylacetat-Hexan 1 :1 umkristallisiert; die kristalline Substanz schmolz bei 236 bis 238°C. Das IR-Spektrum in KBr zeigte charakteristische Banden bei 3600 bis 3300, 1740, 1720, 1680 und 1250 cm-'.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

22 Ol Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von steroidalen Insektenhäutungshormonen durch Extraktion aus pflanzlichen Stoffen, dadurchgekennzeichnet, daß man Samen von Pflanzen der Gattung Calonyction (Choisy) Hallier F, Untergruppe Ipomaea, Familie Convolvulaceae zu einem groben Mehl vermahlt, mit einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel entfettet und mit einem Gemisch aus einem aliphatischen Chlorkohlenwasserstoff, einem aliphatischen Alkohol enthaltend 1 bis 4 Kohlenstoffatome und einer stickstoffhaltigen Base extrahiert und die extrahierten Fraktionen einengt, wäscht und einen kristallinen Rückstand (Gesamtkristallisat) abtrennt.

2. Verfahren zur Gewinnung von Crustecdyson, Ecdyson, Makisteron A und einem weiteren bisher noch nicht bekannten Sterin, das Muristeron genannt wird, aus dem gemäß Anspruch 1 erhaltenen Gesamtkristallisat, dadurch gekennzeichnet, daß man