DE2262427C3

DE2262427C3 - Immunostimulierendes Mittel

Info

Publication number: DE2262427C3
Application number: DE2262427A
Authority: DE
Inventors: Robert Paris Fauve
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1971-12-24
Filing date: 1972-12-20
Publication date: 1980-04-24
Also published as: FR2164510B1; IL41120A; CA991543A; DE2262427B2; DE2262427A1; GB1419969A; CS190380B2; ZA728959B; DK137887C; NL7217588A; PL89687B1; AR195897A1; BE793260A; SU592333A3; DK137887B; JPS4868729A; ES410435A1; IL41120A0; FR2164510A1

Description

Die Erfindung betrifft ein immunostimulierendes Mittel, d. h. ein Mittel, das in unspezifischer Weise die Widerstandsfähigkeit des menschlichen und tierischen Organismus gegenüber verschiedenen pathogenen Einflüssen, z. B. gegenüber Viren, Bakterien oder Parasiten, steigert, ohne daß eine Antigen-Beziehung zwischen dem Stimulans und dem infektiösen Erreger besteht.

Es ist bereits eine Anzahl von Verbindungen und Substanzen bekannt, die Bestandteile derart unspezifisch wirksamer immunostimulierender Mittel sind. Ihre therapeutische Anwendung in der Human- oder Tiermedizin kam jedoch bisher koam in Betracht, da sie einerseits außerordentlich toxisch sind und andererseits mit beträchtlicher Verzögerung wirksam werden.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein immunostimulierendes Mittel zu schaffen, das zugleich äußerst aktiv und kaum toxisch ist und in kürzester Frist seine Aktivität entfaltet.

Gegenstand der Erfindung ist daher das im Patentanspruch definierte Mittel.

Das immunostimulierende Mittel der Erfindung läßt sich mit im wesentlichen gleichbleibenden Eigenschaften aus äußerst verschiedenen Zellen gewinnen, so etwa aus den Milzzellen der Maus, die gegebenenfalls mit Listeria monocytogenes infiziert sind, aus Ehrlich-Ascites-Zellen oder Bakterienstämmen, wie Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Escherichia coli K 12, Corynebacterium parvum und anderen. Es läßt sich sowohl aus pathogenen Bakterien (Vibrio cholera, Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium) als auch nichtpathogenen Bakterien (Escherichia coli K 12, Corynebacterium parvum), grampositiven Bakterien (Listeria monocytogenes) als auch gramnegativen Bakterien (Salmonella typhimurium, Escherichia coli K 12 und Vibrio cholera), aeroben Bakterien (Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Escherichia coli K 12, Mycobacterium tuberculosis) als auch anacrohcn Bakterien (Corynebacterium parvum) extrahieren. Ferner läßt es sich aus Bacillus subtilis gewinnen.

Dhgcgcn gelingt es nicht, das immunostimulicrende Mittel der Erfindung aus anderen tierischen Zellen als Milzzellen herzustellen, Eine mehr hypothetische Erklärung besteht darin, daß sich die Aktivität der Milzextrakte gegen solche in den Blutkreislauf gelangten Bakterien richtet, die auf der Stufe der MiIz-Makrophagen blockiert werden.

Diese Bakterien sollten normalerweise auch durch Leber-Makrophagen zurückgehalten werden. Es ist jedoch bekannt, daß mikrobielle Antigene durch Leber-Makrophagen zerstört werden, während sie von

ίο Milz-Makrophagen nicht angegriffen werden.

Eine Suspension des immunostimulierenden Mittels in einer Trägerflüssigkeit, wie sie üblicherweise für injizierbare Suspensionen verwendet wird, stellt eine geeignete Anwendungsform dar. Diese Suspen-

|5 sionen enthalten das immunostimulierende Mittel in genügend kleiner Teilchengröße, insbesondere kleiner als 20 μπι, um eine einwandfreie Injektion zu gewährleisten, vorausgesetzt, daß keine Kontraindikation vorliegt.

Als injizierbare Trägerflüssigkeit verwendet man zweckmäßig 8,5%o Natriumchloridlösung. Die erhaltene Suspension homogenisiert man derart, daß die in der wäßrigen Lösung enthaltenen Feststoffteilchen auf eine für die Injektion in den menschlichen oder tierischen Organismus geeignete Größe gebracht werden.

Beim Gefriertrocknen dieser Suspension fällt ein gelblicher hygroskopischer Feststoff an, der an der Luft in sich zusammenfällt und eine pastöse Masse

ίο ergibt. Der Rückstand kann in Chloroform aufgenommen werden.

Am besten werden die Chloroformlösung und die injizierbare wäßrige Lösung in einem Volumenverhältnis vermengt, daß die schließlich erhaltene wäß-

r> rige Suspension etwa 105 bis 275 meg Trockenbestandteile/ml enthält.

Um z. B. ein immunostimulierendes Mittel aus:
Mäuse-Milzzellen;
mit Listeria monocystogenes (Serotyp I, Nr. 54.149 der Collection de !'Institut P.-.iteur) infizierten Mäuse-Milzzellen;

Listeria monocytogenes (des vorstehend genannten Stammes);
Salmonella typhimurium (Stamm C 5 der Collection

4-ί de !'Institut Pasteur);

Escherichia coli K 12 (Stamm Nr. C 600 der Collection de !'Institut Pasteur);

Corynebacterium parvum (Stamm Nr. 936 B der Collection de !'Institut Pasteur);

>o Mycobacterium tuberculosis (Stamm BCG des Institut Pasteur);

Vibrio cholera (Stamm des Institut Pasteur) oder
Bacillus subtilis
herzustellen, verfährt man z. B. folgendermaßen:

v» Das Ausgangsmaterial wird pro Volumenteil mit 10 Volumenteilcn eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (1:1) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird hierauf 2 Stunden bei +4° C in einer Mühle homogenisiert und anschließend 20 Minuten lang bei

w) 3500 g zentrifugiert. Der Überstand wird abgehebert und in einem Kolben bei 40" C im Wasserstrahlvakuum eingedampft. Hierauf füllt man den Kolben mit der, bezogen auf die Ausgangssubstanz, doppelten Chloroformmengc und läßt ihn 30 Minuten bei

ι.·, 40 UpM rotieren. Anschließend wird die Chlornformlösungdurch Whatman Nr. 3-Papier filtriert. Das Filtrat mit dem gewünschten immunostimulierenden Mittel kann in einem Ulasgcfäß bei +4" C aufbc-

wahrt werden.

Die Bestandteile des immunostiinulierenden Mittels der Erfindung sind in Chloroform löslich, jedoch in Wasser unlöslich. Dennoch kann man, ausgehend von der genannten Chloroformlösung, eine injizierbare Suspension nach folgendem Verfahren herstellen: Ein bestimmtes Volumen der Chloroformlösung wird in ein Rohr eingefüllt und mit einem bestimmten Volumen einer pyrogen-freien 8,5%o Natriumchloridlösung versetzt. Hierauf leitet man in das Flüssigkeitsgemisch ein gegenüber den Bestandteilen inertes Gas, zweckmäßig Stickstoff oder ein Gemisch aus 95% Luft und 5% Kohlendioxid. Dies geschieht mit Hilfe eines im Inneren des Rohres in die Chloroformphase reichenden Glasrohres, wobei das Gas so lange eingeleitet wird, bis alles Chloroform vertrieben ist. Das ursprünglich in der Chloroformlösung enthaltene immunostimulierende Mittel wird im Verlauf dieses Prozesses in der wässerigen Phase suspendiert. Anschließend homogenisiert man die Suspension, um die suspendierten Teilchen zu verkleinern, was im Labor üblicherweise mit einer Spritze geschieht, deren Nadel einen Innendurchmesser von 0,4 mm aufweist. Hierbei wird die Suspension solange angesaugt und wieder verdrängt, bis sie keine Teilchen mit einem Durchmesser von mehr als 20 μπι mehr enthält. Eine derartige Suspension opalesziert.

Mit Hilfe der Suspension werden die nachstehenden pharmakologischen Versuche an Mäusen durchgeführt, wobei die Tiere einerseits vom Stamm N.CS. des Service de Pathologie Experimentale de !'Institut Pasteur und andererseits vom Centre d'elevage du CNRS d'Orleans la Source stammen. Es werden Tiere beiderlei Geschlechts eingestzt, die 3-5 Wochen alt sind und ein Körpergewicht von 15 bis 20 g besitzen.

Die im folgenden beschriebenen Ergebnisse werden bei der intravenösen, subkutanen oder intraperitonealen Injektion von jeweils 0,5 ml der genannten Suspension erzielt. Die Injektionen hatten weder unmittelbar noch nach 5 Monaten sichtbare toxische Auswirkungen.

A. Schutz der Mäuse gegen Listeria monocytogenes- und Salmonella typhimurium-lnfektipnen

Die Infektionen werden mit Hilfe des Stammes Listeria monocytogenes (Serotyp I, Nr. 54.149 der Collection de !'Institut Pasteur) und des Stammes Salmonella typhhaurium (Stamm C 5 dor Collection de !'Institut Pasteur) an Mäusen hervorgerufen, denen vorher zum Teil intravenös, zum Teil intraperitoneal jeweils 0,5 ml von Suspensionen immunostimulierender Mittel verschiedenen tierischen und bakteriellen Ursprungs injiziert wurden. Außerdem wird eine Kontrollgrtppe von Mäusen infiziert.

Die vorher intraperitoneal mit dem immunostimulierenden Mittel behandelten Mäuse widerstehen einer Listeria monocytogenes-Dosis, die der lOfachen letalen Dosis (LD₃₀) desselben pathogenen Erregers bei der Kontrollgruppe entspricht. Die intravenös behandelten Tiere sind sogar gegenüber der 75fachcn letalen Dosis des pathogenen Erregers resistent.

In ähnlicher Weise überstehen die vorher intravenös mit dem immunostimulierenden Mittel behandelten Mäuse die 20fache Menge der bei der Kontrollgruppc ermittelten LD₅₀ des pathogenen Erregers Salmonella typhimurium. Die Schutzwirkung läßt sich hei oraler Verabreichung an die Mäuse noch wesentlich steigern. In diesem Falle überstehen sie eine Dosis des pathogenen Erreger, die der lOOfachcn letalen Dosis bei der Kontrollgruppe entspricht.

Die Schutzwirkung tritt bei Mäusen sogar dann auf, wenn diese nur 3 Stunden vor der Infektion mit dem immunostimulierenden Mittel behandelt werden. Der Schutz ist auch noch nach 30 Tagen gegeben.

B. Einfluß der intraperitonealen Injektion eines aus Listeria monocytogenes extrahierten immunostimulierenden Mittels auf das Gewicht von Milz und Thymusdrüse sowie auf die peritonealen Zellen.

Die Versuche werden mit 5 Wochen alten N.C.S.Mäusen durchgeführt.

1. Gewicht der Milz: Die Injektion des Mittels hat im Zeitraum von 2 Stunden bis 4 Tagen nach der Behandlung keine Veränderung des Milzgewichts zur Folge.

2. Gewicht der Thymusdrüse: Es wird ebenfalls keine Gewichtsveränderung festgestellt.

3. Quantitative und qualitative Veränderung der peritonealen Zellen: Zur Untersuchung der ZeI-

-^u ien läßt man zunächst die Mäuse ausbluten und injiziert hierauf in die Bauchhöhle 5 ml eines Gemisches aus 2% Rinderalbuni in und 5 Einheiten Heparin pro ml nach dem in Science, Bd. 160, S. 795 (1968) beschriebenen Verfahren. Hierbei kann folgende zeitliche Veränderung der Anzahl von Makrophagen, Polynuklearzellen und Lymphozyten festgestellt werden:

a) Makrophagen: Die Anzahl sinkt zunächst auf 50%, steigt jedoch nach 24 Stunden und hält sich

^J0 dann auf einem gegenüber den Kontrolltieren höheren Wert. Der Makrophagen-Anteil (Prozentsatz der gefundenen Makrophagen) nimmt innerhalb 24 Stunden nach der Injektion des immunostimulierenden Mittels zu und liegt bis zum

^r' vierten Tag relativ hoch.

b) Polynuklearzellen: Sie werden erst nach 24 Stunden in der Bauchhöhle nachgewiesen, wobei ihre Anzahl leicht erhöht ist.

c) Lymphozyten: Nach leichter Abnahme 'Heigt ihre Anzahl innerhalb von 3 Tagen nach der Injektion beträchtlich.

B:i dieser Untersuchung fällt vor allem auf, daß der prozentuale Makrophagen-Anteil nicht abnimmt und daß die peritonealen Makrophagen sogar 4 Tage

■'"' nach der Injektion keine nennenswerte Zunahme der Anzahl ihrer Lysosomen bewirken. Auch die Zellenanzahl vergrößert sich nur geringfügig (weniger als 100%). Diese Tatsachen machen den Unterschied zu Ergebnissen deutlich, die mit bekannten Immunosti-

'" mulantien, etwa BCG-Impfstoff oder den Endotoxinen, erzielt wurden.

In den Fig. 1 und la sind diese Ergebnisse graphischdargestellt. Fig. 1 zeigt die zeitliche Abhängigkeit des prozentualen Makrophagcn-Anteils im Falle

*·"' der Injektion von immunostimulierendem Mittel in behandelte Tiere 'Kurve C) bzw. physi alogischem Serum in die Kontrolltiere (Kurve T). Fig. la zeigt die zeitliche Abhängigkeit der Makrophagen-Anzahl pro ml bei den behandelten Tieren (Kurve C₁) bzw.

^Ml den Kontrolltierer (Kurve T₁), sowie die zeitliche Abhängigkeit der Lymphozytenanzahl bei den behandelten Tieren (Kurve C₂) b/.w. den Kontrollieren (Kurve T₁) nach der Injektion.

C. Einflul.) der intravenösen Injektion eines aus Li-""' steria monocytogenes extrahierten immunostimulierenden Mittels auf d..:- Gewicht der Milz und der Thymusdrüse sowie auf die Blut/ellen und peritonealen Zellen

1. Gewicht der Milz und der Thymusdrüse: Wie auch oben ist keine Veränderung des Organgewichtes festzustellen.

2. Blutzählung und Blutbild: Die Injektion des Mittels hat keine Leukopenie zur Folge; außer- , dem ist keine wesentliche Lcukozytosc zu beobachten.

3. Quantitative und qualitative Veränderungen der peritonealen Zellen:

a) Makrophagen: Ab 24 Stunden bis zum 4 Tag _l(l nach der Injektion ist die Anzahl der Makrophagen bei den behandelten Mäusen gegenüber den Kontrolltieren leicht erhöht. Der prozentuale Makrophagen-Anteil ist bereits von Anfang an gegenüber der Kontrollgruppe erhöht und bleibt , ·, es auch bis zum Ende des Beobachtungszeitraums.

b) Lymphozyten: Nach geringfügiger Abnahme ihrer Anzahl erhöht sich diese, besonders ausgeprägt 48 Stunden nach der Injektion, und nimmt -,, 24 Stunden später wieder den Normalwert an.

Diese Ergebnisse sind ähnlich wie in den Fig. 1 und la in den Fig. 2 und 2a graphisch dargestellt. Die zeitliche Abhängigkeit des prozentualen Makrophagen-Anteils ist für die behandelten Tiere in Kurve C, >-, und für die Kontrollgruppe in Kurve T₃ dargestellt. Die zeitliche Abhängigkeit der Makrophagen-Anzahl geht für die behandelten Tiere aus Kurve C₄ und für die Kontrollgruppe aus der Kurve T₄ hervor, während die zeitliche Abhängigkeit der Lymphozytenanzahl _in für die behandelten Tiere in Kurve C, bzw. für die Kontrollgruppe in Kurve T_s graphisch dargestellt ist.

D. Ausscheidung von Salmonella typhimurium aus dem Blut

Eine Suspension von 1,3 bis 1,9- K)⁷ lebenden „ Bakterien des Stammes Salmonella typhimurium C₅ wird vorher mit dem immunostimulierenden Mittel der Erfindung behandelten Mäusen intravenös injiziert. 2 Minuten bzw. 2 Stunden nach der Infektion werden die Mäuse mit Äther betäubt und es wird Blut ₄₍₁ aus der Achselarterie entnommen Nach pepionptrr Verdünnung werden die Proben auf Nährgelose verimpft. Auf diese Weise kann festgestellt werden, wieviele Bakterien 2 Minuten bzw. 2 Stunden nach der Infektion im Blut der Tiere vorhanden sind. Die unter ₄-dem Einfluß der aus verschiedenen Ausgangsmaterialien extrahierten immunostimulierenden Mittel erzielten Ergebnisse sind in Fig. 3 graphisch dargestellt. Es ist die zeitliche Abnahme D des Gehalts an lebenden Bakterien \r\ Blut in Gegenwart der aus Ehrlich- -_n Ascites-Zellen (Kurve A), aus Listeria monocytogenes (Kurve L), aus Salmonella typhimurium (Kurve 5) und aus Escherichia coli K 12 (Kurve £) extrahierten immunostimulierenden Mittel bzw. bei den Kontrolltieren (Kurve T) dargestellt. Die Salmo- -nellen-Ausscheidung erfolgt bereits in Gegenwart des Ehrlich-Ascites-Zellenextrakts wesentlich schneller (1 log 10-Steigerung im Vergleich zur Kontrollgruppe), jedoch ist dieser Effekt bei Verwendung von Extrakten aus Listeria monocytogenes, Escherichia _bl) coli K 12 und Salmonella typhimurium noch deutlicher ausgeprägt (3 log 10 im Vergleich zur Kontrollgruppe). Eine ähnlich beschleunigte Ausscheidung ist bei Extrakten aus Vibrio cholera und bei Verwendung von BCG-Irnpfstofi zu beobachten. Hierbei ist her- _h. vorzuheben, daß der Unterschied bei Mäusen, die speziell gegen Salmonella typhimurium immunisiert wurden, lediglich 4 log 10 beträgt.

Um festzustellen, ob eine Beziehung zwischen der injizierten Menge des immunostimulierenden Mittels und der Ausscheidungsgeschwindigkeit der Bakterien aus dem Blut besteht, werden 4 Gruppen von jeweils 5 Mäusen jeweils 0,5 ml einer Suspension intravenös verabreicht, die 1, 10, 100 bzw. 1000 ng des immunostimulierenden Mittels enthält. Daneben wird einer Kontrollgruppe von Mäusen physiologisches Serum auf demselben Wege injiziert. Nach 15 Stunden verabreicht man jeder Maus 5 · IO⁷ Salmonella typhimurium durch intravenöse Injektion. 2 Stunden nach der Infektion wird den Tieren Blut entnommen und eine Blutzählung durchgeführt. Fig. 4 zeigt graphisch die Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung des immunostimulierenden Mittels, ausgedrückt durch die Anzahl /V der im Blut zum Zeitpunkt der Untersuchung gefundenen Bakterien. Die beobachtete regelmäßige Abnahme ist ein Hinweis darauf, daß ein /λι-sammenhang zwischen der injizierten Dosis des immunostimulierenden Mittels und dem Ausmaß der Bakterienausscheidung aus dem Blut besteht.

Ein durch Einbetten des aus Salmonella typhimurium extrahierten immunostimulierenden Mittels in Calciumphosphatgel erhaltenes Präparat bewirkt ebenfalls die beschleunigte Ausscheidung der Bakterien, wenn man es 15 Stunden vor der Infektion subkutan injiziert. Dies ist ein Beweis für die außerordentliche Wirksamkeit des immunostimulierenden Mittels der Erfindung, das außerdem durch 15minütiges Erhitzen auf 100° C seine Aktivität nicht verliert.

E. Entwicklung von Listeria monocytogenes in Mäiiseleber und -milz

Es wurde bereits gezeigt, daß eine prophylaktische Injektion des aus Listeria monocytogenes oder Ehr-Mch-Ascitis-Zellen extrahierten immunostimulierenden Mittels gewissen Schutz gegenüber Listeria monocytogenes-Infektionen bietet. Man kann nun die Reaktion der Mäuse auf eine derartige Infektion dadurch genauer quantifizieren, daß man eine Bakterienzählung in Milz und Leber der Tiere durchführt Πίρς heniht auf der Tatsache, daß sich I.isteri;i-Stämme nur in den Makrophagen dieser Organe entwickeln.

Die Versuche werden mit 6 Mäusegruppen durchgeführt, denen jeweils vorher 0,5 ml der folgenden Suspensionen von immunostimulierenden Mitteln subkutan injiziert wurden: Listeria monocytogenes (L), Corynebacterium parvum (CP), Salmonella typhimurium (5), Ehrlich-Ascitis-Zellen (A), Mäuse-Milzzellen (R); die 6. Gruppe (T) erhält lciiglich 0,5 ml 8,5%o Natriumchloridlösung. Sämtliche Mäuse werden nach 18 Stunden mit 8 · 1Ö⁴ Listeria monocytogenes-Bakterien intravenös infiziert. 2, 24 bzw. 72 Stunden nach der Infektion werden die Tiere durch Cervix-Schnitt getötet. Leber und Milz werden entnommen und zerkleinert und nach dem Verdünnen auf Gelose verimpft. Auf diese Weise kann die Anzahl der in Leber und Milz vorhandenen lebenden Listeria-Bakterien zu einem gegebenen Zeitpunkt bestimmtwerden. In den Fig. 5 und 5 a sind die erzielten Ergebnisse graphisch widergegeben. Sie zeigen die zeitliche Abhängigkeit (in Stunden) der mittleren Listeria monocytogenes-Anzahl in der Milz bzw. der Leber dieser Tiere. Aus den Zeichnungen geht hervor, da3 sich die 2 Stunden nach der Infektion gefundene Bakterienanzahl für alle 6 Mäusegnippen in derselben Größenordnung bewegt. Auch 24 Stunden nach der Infektion lassen die Ergebnisse nicht auf eine positive

Wirkung der Extrakte schließen. Nach 72 Stunden sind jedoch ausgeprägte Veränderungen zu beobachten. Während nämlich die Milzen und Lebern der Kontrollmäuse mehr als 10⁷ Rakterien enthalten, findet man in den Milzen der mit aus Listeria, Salmonella typhimurium, Ehrlich-Ascites-Zellen und Mäuse-Milzzellen extrahierten immunostimulierenden Mittel behandelten Tiere eine lOOfach geringere Bakterienanzahl und in den Lebern der gleichen Tiere eine lOOOfach geringere Anzahl von Keimen. Die Wirkung des aus Corynebacterium parvum extrahierten immunostimulierenden Mittels ist weniger stark, jedoch nichts destoweniger beträchtlich.

Vergleichbare Effekte erzielt man mit immunostimulierenden Mitteln, die sich von Vibrio cholera oder Mycobacterium tuberculosis BCG ableiten. Auch hier besteht ein Zusammenhang zwischen der injizierten Dosis des immunostimulierenden Mittels und dem erzielten Effekt.

F. Beeinflussung der Empfindlichkeit gegenüber bakteriellen Endotoxinen

Die immunostimulierenden Mittel der Erfindung erhöhen die Empfindlichkeit der Mäuse gegenüber bakteriellen Endotoxinen nicht, wie aus folgendem Test hervorgeht:

Drei Gruppen je 5 Mäusen werden jeweils 0,5 ml der Suspension eines aus Listeria monocytogenes extrahierten immunostimulierenden Mittels intravenös injiziert. Gleichzeitig werden jeweils 0,5 ml einer 8.5%o Natriumchloridlösung an 3 Kontrollgruppen intravenös verabreicht. Nach 24 Stunden wird jede Gruppe mit 10,100 bzw. 500 ng bakterieller Endotoxine geimpft. Es zeigt sich, daß die Mäuse der Testgruppen unter denselben Bedingungen überleben, wie die Mäuse der Kontrollgruppen.

G. Steigerung der Widerstandsfähigkeit der mit dem immunostimulierenden Mittel behandelten Mäuse gegenüber Streptolysin 0

Drei Gruppen von je 5 Mäusen werden je 0,5 ml einer Suspension mit einem Gehalt von 100 μg eines aus Salmonella typhimurium C 5 extrahierten immu-

zeitig werden an drei Kontrollgruppen jeweils 0,5 ml einer 8,5%o Natriumchloridlösung intravenös verabreicht. Nach 24 Stunden wird jede Gruppe mit Streptolysin 0-Dosen geimpft, die der 2-, 3- bzw. 4fachen LD₅₀-Dosis entsprechen. Während alle Kontrollmäuse nach spätestens 1 Stunde sterben, überleben die mit der 2fachen LD₅p-Dosis für Streptolysin 0 behandelten Mäuse; die mit der 3fachen LD₅₀-Dosis behandelten Mäuse leben noch 6 Stunden, während die mit der 4fachen LD₅₀-Dosis behandelten Mäuse im gleichen Zeitraum sterben, wie die Kontrollmäuse. Diese Versuche beweisen im Zusammenhang mit den bereits beschriebenen Versuchen, insbesondere den Studien über den Einfluß der immunostimulierenden Mittel der Erfindung auf die peritonealen Zellen und die Blutzellen von Mäusen, daß die Mittel nicht toxisch sind. Ihre außerordentliche antiinfektiöse Wirkung geht darüber hinaus aus der Tatsache hervor, daß ein intravenös injiziertes bakterielles Inoculum in Gegenwart der immunostimulierenden Mittel der Erfindung beschleunigt ausgeschieden wird (dies sogar, wenn die Tiere schon 15 Stunden später infiziert werden) und daß die Widerstandsfähigkeit der behandelten Mäuse gegenüber Listeria monocytogenes-Infektionen gesteigert wird. Hierbei ist zu erwähnen, daß bekanntlich Tiere, die gegen Listeria monocytogenes-Infektionen geschützt sind, auch gegenüber zahlreichen anderen Infektionen resistent sind, die durch Bakterien oder Parasiten hervorgerufen werden, welche zur Vermehrung im Inneren der Makrophagen befähigt sind, z. B. durch Bruceila-, Salmonella- oder Mycobakterien sowie Toxoplasmen. Darüber hinaus schützt ein aus Salmonella typhimurium extrahiertes immunostimulierendes Mittel gegen die lOOOfache tödliche Dosis von Pestbazillen, wenn

ίο diese subkutan appliziert werden.

H. Einfluß des immunostimulierenden Mittels auf die in vitro-Blastotransformation von Lympho/ytcn aus Mäusemilz

Mäusemilzen werden in Hanks-Medium zerkleinert

ι, und die erhaltene Zellsuspension wird durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 60 μτη filtriert. Hierauf gibt man jeweils 0,5 ml einer Suspension von 0,5 · 10* bis 10⁷ Zellen in Medium 199, 0,05 ml menschliches Serum und U,()5 ml einer wässerigen Suspension des

:o immunostimulierenden Mittels in Mikrokulturröhrchen. Mit steigenden Konzentrationen des immunostimulierenden Mittels von 10 bis 500 (ig/ml werden verschiedene Versuche durchgeführt.

Nach 42 Stunden gibt man 0,05 ml einer Lösung

j-, zu, die tritiertes Thymidin entsprechend einer Intensität von 10 Mikrocurie/ml enthält. Nach weiteren 4 Stunden werden die Röhrchen 10 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. Der erhaltene Bodensatz wird in 0,5 ml physiologischem Serum suspendiert und mit

jo 0,5 ml lOprozentiger Chloressigsäure versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird auf einem Whatman GS/C-Filter unter einem Wasserdruck von 60 cm filtriert. Nach Spülen des Filters und des Röhrchens mit 5prozentigerTrichloressigsäure und 1 ml 90prozenti-

gern Äthylalkohol trocknet man den Niederschlag auf dem Filter und füllt ihn in das Glasgefäß eines Zählers ein. Der Flüssigkeits-Szintillationszähler liefert den Mitoseindex, der sich aus der Beziehung der in den Kulturen in Gegenwart des immunostimulierenden

ίο Mittels registrierten Zerfälle zu der in den Kontrollkulturen beobachteten Anzahl von Zerfällen er-

Fig. 6 zeigt die Abhängigkeit des Mitoseindex (/) von der Konzentration des immunostimulierenden

η Mittels (ng/ml). Aus Fig. 6 geht hervor, daß das immunostimulierende Mittel bei Konzentrationen von 10 bis 500 μg/ml ausgeprägte Aktivität entwickelt. Die aus Bacillus subtilis extrahierten immunostimulierenden Mittel der Erfindung zeigen ähnliches

,ο Verhalten, wie es in den vorstehenden pharmakologischen Versuchen zum Ausdruck kommt.

Die immunostimulierenden Mittel der Erfindung eignen sich als Wirkstoffe für Medikamente zur vorbeugenden oder therapeutischen Behandlung des

,5 menschlichen oder tierischen Organismus gegen infektiöse Krankheiten, die durch bakterielle Keime oder Viren hervorgerufen werden, z. B. gegen Tuberkulose, Pasteurellose, Brucellose, Listeriose oder durch gramnegative Bakterien verursachte Infektio-

f,n nen. Sie können darüber hinaus zur Behandlung von Toxikosen verwendet werden. Aufgrund der raschen Wirkung eignen sich die immunostimulierenden Mittel hervorragend zur Verhütung postoperativer Infektionen aller Art.

h5 Sie können intravenös, intramuskulär oder subkutan als Suspensionen in pharmazeutisch verträglichen und sterilen Trägerflüssigkeiten, z. B. physiologischen Serumlösungen (Kochsalzlösungen oder glu-

kosierten Sera), verabreicht werden. Man konfektioniert sie zu* Dosierungseinheiten, die bei der Applikation in der Humanmedizin etwa 0,5 bis 50 mg, am besten 1 bis 10 mg, des immunostimulierenden Mittels enthalten.

Man kann sie auch einem für die intradermale, subkutane oder intramuskuläre Applikation geeigneten Gel einverleiben, günstig einem Calciumphosphatgel. Ein derartiges Präparat wird z. B. auf folgende Weise hergestellt:

40 ml einer beliebig konzentrierten Suspension des immunostimulierenden Mittels in physiologischem Serum werden mit 5 ml einer Dinatriumhydrogenphosphatlösung, die 7,92 g Natriumphosphat pro 100 ml enthält, und 5 ml einer Calciumchloridlösung, die 8 g wasserfreies Calciumchlorid pro 100 ml enthält, versetzt.

Der erhaltene Niederschlag wird abzentrifugiert

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und in pyrogenfreirm physiologischen Serum aufgenommen, wobei man gleichzeitig die gewünschte Konzentration des immunostimulierenden Mittels einstellt.

Das immunostimulierende Mittel der Erfindung kann auch oral appliziert werden, wenn man es mit geeigneten pharmazeutisch verträglichen festen oder flüssigen Exzipientien vermengt. Bei Verwendung spezieller Verdünnungs- und Hilfsmittel kann es auch rektal appliziert werden. Schließlich kommt auch die iiußcre Anwendung in Betracht, z. B. als Aerosol in Kombination mit einem geeigneten Träger zur Bekämpfung von Nasalinfektionen.

Es ist selbstverständlich, daß die in der Beschreibung genannten Stämme über den entsprechenden Zeitraum unter entsprechenden Bedingungen zur Nacharbeitung der Erfindung zur Verfügung gehalten werden (vgl. PMZ, 1975, Seiten 171-176).

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Immunostimulierendes Mittel, erhalten durch Suspendieren von tierischen Milzzellen, Ehrlich-Ascites-Zellen oder Bakterien in einem aus gleichen Volumenteilen Chloroform und Methanol bestehenden Gemisch, Abtrennen der unlöslichen Bestandteile, Eindampfen der flüssigen Fraktion unter vermindertem Druck bei niederen Temperaturen, Aufnehmen des festen Rückstandes in Chloroform, Filtrieren der erhaltenen Chloroformlösung des immunostimulierenden Mittels, gegebenenfalls Vermengen der Lösung mit einer physiologisch verträglichen Trägerflüssigkeit und Einleiten eines gegenüber den Lösungsbestandteilen inerten Gases, bis das Chloroform vollständig vertrieben ist.