DE2038230A1

DE2038230A1 - Verfahren zur Gewinnung von Laktulose und Laktobionsaeure aus Laktose

Info

Publication number: DE2038230A1
Application number: DE19702038230
Authority: DE
Inventors: Masakazu Mitsuhashi; Toshio Miyake; Shuzo Sakai; Yoshinori Sato
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 1969-07-31
Filing date: 1970-07-31
Publication date: 1971-03-04
Also published as: FR2053323A1; IT1023006B; FR2053323B1; GB1325727A

Description

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Hayashibara Oompana 31. Juli 1970

Okayama / Japan ^SJ/Hu

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Verfahren zur Gewinnung von Laktulose und Laktobionsäure aus Laktose

Die Erfindung betrifft die Gewinnung von Laktulose und Laktobionsaure aus Laktose.

Bekanntlich findet sich Laktulose in der Natur nicht vor. Montgomery gelang . 1930 die Synthese von Laktulose durch Isomerisieren von Laktose unter Benutzung der Lobry-ae-Bruyn-Eeaktion. Hiemach wird nach Eindampfen der Seaktionslösang durch Methanolzusatz die Laktulose zum Auskristallisieren gebracht und die übriggebliebene Laktose durch Oxydieren mit Brom als Aldonsäure abgeschieden« für di® ÜJechnik ist diese Method© jedoch zu kompliziert und wirtschaftlich nicht .durchführbar, da folgende zusätzliche Te rf Areas stuf em erforderlich sind: eretea» dae Entferaen dta. übersohüssigen Bro»s mit eintr Silbersttlfatlöeong und .des r*etll©3sea Silbers, »it •ehwfligitr Säurt; swti'ttne dit IiolieEHHg tor.- IDafeteilos© durcb. Mtthanoltxtrakticni ame dtr .roatXiehtn lismage -Bio iu's'bsute beträgt sudtfli aar 15%· .

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Auch wurde versucht, die Laktose mittels Matrium- oder Ammoniumhydroxid !su isomerisieren; die iaaslbsttt® betrug aber auch hier nur etwas über 10?£_o Schließlich gewannen B„ Kahn u. Mitarb» Laktuiose aus Laktose über das !-Cp-IEoIyI)-IaCtO-sylamin unter Anwendung der Amadori-Beaktioni jedoch erzielte man nach diesem noch unwirtschaftlicheres Yerfahren eben- ■ fall keine bessere Ausbeute«,

Die der vorliegenden Erfindung zttgra&d©3Li©g®a&© Aufgabe bestand in der Entwicklung eines in der Seatrnik wirtgchaftlich anwendbaren Verfahrens zur Gewinnung reiner I^ktulos© xmd reiner Laktobionsäure.

Das erfinduagsgemäße Yerfahren ist dadurcli gakenaseichnetg daß man

(a) Laktose im alkalischen Medium au. Jiaktalos© isom©risi©rt₂

(b) die nicht isomerisiert Terblieben.® Laktos© mittels Laktose- Belbydrogenase zu LaktobionsäßE© osydi©rt und se ggflls. "wan der Laktulose miife1S©lg basisch©»

uad/od@r dinreh lallsa als tesi

Ba ia Sitafe (a) seki? mim di© Hälft© äos lafette©®© isomerisiert wird₉ io'fe aatiai?g®iiäS di® Ast des

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_ 3 —

falls erwünscht, der größte Teil der verbliebenen Laktose
durch Eindampfen der Isomeri sationslö sung sum Auskristallisieren gebracht und anschließend die in der Isomerisationslösung noch verbliebene Laktose oxydiert werden. Anschließend kann

leicht
die unangegriffen gebliebene Laktulose'abgetrennt werden.

Versuche mit verschiedenen Enzymstämmen der Gattung Pseudomonas ergaben, daß die aus P. graveolens (IK) 3460). oder.P. Fragi (NRBL 23) gewinnbaren Enzyme am vollständigsten Aldosen, insbesondere Laktose, in die entsprechenden Bionsäuren überführen_? - dagegen auf Ketosen, wie Laktulose überraschenderweise überhaupt nicht einwirken» Die genannten Enzyme sind demzufolge zum spezifischen Oxydieren von Laktose in Gegenwart von Laktulose besonders geeignet, zumal zum Kultivieren dieser Enzyme nur äußerst geringe Mengen an anorganischen und organischen
Nährstoffen erforderlich und diese nach derOxydation leicht
entfernbar sind; di® zur Einstellung des pH benutzte Kalziumverbindung bildet das Ealziumbionat, das in der nachfolgenden Fällungsstufe abgeschieden wird.

Wi® dargelegt, ist die gewonnene Laktobionsäure entweder als basisches Kalziumsalis leicht ausfällbar oder durch Absorption an ein basisches Ionenaustauschharz nach Abtrennen der Metallionen mittels eines Ionenaustauschharz«s als frei© Säure isolierbar. Eine vollständige Abtrennung der Bionsäure erreicht man durch Anwendung beider Methoden. Unabhängig davon, ob man die Bionsäure als Kalziumsalz oder als frei® Säure gewinnt,

...4. 109810/2231

ist die Tatsache,, daß gleichseitig die Laktulos© isoliert wird, als ein wichtiger wirtschaftlicher Yorteil der Erfindung zu werten.

Weiterhin ist von Yorteil₉ daß die beiden Beaktionsprodukte mit. gleichartigem Eeinheitsgrad gewonnen werd@n₅ da man von einer im Handel befindlichen Laktose ausgeht₉ die aus Milchmolke mit einer Reinheit von über 99% gewonnen wird«.

(a). Die Isomerisationsstufe.,

Die Lobry-de-Bruyn-Saktion unter Benutzung eines basischen Katalysators, der die Isomerisation von Laktose zu Laktulose bewirkt,, ist die einfachste Methode für diesen Zweck. Die Iso merisation ex'folgt beim Erwärmen von stark basischen wässrigen Laktoselösungenj, die z.B. Kalium-₉- Kalzium=' ₉ Natrium und Aimnoniumhydroxid oder stark basische Anionenau stau schharze enthalten. Zucker sind bekanntlich bei hoher Alkalität 'besonders bei hoher Temperatur unstabil, und es tritt schnell ©in oxydativer Abbau ein. Gibt man jedoch ©inen Katalysator ergibt sich eine Vielzahl von Möglichkeiten^ die sich mach der Produktionsausrüstung oder anderen Bedingungen richtet^ vor allem ob die leaktion bei ■ hoh@n Semperatnir-eB. -in kurzer Zeit oder bei niedrigeren Temperatur©» üb©r laufen soll«,

Während die bisherigen Yer£®hx@D. bei

über länger® Zeit dupchgeführt wurden_s wobei ©in vergleichbar

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■- 5 -

nur geringer Abbau erfolgte, führten die Erfinder auch. Versuche bei hohen Temperaturen und kurzer Beaktionszeit durch, wobei man den oxydativen Abbau in Abhängigkeit von der vorgegebenen Alkalimenge und der Temperaturhöhe untersuchte. TJm eine Luftberührung zu vermeiden und kurzzeitig erhitzen zu können, flössen die Zuckerlösungen mit konstanter Geschwindigkeit durch ein Reaktionsrohr, in dem sie erhitzt, gekühlt und neutralisiert wurden. Benutzt wurden 20%ige Laktoselösungen mit 1,5% Ca(OH)ρ· Di© Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle:

Heizdauer	5 min	10 min	15 min	3 Tage	36(1,5)	■ 4-5 (4)	43 (D
Heiztemp.°G	Isomerisiergrad (Abbauverlust) in %
35 80 100	30 (1,5)

Laktosekonzentrationen von 20 bis 40% wurden als geeignet gefunden. Niedrige Isomerisationstemperatüren sind zwar vorzuziehen, da bei Temperaturen über 80⁰C zur Verhinderung von Zuckerverlusten eine ungewöhnlich kurze Behandlungsdauer von nur wenigen Minuten erforderlich wäre» Bei der Eeaktion bei niedrigen Temperaturen müßten aber z.B. 0,13%ige alkalische Lösungen 3 bis 4 Tage stehengelassen werden. Die Versuche bei

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hohen Temperaturen wurden "bei einer Alkalität von 1 bis und einem pH von 9 bis 10 durchgeführt,- wobei die Zuckerver--" luste bei kurzzeitiger Erhitzung etwa 1 bis 2$ betrugen} obwohl eine lebhafte Verfärbung eintrat ₈ erreicht© der Xsomeri» sationsgrad 30 bis 40^ (letzterer wurde nach der Gystein-HoSCX-Garbazol-Methode bestimmt)_o Der gewonnen® isoiaerisierte Zucker wurde schnell abgekühlt und in eineia Fakuuabehälter einge- ~ füllt, in welchem die Beaktionsfliiseigkeit mit v@reL Salzsäure oder Schwefelsäure neutralisiert wurde*§ das gebildete Kalziumsulfat filtrierte man ab. Natriumchlorid und Ammoniumsulfat wurden bei der folgenden Kultivierung oder in der enzymatisehen Reaktion verwendet, farbig® leaktionsgemische wmrd@n mittels granulierter Kohl© schichten eatfärtto laalysen se igten, daß Laktulose sich najtesia su H-Qfa nebea kl@in.en Mengen von Abbauprodukten "bildete; daneben, verblieb nicht umgesetzte Laktose in größeren Mengen.

h Wenn dieses Bohprodukt mit ©iaee loBsaa.ras'te.iiseMaaE'^ behandelt wird, erhält man einen Sirup axt größerer SüS@ als Iekto®©₉ der als Süßmittel anwendbar ist» Ein© Jfcbtr®nmmg der aicht isomerisierten Laktose durch. Inskristelli8ier©a dei? ©ingedampften Sirup® steigert deren Siiß©| derartig® Sirupe enthalten bisweilen über

Statt Metall- und lüB©aiiiafe.jteoxii.@m Isis siehe Ionenäustausslifearae. als "basieefee den; in diesem Fall "benötigt aam alber- ©ia© läagei?©

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zeit und höhere Temperaturen. Daher hat diese Methode folgende Nachteilet

1) Die Notwendigkeit des Umlaufs der lösung unter Vermeidung Ton Luf tberührumg zwecks Verhinderung der Oxydation der Zucker;

2) die Herabsetzung der Alkalität des Ionenaustauschers durch die gebildete Säure%

3) die Verminderung der Wiederverwendungsumläufe selbst bei Anwendung von vergleichsweise hoehhitzebeständigen Harzen.

Als basisches Harz wurde "Amberlite EA-OO" verwendet. Bei einem Umlauf bei 7O°C und einer Dauer von über 5 h erhielt man in einer 30%igen Laktoselösung ohne Luf tberührung einen Isomerisationsgrad von über 30$έ»

(b). Die Oxydationsstiife.

Zur Trennung der isomerisierten Laktoselösung erfolgt, wie oben angegeben, ©rfindnngsgemäß durch enzymatisch© Oxydation. Bas kann entweder durch Gjcydafcion der restlichen Laktose zu Laktobionsäure unter Kultivisrung von Pseudomonas-Stämmen die Laktose-DehydrogeBase - erzeugen auf der isoiaerisierten Lösung als Kohlenquelle« Oder man dehydriert die isomerisierte Laktoselösungen enx^matisch. Besonders zweckmäßig ist die Einwirkung von. Stämmen der Pseudomonas-GattuBg auf 5 bis 10%ige isomerisierte Laktoaelöimg unter Beliiftuag und Zugabe einer Stickstoffquelle, wie gequollenem Haieextrak-fc, und kleiner

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Mengen anorganischer Salze. Me in den vorgenanten Kulturbrühern erhaltenen Enzymzellen werden einer 20 bis 30%igen isomerisierten Laktoselösung zugegeben. Bei einer Oxydation unter Belüftung, Bewegung und Vermeidung eines Abfalls des pH-Wertes in Gegenwart basischer Stoffe, wie Kalziumkarbonat, wird die restliche Laktose zu Laktobionsäure oxydiert, wobei ein kleiner Verlust an Ketose entsteht. Die Umsatzzeit beträgt' 10 bis 20 h. Der Oxydationsgrad wurde durch quantitative Analysen der gebildeten Kaiziumbionatmengen bestimmt.

(c). Die Aufbereitungsstufe.

Aus dem Oxydationsgemisch wird zunächst das Kalzium mittels stark saurer Austauschharze entfernt. Unter Ausnutzung der Azidität der Bionsäure ist anschließend deren Isolierung durch Absorption an schwach basischen Ionenaustauschharzen durchführbar, indem man das Absorbat aus dem Austauscher mit starken Alkalien herausgelöst und in der erhaltenen Lösung der Alkalimetallsalze der Bionsäure mit starken sauren lonenaus-

reine

tauschharzen reinigt^ die Bionsäure in Freiheit setzt. Eine andere Möglichkeit der Trennung besteht^durch Ausfällen des basischen Kalziumsalzes der Bionsäure aus der konzentrierten Lösung, die durch langsame Zugabe von Kalziumhydrbxid alkalisch gemacht wird. Die gebildeten Kristalle warden mit Schwefelsäure zersetzt, wonach man aus der Lösung zuerst das gebildete Kalziumsulfat und dann durch Zugabe einer kleinen H©ng© Bariumsalz die verbliebenen Sulfationen entfernt» Nach Entfernen der restlichen Metallionen durch einen Kationenaustauscher

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wird die freie Bionsäure in reinem Zustand erhalten.

Me Matterflüssigkeit, aus welcher die Bionsäure als solche oder als Kalziumsalz entfernt war, wird mit sauren und basischen Austauschharzen gereinigt, um reine Laktulose zu erhalten. Andererseits ist das in der Oxydatiohsstufe. (b) erhaltene rohe Gemisch von Laktulose und Laktobionsäure nach Reinigung mit Aktivkohle und stark saurem Ionenaustauschharz auch unmittelbar als saures Süßmittel als Nahrungsmittelzugabe anwendbar.

Obwohl das Bisaccharid Laktulose als 4-0-ß-D-galactopyranosyl-^

(B-Fruktose) ähnliche physikalische Eigenschaften wie Rohrzucker aufweist, ist seine Süße, wie bereits erwähnt, wesentlich milder und feiner, wogegen diejenige herkömmlicher Süßmittel, wie Glukose, Eruktose, Bienenhonig und Stärkesirup, besonders Rohrzucker, eine gewisse Reizwirkung ausübt und monoton, aber nicht mild ist. Hohe Konzentrationen der üblichen Zucker bewirken eine Auskristallisation} auch sind sie alle verdaulich und haben, wesentliche Nährwerte. Neuerdings besteht aber eine verstärkte Nachfrage der pharmazeutischen und kosmetischen Industrie nach Süßmitteln mit besserer, verfeinerter und anhaltender Süße und entsprechendem Geschmack und nach unverdaulichen Nahrungsmittelzusätzen ohne Kalorienwert.

Folgeade Eigenschaften der Laktulose sind für deren Verwendung in Nahrungsmitteln von Bedeutung:

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1. Laktulose verleiht Nahrungsmitteln und Getränken keine

ist scharfe und unerwünschte Süße wie Bokra.cker₉ jedoch auch zusammen mit Bohrzucker in Nahrungsmitteln und Getränken unter Abschwächung der Beizwirkung von Botossueker verwendbar, wodurch den Nahrungsmitteln ein© laaiasonisciie und verfeinerte Süße verliehen wird.

2. Laktulose verleiht Nahrungsmitteln lajad Getränken eine er- ψ höhte Viskosität und festen Produkten einen schönen Glanz, während Glukose und Iruktose viskosität shexabsetzend wirken.

5. Bei Nahrungsmitteln und Getränken_s die stark mit Laktulose gesüßt sind_t tritt dennoch weder ein Auskristallisieren noch eine durch Auskristallisieren verursachte Trübung ein, wie es bei der Verwendung von Bohrsueker und Glukose als Süßmittel der Fall ist. Wird Laktulose gleichzeitig mit

Zucker oder Glukose verwendet, so wird eine Jsskristallisation ' dieser Zucker verhindert und die Haltbarkeit vergrößert.

4. Laktulose besitst geschmack- und feneis.tigk©it®e:ßb.alten&e Eigenschaften, wodurch die mitLaktnios© versetzten Nahrungsmittel und Getränke einen gleichbleibenden Geschmack und gleichbleibende Süße erhalten«

5. Da Laktulose der Hydrolyse durch

Tierkörper nicht absorbiert wird» ist sie ein kalorienfreies, jedoch einem "Körper" gebendes Siü&nittel. IfaJ^rangsmittel

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und Getränke, die ausschließlich dieses Süßmittel enthalten, sind als kalorienfreie Produkte zu bezeichnen.

Die Prüfung der Laktulose enthaltenden Produkte ergab folgendes:

(1). Ergebnisse von Gerneinschaftsprüfungen, bei denen dreißig Prüfer jeden paarweisen Vergleichstest mit Rohrzucker, Glukose und Laktulose bei Konzentrationsgraden von 35» 20 und 10$ jeweils fünfmal wiederholten, bestätigten, daß die Süßkraft von Laktulose schwächer als die von Rohrzucker, aber gleich stark wie die von Glukose ist, jedoch ist die Qualität'milder und verfeinerter als von Rohrzucker. Man erhielt das Schema:

Rohrzucker^*Laktulose =» Glukose ^> Laktose.

(2). Die in Masser völlig lösliche Laktulose kristallisiert selbst bei hohen Konzentrationen sehr schlecht. Bei Zugabe von 10% Laktulose zu einem 70% Konzentrat von Rohrzucker und Glukose wird kein Auskristallisieren beobachtet, obwohl Lösungen, die nur Bohr zucker oder Glukose enthalten, nach kurzer Zeit auskristallisieren.

(3). Versuchsbedingungen !sei der vergleichenden Prüfung auf Hydrolysefestigkeit!

- ...12 10981 n/2 291.

Temperatur 40⁰C

pH ABC

5*0 6,0 7₉5

Eeakti ons sub strat: '. Ende 1% 5 ml

0,1 M-Pufferlösung bei (A), (B) 4 ml Azetat

(C) 4 ml Mcllvaine-Reagenz Enzymlösung 1 ml.

Der reduzierende und Gesamtzucker wurde unmittelbar nach der Schoorl-Methode' bestimmt; nach der Hydrolyse wird für 1 h bei 100⁰C mit 1 ml 25% HGl neutralisiert. Die Prüfungen ergaben folgendes;

Laktose, dessen Zersetzung als Kontrolle für die Wirkungen von Rhyzops und Glukoamylasen gewählt war, zerfiel in 5 h. 100%ig„ Bei Einwirkung von Invertase zersetzte sich Rohrzucker völlig in 15 min« Bei Anwendung eines Extraktes von Schweinepankreas verfiel Maltose nach 26 h völlig. In allen drei Fällen blieb Laktulose selbst bei einer Einwirkungsdauer von 120 h unzersetzt.

(4). Zur vergleichenden Prüfung der Absorbierbarkeit von Laktulose in Verdauungsorganen höherer Tiere wurde wie folgt g%.rbeitet:

In an beiden Seiten verschlossene . Darmteile lebender Kaninchen, die 24 h nichts zu fressen bekamen, wurden 50 ml von 20%igen Lösungen, einerseits von Laktulose, andererseits von Rohrzucker injiziert. 90% des injizierten Rohr-

10°

suckers waren in wenigen Stunden absorbiert, v/agegen Laktulose kein Anzeichen einer Absorption zeigte.

(5). Die Stabilität von Laktulose bei verschiedenem pH wurde unter nachstehenden Bedingungen geprüft:

Endwert der Zuckerkonzentration 0,02$ pH-Endwert der 0,02 M-Pufferlösung 2,0 bis 10,0 Temperatur 98⁰C.

Nach Prüfung der Änderungen des Gehaltes der in Abständen genommenen Proben an reduziertem Zucker (R) und Gesamt zucker (G) gemäß der Somog^i-Efelson-Hethode wurde die Ausgangskonzentration mit 100 angesetzt. Zu 1 ml Beaktionsflüsaigkeit wurden 0,5 ml einer 5%ig«3a HOl gegeben, die Mischung dann 4-5 min auf 100⁰C gehalten und mit 0,5 al NaQH neutralisiert» Die Bestimmung des 'Gesamfczukkers erfolgte nach der Somoggi-Helson-Methode und die Ergebnisse wurden als Gesamtzuckerwerte (G) ausgedrückt» Die Ergebnisse zeigt folgende Sfabelle.

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pH	nach	12 h	Erhitzun£sdauer	1	2,	in	h	.5,	8	0 0	12
anfangs	2	,3		100	102 100	5	103 101	107 102	0	110 103
2,0	4	,0	E G	101	101 100		99₉5	100 100		100 102
4,0	6	,5	R G	100	100 102		98,0	99, 98,	99,5 97,8
6,0	8	,2	E G	105	104 91,		103 84_$0	104 80,	103 75₉3
9,0		E G	3

Aus der Tabelle ersieht bis 8,0 Laktuloselösmngen halten werden können§ Wert der Hydrolyse; b@±m zu versetzen»

, daß in einem pH-Bereich von 3^0 ©hm© Zersetzung 12 h bei 98⁰G g©~ pH 2 unterliegt ein äußerst kleiner 9₃O hat Laktulos© di© !©igung sich

Vie oben angegeben, ist Laktuloseignet für !zahlreich© ©rfrischand© haltigea Getränken^, v±® GoIa₀ Apf© niert Laktulose mit de-r ge schnack» In Milchsäura und Yoghurt, hamoniert bessert den GesckaaeL· geschnack. In natürliches als Süßmitt©! besonders ge Getränk® ο In kohlensäure·=

lachöalpis, gat ait d©3? Hil©is.säur-e, ver-

Milchsäure- ©n₉ künstlichen Fruchtsäften

...15

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und Fruchtsaftkonzentraten erhält Laktulose den frischen Fruchtgeschmack und verleiht den Produkten eine erfrischende Süße. Kleine Zusätze von Laktulose zu alkoholischen Getränken westlicher und ,japanischer Art, wie Bier und Wein, zeigten eine starke Verbesserung des Geschmacks und des "Körpers". Auch hohe Zusätze von Laktulose zu stark konzentrierten Säften bewirken kein Auskristallisieren des Süßmittels. Besonders in den Fällen, bei de^eine Anwendung künstlicher Süßstoffe nicht angebracht ist, ist obiger Vorteil der Laktulose von besonderer Bedeutung.

Die milde Süße und die hohe geschmackserhaltende Eigenschaft der Laktulose macht diese besonders anwendbar in Speiseeis, Eisbonbons, Brauselimonaden und gefrorenen Desserts wie auch in Fruchtkonserven und Tomatensau^cen. Laktulose erzielt in Speiseeis einen höheren Schmelzpunkt, eine Zunahme der Fließfähigkeit (over run) und Weichheit.

Laktulose läßt sich sehr gut in Konditoreierzeugnissen japanischer und westlicher Art zur Verhinderung des Zusammensinkens, Austrocknens oder Auskristallisierens sowie zur Erzielung des gewünschten Feuchtigkeitsgehaltes verwenden. Zwecks Bereitung kalorienarmer Nahrungsmittel wird z.B. die Hälft© des erforderlichen Zuckers durch Laktulose ersetzt. Bei einem Zusatz von wenigen Prozenten Laktulose zu Broten und Backwaren bleibt die Laktulose in den Endprodukten unzersetzt. Bei Backwaren, wie Biskuits und Keksen, bewirkt Laktulose sehr

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erwünschte schöne Back-farben, während die Feuchtigkeitsbeständigkeit der Laktulose das Verformen und Zerbrechen vermindert und die Ausbeute verbessert»

Laktulose verleiht Gelees eine veredelte Süße«, erhöht den Geschmack, macht die Färbung haltbar, verlängert die Durchsichtigkeit und verhindert ein starkes Austrocknen oder eine Plasmolyse und das bewirkt eine dauernde Erhaltung der ursprünglichen Frische. Laktulose verleiht verschiedenen Crems eine zarte Süße und eine milde Schmackhaft!gkeit« Außerdem bewirkt Laktulose z.B. in Kandis,, Schokoladeneinfüllungen, Kaugummis und Karamellen eine Änderung der herkömmlichen ausgeprägten Süße, verstärkt und verbessert den Nachgeschmack.

Beispiel 1.

(a) Eine Lösung von 1 g Laktose in 5 1 Wasser wird nach Zusatz von 6 g OaO 4 Tage bei 35°O inkubiert, bis die optische Drehung fast konstant wird. Die entfärbte und gereinigte isomerisierte Lösung dampft man hierauf im Vakuum ein, worauf die auskristallisierte Laktose abfiltriert und gewaschen wird.

(b) Die mit den Waschflüssigkeiten vereinigte Mutterflüssigkeit stellt man auf einen Gehalt von 10% ein, neutralisiert mit GO₂, erhitzt.nach Zusatz von 1% flüssiger Maisqafquellung, 0,2% Harnstoff, 0,05% KH₂PO₄ und 0,025% MgSO₄.7H₂O im Autoklav

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und gibt dann 2,5% getrennt sterilisierten GaCO^ zu. Dann wird Pseudomonas graveolens (Ii¹O 3460) inokuliert und 50 h bei 30⁰O unter Belüftung und Rühren mit 400 U/min kultiviert, worauf die Enzymzellen abgeschleudert und als Dehydrogenase für weitere Oxydationen von Laktose verwendet werden.

(c)Die zentrifugierte Kulturbrühe wird entfärbt, filtriert, eingedampft und durch Zusatz von gesättigtem Kaltwasser schwach alkalisch gemacht, wodurch das basische Kalziumsalz der Laktobionsäure ausfällt. Diese wird nach dem Abfiltrieren in der dreifachen Wassermenge aufgeschlämmt, der Aufschlämmung langsam verdünnte Schwefelsäure zugegeben und das gebildete Kalziumsulfat abfiltriert, während aus dem I¹Xltrat mittels eines stark sauren Austauschharzes ("Amberlite IE 120") die restlichen Kalziumionen und mittels geringer Mengen eines basischen Austauschharzes ("Amberlite IE 400") die überschüssigen Schwefelsäureionen entfernt werden. Durch ¥akuumeindampfen erhält man sodann Laktobionsäure als Sirup;.papierchromatographisch wird ein· Gehalt von 98% Bionsäure nebst.geringen Mengen Laktose, Laktulose u.a. ermittelt. Ausbeute 13%_s berechnet auf Ausgangslaktose.

(d) Das oben unter (c) nach Abtrennen des Kälziumbionats erhaltene liltrat wird durch Sättigung mit Cog möglichst weit gehend von Kalziumionen befreit, dann mittels eines Dreibett- Auetauschharz-Systems ("Amberlite IJ 120, IM 69, IH 120 und IP 4-11") entfärbt und eingedampft. Die erhaltene Laktulose

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ist 99%ig rein und enthält kaum Laktose. Ausbeute 4Ö%₉ be rechnet auf Ausgangslaktose.

Beispiel 2.

(a) 1 1 einer 15%igen Laktoselösung wird nach Versetzung mit 200 ml Ammoniakwasser (spez»G-ew„ 0^88) 4 Tage auf 35⁰O gehalten, bis die optische Drehung konstant blieb.

(b) Nach Einstellen der isomerisierten Lösung mit Schwefelsäure auf pH 5j8, Zugabe von O₉5% flüssiger Maisaufquellungg 0,06% EH₂PO₄ und 0,025% MgSO^.THgO und Sterilisieren inokulierte man die Lösung mit Pseudomonas fragi (ISEL 25) und kultivierte unter Belüftung und Einstellung des pH mit CaCO^ gemäß Beispiel 1.

(c) Nach Abtrennen der Zetl©n₉ GaGQ^₉ GaSO^ usw. wird, di© ■feurbrühe eingedampft_s mit konzentriert©® Kalkwass©? sctefaeh alkaliseli g©isacht_f das auskristallisi©rt© "basisciiG Kalziombionat abgescJaleudertj gewaschen und g@5iäß Beispiel 1 au einer von aadereia Garboasäur^a freien Laktobionsäure Ausbeuts ^LVJ%j berechnet auf Ausgangslatefcos©»

(d) Dia unter (e) abg©schloud©rt©

säumen mit den tfascliflüssigk©It©a iron H@t>allioa©a₉ r©stliöb.©r Bionaäur© ism. mittels Breibott^AustaTa Han asMlt ©ia©a g@lbli©hoa Bisap₉ dop auf

mit

ssweif

set at uad_ unter

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Kristallimpfen und Rühren gekühlt wird. Ausbeute an Laktulose Kristallen 38%,berechnet auf Ausgangslaktose.

Beispiel 3«

2 1 einer 15%igen Laktoselösung werden nach Zusatz von 2 g GaO 3 bis 4 Tage bei 35°C behandelt, dann mit CO₂ neutralisiert und mit Aktivkohle entfärbt; hierauf wird die Lösung mit 37 g OaOO^ auf 1 1 Lösung und 5 g der nach Beispiel 1 abgetrennten Enzymzellen versetzt und 15 & unter Belüften und starkem Rühren bei 30⁰C oxydiert. Nach Entfärben und Abtrennen der Kalziumionen mittels Austauschharz ("Amberlite IR J Adsorption der Laktobionsäure an einem schwach basischen Ionenaustauschharz ("Amberlite IRA 69")» Entfärben durch Überleiten über ein Gemischtbett-Austauschharz ("AmberliteIR 120 und IRA 4-11") und Eindampfen erhält man reine laktonfreie Laktulose. Ausbeute 38%, berechnet auf Ausgangslaktose.

Die adsorbierte Lactobionsäure eluiert man mit Natronlauge, führt das gebildete Natriumbionat durch einen .stark sauren Austauschharzturm ("Amberlite IR 120") und gewinnt die freie Säure nach Eindampfen in Sirupform. Ausbeute 47%,berechnet auf Ausgangslaktose.

Beispiel A-.

In kontinuierlicher Arbeitsweise wird eine 30%ige Laktoselösung mit Natronlauge auf pH 10,0 eingestellt und durch 5 niin

...20 1 093 1.Q/'> ?.9 1

langes Erhitzen bei 95°C kontinuierlich isomerisiertj dann ' schnell gekühlt, mit HGl neutralisiert^ durch Führen durch eine 4 m hohe Schicht granulierter Aktivkohle entfärbt und mittels Ionenaustauschharz entsalzt. Den isomerisierten gelblichen Sirup, der etwa 40% Laktulose enthält, stellt man auf einen 1Oxigen Gehalt ein„ gibt 2₈5% GaCO₅ und auf je 10 g Zucker 200 mg der nach Beispiel 1 erhaltenen Enzymzellen zu und oxydiert 20 h bei 30⁰C unter Belüften und Rühren,, wobei das meiste Lakton umgewandelt wirdo - .

Die erhitzte und mit Aktivkohle entfärbte Reaktionslösung befreit man von Kalziumionen mittels eines stark sauren Ionenaustauschharzes ("Amberlite IE :120") und von Laktobionsäure mittels eines schwach basischen lonenaustauschharzes ("Amberlite IEA. 69")· Die gemäß Beispiel 3 aufgearbeitete Laktobionsäure gewinnt man. rein in einer Ausbeute von 52%₉ berechnet auf Ausgangslaktose „ wogegen man die säurefreie Laktulose-Lösung nach Entfärbung und Reinigung in einem stark saure und stark basische lonenaustauschharze enthaltenden Mischbett-System in einen farblosen Sirup überführt, der neben Laktulose weniger als 1% Laktose enthält. Ausbeute 37%* berechnet auf Ausgangslaktose.

Beispiel 5.

Eine 25%ige Laktoselösung_s derben Luft durch Kochen entfernt war, ließ man bei 70⁰C durch einen Ohirm_s der mit einer großen Menge eines basischen Ionenaustauschharz©®. ("Amberlite JR 400")

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gefüllt war, umlaufen, wo"bei die Zuckeroxydation nach Möglichkeit durch einleitende Luft verhütet wurde. In 5 Ms 7 h erreichte der Isomerisationsgrad 32%. Danach wurde mit Aktivkohle entfernt und im Mischbettharz-System ("Amberlite IE 12C und IE 411") gereinigt. Den erhaltenen sehr süßen Sirup arbeitete man nach Beispiel 4- auf. Ausbeute an Laktulose 30%, an Laktobionsäure 57%» berechnet auf Ausgangslaktose.

Nachfolgend werden Anwendungsformen der erfindungsgemäß gewonnen Laktulose zur Bereitung von Lebensmitteln und Getränken näher beschrieben.

(A) Bereitung eines kohlensäurehaltigen Getränkes.

Der Ansatz für 10 1 eines Zidergetränkes betrug: Lactulose 700 g

Saccharin 12 g

Kochsalz 2g

Zitronensäure usw. 60 g Geschmackstoff 50 ml.

Nach vollständigem Auflösen in vorberechneten Wassermengen und Sättigen mit CO₂ wurde das eine erfrischende Süße aufwei sende Getränk auf Flaschen gefüllt. Das neue Süßmittel harmo- mieierte gut mit der Sauerkeit und dem Süßstoff des Ansatzes und erteilte letzterem eine feine Süßigkeit und Frische. Zu- d#M handelt es eich üb ein völlig kalorienfreies Getränk.

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(B) Bereitung eines Orangendicksaftes. Der Ansatz bestand für 1OOO 1 aus

750 1 einer 60%igen laktuloselösung 79 1 eines auf den fünften Teil eingedickten Orangensaftes

40 kg Zitronensäure
5 1 Orangengrundmasse
2,5 1 Orangenessenz.

In diesem Gemisch verstärkt Laktulose die Saurigkeit und den innewohnenden Geschmack der Orangen, harmonisiert somit mit deren Aroma sowie verhindert die Kristallisation und Trübung des noch weiter eingedickten Saftes.

(0) Einmachen von Mandarinen»

Hit 100 kg eines 60 kg Laktulose und 30 g Saccharin enthaltenden Sirups werden entschälte Mandarinen Übergossen und in üblicherweise sterilisiert. laktulose verleiht diesen den gewünschten Glanz; ihre milde Süße harmonisiert gut mit Saurigkeit der Früchte sowie betont und bewahrt deren Aroma. Man erhält ein kalorienarmes Nahrungsmittel.

(D) Bereitung von Tomatensauce.

Zu 10 1 Tomatenpüree, das durch Zerquetschen von Toai&ten, Abseihen des Breie« und Eindicken auf 40 bis 5OJf bereitet war, wurden zugegeben:

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800 g trockner Laktulose

100 g Kochsalz ■

100 g 30%iger Essigsäure

50 g Zwiebel·^ .

12 g Zimt
5 g Nelkenöl
2 g Gewürzmischung
2 g Muskatblüte
1 g roten Pfeffer .

Das Gemisch dickte man bis zur Wichte 1,128 ein.Das Produkt behielt seinen lebendigen Glanz und seine Färbung. Laktulose verlieh ihm eine milde Süße und verstärkte sein frisches Aroma.

(E) Bereitung von Eiskrem.

Ein Gemisch von

30 Gew.TIn. "Hautmilch" (skin milk) 15 " " frischer Sahne mit 4-5% Fett 5 ^ä " Laktulose und
0,5" " Zelluloseglykolat

werden mit 50 Gew.TIn. Milch bei 50 bis 75°C innig vermischt, dann auf 60 bis 65°0 erhitzt und filtriert. Die enthaltenen Fette harmonisiert man mit einem Emulgator (a harmonizer), wodurch das Gemisch sich stark ausweitet (the over run increases). Hierauf wird 30 min bei 70°C destilliert, dann gekühlt, bei 3 bis 5 G stehen gelassen und zum Gefrieren gebracht. Das vorzüglich genießbare und schmackhafte Produkt hat eine für ge-

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frorene Desserts gewünschte verfeinerte SuBe₉ einen verhältnismäßig hohen Schmelzpunkt und ein verbessertes Ausweitungsvermögen (an over-run property)ι die Eigenschaften sind mit denjenigen vergleichbar,, die bei Anwendung von Eohrucker erhalten werden«

(F) Bereitung von Sandkuchen ("Gastella")„

Ein durch übliches Vermischen aus
1000 g Eier
500 g Mehl
100 g Laktulose
50 g Honig

bereiteter Teig wird auf mit dünner Papierschicht bedeckte Eisenbleche aufgebracht und im Ofen bei 180 bis 190°C bis zur gewünschten färbung gebacken= Die Laktulose verleiht dem Kuchen eine vorzügliche Backfarbe» Sein G-efüge besteht aus feinen, gleichförmigen Körnern der gewünschten Elastizität» Dessen Feuchtigkeit und ursprüngliche feine Weichheit läßt sich längere Zeit erhalten,- d.hv eine Minderung und Austrocknung des Kuchens wird vollkommen verhindert, darüber hinaus wird der Geschmack und das Aroma durch Laktulose weitgehender veredelt als durch Reissirup, Honig oder andere Süßungsmittel»

(G) HerstellunK von weichen Keksen»
Ein Teigansatz, bestehend aus;

..»25 1 0 8 8-1'η / ■? 2 9 1

100	Gew.	Tin.	Mehl
40	Il	π	Laktulose
15	It	Il	eingedickte Milch
10	H	Il	Butter
10	Π	Il	Backfett
8	Il	Il	Eier
6	Il	Il	Stärke
ο,	5"	Il	Backpulver
ο,	3"	Il	Kochsalz

wurde mit einer geeigneten Wassermenge vermischt, bis das Gemisch eine lappenähnliche Festigkeit hat. Nach dem Ausstanzen buk man 10 min in einem Ofen, dessen Temperatur am Eingang 270°, am Ausgang 130⁰O betrug. Die erhaltenen hellen Kekse besaßen gleichförmigen Glanz, Färbung, Gestalt und schwach trockenes zartes Gefüge, das durch den Speichel*leicht gelöst wird.

(H) Bereitung von Erdbeergelee.

Zu einem heißen Sirup, bestehend aus

80 kg einer 80%igen Laktuloselösung 11,4 kg eines auf 1/10 eingedickten und 121 g

Zitronensäure enthaltenen Erdbeersaftes 10 kg einer 4#igen Pektinlösung,

wurde nach Versetzen mit einer Pektinlösung bei 80⁰O und pH 3,1 erhitzt und dann im Vakuum bei 103⁰O eingedampft. Der Saft, gelatinierte in der gewünschten. Weis·· Dies war über- .

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raschend, da eine übliche Gelatinierung mit weniger als 50% Rohrzucker nicht stattfindet, so daß übertrieben süße Produkte erhalten werden. Weder eine Zersetzung noch eine Plasmolyse der Laktulose durch die Beerensäuren findet statt«

(J) Bereitung von Butterkrem.

Eine wässrige Lösung von 1,1 kg eines trockenen Gemisches von 95% Laktulose und 5% Laktose dampft man zu einem Sirup ein und rührt portionsweise in 100 ml Backöl ein. Sobald die Mischung einen geschmeidigen Zustand mit Glanz und 3?arbe erreicht hat, gibt man geringe Mengen Aroma und alkoholischer Getränke zu. Das Produkt hat einen sehr zarten Geschmack und eine milde Süßigkeit und ist vorzüglich zur Ausschmückung von Torten usw. geeignet.

(K) Bereitung von Gastardkrem.

199 g Laktulose und 8 g Kochsalz werden zuerst in 1 kg Maisstärke eingerührt, dann mit 2,8 kg Eier und schließlich, mit 10 lFrischmilch vermischt« Nach- schwachem Erwärmen gelatiniert die Stärke vollständig. Sobald" das Produkt opak .wird,' wird es gekühlt und mit Aroma versetzt» Es- ist nicht, übermäßig süß und besitzt eine beständige Geschmeidigkeit«, laktulose ist daher zum Süßen verschiedener Kuchan geeignet_o

(L) Herstellung harter Boabona^. - ; ■-. ^;

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Maisstärkesirup setzt man 20 Gew.Tie. Laktulose zu₉ dampft den Sirup im Vakuum bis zum Feuchtigkeitsgehalt von 1 bis 1,5% bei einer Temperatur von 13O°G ein und mischt nach Abkühlen 0,8 Gew.TIe. Zitronensäure sowie Farbe und Aroma zu. Durch Führen der Masse bei 8O⁰O zwischen einem Sieb und einer Walze werden die Formlinge gebildet, in denen Laktulose die strenge Süßigkeit des Bohrzuckers abschwächt, ein Kristallisieren des letzteren verhütet sowie die Klarheit und Qualität der Bonbons verbessert.

(M) Erzeugung von Schokoladekugelkernen.

Die nach vorstehender Vorschrift erhaltene bildsame Masse wird zu Körnern verformt und dann gekühlt oder durch Vakuumaufweitung zu Kugeln verformt. In beiden Fällen benutzt man die Gebilde durch Überziehen mit Schokolademasse als Kerne für Schokoladeerzeugnisse. Die Kerne haben einen milden Geschmack^ keine übermäßige Süßigkeit und harmonieren mit der Schokoladenmasse.

(N) Herstellung kondensierter Milch.

Sogleich bei 110 bis 130⁰O sterilisierte Frischmilch mit geregeltem Fettgehalt wird mit 15% Laktulose versetzt und eingedampft, dann auf unter 15°0 gekühlt, so daß die Laktose Mikrokristalle bildet; die Laktulose verhindert ein Auskristallisieren der Laktose. Das Produkt besteht aus 70% Fett, 45% Laktulose, 29% Milchfeststoffe, 14% Laktose, 7% Protein, 1,5% Asche und 25% Wasser. Es weist eine Kremfarbe und Glanzj die

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- 28 gewünschte Viskosität.und ein ausgezeichnets Gefüge auf.

(0) Erzeugung von Kaugummi.

In 20 Gew.TIe. geschmolzener Gummimasse werden 10 bis 30 Gew.TIe. Rohrzuckerpulver, 50 bis 70 Gew.Tle. Laktulose und Λ Gew.Tl. Geschmackstoff eingeknetet. Das erhaltene Gemisch verformt man zu Bahnen geeigneter Stärke und Form und trocknet über Nacht. Der Laktulosegehalt erhält den Geschmack und gibt einen erfrischenden Nachgeschmack des Produktes.

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Claims

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51. Juli 1970 SJ/Hu

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Patentansprüche

Verfahren zur Gewinnung von Laktulose und Laktobionsäure aus Laktose, dadurch ge kennze ichnet, daß man

(a) Laktose im alkalischen Medium zu Laktulose isomerisiert,

(b) die nicht isomerisiert verbliebene Laktose mittels Laktose-Dehydrogenase zu Laktobionsäure oxydiert und diese ggflls. von der Laktulose mittels basischer lonenharzaustauscher und/oder durch Fällen als basisches Kalziumsalz abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,, daß man als Isomerisationsmittel Alkalimetall- bzw. Ammoniumhydroxid oder ein stark basisches Harz anwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch g#kennzeichnet_t daß man die Laktose-DehydrogenaB© im Isomerisationsgemisch kultiviert oder Zellen «ines -* eat sprechenden Enaymeteisiiea

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4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Laktose-Dehydrogenase bildende Stämme Pseudomonas graveolens (IFO 3460) oder Pseudomonas fragi (NEEL 25) anwendet.

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